מאמר שיטה

בידוד תאים בודדים מעוברים מוקדמים של Xenopus ומיונם לפי גודל

DOI:

10.3791/70630

⸱

20 במרץ 2026

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטה לבידוד תאים בודדים מעוברים מוקדמים של Xenopus laevis ולמיין אותם לפי גודל התא.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העובר המוקדם דורש הפחתה אקספוננציאלית בגודל התא, בעוד שהעובר נשאר קבוע בגודלו בשלבים הראשונים של ההתפתחות. החשיבות התפקודית והמנגנונים שבהם גודל התא משפיע על התפתחות העובר עדיין נחקרים בחסר. העובר המוקדם של Xenopus מספק מערכת ייחודית לטיפול בפערים המרכזיים הללו. בהשוואה לאורגניזמים מודליים אחרים, העובר המוקדם של Xenopus הוא גדול מאוד ומכיל גרדיאנט בגודל תא, מתאים קטנים בקוטב החיה ועד תאים גדולים בקוטב הצומח, לאורך כל העובר בשלבים סביב המעבר באמצע הבלסטולה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להפרדת תאים בודדים מעוברים מוקדמים של Xenopus ומיונם לפי גודל באמצעות מסנני תאים עם גדלי נקבוביות רשת משתנים. כפי שנקבע על ידי מדידות הדמיה וגודל, התאים הממוינים נמצאים בטווח הגודל הצפוי ויכולים לשמש לניתוח תאים חיים או ריצוף, או להיות קבועים להדמיה. מערכת זו תאיר אור חדש על מנגנוני רגולציה תלויי גודל במהלך הפיתוח המוקדם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינוי גודל התא הוא תכונה נפוצה בעוברים מוקדמים, כאשר הביצית המופרית עוברת מספר סבבים של חיתוך, מה שיוצר מספר הולך וגדל של תאים. בעוד שידוע רבות על תפקיד גודל התא כפרמטר מרכזי השולט בתפקודי התא 1,2,3, כיצד גודל התא משפיע על ההתפתחות המוקדמת פחות ידוע. עבודות עדכניות במערכות עובריות שונות מצביעות על כך שגודל התא מווסת את הפעלת הגנום הזיגוטי (ZGA)4 ואת מפרט גורל התא5, התומך בתפקיד חשוב לגודל התא בהחלטות התפתחותיות 6,7.

העובר המוקדם של Xenopus הוא מודל חשוב לחקר קבלת החלטות התפתחותיות המוסדרת על ידי גודל התא. מכיוון שהעובר המוקדם של Xenopus גדול (~1.2 מ"מ בקוטר), קל לשנות את גודלו פיזית, מה שהופך אותו לשימושי להערכת ההשלכות הישירות של שינוי גודל התא. לדוגמה, עוברים קטנים בגדלים שונים יכולים להיווצר על ידי כיווץ עוברים חד-תאיים באמצעות לולאות שיער 4,8, מה שמדגים ZGA4 התלוי במינון. יתרה מזאת, העובר המוקדם של Xenopus מכיל גרדיאנט של גדלי תאים לאורך ציר החיה-צמחי, כאשר התאים הקטנים ביותר בקוטב החי והתאים הגדולים ביותר בקוטב הצמח, מה שמדגים הבדל של מעל פי 100 בנפח4. חשוב לציין, על ידי הדמיה וכימות ישיר של תמלילים מתחילים בתאים בודדים של עוברים שלמים, זיהינו סף בגודל תא שמווסת את ZGA4. יתרה מזאת, בידוד תאים בודדים מעוברים מוקדמים של Xenopus ומיונם לפי גודל אישרו את חשיבות סף גודל התאZGA 4.

כאן אנו מתארים את ההליכים המפורטים לבידוד תאים בודדים מעוברים מוקדמים של Xenopus laevis ומיונם לפי גודל. עוברים מוקדמים של Xenopus יכולים להתפרק לתאים בודדים על ידי דגירתם במדיום חופשי Ca2+, Mg2+ (CMFM)9, ותאים בודדים אלו ניתנים למיון נוסף באמצעות מסנני תאים עם גדלי רשת שונים. התאים הממוינים יכולים להיות מזוהרים ולשימוש ביישומים שונים, כולל ניתוח תאים חיים, ריצוף או בדיקות הדמיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודות בעלי חיים המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת דרום קרוליינה.

1. הכנת תמיסה

הערה: לפני תחילת הפרוטוקול, הכינו את הפתרונות הבאים.

  1. הכן 20× MMR: ערבב 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2, ו-40 mM CaCl2. כוון את ה-pH ל-7.8 עם NaOH. אוטוקלב ואחסן בטמפרטורת החדר.
  2. הכינו את המדיום חסר Ca2+, Mg2+ ללא חומר (CMFM): ערבב 50.3 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 9.2 mM Na2HPO4, 0.9 mM KH2PO4, 2.4 mM NaHCO3, ו-1.0 mM EDTA. אם צריך, כוון את ה-pH ל-7.4. אוטוקלב ואחסן בטמפרטורת החדר.
  3. הכינו ג'ל אגרוז 1.5% בצלחת פטרי 60 מ"מ: הוסיפו 0.75 גרם אגרוז ל-50 מ"ל CMFM. חממו כדי להמיס את האגרוז במיקרוגל. הוסיפו 5-10 מ"ל ג'ל אגרוז כדי לצפות שכבה דקה בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ.
  4. הכינו מדיום גרדיאנט צפיפות של 15% (משקל/נפח)/CMFM: הוסיפו בהדרגה 15 גרם מדיום גרדיאנט צפיפות ל-100 מ"ל CMFM. כדי להקל על המיסה, חממו וערבבו על צלחת עד שהמדיום עם גרדיאנט הצפיפות נמס לחלוטין. שמור על התמיסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד השימוש.
  5. הכינו 4% PFA/1× MEM: ערבבו בקבוקון אחד (10 מ"ל) של 16% מלאי פרפורמלדהיד ו-4 מ"ל של 10× MEM (1000 מ"מ MOPS pH 7.4, 20 mM EGTA, ו-10 mM MgSO4). הוסף מים אולטרה-טהורים ל-40 מ"ל.
    הערה: כדי לקבל עוברים של Xenopus , יש לעקוב אחר פרוטוקול סטנדרטי לביצוע הפריה חוץ-גופית (IVF) (לדוגמה, ראו Sive et al., 2007)10. העובר צריך להיות ב-0.1× MMR מוכן לשימוש.

2. פירוק עוברים מוקדמים לתאים בודדים

  1. הוסיפו ~15 מ"ל של CMFM לצלחת פטרי חדשה בקוטר 60 מ"מ מצופה בג'ל אגרוז 1.5%. השתמשו בפיפטת העברה מפלסטיק כדי להעביר 10-100 עוברים (בהתאם לצרכי הניסוי) אל הצלחת. שים את הצלחת מתחת למיקרוסקופ סטריאו.
  2. השתמשו בפינצטה בשתי הידיים כדי להסיר בזהירות את ממברנת הוויטלין, על ידי תפיסה על פני העוברים עם פינצטה אחת וקילפתה עם השני. הימנעו מפגיעה בעוברים במהלך התהליך.
  3. דגרו את העוברים הדוויטליים ב-CMFM למשך ~1 שעה בטמפרטורת החדר. נערו את הצלחת בעדינות כל 5 דקות כדי להקל על ניתוק התאים. בדקו באופן קבוע עד שלא נראו ערימות של בלסטומרים (איור 1).

3. מיון התאים המנותקים לפי גודל

  1. במהלך דיסוציאציה של הבלסטומר, טבלו את צבעי התאים (40 מיקרון, 70 מיקרון ו-100 מיקרון) בצלחות פטרי נפרדות מלאות ב-CMFM (איור 2). סדר את המנות לפי הסדר משמאל לימין כפי שצוין. כלול גם שני כלים נוספים ממולאים ב-CMFM בין הקבוצות לשטיפה קצרה של צבעי תאים במהלך כל מיון.
  2. סובבו בעדינות את המנה המכילה את הבלסטומרים הבודדים כדי להעשיר אותם במרכז המנה. העבר בזהירות את הבלסטומרים למכשיר הצבעה של 40 מיקרון ב-CMFM.
  3. נער בעדינות את המסננת כמה פעמים כדי לאפשר לבלסטומרים <-40 מיקרון לשקוע דרך המסננת. לאחר מכן העבר במהירות את מסננת ה-40 מיקרון לצלחת המלאה ב-CMFM לכביסה קצרה. העבר בזהירות את הבלסטומרים במסננת 40 מיקרון, שהיא >-40 מיקרון, למסננת 70 מיקרון.
  4. חזור על השלבים עד שהבלסטומרים ממוינים במסננת 100 מיקרון.
  5. סובבו בעדינות כל מנה עם בלסטומרים ממוינים כדי להעשיר אותם במרכז המנה. העבר בזהירות את הבלסטומרים (~4 מ"ל) לחלק העליון של 0.5 מ"ל של מדיום גרדיאנט בצפיפות 15% בצינור מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) (איור 3). הימנע מערבוב.
  6. תן לצינור לעמוד 10 דקות. הבלסטומרים השלמים ישקעו לקרקעית באמצעות כוח הכבידה, ויפרדו מהכדורי החלמון מהבלסטומרים המתפוצצים במהלך המיון וההעברה (איור 3).
  7. בהתאם למטרת הניסויים בהמשך, יש להמשיך בניתוח תאים חיים, להקפיא את הבלסטומרים בחנקן נוזלי לעבודה עם RNA, או לתקן את הבלסטומרים לצביעת חיסון (איור 3).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עוברי Xenopus laevis (n = 50) בשלב 9 הוגברו בתווך CMFM כדי להתנתק לבלסטומרים בודדים בהתאם לפרוטוקול זה (ראו דוגמה באיור 1). הבלסטומרים הבודדים המנותקים ממוינים ברצף באמצעות מסנני תאים בגודל 40 מיקרון, 70 מיקרון ו-100 מיקרון כפי שתואר לעיל. תערובת הבקרה הלא ממוינת והבלסטומרים הבודדים הממוינים היו מקובעים ב-4% פאראפורמלדהיד וצולמו תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 4A). כפי שמוצג באיור 4B,C, בהשווא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גודל התא חשוב מאוד לתפקודי תא3, והשפעתו על התפתחות מוקדמת דורשת בדיקה מעמיקה יותר במערכות עובריות מודליות. כאן תיארנו את הפרטים לבידוד תאים בודדים מעוברים מוקדמים של Xenopus laevis ולמיין התאים לפי גודל באמצעות מסנני תאים, דבר שעשוי להתאים למחקרי גודל תאים. שיטה זו אפשרה לנו לספק ראיות ישירות להפעלת גנים זיגוטיים מווסתים בגודל בתהליך העוברהמוקדם 4.

מספר צעדים מרכזיים הם קריטיים להצלחת הפרוטוקול. מכיוון ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר מצהיר שאין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות למעבדת מתיו גוד באוניברסיטת פנסילבניה על ההכשרה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לבריאות הילד וההתפתחות האנושית ע"ש יוניס קנדי שרייבר (R03HD105802).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
16% פאראפורמלדהיד (PFA)EMS15710-Sליצירת הפתרון הקיבעוני
צלחות פטרי חד-פעמיות בקוטר 60 מ"מVWR25384-092לדגירה של עוברים
מיקרוסקופים סטריאוסקופים זום ACCU-SCOPE 3075VWR470351-130להמחשת עוברים
אגרוזסיגמא-אלדריץ'A-9414לציפוי צלחות פטרי
מסננת תאים, 100 ומיקרו; mVWR76327-102למיון תאים לפי גודל
מסננת תאים, 40 ומיקרו; mVWR76327-098למיון תאים לפי גודל
מסננת תאים, 70 ומיקרו; mVWR76327-100למיון תאים לפי גודל
פיפטות העברה חד-פעמיותVWR414004-035להעברת עוברים
פינצטה דומונט, סגנון 5מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים72701-Dלהסרת ממברנת ויטלין
צלחת פטרי מזכוכית, 60 פעמים; 15 מ"מVWR75845-542לדגירה של עוברים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. Cell biology. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075(2015).
  2. Xie, S., Swaffer, M., Skotheim, J. M. Eukaryotic cell size control and its relation to biosynthesis and senescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 38, 291-319 (2022).
  3. Chadha, Y., Khurana, A., Schmoller, K. M. Eukaryotic cell size regulation and its implications for cellular function and dysfunction. Physiol Rev. 104 (4), 1679-1717 (2024).
  4. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  5. Hubatsch, L., et al. A cell size threshold limits cell polarity and asymmetric division potential. Nat Phys. 15 (10), 1075-1085 (2019).
  6. Fung, H. F., Bergmann, D. C. Function follows form: How cell size is harnessed for developmental decisions. Eur J Cell Biol. 102 (2), 151312(2023).
  7. Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
  8. Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
  9. Venkataraman, T., Dancausse, E., King, M. L. PCR-based cloning and differential screening of RNAs from Xenopus primordial germ cells: Cloning uniquely expressed RNAs from rare cells. Methods Mol Biol. 254, 67-78 (2004).
  10. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים