$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'יקיי (מספר אישור 2023–034C1). מחקר זה תוכנן כמחקר היתכנות פיילוט. כדי להעריך את הכדאיות הטכנית של הכנסת כלוב אחורי עדין וחדשני זה לעמוד השדרה הזנבי של העכברוש לפני אימות בקנה מידה רחב, נעשה שימוש בבעל חיים יחיד (n = 1), בהתאם להנחיות אתיות, כדי למזער את השימוש בבעלי חיים במהלך ההערכה הטכנית הראשונית. זכרים של חולדות ספרג-דולי (SD) נבחרו לזן הסטנדרטי למחקר מיזוג עמוד שדרה. קריטריוני ההכללה היו זכרים בריאים בגילאי 8–10 שבועות, במשקל שבין 200–250 גרם, כדי להבטיח שגובה הדיסק הבין-חולייתי (1.8–2.2 מ"מ) תואם לכלוב של 2 מ"מ. בעלי חיים שהראו ירידה >-10% במשקל במהלך תקופת ההסתגלות, ירידה בפעילות או עיוותים נראים בזנב הוצאו. למחקר זה, זכר עכברוש Sprague–Dawley (בן 8 שבועות, משקל 221.8 גרם; Japan SLC, שיזואוקה, יפן) נוצלה. החיה הוחזקה בסביבה מבוקרת בטמפרטורה של 25°C ולחות יחסית של 50% (טווח מותר 30–70%) עם מחזור אור/חושך של 12 שעות, וקיבלה גישה חופשית למים ותזונת מכרסמים סטנדרטית. חולדות אוחסנו בכלובים בעלי תחתית מוצקה שסופקו בהם חומרי קינון ומקלות לעיסה להעשרת הסביבה. תקופת הסתגלות של 3 ימים יושמה לפני ההליך הניתוחי. כדי למנוע מבני הזוג בכלוב לכרסם את שתלי הזנב, העכברוש נשמר בתנאי מגורים בודדים לאורך כל המחקר, מה שהיה גורם קריטי בעיצוב הניסוי הזה.
הכנת ברגים ולוחות
חומרי קיבוע פנימיים הוכנו לפני הניתוח. מברגים מנירוסטה זמינים מסחרית (קוטר מקורי: 1.2 מ"מ, אורך: 14 מ"מ) נחתכו לאורך מדויק של 6 מ"מ באמצעות חותך חוטים (איור 1A). ברגים אלו עוברו חיטוי באמצעות אוטוקלאב קיטור סטנדרטי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. בלוח קיבוע פנימי מפוליאוקסימימתילן (POM) (אורך 18 מ"מ, רוחב 3 מ"מ, עובי 1 מ"מ), נקדחו חורי בורג בקוטר 1.2 מ"מ במרווחים של 12 מ"מ באמצעות מקדח ידני (איור 1B–D). לאחר מכן, פינות לוחות ה-POM עוגלו באמצעות חותך חוטים כדי למזער גירוי לרקמות הרכות הסובבות (איור 1E). הלוחות עברו סטריליזציה באמצעות גז אתילן אוקסיד (EtO) או פלזמת גז מי חמצן, בהתחשב ברגישות התרמית של הפולימר. כלוב הטיטניום כולל מבנה סריג מחובר עם תעלות אורך בקוטר 300–500 מיקרון. פני השטח שלו הוכנו באמצעות טכנולוגיית טיטניום תלת-ממדית של למלר להשגת חספוס מיקרו-פני שטח של 3–5 מיקרומטר, מה שמקל על צמיחת עצמות ישירות.
הרדמה והליך כירורגי
לא בוצע צום לפני הניתוח כדי להימנע מלחץ מטבולי מיותר. הרדמה בוצעה באמצעות תערובת הרדמה משולשת שכללה מדטומידין (0.15 מ"ג/ק"ג), מידזולאם (2 מ"ג/ק"ג) ובוטאורפנול (2.5 מ"ג/ק"ג), שניתנה באמצעות הזרקה תת-עורית לאזור הגב באמצעות מחט23 בקוטר 25. הוערכה רמת הרדמה ניתוחית מספקת כל 15 דקות על ידי אישור אובדן רפלקס המשיכה של הדוושה (צביטת האצבע), שמירה על ריריות ורודות, ומעקב אחר קצב הנשימה (70–110 נשימות לדקה). לאחר מכן בוצע הליך ניתוחי לאיחוי בין-גופני של חוליות הזנב. החיה הונחה במצב שכיבה (איור 2A), וכל הזנב חוטא לאחר פרוטוקול שיבוש מתחלף בן שלושה סבבים (70% אתנול, פובידון-יוד ו-70% אתנול) כדי להבטיח שדה סטרילי. כדי לזהות את חוליות המטרה, בוצעה מישוש ידני החל מהסאקרום מרוחק. המפרק הנייד הראשון זוהה כחיבור הסקרום-CO1, והקטע המיידי רחוק סומן כ-CO2, מה שהגדיר את אתר היעד CO2–Co3. נוצר חתך אורכי של כ-2 ס"מ בצד הגב, המשתרע מהחוליות הזנביות השנייה עד השלישית (Co2–Co3) (איור 2B), כדי לחשוף את המשטח האחורי של כל חוליה. במהלך החשיפה, ננקטה דאגה לזהות ולמנוע נזק לווריד הזנב הגבי; דיסקציה קהה ואלקטרוקקוטריה דו-קוטבית שימשו לטיפול בדימומים קלים. להכנת אתר המיזוג, נחתך הטבעת הפיברוזית בין חוליות CO2 ו-Co3 באמצעות סכין (איור 2C). האנולוס פיברוזוס והגרעין הפולפוסוס הוסרו בקפידה באמצעות קורטאז' באמצעות קורט ומלקחיים, מלקחיים קטנים (איור 2D). שלב זה בוצע תחת הגדלה ניתוחית בהגדלה בהספק גבוה (≥3.5x). שלמות ההסרה הוגדרה באופן אובייקטיבי על ידי אישור חזותי של דימום נקדודי (סימן "הקצה המדמם") והיעדר מוחלט של רקמה רכה שאריתית. נזק בלתי מקובל לקצה הפלטה הוגדר כסחף עמוק הכולל > 25% מהשטח הכולל או חדירה לעצם הקנסלוס > 0.5 מ"מ. כלוב טיטניום (חתך רוחב 2 × 2 מ"מ, גובה 2 מ"מ) (איור 2E) הוכנס לאחר מכן עמוק למרחב הבין-חולייתי עד שהושגה עצירה פיזית ואושר מגע מלא עם שני לוחות הקצוות ויזואלית, ויצר התאמת הפרעה יציבה (איור 2F, 2G).
קיבוע וסגירת פצע
כדי להקל על קיבוע הלוחות, משטח העצם סביב אתרי החורים המיועדים בחוליות CO2 ו-CO3 הושטח באמצעות נתב חשמלי ידני שפעל במהירות 7,800 סל"ד המצויד בבור כדורי מסוג קובץ בקוטר 2.0 מ"מ (איור 2H). חורי עצם נקדחו בנפרד במרווחים התואמים לחורי הברגים של לוח הקיבוע הפנימי הפלסטי באמצעות מקדח ידני המצויד במקדחה בקוטר 1.2 מ"מ (איור 2I). שני ברגים מנירוסטה בקוטר 6 מ"מ הועמדו מראש לתוך החורים. של לוח הפלסטיק (איור 2J). הברגים הוכנסו בזווית של 90° לעומק סטנדרטי של 5 מ"מ עם מרווח של 12 מ"מ ממרכז למרכז (איור 2K). לבסוף, חתך העור נסגר עם תפרי ניילון 4-0, והזנב חוטא שוב עם 70% אתנול להשלמת ההליך.
ניהול לאחר ניתוח והמתת חסד
בשלב ההחלמה המיידית (יום 0), החיה נבדקה כל 15 דקות, וטמפרטורת הרקטום נתמכה עד שהגיעה לשכיבה מלאה בסטרנל ולתנועה מכוונת. להערכה ארוכת טווח (שבועות 1–12), יושם מערכת ניקוד יומית המבוססת על ציון מצב הגוף (BCS), מצב טיפוח ופעילות כללית, לצד ניטור יומי של אתר הניתוח לאיתור זיהום או התפרקות. אוכל לח סופק על רצפת הכלוב במהלך 48 השעות הראשונות. משקל הגוף נמדד מדי שבוע. נקודות הסיום ההומאניות להמתת חסד מוקדמת הוגדרו במדויק כך: ירידה במשקל ≥20%, BCS ≤2.0, חוסר יכולת מתמשך להגיע למזון/מים > 12 שעות, סימנים לכאב/קוצר נשימה חמור, או סיבוכים חמורים באתר הניתוח (למשל, נמק). בעלי חיים שעמדו בקריטריונים אלו הושמתו באופן הומני בתוך 24 שעות. הטיפול לאחר הניתוח כלל מתן ספלקסין (15 מ"ג/ק"ג) תוך-שריר מיד לאחר הניתוח וב-24 שעות לאחר הניתוח למניעת זיהום. להקלה על כאבים, ניתנה קרפרופן (2 מ"ג/ק"ג) באופן תת-עורי מיד לאחר הניתוח וב-12, 24 ו-48 שעות לאחר הניתוח, בסך הכול ארבע מנות. בשבוע ה-12 לאחר ההשתלה, העכברוש הושמד באמצעות מנת יתר של איזופלורן. הקטע מהחוליה הזנבית השנייה עד השלישית נקטף באחד וקיבע ב-70% אתנול.
המלצות להדרכה, פתרון תקלות וגודל מדגם. כדי להקל על אימוץ מוצלח של פרוטוקול תובעני זה, מפעילים חדשים חייבים לבצע 3–5 הליכי תרגול על גופות חולדות, ולהשיג מיומנות כאשר שלוש הנחות רצופות לא מראות שגיאות תקלות רדיוגרפיות. פתרון תקלות נפוץ כולל מדידה מוקדמת של גובה הדיסק באמצעות צילום רנטגן כדי לאופטימיזציה של בחירת גודל הכלוב ואימות מחדש של שטיחות עצם הגב למניעת נדידת הכלוב. אם רכישת הבורג אינה מספקת, מומלץ להשתמש במהירויות קידוח נמוכות יותר. למחקרי אימות עתידיים, מומלץ גודל מדגם מינימלי של n = 6 עד 10 לכל קבוצה (עם תוספת של 10–20% לדעיכה) כדי להשיג עוצמה סטטיסטית מספקת. יתרה מזאת, מחקרים עתידיים חייבים לשלב קבוצות ביקורת (למשל, כלוב ריק או אוטוגרפט) כדי לאמת את ביצועי הביומטריה.
ניתוח רדיוגרפי והיסטולוגי
סריקת טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (CT) ורדיוגרפיה דיגיטלית בוצעו באמצעות מערכת מיקרו-CT עם מתח צינור של 80 קילו-וולט וזרם של 0.1 מיליאמפר. מסנן אלומיניום בעובי 1.0 מ"מ שימש במהלך הרכישה כדי למזער ארטיפקטים של הקשחת קרן שנגרמו על ידי השתל הטיטניום. להערכה אורך, בוצעה הדמיה ב-in vivo שבועות 1 ו-4 לאחר הניתוח עם גודל ווקסל של 120 מיקרון. הדמיה אקס-ויבו בוצעה 12 שבועות לאחר הניתוח באמצעות מחזיק דגימה בקוטר 24 מ"מ וגודל ווקסל של 24 מיקרון. נתוני CT ותמונות רדיוגרפיות שוחזרו באמצעות אלגוריתם הקרנה אחורית מסונן סטנדרטי ונותחו באמצעות צופה DICOM. הוגדרו קריטריונים כמותיים להערכת איחוד העצמות. רדיולוגית, מיזוג מוצלח אושר כאשר נצפה מבנה טרבקולר רציף המגשר בין לוחות קצה החוליה הגולגולתית והזנבית לאורך לפחות שלושה פרוסות רצופות במיקרו-CT. סף עולמי של 700 יחידות הונספילד (HU) הוחל במהלך סגמנטציה של תמונה. מבחינה היסטומורפומטרית, יחס BV/TV של 70% ומעלה בתוך הכלוב נחשב לסף למימוש פיזי מרחבי ומיזוג מרחב. היסטולוגית, איחוד העצמות הוגדר על ידי גשר עצמות מלא מצד הגולגולת לצד הזנב ללא התערבות של רקמה סיבית. לצורך ניתוח היסטולוגי, בוצעה סימון פלואורוכמות סדרתית באמצעות הזרקה תת-עורית של קלצין (8 מ"ג/ק"ג) יומיים לפני המתת חסד כדי לזהות את התפלגות המינרליזציה הפעילה בנקודת הזמן הסופית של 12 השבועות. החוליות הזנביות שנכרתו הוקבעו ב-70% אתנול במשך 7 ימים וצובעו בגוש בצבע עצם של וילנואבה. הדגימות יובשו באמצעות דרגות עולות של אתנול, הוטמעו בשרף מתיל מתקרילט, וחתכו באמצע הסגיטל במרכז הגיאומטרי המדויק של הכלוב, כפי שנקבע על ידי הנחיית מיקרו-CT מוקדמת, באמצעות מיקרוטום מסור יהלום. דגימות קרקע לא דה-קלציביות (עובי 5 מיקרון) הוכנו במכון היסטומורפומטריית עצם איטו (נייגטה, יפן). התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר ומיקרוסקופ לייזר קונפוקלי למיזוג פלואורסצנטי. בדיקה נוספת בוצעה תחת מיקרוסקופ אור מקוטב, וניתוח היסטומורפומטרי בוצע באמצעות מנתח תמונה ממוחשב. אזור העניין (ROI) הוגדר כנפח הפנימי הכולל של הכלוב, ללא תומכי המתכת, וחולק לתשואה פנימית בכלוב הגולגולתי והזנב. רקמת העצם זוהתה לפי צבעה הסגול/מג'נטה תחת צביעת וילנואבה. עצם למלר (Lm.V) הוגדרה על ידי מבנה מסודר מאוד, מקביל-למלרי תחת אור מקוטב, בעוד שעצם ארוגה (Wo.V) הציגה דפוסי סיבים לא מסודרים.
