הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ריצוף רב-לוקוס לטייפון זן של טוקסופלזמה גונדי

265 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70645

⸱

26 במאי 2026

 , 
1Department of Biosciences, Durham University, 2Department of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, New Valley University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי מהיר וגנוטיפ של זני טוקסופלזמה גונדי באמצעות ריצוף ננופורים נייד של סמנים גנטיים נבחרים, המאפשר זיהוי זן ממוקד וניתן להרחבה במבודדים המתוחזקים במעבדה, עם יישום פוטנציאלי בעתיד בסביבות ניטור.

תקציר

טוקסופלזמה גונדי היא טפיל אפיקומפלקסן המפוזר ברחבי העולם, המאופיין בגיוון גנטי משמעותי, המחייב גישות מולקולריות מדויקות להבחנה בין עיוותים. מטרת הפרוטוקול היא להקים תהליך עבודה שניתן לשחזר לגנוטיפינג ממוקד רב-לוקוסי של מבודדי T. gondii מתורבתים. ההליך כולל התפשטות חוץ גופית של זנים מסוג I (RH) וסוג II (ME49), חילוץ DNA גנומי, הגברה ספציפית ללוקוס של הגנים SAG2 ו-SAG3 , וניתוחים מבוססי ריצוף לזיהוי פולימורפיזמים חד-נוקלאוטידיים (SNPs) ואירועי הכנסה/מחיקה (INDEL). נתוני ריצוף מעובדים ליצירת רצפי קונצנזוס בעלי ביטחון גבוה ולביצוע יישור השוואתי לזיהוי פולימורפיזמים ספציפיים לזיונות. יישום זרימת עבודה זו על זנים ארכיטיפיים הראה יעילות מיפוי גבוהה, עומק קריאה עקבי בין לוקוסי היעד, ושחזור מדויק של גדלי אמפליקון צפויים, מה שמאשר זיהוי אמין של שונות גנטית ברמת הלוקוס. למרות שהקצאת גנוטיפ מקיפה דורשת הכללת סמנים סטנדרטיים נוספים, פרוטוקול זה מספק מסגרת ניתנת להרחבה וניתנת לשחזור לאפיון גנטי ממוקד של מבודדי T. gondii המתוחזקים במעבדה, ותומך בניתוח רצף רב-מקומי עקבי.

מבוא

טוקסופלזמה גונדי הוא טפיל אפיקומפלקסני נפוץ ברחבי העולם ואיום זואונוטי משמעותי במזון ובמים, המסוגל להדביק כמעט את כל בעלי החיים בעלי הדם החם, כאשר הפלידסים משמשים כמארחים הסופיים1. זיהום בבני אדם ובבעלי חיים מתרחש לעיתים קרובות באמצעות בליעת ציסטות רקמה או ביציות נבגיות, והיכולת של הטפיל להחליף בין שלבי טכיזואיט וברדיזואיט מאפשרת התמדה ארוכת טווח ברקמות עצביות ושריריות, התורמת הן להעברה בבשר והן לסביבה 2,3.

למרות ששלוש שושלות שיבוטיות (סוגים I, II ו-III) שולטות באירופה ובצפון אמריקה, תועדה גיוון גנטי נרחב, כולל זנים לא טיפוסיים ורקומביננטיים, ברחבי העולם, במיוחד באזורים עם מאגרי חיות בר עשירים4. לכן, הבחנה מדויקת בין זנים חיונית להבהרת דינמיקת ההעברה, חקירת התפרצויות והבנת אפידמיולוגיה אזורית. שיטות גנוטיפינג מסורתיות כגון PCR-RFLP, סייפוג רצפים רב-לוקוסיים מבוסס סנגר (MLST) וניתוח מיקרו-סליטליט תרמו רבות להבנתנו את מבנה אוכלוסיית T. gondii אך מוגבלות ברזולוציה, בקצב התנועה וביכולתם לזהות שונות תוך-גנוטיפית. גישות אלו דורשות לעיתים תגובות נפרדות מרובות ועלולות להיכשל בזיהוי הוספות, מחיקות או הפלוטיפים מורכבים בתוך לוקוסי פולימורפי1. ריצוף הדור הבא בקריאה קצרה (NGS) שיפר את גילוי וריאנטים נדירים אך נשאר מוגבל בזיהוי שינויים מבניים מורכבים4.

פלטפורמות ריצוף לקריאה ארוכה, במיוחד Oxford Nanopore Technologies, מציעות כיום את היכולת לייצר קריאות רציפות ומדויקות מאוד, המתאימות לפתרון וריאנטים מבניים ומיקומים פולימורפייםמאוד 5. הניידות שלהם, יכולת הניתוח בזמן אמת והתאימות לתהליכי עבודה מבוססי אמפליקון הופכים אותם לכלים מבטיחים ליישומי שטח ולחקירות התפרצויות6. למרות יתרונות אלו, תהליכי עבודה סטנדרטיים לקריאה ארוכה רב-מקומית לגנוטיפינג שגרתי של T. gondii נותרו מוגבלים.

כדי להתמודד עם הפער הזה, הקמנו תהליך ריצוף אמפליקונים לקריאה ארוכה שניתן להרחבה, המיועד לשני לוקוסים פולימורפיים (איור 1). בשילוב עם צינור ליטוש קונצנזוס וקריאות וריאנטים, גישה זו מאפשרת זיהוי מדויק של SNPs ו-INDELs, ותומכת בהבחנה ברמת המתח. הפרוטוקול מתאים למעבדות המצוידות להגברת PCR וריצוף קריאה ארוכה, ואומת באמצעות מבודדים מתורבתים. למרות שהתאמה לדגימות קליניות או סביבתיות ראשוניות עשויה להיות אפשרית, יישומים כאלה דורשים אופטימיזציה ואימות נוספים. בסך הכול, תהליך עבודה זה מספק מסגרת מובנית לאפיון מולקולרי ממוקד ועשוי לתמוך בחקירות אפידמיולוגיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה השתמש בזני טפילים מבוססים במעבדה ובקווי תאי פיברובלסטים אנושיים שהושגו מסחרית. לא היו מעורבים ישירות בנבדקים אנושיים או בעלי חיים.

הערה: אלא אם צוין אחרת, מאגרים ותגובות המשמשים בפרוטוקול זה מסופקים בתוך הערכות המסחריות המפורטות בטבלת החומרים.

1. בחירת סמנים ביולוגיים

  1. הורד רצפים גנומיים של SAG2 ו-SAG3 בפורמט FASTA ממאגר הגנום ToxoDB (https://toxodb.org/toxo/app).
  2. בצע יישור רצף זוגי באמצעות EMBOSS Water (https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/psa/emboss_water).
  3. בחר אזורי אמפליקון ≤1,600 זוגות בסיסים (bp) כדי למזער את זמן הריצוף ולהבטיח הגברה יעילה של PCR.
  4. ודא שכל אזור מכיל SNPs אינפורמטיביים או פולימורפיזמים של INDEL לצורך גזירה בין מאמנים.

2. גידול וקציר של טוקסופלזמה גונדי טאכיזואיטים

  1. תחזוקת תרביות תאים מארחים
    1. השגת פיברובלסטים של עורלה אנושית (HFFs) ממקור מסחרי מוסמך ותרבית אותם במדיום גדילה מלא המורכב מדיום הנשר המותאם של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
    2. דגרו תרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ באינקובטור לח.
  2. תחזוקה והרחבה של קווי טפילים.
    1. הדביק שכבות מונו-שכבות של פיברובלסטים במפגש של 80–90% באמצעות טכיזואיטים בריבוי זיהום של 1–3 טפילים לכל תא מארח. לבקבוק T25 המכיל כ-1 ×10 6 פיברובלסטים, יש להוסיף 1–3 × 106 טכיזואיטים.
    2. בדקו תרביות מדי יום באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך בהגדלה של 20× או 40×. זיהוי פירוק תאי מארח על ידי צפייה בהפרעות מונו-שכבתיות נרחבות.
      הערה: אל תשתמש בתרביות פיברובלסטים מעבר למעבר 20 כדי להימנע מפריטים הקשורים לתרבית.
    3. קציר של טכיזואיטים.
      1. אסוף תרביות כאשר נראה ≥90% פירוק תאי המארח.
      2. צנטריפוגה ב-1,300 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
      3. החזירו את הכדור לתלייה במלח סטרילי של 10 מ"ל עם בופר זרחן על ידי פיפטינג עדין, וצנטריפוגה שוב ב-1,300 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. חזור על זה שוב.

3. חילוץ DNA גנומי ויצירת אמפליקונים

  1. הפקת DNA גנומי באמצעות ערכת טיהור DNA גנומי מבוססת עמודת סיליקה7. DNA אלוט בבופר שחרור של 50 מיקרוליטר.
  2. מדוד ריכוז DNA באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח.
  3. אחסן DNA בטמפרטורה של 4°C לטווח קצר או ב-20°- לאחסון ארוך טווח.
  4. הכינו תגובות PCR באמצעות תערובת DNA פולימראז איכותית, פריימרים ספציפיים ללוקוס (טבלה משלימה 1), ומים ללא נוקלאז.
  5. לבצע הגברה של PCR באמצעות מחזור תרמי מכויל בתנאי מחזור הבאים: (א) דנאטורציה ראשונית ב-98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, (ב) 35 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות; אנילינג ספציפי ללוקוס: 60 מעלות צלזיוס ל-SAG2, 68 מעלות צלזיוס ל-SAG3, 30 שניות; 72 °C למשך 20 שניות, (c) הארכה סופית: 72 °C ל-2 דקות.
  6. בדוק את מוצרי PCR באמצעות אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 1.5%.
  7. מוצרי Purify PCR המשתמשים במערכת PCR מבוססת עמודה ומערכת טיהור חילוץ ג'ל לפי הוראות היצרן8. DNA אלוט ב-15–20 מיקרוליטר של בופר שחרור.
    הערה: יעילות ותפוקת ה-PCR עלולות להיות מופחתות עקב איכות נמוכה של תבניות DNA, ריכוז או תנאי תגובה לא אופטימליים. אם תפוקת האמפליקון נמוכה, יש לוודא את שלמות תבנית ה-DNA באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ואת הריכוז והטוהר באמצעות ספקטרופוטומטר. טמפרטורות וריכוזי החיישון של PCR צריכים להיות מותאמים גם הם לזוגות הפריימרים, ולהגביר את מספר מחזור ה-PCR לפי הצורך.

4. הכנה לספרייה לסידור קריאה ארוכה

  1. תיקון קצה ו-dA-tailing
    1. הפשיר את כל החומרים וערבב היטב באמצעות וורטקס. מדלל את דגימת בקרת ה-DNA ב-10.5 מיקרוליטר של בופר שחרור בשימוש הראשון בלבד ושמור אותה על קרח.
      הערה: תמיד עשו חרוזי מערבולת מגנטיים היטב לפני כל שימוש.
      אזהרה: אל תערובת האנזימים End-Prep Turntex; ערבב בעדינות על ידי פיפטינג.
    2. פיפט 200 fmol (~130 ng למקטע של 1 קילו-בייט) מכל דגימת DNA לצינורות PCR בנפח 0.2 מ"ל ומכוון את הנפח ל-11.5 מיקרוליטר עם מים נטולי נוקלאז.
    3. הוסיפו 1 מיקרוליטר של דגימת בקרת DNA מדוללת לכל צינור וערבבו על ידי פיפטציה של 10–20 פעמים.
    4. הכינו תערובת מאסטר בקצה הכנה לכל דגימה המכילה 1.75 מיקרוליטר בופר תגובה ותערובת אנזימים של 0.75 מיקרוליטר (כולל עודף של 5%).
    5. הוסף 2.5 מיקרולטר של מיקס מאסטר לכל דגימה, ערבב בעדינות וסובב לרגע למטה.
    6. דגרו במחזור תרמי בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואז 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  2. טיהור DNA מוכן בקצה
    1. העבר את תגובת 15 מיקרוליטר לצינור מיקרוצנטריפוגה בקוטר 1.5 מ"ל עם חיבור נמוך ל-DNA.
    2. הוסף 15 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים תלויים מחדש, ערבב בעדינות וסובב לזמן קצר.
    3. דגרו דגימות במיקסר רוטטור למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. הכינו 80% אתנול טרי לכביסה.
    5. הנח צינורות על מתקן מגנטי עד שהחרוזים מתגלגלים והסר בזהירות את הסופרנטנט.
    6. שטפו חרוזים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של 80% אתנול.
      הערה: אפשרו לחרוזים להתגלגל לגמרי, ואז הסרו בזהירות את האתנול.
    7. חרוזים מיובשים באוויר ל~30 שניות; הימנעו מייבוש יתר כדי למנוע סדקים.
    8. החזירו את החרוזים במים ללא נוקלאז של 10 מיקרוליטר ודגרו במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    9. הניחו צינורות על מדף מגנטי והעבירו 10 מיקרו-ליטר לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי עם חיבור נמוך ל-DNA.
    10. מדוד ריכוז DNA באמצעות 1 מיקרו-ליטר על ספקטרופוטומטר.
  3. ברקידוד מקורי
    1. תערובת מאסטר של ליגאזות פתירה/TA, EDTA, מאגר מקטעים קצרים (SFB), וברקודים טבעיים (NB01–NB24).
    2. הקצה ברקודים בודדים לדגימות 1–24.
    3. הרכיבו את תגובת הברקודינג עם 7.5 מיקרוליטר DNA מוכן בקצה, 2.5 מיקרוליטר ברקוד מקורי, ו-10 מיקרוליטר ליגז מאסטר בלנט/TA
    4. ערבבו היטב על ידי פיפטינג של 10–20 פעמים.
    5. דגרו ל-20 דקות בטמפרטורת החדר וסיים את התגובה עם 4 מיקרוליטר EDTA, ערבבו היטב באמצעות פיפטינג, וסובבו לזמן קצר.
    6. אסוף דגימות מקודדות לצינור מיקרוצנטריפוגה בקוטר 1.5 מ"ל נמוך הקשור ל-DNA. הוסיפו חרוזים מגנטיים ב-0.4× סך נפח הדגימה המאוגד (למשל, מוסיפים 230 חרוזים ל-575 מיקרוליטר DNA מאוגד). ערבבו היטב על ידי פיפטינג, ואז דגרו על מערבל רוטור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    7. שטוף את החרוזים עם 700 מיקרוליטר של בופר מקטעים קצרים (SFB). להניף את החרוזים כדי להחזיר את הכדור, להסתובב למטה, ואז להחזיר את הדגימה למתקן המגנטי ולתת לחרוזים להתגלגל. הסר את הבופר באמצעות פיפטה, ואז זרוק אותו.
    8. חזור על השלב הקודם.
    9. סובב למטה והנח את הצינור חזרה על מתקן המגנטי. תנתק כל בופר שנותר.
    10. הסר את הצינור מהמתקן המגנטי ותלה מחדש את הכדור במים נטולי נוקלאז של 35 מיקרוליטר על ידי לחיצה עדינה.
    11. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם ערבוב לסירוגין, ואז העבירו את האלואט לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי עם קישור נמוך DNA.
  4. קישור מתאם וניקוי ספרייה
    1. הרכבת תגובת ליגציה עם 30 מיקרוליטר DNA ברקודד מאוחד, 5 מיקרוליטר מתאם טבעי, 10 מיקרוליטר בופר ליגציה (5×), ו-5 מיקרוליטר ליגז DNA T4.
    2. ערבבו היטב את התגובה על ידי פיפטינג עדין וסיבוב קצר למטה. דגרו את התגובה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. הוסיפו 20 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים תלויים לתגובה וערבבו באמצעות פיפטינג. דגור על מערבל סיבוב למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. סובב את הדגימה והכדור על המדף המגנטי. השאר את הצינור על המגנט ואת הפיפטה מחוץ לסופרנטנט.
    5. שטוף את החרוזים על ידי הוספת 125 מיקרוליטר Short Fragment Buffer (SFB). להניף את החרוזים כדי להחזיר את הגלגל, לסובב למטה, ואז להחזיר את הצינור למתקן המגנטי ולאפשר להם להתגלגל. הסר את הסופרנטנט באמצעות פיפטה, ואז זרוק אותו.
    6. חזור על השלב הקודם.
    7. סובב למטה והנח את הצינור חזרה על המגנט. הוציא כל סופרנטנט שנותר. הסר את הצינור מהמתקן המגנטי והחזיר את הכדור ל-15 מיקרוליטר בופר שחרור (EB).
    8. סובבו למטה ודגרו 10 דקות בטמפרטורה של 37°C. ערבבו את הדגימה כל 2 דקות על ידי הבהבה עדינה במשך 10 שניות כדי לעודד שחרור DNA.
    9. הגר את החרוזים על מגנט עד שהאלואט יהיה צלול וחסר צבע, לפחות דקה אחת.
    10. הסר ושמר 15 מיקרוליטר של אלואט המכיל את ספריית ה-DNA לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נקי בנפח 1.5 מ"ל עם קישור נמוך ל-DNA.
    11. כמת את הספרייה הסופית באמצעות ספקטרופוטומטר.

5. הכנת תאי זרימה וריצוף ננו-נקבוביות

  1. הכנת תאי זרימה
    1. בדוק את תא הזרימה ואמת ≥80 נקבוביות פעילות.
    2. הכינו את תערובת הפריימר על ידי שילוב של 117 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה עם 3 מיקרו-ליטר של תמיסת חיבור בצינור מיקרוצנטריפוגה לנפח כולל של 120 מיקרוליטר. ערבבו בעדינות באמצעות פיפטינג כדי למנוע כניסת בועות אוויר. טעין לאט את כל תערובת הפריימר של 120 מיקרולטר לפתח תאי הזרימה, כדי להבטיח שלא יוכנסו בועות אוויר במהלך הטעינה.
  2. טעינת ספרייה וריצוף
    1. הכינו את תערובת הריצוף על ידי שילוב של 15 מיקרו-ליטר של בופר ריצוף (SB), 10 מיקרוליטר של חרוזי ספרייה (LIB), ו-5 מיקרוליטר של ספריית DNA. ערבבו בעדינות על ידי פיפטור למעלה ולמטה 3–5 פעמים כדי למנוע יצירת בועות. תערובת הריצוף של 30 מיקרוליטר מתקבלת מוכנה לטעינה או ניתנת לכוונתה ל-45 מיקרוליטר במידת הצורך.
    2. טעין לאט 30–45 מיקרוליטר מתערובת הריצוף אל פתח הדגימה של תא הזרימה על ידי השלכת התמיסה בזריקה.
      זהירות: הימנעו מהכנסת בועות אוויר ואל תאפשרו לקצה הפיפטה לגעת בממברנה. סגור את פתח הטעינה היטב לאחר השחרור.
    3. התחל לבצע רצף עם קריאות בסיס בזמן אמת מופעל ועקוב אחרי פעילות הנקבוביות.
    4. המשך ריצוף עד להשגת כיסוי ≥500× לכל אמפליקון (מומלץ ≥1000×), כדי להבטיח עומק קריאה מספק לקריאת בסיס מדויקת, יצירת רצף קונצנזוס אמין, וזיהוי בטוח של וריאנטים בתדר נמוך.
      הערה: אם כיסוי ריצוף נמוך ברור, ודא קלט אמפליקון איכותי בריכוז הנדרש, נקבוביות תאי זרימה פעילה מספקת, והרחיב את הריצוף כדי להשיג את הכיסוי המומלץ.

6. עיבוד נתונים וניתוח וריאנטים

  1. קריאת בסיס ודהמולטיפלקסינג
    1. לבצע שיחות בסיס מדויקות מאוד באמצעות תוכנת קריאה בסיסית הקשורה לפלטפורמה עם הגדרות ברירת מחדל של דיוק גבוה ליצירת קבצי FASTQ לכל דגימה. דמולטי-פלקס קורא לפי ברקוד ושומר רק קריאות שעוברות מסנני בקרת איכות.
  2. מיפוי קריאה ועיבוד BAM
    1. הורד את אוסף הגנום המבוסס Toxoplasma gondii GCF_000006565.2 (TGA4) ממאגר הגנום של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI). הוצאת כרומוזום VIII (NC_031476.1) לניתוח SAG2 וכרומוזום XII (NC_031480.1) לניתוח SAG3 . אנדקס רצפי הייחוס באמצעות SAMtools ויצר אינדקס יישור באמצעות בונה אינדקס יישור לקריאה ארוכה.
    2. קריאות מפה לגנום הייחוס הממוקד באמצעות אלגוריתם יישור לקריאה ארוכה המותאמת לנתוני ריצוף ננו-נקבוביים (למשל, הגדרה מראש למיפוי קריאה ארוכה; -ax map-ont).
    3. המרת פלט יישור לפורמט BAM, מיין ואינדוקס קבצי BAM באמצעות SAMtools. הוסף מידע על קבוצת קריאה לכל קובץ BAM באמצעות כלי Picard. חשב את הכיסוי הממוצע לכל לוקוס באמצעות סטטיסטיקות עומק ויצירת סטטיסטיקות מיפוי באמצעות מדדי flagstat.
  3. יצירת רצף קונצנזוס
    1. יצירת רצפי קונצנזוס לכל אמפליקון באמצעות אלגוריתם ליטוש קונצנזוס מבוסס רשת עצבית עם פרמטרים ברירת מחדל. ייצוא רצפי קונצנזוס בפורמט FASTA לניתוח במורד הזרם.
    2. לבצע יישור מבוסס רפרנס וניתוח רצפים השוואתי באמצעות מאגרי מידע גנומיים זמינים לציבור. המחישו יישורי קריאה ומיקומים פולימורפיים באמצעות תוכנת ויזואליזציה של גנום.
  4. קריאת וריאנט
    1. לבצע זיהוי וריאנטים באמצעות אלגוריתם קריאת וריאנטים מבוסס קונצנזוס. הפרדו פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs) ואירועי הכנסה/מחיקה (INDELs) באמצעות כלי בחירת וריאנטים (קובץ משלים 1).
    2. הפעילו ספי סינון איכותיים. עבור SNPs, סננו גרסאות עם למשל QD < 2.0, FS > 60.0, או MQ < 40.0. ל-INDEL, סננו גרסאות עם למשל QD < 2.0 או FS > 200.0.
    3. דחיסה ואינדקס של קבצי VCF מסוננים באמצעות כלי עיבוד VCF סטנדרטיים. יצר סטטיסטיקות שונות באמצעות כלי סיכום VCF.
  5. שיוך גנוטיפ
    1. להוציא וריאנטים ספציפיים ללוקוס מאזורי SAG2 ו-SAG3 ולהשוות פרופילים פולימורפיים לרצפי זן ייחוס כדי להקצות גנוטיפים של T. gondii .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ה-DNA הגנומי של טוקסופלזמה גונדי הוגבר בהצלחה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR) שפגעה בשני סמנים גנטיים: SAG2 ו-SAG3 (איור 2). לאחר הטיהור, מוצרי ה-PCR הניבו רצועות מובחנות בגדלים הצפויים באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, התואמים ל-639 bp (SAG2) ו-1158 bp (SAG3). הבהירות והעקביות של רצועות אלו אישרו הגברה מוצלחת ושלמות של קטעי הגן המטרה לניתוחי רצף מאוחרים יותר.

ריצוף ננו-נקבוביות בתפוקה גבוה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מדגים את התועלת של ריצוף לונג קריאה של Oxford Nanopore בשילוב עם גישה ממוקדת רב-לוקית לגנוטיפינג מהיר ואמין של טוקסופלזמה גונדי. על ידי התמקדות בשני לוקוסי אנטיגן שטחיים מאופיינים היטב, SAG2 ו-SAG3, אנו קובעים הוכחת מושג לריצוף ריצוף רב-מקומי מבוסס Oxford Nanopore באמצעות ניתוחים השוואתיים של זני RH (סוג I) ו-ME49 (סוג II), ומדגימה את יכולת הפלטפורמה לפתור שונות גנטית ייחודית לזן.

הגברת PCR של שני הלוקוסיים יצרה רצועות ברורות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי משרד ההשכלה הגבוהה והמחקר המדעי של מצרים, המיוצגת על ידי הלשכה המצרית לענייני תרבות וחינוכיים בלונדון, ו-UKRI MRC (MR/X502947/1). איור 1 נוצר עם BioRender.com

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגרוז באבקהThermo Fisher Scientific16500100לאלקטרופורזה של ג'לים
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065מדיום לתרבית תאים
epi2me-labs/wf-amplicon Nextflow workflow (v1.2.1)Oxford Nanopore Technologies, UKN/Aזרימת תהליכים של Nextflow לעיבוד וניתוח נתונים רצף ננופור אמפליקון; גרסה 1.2.1 שימשה לניתוח חוזר של נתוני MinION.
epi2me-labs/wf-alignment Nextflow workflow (v1.2.3)Oxford Nanopore Technologies, UKN/Aזרימת תהליכים של Nextflow ליישר קריאות רצף ננופור לרצפים התייחסותיים וויזואליזציה משולבת באמצעות IGV; גרסה 1.2.3 שימשה לניתוח חוזר של נתוני MinION.
אלכוהול אתילי, טהורMerck Life Science51976-500ML-Fלניקוי חרוזים
סרום בקר עוברי (FBS)Sigma-AldrichMFCD00132239תוסף לתרבית תאים
ערכת שטיפת תא זרימהOxford Nanopore TechnologiesEXP-WSH004שטיפת תא זרימה
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (10 kb)Thermo Fisher ScientificSM1331אימות גודל
שורת תאים של פיברובלסטים אנושיים מעור העורלה HFF-1American Type Culture Collection (ATCC)SCRC-1041פיברובלסטים דרמיים אנושיים המבודדים מעור העורלה הניאונאטלי; משמשים להתרבת טפילים
תא זרימה MinION (R10.4.1)Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114תא זרימה לריצוף
מכשיר ריצוף MinION Mk1BOxford Nanopore Technologies, UKMIN-101Bרצף ננופור; הרצף בוצע באמצעות תוכנת MinKNOW (v25.09.16) לבקרת מכשיר וקריאת בסיסים בזמן אמת.
תוכנת MinKNOWOxford Nanopore Technologies, UKN/Aתוכנה המשמשת לבקרת מכשיר MinION Mk1B, רצף בזמן אמת וקריאת בסיסים; גרסה 25.09.16.
ערכת סימון ברקוד מקומי 24 V14Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24סימון ברקוד לדגימות מרובות
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNew England BiolabsM0367ליגציית DNA
NEBNext Quick Ligation ModuleNew England BiolabsE6056ליגציית מתאם
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5×)New England BiolabsB6058משמש בליגציית DNA
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing ModuleNew England BiolabsE7546הכנת ספרייה
מים חסרי נקלאזותThermo Fisher ScientificR0581דרגה מולקולרית ביולוגית
ערכת טיהור PCR ו-Gel NucleoSpin Macherey-Nagel740609.5טיהור מוצר PCR
פניצילין–סטרפטומיצין (1%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)15140-122תערובת אנטיביוטית
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific (Gibco)10010023חיץ שטיפה
Q5 High-Fidelity 2× Master MixNew England BiolabsM0492Sפולימראז בדיוק גבוה
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen69504מיצוי DNA
Quick T4 DNA LigaseNew England BiolabsM2200אנזים לליגציית מתאם
SYBR Safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102צבע ג'ל DNA
TriTrack DNA Loading Dye (6×)Thermo Fisher ScientificR1161טעינת דגימות לג'ל
Trypsin–EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)25200056להעברת HFF
1× TAE או 1× TBE buffer——חיץ הפעלה
2× PCR premix——תערובת מוכנה ל-PCR

מקורות

  1. Uzelac, A., Djurkovic-Djakovic, O. Isolation, genotyping and phenotyping Toxoplasma gondii in Europe - A critical perspective. Food Waterborne Parasitol. 40, e00279(2025).
  2. Yaman, Y., Bay, V., Kişi, Y. E. Discovery of host genetic factors through multi-locus GWAS against toxoplasmosis in sheep: addressing one health perspectives. BMC Veterinary Research. 21 (1), 263(2025).
  3. Khedr, A. A., et al. Exploring the role of chitosan and curcumin-loaded chitosan nanoparticles against chronic Toxoplasma infection in experimental mice. Scientific Reports. 15 (1), 41765(2025).
  4. Joeres, M., et al. Genotyping of European Toxoplasma gondii strains by a new high-resolution next-generation sequencing-based method. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 43 (2), 355-371 (2024).
  5. Gohar, Y., et al. Intra-strain genetic heterogeneity in Toxoplasma gondii ME49: Oxford Nanopore long-read sequencing reveals copy number variation in the ROP8-ROP2A locus. BMC Genomics. 26 (1), 1094(2025).
  6. Koutsogiannis, Z., Denny, P. W. Rapid genotyping of Toxoplasma gondii isolates via Nanopore-based multi-locus sequencing. AMB Express. 14 (1), 68(2024).
  7. DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook. , QIAGEN. (2023).
  8. User manual PCR clean-up and Gel extraction. , MACHEREY-NAGEL. (2024).
  9. Karst, S. M., et al. High-accuracy long-read amplicon sequences using unique molecular identifiers with Nanopore or PacBio sequencing. Nature Methods. 18 (2), 165-169 (2021).
  10. Yu, P. -L., et al. Next-generation fungal identification using target enrichment and Nanopore sequencing. BMC Genomics. 24 (1), 581(2023).
  11. Vilares, A., et al. Towards a rapid sequencing-based molecular surveillance and mosaicism investigation of Toxoplasma gondii. Parasitology Research. 119 (2), 587-599 (2020).
  12. Fazaeli, A., Ebrahimzadeh, A. A new perspective on and re-assessment of SAG2 locus as the tool for genetic analysis of Toxoplasma gondii isolates. Parasitology Research. 101 (1), 99-104 (2007).
  13. Targa, L. S., et al. Toxoplasma gondii SAG2, SAG3 and GRA6 alleles and single nucleotide polymorphism in congenital infections with known parasite load and clinical outcome. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 65, e8(2023).
  14. Rico-Torres, C. P., et al. Can cloning and sequencing help to genotype positive Toxoplasma gondii clinical samples? Results and validation using SAG3 as a model. Infect Genet Evol. 101, 105283(2022).
  15. Sanchez, S. G., Besteiro, S. The pathogenicity and virulence of Toxoplasma gondii. Virulence. 12 (1), 3095-3114 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תהליך עבודה לגנוטיפנינגהפקת DNA גנומיהגברה ספציפית לאתרהגן SAG2הגן SAG3פולימורפיזם של נוקליאוטיד יחידיישור רצפים
ריצוף רב-לוקוס לטייפון זן של טוקסופלזמה גונדי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.