Method Article

אפיון מבנה תפקוד ממברנת ליפידים-חלבון באמצעות דו-שכבות ממשק טיפות

DOI:

10.3791/70628

⸱

June 12th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Carle Illinois College of Medicine, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Shull Wollan Center, University of Tennessee, 3Department of Chemistry, Louisiana State University, 4Department of Physics and Astronomy, University of Tennessee, 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Tennessee, 6Department of Chemical and Environmental Engineering, University of Cincinnati, 7Department of Metallurgical, Materials, and Biomedical Engineering, University of Texas at El Paso, 8Farragut High School, 9Department of Chemical and Biological Engineering, University of Alabama, 10Department of Engineering Management and Technology, University of Tennessee, 11Labs and Soft Matter Group, Oak Ridge National Laboratory, 12Department of Physics and Astronomy, Texas Tech University, 13Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge National Laboratory

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג פרוטוקול ניסיוני להרכבה, גירוי חשמלי וניתוח דו-שכבתיות מממשק טיפות עם גרמיצידין A. יחסי מבנה-תפקוד בין ליפידים לחלבון נמדדים על ידי מדידת שינויים בשטח הממברנה, בזרם יוני ובהולכה חד-ערוצית, וקישור תגובות אלו לשינויים דמויי פלסטיות בהולכה יונית במודל ממברנה בהשראת סינפסות חשמליות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דו-שכבתיות מממשק טיפות (DIBs) מציעות פלטפורמה ניתנת לכיוון לבדיקת התכונות האלקטרומכניות של ממברנות ליפידים וליפידים-פפטידים תחת גירוי חשמלי מבוקר. DIBs מאפשרים מדידות מוליכות יונים בערוץ יחיד ובאנסמבל על פני שטחי ממברנה גדולים פי כמה מאלו הנגישים בטכניקות קלימפ פאץ' מסורתיות, ובכך מאפשרים ניתוחים ברמת ממברנה של עיוות אלקטרומכני והשפעתה על פפטידים מוליכי יונים. על ידי כיוונון שיטתי של מבנה הממברנה דרך שלב שמן פחמימי בתפורה (למשל, הקסדקן [C16] לעומת דודקאן/הקסדקן [C12/C16] [25%/75%, v/v]), פלטפורמה זו מלמטה למעלה מאפשרת שונות שיטתית בהרכב הממברנה ובסביבת השמן, המשפיעה על ויסקואלסטיות הממברנה וארגון מחדש מבני, ובכך על הולכת יוני פפטיד. נהלים מפורטים מסופקים להרכבת ממברנות 1,2-דיפיטנואיל-sn-גליצרו-3-פוספוכולין (DPhPC) עם גרמיצידין A, תוך שימוש בהרכבים שונים של שמן פחמימנים, וכן ליישום פרוטוקולי פולס מתח שמניעים ממברנות למצבים אלקטרומכניים מטא-יציבים. מאופיין הולכת יוני ממברנה אדפטיבית, כולל תגובות קצרות טווח דמויי פלסטיות (דמוית STP) וארוכות טווח דמויי חיזוק ושקיעה (דמוית LTP/LTD) במערכת ממברנה מודלית. בהרחבה יותר, פרוטוקול זה מספק גישה חזקה וניתנת לשחזור לחקירה שיטתית של תרומות אלקטרומכניות התלויות בהרכב ברמת הממברנה להתנהגות מוליכה דמוית סינפסה ולהבנת האופן שבו סביבות ממברנות ליפידים מווסתות את תפקוד תעלת היונים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ממברנות ביולוגיות הן מבנים סופרמולקולריים קריטיים שיכולים לווסת הולכה יונית ולאפשר תקשורת בין נוירונים דרך סינפסות חשמליות וכימיות 1,2,3,4. סוג תקשורת זה נשלט עוד יותר על ידי פלסטיות סינפטית, שבה שינויים מבניים בסינפסות מווסתים את חוזקן ועמידותן לאורך טווחי זמן 5,6, המתואר בדרך כלל במונחים של פלסטיות לטווח קצר (STP) והגברה ארוכת טווח או דיכוי (LTP או LTD). תופעות אלו, הכוללות שינויים דינמיים בהולכת הממברנה בתגובה לפעילות עצבית, לעיתים קרובות קשורות לנוירופלסטיות7, שהיא הבסיס ללמידה וזיכרון8. מודלים מסורתיים של פלסטיות מדגישים לעיתים קרובות את הוויסות הביוכימי של תעלות יונים באמצעות סינתזת חלבונים, תנועה או זרחון. עם זאת, תפקיד ממברנות הפלזמה הנוירונליות במודלים של פלסטיות הוזנח, ברובו,10,11.

שיטות פלאץ-קלאמפ משמשות כבר למעלה מחצי מאה לחקר אלקטרופיזיולוגיה של תעלה חד-יונית. עם זאת, הם יכולים לחקור רק אזורים של ממברנה הקטנים בהרבה מסינפסות שלמות או מודלים סינתטיים בקנה מידה גדול. כתוצאה מכך, הם מהווים מגבלה טכנית לחקר ארגון מחדש ועיוות ממברנה ברמות מזוסקאלה. המזוסקאלה מוכרת יותר ויותר כסולם אורך קריטי להבנת היבטים רבים של ביופיזיקת ממברנות12,13.

מוצגת שיטה לשימוש ב-1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DIBs)14,15 עם יונופור קטיון פפטיד מונווולנטי, גרמיצידין-A (gA), כדי לדגם הולכה יונית, בדומה למה שמתרחש בסינפסה חשמלית. מערכת זו מציעה מספר יתרונות מרכזיים: (i) DIBs מספקים פלטפורמת שומנים ושמן ניתנת לכיוון המאפשרת ארגון מחדש שיטתי של ממברנה16; (ii) DIBs מאפשרים חקר אירועים חד-ערוציים וערוצי אנסמבל בטווח אורך17,18; ו-(iii) DIBs מאפשרים חקירת טלאי ממברנה תת-מילימטרייםבגודל 2 הלוכדים מבנה מחדש של ממברנה אלקטרומכנית קולקטיבית, תוך שמירה על היכולת לפתור אירועי הולכת יונים חד-ערוציים19,20. שיטה זו מתאימה במיוחד למחקרים הדורשים חקירה חשמלית ואופטית סימולטנית של אלקטרומכניקת ממברנה על שטחי ממברנה גדולים יותר מאלו הנגישים על ידי קלימפ פאץ' קונבנציונלי, תוך שמירה על היכולת לפענח אירועים בערוץ בדיד. הוא שימושי במיוחד כאשר מטרת הניסוי היא לבחון כיצד הרכב הממברנה, סביבת השמן וגלי המתח המוטל משפיעים על מבנה מחדש קולקטיבי של הממברנה והולכת פפטידים. השיטה פחות מתאימה לניסויים הדורשים ארכיטקטורה תאית טבעית או קריאות מולקולריות ישירות של שינויים קונפורמציונליים חלבונים בממברנות ביולוגיות שלמות 19,20,21.

על ידי יישום גירוי חשמלי פיזיולוגי רלוונטי, DIBs נדחפים למצבים יציבים לא שווי משקל שבהם מבנה אלקטרומכני דינמי משנה את הולכת תערובת היונים של פפטידים. שינויים מתפתחים אלה בהולכה יונית דומים תיאורית לתופעות STP, LTP ו-LTD נוירולוגיות שנדונו בנוירו-מדע 22,23,24. במחקר הנוכחי, התנהגויות אלו מפורשות בעיקר כתגובות פיזיקליות ברמת ממברנה לגירוי חשמלי הקשורות לתכונות מכניות פנימיות של ממברנה, כגון ויסקואלסטיות ודחיסותבמערכת ממברנה מודלית. ראוי לציין כי המחקר המתואר כאן מבוסס על ראיות קודמות לכך שדו-שכבתיות שומנים יכולות להציג זיכרון חשמלי בסיסי באמצעות שינויים מתמשכים במוליכות ואחסון מטען קיבולי לאחר גירוי 14,15,25,26,27,28,29,30,31,32,33, 34, ומציעה תובנות חדשות למנגנונים שבאמצעותם דו-שכבתיות שומנים יכולות לתמוך בתפקוד אדפטיבי, דמוי סינפטיה, בהיעדר מכונות תאיות מורכבות. לבסוף, מתודולוגיה זו מאפשרת גם בחינה ישירה של יחסי מבנה-פונקציה וכיצד התנהגות מקרו-סקאלית מתפתחת מארגון מבני פשוט 21,25,27.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נקה היטב את כל כלי הזכוכית והציוד ההכנה עם חומרי ניקוי מעבדה מתאימים ושטוף במים מזוקקים לפני הכנת הדגימה. יש ללבוש משקפי בטיחות בכל עת וכפפות ניטריל או לטקס כדי למנוע זיהום. להשליך את כל הפסולת הכימית בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. ודאו שממסים נדיפים מאוחסנים כראוי בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות. ודא ששטח מעבדת הניסויים והחומרה (איור 1A), כלי הניסויים (איור 1B), והחיבורים החשמליים והאופטיים (איור 1C) יישארו ללא הפרעה וללא מכשולים.

1. הכנת תמיסת בופר מימי

  1. שקלו את הכמות המתאימה של 3-(N-מורפולינו) חומצה פרופאןסולפונית (MOPS) וכלוריד אשלגן (KCl) כדי לקבל את הריכוזים הסופיים הרצויים (למשל, 10 mM MOPS, 0.1 M KCl ב-500 מ"ל).
  2. הוסף את ה-MOPS וה-KCl ל-~450 מ"ל מים מזוקקים בבקבוק נפחי של 500 מ"ל או בגליל מדורג וערבב עם מוט ערבוב מגנטי עד שהוא נמס לחלוטין.
  3. מדוד את ה-pH עם מד pH מכויל. כוונן את ה-pH ל-7.4 על ידי הוספת 1 M אשלגן הידרוקסיד (KOH) או חומצה כלורית (HCl) במרווחים של 0.25 מ"ל תוך ערבוב רציף.
  4. הביאו את הנפח הכולל ל-500 מ"ל עם מים מזוקקים וערבבו היטב. העבר את הבופר לבקבוק נקי עם תוויג, אטום ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: השתמש בבופר עד ~2 חודשים. אמת וכוון מחדש את ה-pH ל-7.4 לפני כל שימוש.

2. הכנת תמיסת גרמיצידין

  1. במכסה אדים כימי, מוסיפים 5 מ"ג גרמיצידין A (gA) לבקבוקון זכוכית נקי בנפח 20 מ"ל. הוסיפו 10 מ"ל מתנול באמצעות מזרק אטום לזכוכית או גז ומערבולת עד שהפפטיד מומס לחלוטין. סמנו את הבקבוקון כ"gA stock" ואחסנו בטמפרטורה של -80°C.
    הערה: ניסויים קבוצתיים משתמשים ביחס מולר ליפיד: פפטיד של ~1:10-4. ניסויים חד-ערוציים משתמשים בפפטיד נמוך פי ~10–100 (1:10-5–10-6) כדי לפענח אירועים בודדים בזמני הקלטה קצרים (<1 דקות). הכנת קת מדוללת משפרת את דיוק הפיפטינג ביחס מולרי נמוך (< ~ 1:10-4).
  2. נקו שני בקבוקי זכוכית נקיים נוספים בנפח 20 מ"ל עם גז ארגון למשך ~5 שניות כל אחד כדי להסיר אבק.
  3. באמצעות מזרק אטום לגז נקי, זרקו 9.9 מ"ל מתנול לכל בקבוקון מנוקה.
  4. פיפט של 100 מיקרוליטר של תמיסת המאגר gA עם מזרק אטום גז סטרילי לתוך בקבוקון אחד לקבלת נפח כולל של 10.0 מ"ל. סמנו את הבקבוקון הזה כ-"A". ריכוז = 2.66 מיקרומו ג'אמקול במתנול.
  5. פיפט 100 מיקרוליטר של תמיסה "A" לבקבוק הזכוכית השני כדי לקבל נפח כולל של 10.0 מ"ל. תתייג את הבקבוקון הזה כפתרון "B". ריכוז = 26.6 nM gA במתנול.
  6. אטום בקבוקונים עם פקקים ועטוף בפארפילם.
  7. אחסן את כל תמיסות ה-gA בטמפרטורה של -80°C עד השימוש.

3. הכנת שלפוחיות פפטידיות

  1. נקה בקבוקון זכוכית נקי בנפח 20 מ"ל עם גז ארגון למשך ~5 שניות.
  2. הוסיפו 4 מ"ג של 1,2-דיפיטנואיל-sn-גליצרו-3-פוספוכולין (DPhPC) לבקבוקון.
  3. במכסה אדים, מוסיפים 1 מ"ל מתנול באמצעות פיפטת זכוכית. סובב בעדינות או מערבולת עד שכל השומנים מומסים.
  4. באמצעות מזרק אטום גז בנפח 500 מיקרוליטר, הוסף 178 מיקרוליטר של תמיסה "A" (לניסויי STP ברמת אנסמבל; יחס מולרי DPhPC:gA = 1:10-4) או 890 מיקרוליטר של תמיסה "B" (לניסויים חד-ערוציים; יחס מולרי DPhPC:gA = 1:5×10-6) לתמיסת המתנול DPhPC. מערבובת עדינה לערבוב.
  5. מתחת לזרם עדין של ארגון במכסה האדים, מאדים את המתנול עד שנוצרת שכבת שומן דקה ואחידה בתחתית הבקבוקון.
  6. הניחו את הבקבוקון הפתוח בתנור ואקום של 40 מעלות צלזיוס ומשכו ואקום מלא למשך 10–12 שעות או לילה כדי להסיר את שאריות הממס.
  7. הוציאו את הבקבוקון מתנור הוואקום והוסיפו 2 מ"ל מבופר של 0.1 מטר KCl שהוכן בסעיף 1 לניסויי STP, מה שמוביל לריכוז סופי של ליפידים וגראמיצידין בהשעיה של 2.36 מ"מ ו-236 ננומטר, בהתאמה. לניסויים חד-ערוצי, הוסף 2 מ"ל של בופר KCl של 1 M כפי שהוכן בסעיף 1. מערבולת להחזיר את שכבת הליפידים ולקבל השענת שומנים של 2 מ"ג/מ"ל, מה שמוביל לריכוז סופי של ליפידים וגרמיצידין בהשעיה של 2.36 מ"מ ו-11.8 ננומטר, בהתאמה.
  8. הקפיאו את הבקבוקון בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס לפחות 6 דקות, ואז הפשרו אותו על פלטת חום או אמבט מים בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 6 דקות. מערבולת לרגע לערבב. חזרו על מחזור ההקפאה-הפשרה הזה שש פעמים כדי לקדם את היווצרות שלפיות רב-למלריות.
  9. הרכיבו אקסטרודר וזיקולת שומן עם ממברנה חרוטה בקוטר נקבוביות 0.1 מיקרון, בהתאם להוראות היצרן. העבר 500 מיקרוליטר של בופר דרך האקסטרודר 3 פעמים כדי להרטיב את הממברנה, לוודא שאין דליפות, ולהשליך את המאגר.
  10. טעין 1 מ"ל של תליית הליפיד-פפטיד המופשרת לתוך האקסטרודר ובצע 31 מעברים דרך ממברנת 0.1 מיקרון כדי לקבל שלפוחיות חד-למלריות בקוטר ~100 ננומטר ולהבטיח הומוגניות בגודל.
  11. העבר את הוזיקולות המופרשות (וזיקולות חד-למלריות גדולות, LUV) לצינור PCR בנפח 1 מ"ל, תייג ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. השתמש תוך שבועיים מההכנה.
  12. אטום כל תליון חלבון שומרים שנותר בבקבוקון המקורי, עטוף בפארפילם, ואחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
  13. אם משתמשים בדגימות שהיו קפואות קודם לכן ולא הוצאו, יש להמיס מחדש בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס באמצעות פלטה חמה או לתת לדגימה להתחמם לטמפרטורת החדר, ואז להוציא את הדגימה.

4. הכנת ג'ל אגרוז

  1. הנח זכוכית נקייה בנפח 50 מ"ל על פלטה חמה. הוסיפו טבליית אגרוז אחת ל-50 מ"ל של אותו בופר שמשמש ללחות שכבת השומן (למשל, 10 מ"מ MOPS, 0.1 M KCl, pH 7.4) ליצירת תמיסת ג'ל אגרוז 1%.
  2. הוסיפו מוט ערבוב טפלון נקי וערבבו בעוצמה עד שהטבליה מתפזרת.
  3. כסה את הבקבוק בנייר אלומיניום וחורר חור אוורור קטן עם מרית מתכת. כוון את טמפרטורת הפלטה החמה ל-220–230 מעלות צלזיוס. התמיסה תתבהר ותגיע לרתיחה מתגלגלת, מה שמעיד על התמוססות מוחלטת של האגרוז.
  4. כבה את האש והסיר בזהירות את נייר האלומיניום. סרק כל סרט שטח עם מרית מתכת נקייה. השתמש מיד בתמיסת האגרוז החמה לציפוי אלקטרודות או תן לה להתקרר ולהתקשה בבקבוק לשימוש מאוחר יותר.
  5. לאחר ציפוי אגרוז באלקטרודה, מכסים את האגרוז המוצק בנייר אלומיניום, אטמו בפארפילם, מתווים ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. כשצריך, חממו מחדש לרתיחה עם ערבוב עד שהמסה מלאה.

5. הכנת אלקטרודות

  1. חתכו חוט כסף בקוטר 0.125 מ"מ לאורכים ~70 מ"מ לאלקטרודות בראש ולאורכים~130 מ"מ לאלקטרודות הארקה.
  2. באמצעות להבה פתוחה (למשל, מצית ידני או מבער בונזן), יש להחזיק קצה אחד של כל חוט כסף באופן אופקי בקונוס המרכזי החם ביותר של הלהבה עד שהקצה נמס ויוצר כדור כדורי בקוטר ~0.2 מ"מ (איור 2A).
  3. הנח את החוטים על משטח נקי ווודא תחת מיקרוסקופ שהכדורים כדוריים ובגודל דומה. אם כדור מוארך או לא סדיר, חתכו את הקצה וחזרו על ההתכה (שלב 5.2).
  4. הניחו את קצות שני חוטי הכסף במיכל זכוכית עם אקונומיקה ביתית טרייה (נתרן היפוכלוריט, NaClO). ודאו שהכדורים טבולים לחלוטין ודגרו לפחות שעה אחת כדי לכלור את פני השטח וליצור Ag/AgCl. מראה חום-אפור עמום מאשר כלור מוצלח (איור 2B).
  5. הסר את החוטים מהאקונומיקה לאחר שהכדור הופך לאפור עמום, שטוף היטב במים מזוקקים והניח אותם על משטח נקי וללא סיבים לייבוש.
  6. יש להשיג מחזיק פיפטה אחד לראש השלב ומחזיק אלקטרודות הארקה אחד. חתכו נימי זכוכית בורוסיליקט בקוטר 100 מ"מ (1.0 מ"מ OD, 0.58 מ"מ ID) לשניים באמצעות חותך זכוכית.
  7. הכנס חצי נימי אחד למחזיק הפיפטה בראש השלב והדק את המחזיק כדי לאבטח אותו. התקן נימי 100 מ"מ מלא על מחזיק האלקטרודות הקרקעי וקבע אותו.
  8. הכנס את הקצה הלא-כדורי של חוט הכסף באורך 130 מ"מ לתוך נימי האלקטרודה הארקעית עד ~20 מ"מ מהקצה הכדורי בולט. הדביקים את הקצה הנגדי של החוט למחזיק, והשאירו ~5 מ"מ חשופים לחיבור הארקה.
  9. חזור על השלב הבא עם חוט בקוטר 70 מ"מ לאלקטרודת ראש הבמה, כדי להבטיח מגע יציב בין החוט למחבר הראש (החלק בצבע זהב). חתוך כל חוט עודף מקצה מחבר הראש.
  10. טבלו כל כדור כסף כלור לתוך האגרוז, ממש מעל צומת הכדור-ציר, כדי ליצור ציפוי דק ואחיד. תצלול פנימה והחוצה לפחות 10 פעמים.
  11. משכו את האלקטרודה ותנו לאגרוז להתגשם בטמפרטורת החדר. חזרו על טבילה במידת הצורך כדי ליצור קליפה חלקה ואחידה בעובי עשרות מיקרומטרים. הימנעו מציפוי גבוה מדי או נמוך מדי על החוט (איור 2C).
  12. התקן את ראש הבמה והאריז אלקטרודות על מיקרומניפולטורים. חבר את חוט ההארקה החשוף (~5 מ"מ) להארקת המגבר באמצעות קליפס אליגטור.
  13. באמצעות פינצטה, כופפו בעדינות כל אלקטרודה באמצע הדרך בין קצה הכדור לנימי הכדור כך שהקצה הכדורי יהיה בניצב לשלב המיקרוסקופ. הימנעו מכיפופים מעל 90° כדי למזער עיוות אופטי בתצוגות הוויזואליות והווידאו של המיקרוסקופ.
  14. כוון את כיוון האלקטרודות במחזיקיהן כך שקצוות הכדור המצופה באגרוז יהיו בניצב למישור ההדמיה של המיקרוסקופ (איור 3A).

6. היווצרות בי-שכבות בממשק טיפות (DIBs)

  1. הניחו צלחת פטרי נקייה עם תחתית שקופה על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. מלאו את הקערת בשמן אלקן (למשל, 100% הקסדקן, או 25%/75% v/v דודקן/הקסדקן) לעומק ~ 5 מ"מ (איור 1B).
  2. באמצעות בקרות המיקרומניפולטור, הנמיך את שני קצות הכדור המצופים באגרוז לתוך השמן לעומק ~2.5 מ"מ מתחת לפני השמן. הימנעו מתנועה מהירה עם המיקרומניפולטור כדי למנוע התנגשות בין ראש כדור אלקטרודות לצלחת הפטרי.
  3. כוון את פוקוס המיקרוסקופ עד ששני קצות הכדורים וציפויי האגרוז שלהם יהיו בפוקוס חד. מקם את האלקטרודות קרוב לקצה שדה הראייה כך שניתן יהיה לצפות בשתיהן בו-זמנית.
  4. באמצעות פיפטה מכויילת בנפח 2 מיקרוליטר, שואף את המתלה של וזיקולת ליפידים-פפטיד מופרעת. יש לשחרר לאט 250 ננוליטר מהמתלה ישירות על כל קצה כדורי מצופה באגרוז באמצעות קצה פיפטה נפרד לכל אחד, מבלי לגעת בקליפת האגרוז עם קצה הפיפטה.
    הערה: כדי למזער רעידות ביד ולהגביר יציבות, עגן את שני המרפקים על מדף השולחן נגד הרעידות. ייצוב את פרק כף היד עם היד הלא-פיפטית, טבל את הפיפטה באיטיות בשמן, והתקרב לאלקטרודה בהדרגה. החזקת נשימה קצרה בזמן טעינת טיפות עשויה להפחית עוד יותר תנועות לא מכוונות.
  5. אפשר לטיפות להתפשט ולצפות את קליפת האגרוז ולשקוע הרחק מהאלקטרודה תחת כוח הכבידה. שימו לב לשקיעה מהצד דרך קיר צלחת פטרי אם התמונה נקייה (איור 3B).
    הערה: הזמן הנדרש לשקיעת הטיפות תלוי בהתפלגות גודל הווסיקולות, בטמפרטורה ובטופוגרפיית האגרוז. ל-DIBs של DPhPC, חכו לפחות 5 דקות אחרי הטיפה15.
  6. דחף בעדינות את שולחן האנטי-רטט כדי להעריך את מוכנות הטיפות. אשר שהטיפות השקועות נעות בעיכוב קל יחסית לתנועת האלקטרודה, מה שמעיד על היווצרות טיפות מונו-שכבת שומן מצופות במלואן.
    הערה: התנועה המאוחרת מתרחשת משום שהיווצרות שכבת ליפידים סביב הטיפה המימית מורידה משמעותית את מתח הפנים, ובכך מעכבת את התגובה הפיזיקלית בעת הזזת האלקטרודה בשמן.
  7. אם התנהגות זו לא נצפית, יש להמתין עוד 2–3 דקות ולחזור על התהליך.

7. התקנה חשמלית וניטור דו-שכבתי (חזותי וחשמלי)

  1. ודא שהמיקרוסקופ, שולחן האנטי-רעידות, כלוב פאראדיי וכל הרכיבים החשמליים, כולל המגבר, הדיגיטזר, מחולל הפונקציות והמחשב, מחוברים לאדמה משותפת (איור 1).
  2. סדר את חיבורי המכשירים לפי מדריך ההגדרה של היצרן. השתמש באיור 1C כהפניה סכמטית לקונפיגורציה החשמלית והאופטית החיונית. עיין בהוראות המפורטות לגבי הארקה35, קונפיגורציית חומרה/תוכנה, וכיוון הזזת פיפטות לניסויים ב-DIB.
    הערה: פעל לפי הוראות הגדרה ייחודיות לכל התוכנה והחומרה המפורטות בטבלת החומרים.
  3. חבר את אלקטרודות הראש וההארקה למגבר ה-patch-clamp.
  4. הגדר מחולל פונקציות חיצוני (או ערוץ היציאה של תוכנת הרכישה) ליצירת גל מתח משולש של 10 הרץ, 10 mV. אשר את המשרעת והתדר על אוסצילוסקופ מחובר ובתוך תוכנת הרכישה.
  5. לאחר שהטיפות שקעו ~ 10 דקות, השתמשו במיקרומניפולטורים כדי להביא את שתי הטיפות למגע עדין. כוון את מיקום האלקטרודות כך ששטח המגע של הטיפות יהיה בתחילה לא עולה על ~רבע מהקוטר שלהן.
  6. הפעל את גל המשולש של 10 Hz, 10 mV ועקוב אחרי תגובת הזרם הקיבולית עם המגבר ותוכנת הרכישה.
  7. המתינו להיווצרות דו-שכבתית ספונטנית, המסומנת חשמלית על ידי תגובת זרם קיבולית מתרחבת משיא לשיא ואופטית על ידי החזרה פנימית הולכת וגדלה (מראה אליפסה) ממגע עם דו-שכבתיות (איור 4). יש לאשר כי דו-שכבות ליפידיות טהורות מציגות רמות זרם מלבניות לגירוי המתח המשולש, בעוד שדו-שכבות עם gA-dopped ביחס ~1:10-4 ליפיד: פפטיד מציגות רמות משופעות המשקפות הולכה יונית אנסמבלית.
  8. כוונו את שטח מגע הטיפה על ידי הזזת האלקטרודות במעט עד שתגובת הזרם הקיבולית משיא לשיא לצורת גל משולש של 10 הרץ, 10 מילי-וולט היא בין ~100–200 pA עבור ~250 nL DIBs בשמנים C16 או C12/C16, המתאימים לטווח קיבול ~250–500 pF33.
    הערה: פולסים בתדר גבוה או מתחי החזקה DC שאינם אפסיים עלולים לגרום לאלקטרורטיטינג ולהרחבת שכבה דו-שכבתית מופרזת, מה שמוביל להתלכדות טיפות ולקרע דו-שכבתי. טווח 100–200 pA מספק איזון בין יציבות דו-שכבתית לבין אות לרעש, ומאפשר התרחבות שטח מספקת במהלך הגירוי.
  9. אם ה-DIB מתאחד, להרים את האלקטרודות מהשמן. שטוף היטב את ראשי האלקטרודות עם אותו בופר מימי ששימש לדגימות הליפידים והאגרוז.
  10. הסר כל טיפה מימית מהצלחת פטרי באמצעות מזרק סטרילי. מלא בשמן טרי במידת הצורך, טבל מחדש את האלקטרודות. טענו מחדש את תמיסת ה-LUV על האלקטרודות כפי שמתואר בסעיף 6 וחזרו על התהליך.
  11. לאחר אישור תגובות קיבוליות או מוליכות יציבות, כבו את גל המשולש ואפשרו ל-DIB להתאזן לפחות 15 דקות לפני יישום פרוטוקולי גירוי.

8. פרוטוקולי גירוי חשמלי

  1. ניסויי פולס (משלבים תגובות דמויות-STP ו-LTP / LTD)
    1. הגדר את מחולל הפונקציות או תוכנת הרכישה כך שיספק פולסי מתח בעוצמה, משך ואינטרוול בין פולסים רצויים (למשל, PPF [הקלה על פולסים מזווגים] ודפוסי PPD [דיכאון פולסים זוגיים]).
    2. פתח את תוכנת צילום הווידאו. בחר את הגדרות המצלמה והעדשה האובייקטיבית המתאימות. הגדר את קצב הפריימים לפחות ל-20 פריימים לשנייה וודא שהוא נשאר יציב במהלך ההקלטה.
    3. בתוכנת רכישת הנתונים, הגדר את תדר הדגימה לפחות 5 קילוהרץ עבור האות הנוכחי.
    4. לחצו על רכישת > פרוטוקול חדש כדי ליצור פרוטוקול חדש, או לחצו על רכישת > פרוטוקול עריכה כדי לשנות פרוטוקול קיים. בלשונית מצב רכישה, בחר גירוי אפיזודי. הגדר ריצות/ניסיון ל-1 וסוויפ/ריצה ל-1.
    5. הגדר את משך הסריקה ל-4 שניות ארוך יותר ממשך הניסוי הכולל. לפרוטוקול STP של 120 שניות (60 שניות PPF + 60 שניות ליום ליום), הגדר את משך הסריקה ל-124 שניות כדי לאפשר בסיס של 2 שניות לפני ואחרי הגירוי.
    6. בלשונית הקלטים , הקצה את ערוץ ההקלטה לקלט הנוכחי. בלשונית היציאות , הקצה את ערוץ הגירוי לפלט המתח השולט באלקטרודות.
    7. פתח את לשונית Waveform. בעמודה A, הגדר Type ל-Step, הרמה הראשונה ל-0 mV, ומשך ראשון ל-2000 ms כדי להגדיר קו בסיס קדם-גירוי.
    8. בעמודה B (PPF), הגדר Type ל-Step. יש לציין את אמפליטודת המתח הרצויה (למשל, +100 mV), משך הפולס (למשל, 100 מילישניות), וקצב הרכבת כדי לקבוע את מרווח הפולסים התואם למחזור העבודה היעד (למשל, 90.9%).
    9. בעמודה C (PPD), הגדר באופן דומה Type to Step עם אותה משרעת ומשך פולס, אך מגדילים את קצב הרכבת או מרווח האינטרפולס כדי להשיג את מחזור העבודה הנמוך הרצוי (למשל, 28.6%).
    10. בעמודה D, הגדר קו בסיס לאחר גירוי זהה לעמודה A (0 mV, 2000 ms).
      הערה: אם משך כל האפוקסים בלשונית צורת הגל עולה על משך הסריקה בלשונית Mode/Rate , יש להגדיל מעט את משך הסריקה עד שהשגיאה תיפתר.
    11. שמור את הפרוטוקול עם שם תיאורי (למשל, "STP_120s").
    12. התחל להקליט וידאו, ואז מיד להתחיל ברכישה/גירוי חשמלי על ידי לחיצה על כפתור העיגול האדום "הקלטה" כדי להקליט נתונים. לחלופין, להגדיר טריגר דיגיטלי כך שתחילת הגירוי תפעיל את הקלטת הווידאו והקליטה החשמלית בו-זמנית.
    13. ב-60 שניות הראשונות של גירוי (PPF), תגובת הזרם הנמדדת בדרך כלל עולה מהפולס הראשון ויכולה להגיע לרמה נראית ב-t = 60 שניות, בעוד שב-60 השניות האחרונות של גירוי (PPD), תגובת הזרם הנמדדת בדרך כלל פוחתת (איור 5). בסיום הפרוטוקול, יש להפסיק את רכישת החשמל ואת הקלטת הווידאו בו-זמנית.
  2. ניסויים חד-ערוציים
    1. בפאנל הקדמי של מגבר ה-patch clamp, הגדר את מתג הפקודה החיצונית לכבוי. הגדר את מתח האחיזה ל-+200 mV. הגדר את מסנן המעבר הנמוך המובנה של המגבר ל-1 קילוהרץ. בתוכנת הרכישה, הגדר את קצב הדגימה ל-10–50 קילוהרץ ובחר מצב הקלטה רציף "ללא רווח".
      הערה: קצבי דגימה גבוהים עשויים להפחית את יחס האות לרעש של הנתונים שנאספו. שימוש בקצבי דגימה גבוהים יותר בעת פתרון מעברי שער מהירים או מצבי ריצוד קצרים הוא חשוב. תוחלת החיים הפתוחה הממוצעת של גרמיצידין A היא בדרך כלל בטווח של 0.1 שניות עד 10 שניות, בעוד שמצבי ריצוד עשויים להתרחש בתת-מ-ms ו-μs; לכן, ייתכן שיהיה צורך בדגימה של ~50 קילוהרץ כדי ללכוד אירועיםכאלה 36. ניתוח אידיאליזציה חד-ערוצי-מאוחר יותר עם JSMURF מאפשר זיהוי אירועים עמיד בין הקלטות עם יחס אות לרעש משתנה37.
    2. ללא פקודה חיצונית, התחל להקליט את אות הזרם הבסיסי. על המגבר, החלף את פקודת המתח מ-OFF ל-"+" כדי להפעיל מתח DC של +200 mV על פני ה-DIB.
    3. שיא ל-~15 שניות ללכידת אירועים חד-ערוציים תוך הגבלת סטיית קו הבסיס. בריכוז המולר של ליפיד:gA של 1:5×10-6, הזרם המתועד נראה מדרג עקב היווצרות וביטול אירועי שער מוליכת ערוצים.
    4. לפני שמפסיקים את ההקלטה, החליפו את פקודת המתח מ-"+" חזרה ל-OFF. עצור את איסוף הנתונים ושמור את ההקלטה עם שם קובץ תיאורי (למשל, "DIB_C16_postPPF_200mV.abf").
      הערה: הקלטות בערוץ יחיד עם משך מוגדר יכולות להתבצע גם באמצעות גירוי אפיזודי מתוכנת, עם אמפליטודה ומשך קבוע כפי שמתואר בסעיף 8 עבור PPF/PPD. לניסויים חד-ערוציים "פוסט-PPF", גירוי אפיזודי עם מתח DC של +200 mV מחובר מיד לאחר 60 שניות של PPF.

9. שטח הממברנה ואקסטרפולציה של שטף

  1. בסיום כל ניסוי אנסמבל (STP, LTP/LTD), הזזים לאט אלקטרודה אחת לרוחב עם המיקרומניפולטורים כדי לנתק את ה-DIB.
  2. שחרר את מחזיק האלקטרודות של המיקרומניפולטור וסובב את האלקטרודה במחזיק שלו בזווית ~45° כך שחוט הכסף בקוטר 125 מיקרון יהיה במישור ההדמיה.
  3. כוון את גובה האלקטרודה עד שהחוט יהיה בפוקוס חד תחת המיקרוסקופ. צלם תמונה סטילס או צילום מסך של חוט הכסף הממוקד באמצעות תוכנת המצלמה. שמור את תמונת הקנה מידה לכיול מאוחר יותר של גודל הפיקסל למילימטרים.
  4. עבדו את עקבות הזרם המתועדים לפי הנהלים המפורטים בהפניה 28 כדי לקבל נתוני זרם לעומת זמן רציפים וללא ארטיפקטים (איור 6A).
  5. קבעו את מיפוי הפריים לזמן על ידי חלוקת אינדקסי המסגרת בקצב הפריימים הנמדד והתאמת חותמות זמן הרכישה.
  6. ייבא את מסגרות התמונה והניסוי של כיול בקנה מידה לתוכנת ניתוח תמונה.
  7. השתמשו בקוטר החוט הידוע (125 מיקרון) מתמונת הכיול בקנה המידה כדי להגדיר את הסקאלה המרחבית באמצעות פונקציית הכיול התוכנתית (ניתוח > הגדרת קנה מידה).
  8. לחישובי שטף לכל ניסוי, בחרו N נקודות זמן המשתרעות על פני תקופת הגירוי הכוללת (למשל, 30 נקודות זמן בניסוי של 120 שניות). ודא שנקודת הזמן הראשונה מתאימה לפולס הגירוי הראשון.
  9. בכל נקודת זמן, מדדו את קוטר ה-DIB על ידי ציור קו על פני הצומת של קצוות הדו-שכבתי ורישום אורכו ביחידות מכוילות.
  10. המרו כל קוטר שנמדד לשטח ממברנה (A), בהנחה של גאומטריה מעגלית או באמצעות מקדם האליפסה הגיאומטרי המתאים לתצורת שמן השומנים הספציפית. השתמשו באזורים המתקבלים כדי להעריך את התפתחות שטח הממברנה לאורך זמן עבור תנאי ניסוי שונים (איור 6B).
  11. לכל נקודת זמן, חלקו את ערך הזרם המתאים בשטח לקבלת שטף (I/A). חלק את כל נקודות נתוני N שטף בערך השטף הראשון כדי לקבל זרם מנורמל לפולס הראשון, (I/A) / (I0/A0), כאשר נדרש ניתוח זרם מנורמל (איור 6C).
  12. פלקס גרף או זרם מנורמל מול זמן או מספר פולס מול זמן. ניתוח שטף חוזר לכל ניסויי האנסמבל (STP, LTP/LTD) (איור 6D).
  13. פרש עליות מתמשכות של שטף או זרם מנורמל ביחס לפולס הראשון במהלך דיכאון אחרי לידה או מעבר ל-2 דקות כהולכה משופרת, בעוד שחזרות לקו הבסיס או ירידות מתחת לערך הפולס הראשון מצביעות על הולכה מדוכאת. השתמשו בלוחות הזמנים המתקבלים כדי לסווג תגובות כהתנהגות דמוית פלסטיות קצרה טווח (<2 דקות) או התנהגות דמוית חיזוק / דיכאון לטווח ארוך (>~5 דקות).

10. ניתוח חד-ערוץ

  1. ייבא הקלטות חד-ערוציות גולמיות לסביבת ניתוח מועדפת או לממשק clampSeg והפנהל-37 לתיאורים והסברים מלאים של פונקציות התוכנה.
  2. הפעילו מסנן דיגיטלי מעבר נמוך התואם למסנן רכישה ניסיוני (למשל, 1 קילוהרץ בסל).
  3. תצורת פרמטרים.
    1. הגדרה אלפא (α) = 0.05, מגדירה את רמת הביטחון הסטטיסטית כך שלכל שלב שזוהה יש הסתברות של <5% להיות תנודות רעש אקראיות.
    2. יש לציין 5,000-10,000 איטרציות מונטה קרלו לכל מקטע של שנייה כדי להעריך את התפלגות הרעש ולהגביר את החוסן הסטטיסטי של זיהוי אירועים.
      הערה: השתמש בעיבוד חישובי מקבילי ב-1 שנייה "חתיכות" אם יש זמין, כדי לקצר את זמן הניתוח.
    3. הרץ את אלגוריתם JSMURF על מסלול הזרם המסונן.
  4. אימות מודלים.
    1. שכבו את מסלול ההולכה האידיאלי (גל מרובע) על מסלול הזרם המסונן ומאשרים ויזואלית שמעברי השלבים חופפים לשינויים פתאומיים באות הניסוי.
    2. השתמש במאפייני המסנן הנמוך הידועים כדי ליצור שחזור קונבובלי של המסלול האידיאלי ולשכב אותו על המסלול הגולמי37. וודא שהאות המשוחזר תואם במדויק את מעטפת התזמון והמשרעת של הזרם המוקלט.
  5. כימות של מוליכות ואורך חיים.
    1. הגדר את הרמה היציבה הנמוכה ביותר במסלול האידיאלי כמצב קו הבסיס הסגור. זהה את אמפליטודת הרמה הלא-אפסית הראשונה כמוליכות ראשונית במצב פתוח (רמת ערוץ יחיד).
    2. סווג כפולות שלמות גבוהות של משרעת זו כמצבים פתוחים מרובי ערוצים (2+, 3+ וכו'). זהה רמות ביניים שהן יציבות אך נמוכות יותר מרמות פתוחות מלאות כמצבי תת-מוליכה.
    3. להוציא את המשרעת והמשך של כל אירוע מהעקבות האידיאליות ולשים אותם ליצירת היסטוגרמות משרעת מוליכות והיסטוגרמות לכל החיים.
  6. היסטוגרמות משרעת והתפלגויות חיים
    1. השווה את ההיסטוגרמות האידיאליות של מוליכות-משרעת עם היסטוגרמות משרעת שנוצרות ישירות מהנתונים המסוננים. אשר שההיסטוגרמות האידיאליות מציגות שיאים חדים ומופרדים טוב יותר התואמים למצבי הולכה דיסקרטית37.
    2. לכל תנאי ניסוי, מחשבים את פונקציית ההישרדות N(t)/N(0), כאשר N(0) הוא סך כל אירועי הפתיחה (מלא ותת-מוליכות) ו-N(t) הוא מספר האירועים עם משך ארוך מ-t. החריגו מרווחי מצב סגור מניתוח זה.
    3. גרף N(t)/N(0) לעומת פונקציות דעיכה אקספוננציאלית בזמן והתאמה באמצעות שגרת ריבועים פחות לא ליניארית בתוכנה מועדפת.
    4. פרש הזזות ימינה בשיאי התפלגות המוליכות בהיסטוגרמות אמפליטודה כמוליכות מוגברת, קבועי זמן דעיכה ארוכים יותר בגרפים של N(t)/N(0) לעומת זמן כיציבות מצב פתוח מוגברת, והתפלגויות שמאלה כחיי ערוץ קצרים יותר.
      הערה: מזער הפרעות סביבתיות כמו זרמי אוויר, רטט וחפצים נעים בקרבת מקום. הימנעו מלהישען על שולחן האופטיקה והרחקו את השיחות מהמערכת הניסיונית. שמרו על טלפונים ניידים, טאבלטים, מחשבים ניידים ומכשירים אלקטרוניים אישיים אחרים במרחק של לפחות 1.5 מטר מהכלוב פאראדיי כדי להפחית הפרעות אלקטרומגנטיות. השתמש במיכל שמן שקוף אופטית ואופטימיזציה של תאורה וקונטרסט מיקרוסקופ כדי לחדד את קצוות הטיפות והשכבות הדו-צדדיות. רכוש ו/או ייצא סרטונים בגווני אפור אם זה משפר את ניגודיות הגבול ומפשט מדידות ידניות של קוטר DIB. לניסויים שאינם חוקרים השפעות טמפרטורה, יש לוודא שסביבת המעבדה, מעמד המיקרוסקופ והשמן נשמרים על טמפרטורה של 21–22 מעלות צלזיוס.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגדרת ניסוי DIB
מערכת ההקלטה ממוקמת בתוך כלוב פאראדיי על שולחן נגד רעידות, כאשר נתוני חשמל ווידאו נאספים על ידי שני מחשבים נפרדים (איור 1A), אם כי ניתן להשתמש במחשב יחיד עם יכולת מסך מפוצל. סביבת הדגימה של DIB מורכבת משני אלקטרודות מצופות אגרוז הטבועות בנפח מוגדר של שמן אלקן (איור 1B). איור 1C מציג סכמטיקה של החיבורים החשמליים והאופטיים החיוניים למערכת הניסוי המתוארת בכתב יד זה.

figure-results-1
איור 1: הגדרת ניסוי. (א) שולחן נגד רטט ומארז כלוב פאראדיי עם רכיבים עיקריים שצוינו, כולל מגבר, דיגיטייזר, מסנן רעש, מחוללי פונקציות וממשק כפול לרכישת חשמל ווידאו. (B) מבט קדמי עליון של סביבת הדגימה והאלקטרודות של DIB. (ג) סכמטיקה של חיבורים חשמליים ואופטיים הקשורים למבנה הניסויי המתוארת בכתב יד זה. כל הרכיבים הבודדים חולקים קרקע משותפת במבנה המעבדה. כל הניסויים בוצעו בטמפרטורת החדר (21–22 מעלות צלזיוס). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הכנה ובקרת איכות של אלקטרודות Ag/AgCl
המסת קצה החוט הכסוף יוצרת כדור כדורי (איור 2A); מותכים באיכות ירודה נראים מוארכים או לא סדירים. כלורין באקונומיקה יוצר משטח Ag/AgCl חום-אפור עמום (איור 2B). שכבת אגרוז דקה ואחידה בעובי של עשרות מיקרומטרים על הכדור חיונית לתמיכה יציבה בטיפות ולקישור אלקטרוכימי בהתנגדות נמוכה, בעוד שציפוי לא אחיד מוביל לחיבור טיפות לקוי (איור 2C).

figure-results-2
איור 2: הכנת אלקטרודות. (א) תמונות מיקרוסקופ של התכות אלקטרודות באיכות טובה וירודה. (ב) השוואה בין ראשי אלקטרודות לא כלוריים לראשי אלקטרודות כלור. (ג) דוגמאות לציפויי אגרוז באיכות טובה או ירודה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: הגדרת האלקטרודות. (א) מבט עליון על יישור זווית האלקטרודות המותקנת. (ב) מבט צד על השוואת טיפות שאינן שוקעות מיד לאחר טעינת LUV לטיפות שוקעות לאחר היווצרות שכבה מונו-שכבתית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מיקום האלקטרודות והתנהגות שקיעת טיפות
תצוגות מלמעלה למטה מציגות מיקום זוויתי נכון של האלקטרודות כדי למזער עיוות אופטי (איור 3A). תצוגות צד משווות בין טיפות לא שקועות (מיד לאחר טעינת תמיסת LUV) לטיפות שוקעות בציפוי שומן (לאחר 5 דקות) (איור 3B). טיפות שוקעות ששימשו ליצירת DIB מראות תגובה פיזית מאוחרת לתנועה עקב ירידה משמעותית במתח הפנים של שכבות המונופידים, מה שמאשר חזותית את היווצרות טיפה מימית תלויה מצופה במלואה בשכבת שומנים מונופידית. לאחר שהשקיעה מתבססת, נעשה שימוש בגירוי גלי משולש כדי לספק אישור חשמלי להיווצרות ויציבות בשכבה הדו-שכבתית35.

figure-results-4
איור 4: יצירת דו-שכבתיות בממשק טיפות. (א) רצף טיים-לאפס המראה היווצרות והתרחבות שכבות דו-שכבתיות לאחר מגע עם הטיפות. (B) השתקפות פנימית של ממברנה המשמשת להערכת קוטר ושטח של השכבה הדו-שכבתית. הדמיית DIB מתבצעת מתחת למערכת באמצעות מיקרוסקופ הפוך. פס קנה מידה = 50 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

היווצרות DIB ומדידת שטח
תמונות עוקבות לוכדות "זיפינג" דו-שכבתי ספונטנית והתרחבות שטח כאשר שתי טיפות שוקעות נוגעות זו בזו (איור 4A). ההשתקפויות הפנימיות הבהירות בצורת אליפסה במגע הטיפה משמשות להערכת קוטר השכבה הכפולה ובהרחבה של שטח הממברנה לאורך זמן (איור 4B).

figure-results-5
איור 5: פרוטוקול STP — גירוי ותגובה. תגובות זרם מייצגות במהלך הקלה על פולסים זוגיים (PPF, 0–60 שניות, אדום) ודיכוי דופק זוגי (PPD, 60–120 שניות, כחול) מוצגות (למעלה), יחד עם פרוטוקול הגירוי המתאים (למטה). פולסי PPF ו-PPD הם באורך של 100 מילישניות עם זמני כיבוי של 10 מילישניות ו-250 מילישניות, בהתאמה, ומניבים מחזורי עבודה של 90.9% ו-28.6%. הקלה מתייחסת לעלייה נטו בזרם היוני; דיכאון מתייחס לירידה נטו. התגובות הנוכחיות נרשמות רק בתקופות ON; לצורך ויזואליזציה, הנתונים בין הפולסים עוברים אינטרפולציה כדי להדגיש מגמות כלליות בזרם. אורכי הזמן הסכמטיים של הפולסים ומספר הפולסים בתוך שלבי PPF ו-PPD אינם מצוירים בקנה מידה ומוצגים לצורכי ויזואליזציה. נתוני תגובה זרם מייצגים משוחזרים מ-Podar PT ואחרים,25 תחת CC BY-NC-ND 4.0. זכויות יוצרים © 2025 המחבר/ים. פורסם על ידי PNAS. סכמטי גירוי שונה עבור כתב היד הנוכחי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

פרוטוקול גירוי חשמלי ליצירת התנהגות דמוית פלסטיות לטווח קצר (דמוית STP)
דפוסי הגירוי המסומנים כאן מייצגים הקלה על פולס זוגי (PPF) ודיכאון (PPD) באנלוגיה למונחי מדעי המוח, בדומה לקונר ונג'ם28,29. הקלה בפולס זוגי (PPF; 0–60 שניות) ודיכוי פולס זוגי (PPD; 60–120 שניות) מסופקות באמצעות פולסים של 100 מילישניות עם זמני כיבוי של 10 מילישניות ו-250 מילישניות, בהתאמה, התואמים למחזורי עבודה של 90.9% ל-PPF ו-28.6% ל-PPD. הפאנל העליון מציג תגובות זרם מייצגות במהלך תקופות ON, בעוד שהפאנל התחתון מציג את דפוס הגירוי.

זרם, שטח וזרם יוני במהלך STP וגירוי ארוך טווח לאחר מכן
הזרם המנורמל (I/I0) עבור דו-שכבתיות DPhPC עם gA בשמנים C16 ו-C12/C16 מוצג במהלך PPF ו-PPD (איור 6A). שטח ממברנה מנורמל (A/A0) הנמדד ב-30 נקודות זמן מגלה התפתחות שטח דומה בשני תנאי הנפט, למרות זרמים שונים (איור 6B). הנתונים עבור זרם ושטח מנורמל מיוצגים כענני SD ±ממוצעים ופסי רוחב, בהתאמה, ב-28 DIBs עצמאיים לכל תנאי נפט. זרם מנורמל, J/J0 = (I/I0)/(A/A0), מפריד בין שינויים בלתי תלויים בשטח במוליכות ומתאים לשינויים בהולכת הממברנה מעבר להתרחבות שטח פשוטה (איור 6C). עם זאת, שינויים אלו עשויים לשקף תרומות הן ממוליכות חד-ערוצית והן ממספר הערוצים הפעילים של מוליכות. גירוי דיכאון לאחר לידה ממושך עד 30 דקות יוצר התנהגות דמוית דיכאון (LTD) לטווח ארוך בממברנות C16 אך שומר על שטף מוגבר התואם להתנהגות דמוית LTP בממברנות C12/C16 (איור 6D). יחד, הנתונים הללו מראים שהרכב הממברנה מווסת שינויים דמויי פלסטיות בזרם היוני הן בטווח זמן קצר והן ארוך.

figure-results-6
איור 6: זרם, שטח וזרם יוני מחושב של DIBs במהלך STP ומעבר ל-LTP/LTD. (A) זרם מנורמל (I/I₀) במהלך PPF (0–60 שניות, רקע לבן) ו-PPD (60–120 שניות, רקע אפור) עבור ממברנות DPhPC עם gA בשמנים C16 (כתום) ו-C12/C16 (כחול), כאשר כל מצב כולל n = 28 DIBs שנוצרו באופן עצמאי. (B) אזורי ממברנה מנורמליים (A/A₀), שנמדדו ב-30 נקודות זמן, המציגים מסלולי שטח דומים למרות תגובות זרם שונות; הנתונים מוצגים כממוצע ± S.D. על פני אותו n = 28 DIBs בלתי תלויים למצב נפט. (C) שטף מנורמל, J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀)), מחושב ממדידות הזרם והשטח המתאימות, ומדגיש שינויים במוליכות מעבר להשפעות שטח. (D) התנהגות ארוכת טווח תחת גירוי PPD ממושך: לאחר 120 שניות STP הראשונות (בצל אפור), DIBs עברו פולסים של 30 דקות לאחר לידה עם ON = 100 מילישניות ו-OFF = 250 מילישניות (אדום/ירוק מוצק) או 30 שניות (כתום/אפור). השטף מתפרק לבסיס או מתחת לקו הבסיס בממברנות C16, מה שמעיד על התנהגות דמוית LTD, אך נשאר גבוה בממברנות C12/C16, מה שמעיד על התנהגות מתמשכת בדומה ל-LTP. אזורים מוצלים מייצגים שגיאה מתפשטת מ-I/I₀ ו-A/A₀. מערכי נתונים PPD מורחבים ב-(D) התקבלו מ-n = 6 DIBs עצמאיים לכל תנאי שמן עבור פרוטוקול 120 שניות, ואחריהם 3 DIBs לכל תנאי PPD מורחב. כל נקודות הנתונים מחוברות רק לצורכי ויזואליזציה. פאנלים A, B ו-D שוכפלו תחת CC BY-NC-ND 4.0. זכויות יוצרים © 2025 המחבר/ים. פורסם על ידי PNAS. פאנל C נוצר לאחרונה עבור כתב היד הנוכחי מתוך נתונים שדווחו ב-Podar PT ואחרים,25. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מייצגת 15 שניות עקבות זרם חד-ערוצי מ-DIB עם gA, שנוצרה בשמן C16 לאחר גירוי PPF
המעקב כולל את האות הגולמי שנקלט בתדר 50 קילוהרץ עם מסנן מעבר נמוך של 1 קילוהרץ, מסלול מסונן בסל 8 קוטבים בתדר 250 הרץ, ואת ההתאמה האידיאלית של JSMURF. הרמה היציבה הנמוכה ביותר מגדירה את המצב הסגור, ורמות גבוהות יותר מתאימות לאירועים חד-ערוציים, מרובי ערוצים ותת-מוליכות. עקבות אלו מהווים בסיס לניתוח משרעת מוליכה וניתוח חיים לאורך זמן. דוגמת זמן השהייה במצב הולכה המוצגת מייצגת את משך רמת הולכות מסוימת, שהמשרעת והמשך שלה משקפים את התרומה המשולבת של אירועים מלאים ו/או תת-מוליכים בו-זמנית.

משרעת מוליכות והתפלגויות חיים
היסטוגרמות משרעת מוליכות עבור ממברנות C16 ו-C12/C16 (איור 7A–B) משוות בין תנאים לפני PPF ואחרי PPF ביחס מולרי DPhPC:gA של 1:5×10-6. קירובים גאוסיאניים מתחת לנתונים מצביעים על הזזות בשיאי ההולכה הממוצעים לאחר PPF ומסבירים שיאים נפרדים התואמים לתת-מוליכות ולמצבים מרובי ערוצים. השוואות סטטיסטיות של התפלגויות מוליכות בוצעו על נתונים מאוגדים ברמת האירועים באמצעות מבחן t של וולש ומבחן Mann-Whitney U (α = 0.05), כאשר כל תנאי כלל 3 הקלטות DIB עצמאיות ו-N עבור מצב מוליכות נתון מציין את סך כל האירועים שזוהו בין ההקלטות. התפלגויות הסתברותיות לאורך החיים, N(t)/N(0), לפני ואחרי (איור 7C–D) מראות שממברנות C12/C16 מפתחות התפלגויות הולכה עם זנב ארוך יותר ושינויים באורך חיים ביחס ל-C16, מה שמעיד על שינויים ביציבות הערוץ. נתוני ההיסטוגרמה מייצגים את העקבות המסוננות של 15 שניות (עקבות אדום) שנרכשו עבור כל תנאי. התפלגויות חיים במצב מוליכות נוצרו מ-3 הקלטות DIB עצמאיות לכל תנאי; עקומות מנוקדות מסמנות שכפולים בודדים, ועקומות מוצקות מציינות התאמות מעריכיות גלובליות ל-N(t) / N(0) לעומת t.

figure-results-7
איור 7: היסטוגרמות משרעת מוליכות והתפלגויות זמן שהייה במצב מוליכות. היסטוגרמות משרעת מוליכות לפעילות gA בממברנות (A) C16 ו-(B) C12/C16 משוות בין תנאים לפני PPF (אפור) ואחרי PPF (כתום/כחול) ביחס מולרי של 5 × 10-6 gA:ליפיד. קירובים גאוסיים מתחת להיסטוגרמות מצביעים על שינויים בשיאי ההולכה הממוצעת ובסטיות תקן למצבים חד-ערוציים ורב-ערוציים. היסטים בהולכות הממוצעת לאחר PPF מסומנים על ידי קווים מקווקו (שחור = לפני PPF; כחול/כתום = אחרי PPF) וחצים. כל תנאי מייצג 3 הקלטות DIB עצמאיות. השוואות סטטיסטיות של התפלגויות מוליכות בוצעו על נתוני אירוע מאוחדים באמצעות מבחן t של וולש ומבחן Mann-Whitney U (α = 0.05), כאשר N עבור מצב הולכה נתון מציין את סך כל האירועים שזוהו בשלוש ההקלטות. אירועי תת-מוליכות נכללו גם הם בניתוח, כאשר התפלגויות תת-מוליכות מייצגות צוינו משמאל לשיא הפתוח הראשון לכל מצב ממברנה. התפלגויות הסתברותיות לאורך החיים של אירועי מצב הולכה בממברנות C16 (C) ו-C12/C16 (D) לפני (כתום / כחול) ואחרי גירוי PPF (כתום כהה / כחול כהה) ב-5×10-6 M gA:ליפיד תואמות את ניתוחי ההולכה המוצגים באיור 7A–B. כאן, N(t) מייצג את המספר המצטבר של אירועי מלא ותת-מוליכות עם משך ארוך יותר מהזמן t. קווים מנוקדים מציינים התפלגויות לאורך חיים משכפולים בודדים (n = 3 DIBs עצמאיים לכל תנאי), והשקיעות מוצקות מציגות התאמות מעריכיות גלובליות שבוצעו באמצעות תוכנת התאמת עקומות לא ליניארית. פאנלים A–D שוכפלו מ-Podar PT ואחרים,25 ואוגדו לכתב היד הנוכחי תחת CC BY-NC-ND 4.0. זכויות יוצרים © 2025 המחבר/ים. פורסם על ידי PNAS. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-8
איור 8: חקירת התנהגות חד-ערובית — מעקב תגובה נוכחי ל-DIBs ב-C16 לאחר גירוי PPF. (A) דוגמה למסלול זרם 15 שניות המציג נתונים גולמיים (כחול), מסונן עם מסנן Bessel 8-קוטבי במהירות 250 Hz (אדום), והעקבה האידיאלית (ירוק) המשמשת לזיהוי מצבי מוליכה. הרמה היציבה הנמוכה ביותר מגדירה את מצב ה"סגור" הבסיסי. (B) רמות תת-מוליכות מייצגות שזוהו בין רמות המוליכות המלאה ה-2ל-3, המאומתות על ידי שיאים ביניים מובחנים בהיסטוגרמת המשרעת (ראו איור 7A, כתום). זמני השהייה של מוליכות מופקים ממשך כל רמת הולכה מזוהה (למעט המצב הסגור) כדי ליצור התפלגויות חיים של N(t)/N(0). משוחזר מ-Podar PT ואחרים,25 תחת CC BY-NC-ND 4.0. זכויות יוצרים © 2025 המחבר/ים. פורסם על ידי PNAS. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

לאחר PPF, ממברנות C12/C16 מציגות הזזה בולטת ימינה בהתפלגויות משרעת ההולכה, המצביעה על הולכה חד-ערוצית מוגברת, המלווה בהזזה שמאלה בהתפלגויות החיים במצב ההולכה, בהתאם לזמני פתיחה קצרים יותר. שינויים אלו תואמים לדילול אלקטרומכני של שכבת הבי-שכבה של C12/C16 במהלך PPF, כפי שנתמך במדידות מכניות ישירות ועובי שדווחו בעדכון 25, שמפחיתים את המחסום האנרגטי להעברת יונים דרך gA ומגדיל את קצב התפוקה של היונים בכל פתיחה תוך הפחתת יציבות הערוץ. לעומת זאת, ממברנות C16 מראות שינויים מינימליים באחת מההתפלגות, מה שמדגיש את הגמישות המבנית המוגבלת שלהן. יחד, תוצאות אלו מראות כי פלטפורמת DIB לוכדת גם מתאמים קבוצתיים וגם חד-ערוציים של התאמה אלקטרומכנית לממברנה, כולל שינויים דמויי STP ודומים ל-LTP/LTD בהולכה יונית הנובעים מדינמיקה תלויה בהרכב הממברנה (איור 8).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במונחים מעשיים, שיטה זו מספקת שלוש יכולות ניסוי מרכזיות: שונות נשלטת בהרכב הדו-שכבתי דרך הרכב השומנים ופאזה השמן, ניטור אופטי וחשמלי בו-זמני של מבנה מחדש של ממברנה, וגישה למשטר שטח ממברנה שמגשר בין אלקטרופיזיולוגיה חד-ערוצית למכניקת ממברנות מזוסקאלה 14,15,20,21,25. תכונות אלו הופכות את השיטה לשימושית במיוחד ללימודי מבנה-פונקציה במערכות ממברנה מפושטות שבהן אלקטרומכניקת ממברנה, ולא מורכבות תאית מלאה, היא נקודת המבט הניסיוניתהמעניינת 14,15,20,21,25,39.

פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה והניתוח של DIBs עם גרמיצידין A-dopped בשמנים אלקניים, כדי לבדוק את יכולת ממברנות הליפידים לבנות מחדש תחת גירוי חשמלי פיזיולוגי רלוונטי 14,15,25,35,38. בהשוואה לטכניקות קלאמפפאץ' 21, פלטפורמת DIB בוחנת טלאי ממברנה שהם גדולים פי כמה וסדרי גודל תוך שמירה על רזולוציה מספקת ללכידת אירועי ערוץ יון בדידים 14,15,19,20,21,28,38. יכולת זו חשובה במיוחד לפתרון שיקום אלקטרומכני בקנה מידה בינוני (למשל, כרטבה אלקטרו-ודחיסה חשמלית) ולקישורו להתנהגות ערוצים מיקרוסקופיים שמובילים יחד לפנוטיפים של מוליכות ממברנה דמוית STP-, LTP ו-LTD תחת גירוי פיזיולוגי 13,25,27,38. מערכת DIB הנוכחית אינה מיועדת לשחזר את המורכבות המולקולרית של הסינפסות הביולוגיות 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . בהתאם לכך, מונחים כמו STP, LTP, LTD, PPF ו-PPD משמשים במשמעות תיאורית מבוססת אנלוגיה כדי לציין עליות וירידה בטווח זמן קצר וארוך בהולכה יונית בממברנה תחת פרוטוקולי גירוי מוגדרים. הממצאים הראשוניים של עבודה זו מפורשים באופן ישיר ביותר במונחים של אלקטרומכניקה של ממברנה, התאמת מוליכות ומבנה מחדש של אי-שיווי משקל תלוי בהרכב ב-DIBs, מה שעשוי להציע אנלוגיות מושגיות ופרספקטיבות פיזיקליות מועילות על פלסטיות סינפטית מבלי לרמוז על שקילות מכנית למעגלים עצביים או ויסות סינפטי ביוכימי 10,11,25,38.

מספר שלבים טכניים הם קריטיים להשגת תוצאות שניתן לשחזר. הכנה קפדנית של אלקטרודת Ag/AgCl, כולל התכה אחידה של קצה הכסף, כלור יסודי ושכבת אגרוז דקה ואחידה, מבטיחה חיבור יציב של טיפות וקישור אלקטרוכימי בהתנגדות נמוכה20,35. אישור חזותי של שקיעת טיפות וכיוון נכון של האלקטרודות ממזער עיוות אופטי במהלך צילום וידאו ומשפר את דיוק מדידות שטח הממברנה. כיול בקנה מידה לאחר רכישה באמצעות קוטר חוט כסף ידוע מספק המרה חזקה מפיקסל למ"מ, החיוני לחישוב אמין של שטח הממברנה ושטף היונים. בעבודה זו, מוליכות הממברנה (פלוקס) מוגדרת כזרם ליחידת שטח (I/A), ומכיוון ששטח DIB משתנה במהלך הרטבה חשמלית, כימות שטף מדויק דורש מדידות זרם ושטח דו-שכבתיות מותאמות זמן 13,25,27,35.

גישה זו תומכת גם בקריאות משלימות ברמת אנסמבל ובערוץ יחיד באותה פלטפורמה 14,15,20,25,35,38. ברמת האנסמבל, הקלטות וידאו וחשמל מסונכרנות מודדות שינויים דינמיים בשטח (הרטבה חשמלית) ובזרם, מהם נגזר זרם יוני (זרם/שטח). בגירוי חשמלי, הממברנות נדחפות למצבים יציבים לא שווי משקל (NESS) שבהם מבנה מחדש של ממברנה תלוי בהרכב יוצר תגובות דמויות-פלסטיות בקנה מידה קצר שיכולות להתפתח להתנהגות דמוית חיזוק או דמוית דיכאון בקנה מידה ארוך לאורך תקופות ממושכות (מינימומים)25,26,28,29,30,31,32,33, 38. ברמת הערוץ היחיד, ניתוח כולל אידיאליזציה של עקבות זרם לרמות הולכה מדורגות (מצבים סגורים, חד-ערוציים, רב-ערוציים ותת-מוליכות). כלי אידיאליזציה מסורתיים של גל ריבועי בדרך כלל פותרים רק מספר מוגבל של רמות בדידות; לנתונים מורכבים או רועשים יותר, שיטות אידיאליזציה ללא מודל כמו JSMURF מועדפות37. פוטנציאלי החזקת DC קצרים שנותחו עם JSMURF מספקים זיהוי אירועים סטטיסטי קפדני תחת רעש הטרוגני, ומניבים היסטוגרמות מוליכות-משרעת (רמות שלמות ותת-מוליכות) והתפלגויות חיים של N(t)/N(0). היסטוגרמות משרעת אידיאליות ומסוננות מאפשרות אימות חזותי וכמותי של הקצאות מצבי מוליכה, בעוד ששחזורים קונבולביים (עקבות אידיאליות שעברו דרך מסנן מעבר נמוך ידוע) מאשרים בחירת פרמטרים ונאמנות אירועים37.

הרכב הממברנה, המכוון כאן דרך שלב השמן הסובב (למשל, C16 לעומת C12/C16), צפוי לווסת את הצמיגות ויכולת המבנה מחדש של הדו-שכבתיות תחת גירוי חשמלי, בהתאם למדידות ישירות שדווחו בעבודות קודמות 22,25,39. ממברנות תואמות יותר צפויות להראות דילול גדול יותר מונע EC ושיפור בהתאמה הידרופובית ל-gA במהלך PPF 22,23,25, מה שיוביל להולכת ערוץ יחיד מוגבר ולהקלה שיכולה להתייצב כהתנהגות דמוית LTP 25,38. לעומת זאת, ממברנות קשיחות יותר מציגות תגובתיות מבנית מוגבלת, שינויים קטנים יותר במוליכות במהלך PPF ו-PPD, ונטייה ל-LTD בפולסים ממושכים. תוצאות אלו התלויות בהרכב מדגישות כיצד תכונות החומר נוטות את הממברנות למשטרים ארוכי טווח מובחנים ורלוונטיים פונקציונלית 22,23,25,39.

לפלטפורמת DIB יש גם מגבלות חשובות21. הפרשנות המכאנית שמקודמת כאן היא שהבדלים בהרכב השמן משנים את תכונות החומר הדו-שכבתי ואת הרגישות למבנה אלקטרומכני, אשר בתורו מווסת את הולכת גרמיצידין A 22,23,25. פרשנות זו נתמכת במחקר הקודם, שמדד ישירות את צמיגות הממברנה, מתח בין-פנים, וכן שינויים דינמיים בעובי הממברנה בתנאי ממברנה אלו ובגירוי22. עם זאת, בעבודה הנוכחית, תכונות החומר הללו לא נמדדו בו-זמנית בכל ניסוי ולכן משמשות כאן לתמיכה בתגובות המבניות והמכניות השונות לגירוי חשמלי של ממברנות בסביבות C16 ו-C12/C16, במקום לקבוע באופן עצמאי את הפרשנות המכאנית של הנתונים. בנוסף, זרם האנסמבל והשטף עשויים לשקף הן שינויים בהולכת הערוץ היחיד והן שינויים במספר הערוצים המוליך, אשר עשויים להשתנות עם שטח הממברנה, דיפוזיית פפטידים ודימריזציה בתנאים לא שווי משקל 17,18,22,23. שלב השמן הסובב עשוי גם לחדור או לסגת דינמית מהליבה הדו-שכבתית במהלך הגירוי, מה שתורם לסטייה בסיסית בהקלטות חד-ערוציות ולשינויים הדרגתיים בהרכב הממברנה לאורך זמן 13,21,25. יחד, גורמים אלו מגבילים את השימוש בהקלטות מתח קבוע ארוכות טווח להגדרת תכונות ממברנה סטטית ומדגישים כי DIBs מתנהגים כמערכות פתוחות ודינמיות ולא כממברנות שיווי משקל סגורות 13,21,25. לכן, בעוד שהפרוטוקול הנוכחי מתעד שינויים תלויים בגירוי, דמויי פלסטיות, בהולכה לאורך טווחי הזמן הניסיוניים המיועדים25,38, יידרשו מחקרים עתידיים שישלבו מדידות מכניות ישירות עם הקלטות חשמליות ואופטיות בו-זמנית, ייתכן לצד דימות מולקולה בודדת מבוססת פלואורסצנציה, כדי לפתור באופן מלא יותר את התרומה של מבנה מחדש של ממברנה, הולכת תעלה ואוכלוסיית התעלות21, 25.

מצבי כשל נפוצים כוללים חיבור טיפות לא יציב, שקיעת טיפות לא שלמות, התלכדות מוקדמת של טיפות במהלך היווצרות שכבות כפולות, והגדרה אופטית לקויה של קצה הדו-שכבה במהלך ניתוח השטח. היצמדות טיפות לא יציבה נגרמת לעיתים קרובות מגאומטריית כדור כסף לא סדירה או ציפוי אגרוז לא אחיד, וניתן להפחית אותה על ידי אימות סימטריית כדורים ושמירה על מעטפת אגרוז חלקה. טעינת אלקטרודות דורשת גם הפקדה ידנית של טיפות מימיות בגודל ננוליטר על ראש אלקטרודה תת-מילימטרית, מה שדורש תיאום עין-יד משמעותי ותפיסת עומק בין מדיומים עם מדדי שבירה שונים (אוויר מול שמן). כתוצאה מכך, קצה הפיפטה עלול לגעת בטעות בקליפת האגרוז או לפספס את ראש האלקטרודה במהלך הזריקה. טכניקות לשיפור יציבות כמו חיזוק שורש כף היד, התקדמות איטית של פיפטות בשמן, והחזקת נשימה, יחד עם תרגול חוזר, יכולות לשפר את רמת הטעינה. יתרה מזאת, שקיעה לא שלמה או התעכבות ביצירת שכבה מונו-שכבתית יכולים להיגרם מהטרוגניות של וזיקולות, שינויים בטמפרטורה או טופוגרפיית אגרוזה, וניתן לשפר זאת על ידי הארכת זמן ההמתנה לאחר שקיעת הטיפותב-15,20,35. התאחדות במהלך היווצרות שכבות דו-שכבתיות קשורה לעיתים קרובות לשטח מגע מופרז או גירוי חשמלי אגרסיבי מדי (> ± 200 mV) וניתן למתן אותה באמצעות שטחי מגע קטנים יותר של טיפות ראשוניות, המאפשרים זמן נוסף לייצוב שכבה אחת, ואימות תגובת הקיבול בגלי משולש בעוצמה נמוכה לפני הפולס 25,35,38.

למרות מגבלות אלו, פלטפורמת ה-DIB היא מאוד ניתנת לכיוונון, להרחבה ולשחזור 14,15,20,21,25,35,38,40, והיא משלמת את האלקטרופיזיולוגיה הממוקדת חלבונים על ידי בידוד תרומת מכניקת השומנים להולכה 22,23,25 . על ידי איחוד מדידות אנסמבל וערוץ יחיד במערכת אחת, פרוטוקול זה מספק דרך מעשית לניתוח כיצד עבודה חשמלית וגמישות ממברנה משתלבות ליצירת התנהגות מוליכה דמוית סינפטית (תגובות דמוית STP, LTP ו-LTD) במודל מלמטה למעלה נשלט 25,29,30,31,32,33,38. בהתאם לכך, המתודולוגיה מציעה בסיס לחקירה שיטתית של כללי למידה תלויים בהרכבים בממברנות ולכימות כיצד כוחות מכניים וחשמליים מחברים חלבוני ממברנה לדו-שכבת המארחת שלהם בסולמות זמניים ומרחביים 21,22,23,25. ביחד, יכולות אלו מציבות את ה-DIBs כמסגרת עוצמתית לפירוק התנהגויות נוירוביולוגיות מורכבות למנגנונים ביופיזיקליים ניתנים לבדיקה 10,11,25,38.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לכל המחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.P.C. וג'יי.קיי. נתמכים על ידי מחלקת מתקני המשתמשים המדעיים של משרד האנרגיה (DOE), בחסות תוכנית מדעי האנרגיה הבסיסית (BES), משרד המדע של משרד האנרגיה, תחת חוזה מס' DE-AC05-00OR22725. D.B. נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע, מחלקת הביולוגיה המולקולרית והתאית (MCB), תחת חוזה מס' 2219289. המחקר מומן בחלקו באמצעות פרס Nonquilibrium and Emergent Transients in Advanced and Soft Materials (NEAT), בחסות תוכנית המחקר והפיתוח המונחית על ידי מעבדת אוק רידג', המנוהלת על ידי UT-Battelle, LLC עבור משרד האנרגיה האמריקאי. P.T.P. ו-C.M. זכו לתמיכה דרך תוכנית ההתמחות של DOE Omni Technology Alliance ותוכנית שיתוף הפעולה החינוכי ב-ORNL (ECO). P.T.P. ו-V.S. נתמכו על ידי תוכנית ההתמחות לסטודנטים למחקר (RSI) של מעבדת אוק רידג' הלאומית (ORNL). P.T.P., O.Z. ו-Z.G. קיבלו תמיכה דרך תוכנית ההתמחות במעבדות לתואר ראשון במדעים (SULI) של משרד האנרגיה האמריקאי. A.A. ו-J.H.M. נתמכו על ידי מלגת חינוך מתקדם לסטודנטים ממיעוטים (GEM). איסוף וניתוח נתונים בוצעו במרכז שול-וולן ובמרכז למדעי חומרים ננו-פאזיים, שהוא מתקן משתמשי משרד הידע של משרד האנרגיה האמריקאי.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-דיפיטנוי-sn-גליצרו-3-פוספוכולין (DPhPC)ליפידים פולריים של Avanti850356P/850356Cנרכש כאבקה ליופילית (P) או בכלורופורם (C) 
Agarose סיגמא-אלדריץ'A9539
אגרוס (טבליות אגרוז 0.5 גרם)ציון דרךA2501אתה יכול להשתמש בצורת אבקה או בטבליות 
Agilent Technologies 33522A מחולל גל Keysight–אפשר להשתמש בכל מחולל גל עם יציאות כבל BNC
גז ארגון (Ar)איירגזAR UHP300; 72-402221259-1ארגון דחוס; טוהר אולטרה גבוה
איזון אנליטי  מטלר טולדודגם: MS304S/03כל איזון אנליטי ברמת מעבדה עם דיוק של 0.0001 גרם
מגבר Axopatch 200B  מכשירים מולקולריים–
BK Precision 4017B 10 MHz DDs מחולל סריקה/פונקציותדיגי-קיBK4017B-ND
נימי זכוכית בורוסיליקטוורלד פרסיז'ן אינסטרומנטס1B100F-4
חבילת התוכנה Clampex pCLAMP 11מכשירים מולקולריים–
מערכת DigiData 1550Bמכשירים מולקולריים–זה כולל מיני-אקסטרודר, 2 מזרקים, ממברנות 100 PC, 100 תומכי פילטר, ובלוק אחד/מחזיק חימום
דודקן, 99%סיגמא-אלדריץ'112-40-3
סט אקסטרודר עם מחזיק/בלוק חימום  ליפידים פולריים של Avanti610000
תוכנת פיג'יImageJ–
מקפיא (-80 & דרג; C)פישר סיינטיפיקאיזוטמפ; דגם: 8964; הודעה אישית: 828278-21
כלי זכוכיתVWR אינטרנשיונל–
גרמיצידין-אמיליפור סיגמא368020
הקסדקן, 99%סיגמא-אלדריץ'544-76-3
Hum Bug Noise Eliminator (60Hz)מערכות A-M726300
מערכת מיקרוסקופ הפוך (Nikon Ti2-A)ניקון–ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ הפוך או זקוף
אלכוהול איזופרופילVWR אינטרנשיונלBDH1133-4LP
מחזיק מיקרואלקטרודות וורלד פרסיז'ן אינסטרומנטסMEH1S
מיקרומניפולטורים  סאטר אינסטרומנטMP-285ניתן להשתמש במניפולטורים ידניים
מצלמת מיקרוסקופאולימפוסDP74
מיקרוסופט אקסלמיקרוסופט–
MOPSסיגמא-אלדריץ'M1254
תוכנת מצלמות מיקרוסקופ NIS-Elementsניקון–ניתן להשתמש בתוכנות לכידת מצלמה עם יכולת צפייה חיה ו/או וידאו. ניתן להשתמש בצפייה חיה ובהקלטת מסך סימולטנית כתחליף לצילום וידאו. 
Parafilm M סרט מעבדה רב-תכליתיפאראפילםPM999
פטרי דיש--הצלחת חייבת להיות שקופה בתחתית ורצוי גם בדופן הצדדית
כלוריד אשלגן (KCl)סיגמא-אלדריץ'P3911
כפפות בדיקת ניטריל רכות ללא אבקה  VWR אינטרנשיונלCA89-38-272
Refrigirator (4 & deg; C)פישר סיינטיפיקמס' קאט: 97-938-1; מספר דגם: 3556FS
חוט כסףגודפלו147-346-94
ערבוב פלטה חמהתרמו סיינטיפיק SP131325

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Droplet Interface BilayersLipid MembranesMembrane StructureIon ConductanceElectromechanical PropertiesMembrane CompositionPeptide Ion ConductionVoltage Pulse ProtocolsMembrane PlasticitySynaptic Conductive Behavior

Related Articles