הזדקנות הקשורה לניוון עצבי: הערכה סימולטנית של פעילות β-gal וכתם Nissl בחתכים היסטולוגיים במוח מכרסמים

Verónica Salas-Venegas; Ricardo J Ramírez-Carreto; Anahí Chavarría

doi:10.3791/70676

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הזדקנות הקשורה לניוון עצבי: הערכה סימולטנית של פעילות β-gal וכתם Nissl בחתכים היסטולוגיים במוח מכרסמים

118 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70676

⸱

17 ביולי 2026

Verónica Salas-Venegas^*¹ , Ricardo J Ramírez-Carreto^*¹ , Anahí Chavarría¹

¹Laboratorio de Neuroinmunología, Unidad de Investigación en Medicina Experimental, Facultad de Medicina-UNAM, Hospital General de Mexico "Dr. Eduardo Liceaga"

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מוצג ככלי לזיהוי פעילות β-גלקטוזידאז הקשורה להזדקנות, לביצוע צביעת Nissl להערכה סימולטנית של הזדקנות ושלמות הנוירונים, ולחקר קשרים בין נטל הזדקנות לניוון עצבי.

תקציר

הזדקנות תאית היא תהליך פיזיולוגי המאופיין בעצירת מחזור תא בלתי הפיך, אשר פוגע בהתחדשות ובתפקוד הרקמות. תופעה זו הפכה לגורם מרכזי לניוון עצבי, המונעת מהצטברות תאים מזדקנים במערכת העצבים המרכזית (CNS). תאי הזקנה רוכשים פנוטיפ הפרשה פרו-דלקתי הקשור להזדקנות (SASP) שמחזיק דלקת נוירולוגית כרונית ומפריע למיקרוסביבה הנוירונלית. כתוצאה מכך, תהליכים חיוניים כמו נוירוגנזה, פלסטיות סינפטית והישרדות נוירונים נפגעים. גוף ספרות נרחב מקשר הזדקנות תאית להפרעות ניווניות נוירודגנרטיביות שונות, כגון מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר או טרשת נפוצה, ונזק חריף הקשור לנוירונים, כגון איסכמיה מוחית או פגיעת מוח טראומטית.

ההערכה המשולבת של פעילות β-גלקטוזידאז (SA-β-gal) הקשורה להזדקנות וצביעת Nissl בחתכים היסטולוגיים מספקת גישה מקיפה להערכת הזדקנות תאית ושלמות הנוירונים בו-זמנית בהקשר רקמתי זהה. אסטרטגיה זו מאפשרת מתאם מרחבי מדויק בין הצטברות תאים מזדקנים באזורים פגיעים מסוימים (למשל, ההיפוקמפוס או הקורטקס) לבין אובדן נוירוני או נזק לרקמות. על ידי שילוב סמן תפקודי של הזדקנות עם מדד קלאסי למורפולוגיה וצפיפות נוירונים, גישה זו מחזקת את החוסן הפרשני של הניתוח. יתרה מזאת, הוא מאפשר אפיון מדויק יותר של הקשר בין נטל זקנה לשינויים נוירודגנרטיביים, וממקסם את תפוקת המידע מדגימות רקמה מוגבלות.

יתרה מזאת, פרוטוקול זה יכול לקבוע כיצד הצטברות תאי הזדקנות מתרחשת בתגובה להתערבויות (פרמקולוגיה, מניפולציה גנטית וכו') במודלים של מכרסמים של מחלות ניווניות עצביות, ובכך לספק כלי עוצמתי לניתוח תרומה זו לפתופיזיולוגיה שלהם.

מבוא

הזדקנות תאית מוגדרת על ידי עצירה כמעט בלתי הפיכה של מחזור התא, המלווה בשינויים מקרומולקולריים^{נרחבים 1}. יתרה מזאת, תאים זקנים רוכשים פנוטיפ היפר-סקריטורי (SASP), המאופיין בהפרשה חזקה של מגוון רחב של ציטוקינים פרו-דלקתיים, גורמי גדילה ופרוטאזות². ביחד, גורמים אלו תורמים להקמת מיקרוסביבה פרו-דלקתית שמחזקת הזדקנות ומשפיעה על הומאוסטזיס הרקמות. במערכת העצבים המרכזית, תאים מזדקנים מצטברים בהדרגה עם הגיל, במיוחד באזורים הפגיעים לפתולוגיה הקשורה לגיל³. הזדקנות תאית ממלאת תפקיד משמעותי בשינויים התפקודיים הקשורים להזדקנות ולהפרעות ניווניות נוירודגנרטיביות, כאשר העומס של תאים מזדקנים גדל בהדרגה במהלך הזדקנות רגילה. סוגי תאים רבים בתוך מערכת העצבים המרכזית רגישים להזדקנות, כולל אסטרוציטים, מיקרוגליה, אוליגודנדרוציטים, נוירונים ותאי גזע עצביים⁴. מצטברות ראיות מצביעות על הזדקנות של אוכלוסיות תאי ה-CNS הללו באתיופיתולוגיה של מספר מחלות ניווניות נוירודגנרטיביות, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, דמנציה פרונטוטמפורלית, טרשת צדדית אמיוטרופית וטרשת נפוצה⁵. הפרעות ניווניות נוירודגנרטיביות נקשרו להזדקנות תאית⁶, ותאים מזדקנים הוכחו כמצטברים בקרבת פלאקים של β אמילואידים וקשרים נוירופיברילריים. עליות הקשורות לגיל בפעילות SA-β-gal תוארה במוחות מכרסמים (למשל, 3, 8, 17 ו-24 חודשים), כאשר עליות מובהקות סטטיסטית בולטות בעיקר בקבוצה המבוגרת ביותר (24 ^{חודשים).}

מחקרים שונים מספקים תובנות חשובות לגבי הקשר בין שינויים היסטולוגיים לתוצאות פונקציונליות, כגון פגיעה קוגניטיבית ודיסרגולציה מטבולית, במודלים פתולוגיים של בעלי חיים המתמודדים עם מתאמים תפקודיים או התנהגותיים של פגיעות מוח ^8,9.

למרות מחקר נרחב, אין סמן אוניברסלי אחד שמזהה באופן אמין תאים זקנים תוך הבחנה שלהם ממצבים אחרים שאינם מתרבים; עם זאת, הסמן הנפוץ ביותר להזדקנות תאית הוא האנזים הליזוזומי β-גלקטוזידאז (SA-β-gal), שמזוהה ב-pH 6, אנזים הידרולאז שמזרז את ההידרוליזה של β-גלקטוזידים למונוסכרידים. גורם מבדיל מרכזי הוא ה-pH. SA-β-gal מציג פעילות אופטימלית ב-pH 6, בניגוד לחיידקים β-גלקטוזידאז הפועל ב-pH 7.4, ול-β-גלקטוזידאז ליזוזומלי אנדוגני, הפועל בערכי pH חומציים הנעים בין 3^ל-5 ^7,10.

צפיפות תאים וארכיטקטורת ציטוארכיטקטורת המוח הן הגורמים הבסיסיים לארגון ותפקוד עצבי. התפלגות מרחבית ושפע אוכלוסיות תאים ספציפיות הם קריטיים לתפקוד המעגל, וכימות מדויק שלהם חיוני לחקר מצבים נוירופתולוגיים הכוללים פגיעות או אובדן סלקטיבי של תאים. צביעת Nissl, שיטה סטנדרטית במדעי המוח, היא טכניקה היסטולוגית נפוצה להערכת צפיפות וארכיטקטורה עצבית ברקמות עצביות. על ידי תיוג סלקטיבי של גופי Nissl בתוך הסומטה הנוירונלית, שיטה זו מאפשרת הדמיה וכימות אמינים של אוכלוסיות נוירונים באזורים במוח¹¹. בנוסף לעמידותו, צביעת Nissl מאופיינת בפשטות טכנית, עלות נמוכה וזמן עיבוד קצר יחסית, מה שהופך אותו לכלי מעשי ונגיש למחקרים נוירואנטומיים ונוירודגנרטיביים שגרתיים.

ההערכה המשותפת של צביעת Nissl ופעילות β-גלקטוזידאז (SA-β-gal) הקשורה להזדקנות באותו חתך היסטולוגי מספקת מסגרת איתנה ומרחבית לחקירת שלמות הנוירונים ועומס התאים המזדקנים בו-זמנית. גישה אינטגרטיבית זו מאפשרת מיפוי ישיר של הזדקנות לתכונות ניווניות אזוריות ספציפיות, כולל אובדן עצבי והפרעה תאריכלית. שילוב של סמן מבני קלאסי עם אינדיקטור פונקציונלי של הזדקנות מחזק את פרשנות הנתונים וחושף קשרים מכניים בין הצטברות תאים זקנים לתפקוד לקוי של הרקמות, תוך מקסום התפוקה האנליטית מדגימות מוגבלות.

חשוב לציין שאסטרטגיה זו מתאימה במיוחד למחקרים עם זמינות רקמה מוגבלת, עיצובים אורכי או מבוססי התערבות (למשל, טיפולים סנוליטיים או סנומורפיים), וניתוחים ספציפיים לאזור במבנים מוחיים מורכבים, שבהם קריטי לקשר בין הזדקנות לפגיעות עצבית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

לבצע את כל ההליכים בבעלי חיים בהתאם להנחיות מוסדיות ולאומיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה, ולקבל אישור מוקדם מוועדת האתיקה המתאימה. פרוטוקול זה עומד בתקן הרשמי המקסיקני הנוכחי לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה (NOM-062-ZOO-1999(Muñoz, 2001)), תיקונים ואישורים מוקדמים על ידי ועדות האתיקה והמחקר, וועדת הטיפול והשימוש המוסדי בבעלי חיים (CICUAL) של הפקולטה לרפואה, האוניברסיטה הלאומית האוטונומית של מקסיקו (FM/DI/039/2023, CICUAL-009-2023). בעלי החיים סופקו על ידי הוויואריום של ה-Unidad de Medicina Experimental, הפקולטה לרפואה.

הערה: כדי לאפשר הערכה סימולטנית של פעילות β-גלקטוזידאז (SA-β-gal) הקשורה להזדקנות וצביעת Nissl ברקמת מוח מכרסמים, פרוטוקול זה עושה שימוש ב-4% מוחות מכרסמים מקובעים בפרפורמלדהיד, שעוברים קריוסגרציה בטמפרטורה של מינוס 20 ± 1 מעלות צלזיוס. כל החתכים מוערכים תחילה לפעילות SA-β-gal (שלב 1), לאחר מכן צובעים ב-Nissl (שלב 2), ולאחר מכן מותקנים עם מדיום הרכבה אנטי-פייד (שלב 3). לאחר העיבוד, השקופיות נבדקות תחת מיקרוסקופ אופטי בשדה בהיר, המאפשר צילום תמונות ברזולוציה גבוהה של האזורים הרלוונטיים לניתוח נוסף.

1. הכנת חתכי רקמה וזיהוי פעילות β-גלקטוזידאז (SA-β-gal) הקשורה להזדקנות

הכנת חלקי מוח
1. השגת המוח באמצעות פרפוזיה טרנסקרדיאקית עם פרפורמלדהיד ב-4% בהתאם לפרוטוקול שתואר קודם על ידי Wu ואחרים, 2021¹². העבר את המוח לתמיסת מלח עם בופר פוספט (PBS) המכילה 0.01% נתרן אזיד לאחסון ארוך טווח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. כדי להמשיך בפרוטוקול, שים את המוח בתמיסת סוכרוז של 30%, מחכה עד שישקע לתחתית, ואז מאחסן אותו בטמפרטורה של מינוס 20 עד מינוס 80 מעלות צלזיוס. פרוטוקול זה יכול לשמש ברקמות מוח שונות של מכרסמים (למשל, עכברוש, עכבר, חזיר ניסיון) ולהקפיא אותו ב-2-מתילבוטן.
3. קריוחת הרקמה בטמפרטורה של מינוס 20 ± 1 מעלות צלזיוס כדי לקבל חתכים אחידים המוטמעים בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.C.T.) (עובי של 20–40 מיקרון) ומורכבים על שקופיות זכוכית מצופות ג'לטין.
4. התקן חלקים על מחסניות זכוכית ואחסן בתנאים קרים עד לשימוש.
זיהוי פעילות β-גלקטוזידאז (SA-β-gal) הקשורה להזדקנות.
1. הכינו תמיסת צביעה ל-SA-β-gal טרייה ביום השימוש מהתמיסות המוצגות בטבלה 1.
2. כוון את התמיסה ל-pH 6.0 כדי להבטיח את הספציפיות של פעילות SA-β-gal.
  הערה: יש להכין את תמיסת הצביעה של β-גלון לפני השימוש; הימנע מערבוב מוקדם בתמיסה מימית.
  5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-β-D-גלאקטופירנוסיד (X-Gal) אינו יציב בתמיסה מימית.
איזון את טמפרטורת שקופיות הרקמה.
1. הוציאו את הסליידס מהאחסון הקר.
2. הניחו את השקופיות בצנצנת קופלין ותנו להן להתאזן בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות.
3. הרטיב את החלקים על ידי הוספת מספיק PBS כדי לכסות את השקופיות בצנצנת קופלין.
4. הנח את המחסניות על רועיד מסלול במהירות נמוכה למשך 5 דקות ב-RT.
5. חזור על הכביסה פעם אחת.
הכינו שקופיות לצביעה.
1. הסר בעדינות את עודפי ה-PBS מקצוות הסלייד באמצעות נייר סופג.
2. ציירו מחסום הידרופובי סביב כל אזור באמצעות עט מחסום דוחה מים, תוך הימנעות ממגע עם הרקמה.
בצע צביעת SA-β-gal
1. הנח את המחסניות בתא לחות.
2. עם מיקרופיפטה, הוסף כ-200 מיקרוליטר של תמיסת צביעה לכל חלק, כדי להבטיח כיסוי מלא של הרקמה.
3. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
4. לאחר הדגירה, הסר את תמיסת הצביעה באמצעות נייר סופג.
5. הנח את המחסניות בצנצנת קופלין והוסיף PBS לכסות אותן, והנח ערבוב עדין על שייקר אורביטלי במהירות נמוכה למשך 5 דקות ב-RT.
  הערות: אל תשתמשו במדגם CO₂. המשיכו מיד לצביעת Nissl.

2. צביעת Nissl

הכינו את תמיסת ה-Nissl הפועלת.
1. הכינו פתרונות מלאי כפי שמתואר בטבלה 2.
2. מהתמיסות המקוריות, יש להכין את תמיסת העבודה של Nissl על ידי ערבוב של 15 מ"ל תמיסת קרסיל סגול עם 85 מ"ל בופר אצטט.
3. סנן את התמיסה להסרת משקעים עם נייר סינון (דרגה 4, גודל נקבוביות 20-25 מיקרון).
4. לאחר תמיסת המסנן, יש לחמם מראש ב-37 מעלות צלזיוס לפחות 30 דקות (או 40–43 מעלות צלזיוס באמבט מים).
5. הוסף 10 טיפות של חומצה אצטית 0.1 M מיד לפני השימוש לתמיסת העבודה של Nissl.
  הערה: השתמש בתמיסת העבודה של Nissl עד ארבע פעמים באותו יום; אל תאחסן בין לילה.
6. הכינו אתנול מחומץ על ידי הוספת 95 מ"ל אתנול אבסולוטי לבקבוק וולומטרי והוספת 15 טיפות של 0.1 מטר חומצה אצטית. תעלה ל-100 מ"ל מים מזוקקים ותערבב היטב.
הכניסו מראש את השקופיות.
1. הניחו את הסליידס בצנצנת קופלין והוסיפו PBS לפי הצורך כדי לכסות את השקופיות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
כתמי מקטעי כתמים.
1. הטבילה בזהירות בתמיסת Nissl המחוממת מראש, שקופית אחרי שקופית.
2. דגרו את המחסניות ל-5–20 דקות בתמיסת Nissl.
  הערה: הזמן תלוי בעובי הרקמה. צבע מוניטור כל 5 דקות עד שמופיע צבע סגול עמוק.
שטוף את החלקים.
1. שטפו בעדינות את הסליידים במים מזוקקים למשך דקה. העבירו לסליידס בצנצנת קופלין עם מים מזוקקים טריים לדקה נוספת.
2. העריכו את איכות הצביעה. התבוננו בשקופיות תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (10× אובייקטיביות).
3. במיקרוסקופ שדה בהיר, יש לאשר צביעת נקודות סגולים עזים עם רקע מינימלי.
  הערה: אם הרקע מוגזם, טבלו סליידס באתנול חומצה של 95% למשך 10 שניות.
4. העבר מיד לאתנול אבסולוטי למשך 10 שניות כדי לעצור את ההתמיינות.
  הערה: צבע מחדש במידת הצורך, וחזור על שלבי הצביעה (8.1-9.3) אם הצבע חלש.
תייבש ונקה את המגלשות.
1. טבלו את הסליידים בקסילן לפחות 5 דקות (עד שעתיים אם צריך)
  הערה: עבדו במהירות, כי הרקמה מתייבשת תוך ~2 דקות.

3. הרכבה

הכנת מדיום ההתקנה
1. מערבבים 8 מ"ל מדיום התקנה עם 2 מ"ל קסילן.
  הערה: הכינו רק את הכרך הנדרש; מדיום ההרכבה יתקשה במהירות.
2. הסר את השקופיות מהקסילן וטשטש בעדינות את הקצוות. הנח מחסניות על משטח ישר.
3. מרחו ~120 מיקרוליטר של מדיום ההרכבה על הרקמה.
4. הנח את הכיסוי לאט מצד אחד כדי למנוע בועות.
ייבשו את השקופיות וצלמו תמונות.
1. תן למחסניות להתייבש לפחות 5 דקות ב-RT.
2. תבונן תחת מיקרוסקופ שדה בהיר וצלם תמונות של אזורים מעניינים.
3. לאחר ההרכבה, ייבוש מלא של מדיום ההרכבה דורש זמן ממושך (24 שעות).
אחסן את השקופיות.
1. אחסנו שקופיות ב-RT לשימור ארוך טווח (למשך חודשים רבים).

4. כימות נטל ההזדקנות

הערה: גישה זו מיושמת כהערכה איכותנית; עם זאת, כאשר נדרש על ידי עיצוב המחקר, ניתן להרחיב אותו לכלול ניתוח כמותי.

הגדר נטל הזדקנות כשפע יחסי של תאים חיוביים β-גלקטוזידאז (SA-β-gal) הקשורים להזדקנות בתוך אזור עניין מוגדר (ROI). מבטאים מדד זה כאחוז של תאים חיוביים ביחס למספר התאים הכולל, או כצפיפות התאים החיוביים ליחידת שטח (תאים/מ"^{מ 2}).
אזור עניין נבחר (ROI). זיהוי ROIs בהתבסס על נקודות ציון נוירואנטומיות סטנדרטיות באמצעות אטלס מוחי המתאים למין ולגיל. אזורים מומלצים כוללים תת-שדות היפוקמפליים (CA1, CA3, גירוס שיניים) ואזורים קורטיקליים עם ארגון למינרי מוגדר.
1. בחרו 3–5 שדות לא חופפים לכל ROI לכל חלק.
2. נתח לפחות 2–3 חתכים לכל בעל חיים, במרווחים אנטומיים עקביים.
3. שמור על אותו גודל וצורה של תשואה על כל הדגימות.
4. עיוור את המפעיל לתנאים ניסיוניים במהלך בחירת ROI כדי למזער הטיה.
לרכוש תמונות.
1. לצלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר המצויד במצלמה דיגיטלית בתנאים סטנדרטיים:
  1. השתמש בהגדלות עקביות (למשל, 10× לסקירה אזורית, 20× או 40× לכמות).
  2. שמור על תאורה קבועה, זמן חשיפה ואיזון לבן בכל הדגימות.
  3. הימנעו מרוויה של אות SA-β-גלון (כחול) וודאו ויזואליות ברורה של צביעת Nissl (סגול).
  4. שמור תמונות בפורמט ללא אובדן (למשל, TIFF) לניתוח במורד הזרם.
עיבוד מוקדם של התמונות.
1. בצע עיבוד מוקדם באמצעות תוכנות ניתוח תמונה (למשל, ImageJ/Fiji)¹³.
  1. המור תמונות לפורמט RGB במידת הצורך.
  2. הפעילו חיסור רקע כדי לתקן תאורה לא אחידה.
  3. נרמל ניגודיות באופן אחיד בכל התמונות מבלי לשנות את עוצמת האות היחסית.
  4. הימנע מעיבוד יתר שעלול לעוות גבולות אותות.
זהה תאים חיוביים ל-SA-β-gal.
1. הגדר תאים חיוביים בהתבסס על נוכחות משקע כחול מובחן הממוקם בתוך הציטופלזמה. השתמש בסף צבע כדי לבודד את האות הכחול (למשל, טווחי גוון/רוויה/עוצמה שנקבעו אמפירית).
2. אימות ספים באמצעות ביקורת שלילית (רקמה צעירה או לא מטופלת) כדי למנוע צביעת רקע.
אשר עקביות מורפולוגית עם פרופילים תאיים שנצפו בצביעת Nissl.
גישות כימות
1. כימות מבוסס תאים: ספירת תאים SA-β-gal-חיוביים ידנית או באמצעות כלים חצי-אוטומטיים. קבעו את מספר התאים הכולל בתוך אותו ROI באמצעות צביעת Nissl.
2. תוצאות מבטאות כך:
  עומס הזדקנות (%) = (SA-β-gal-positive/תאים כוללים) ' 100
3. כימות מבוסס צפיפות: חישוב מספר התאים החיוביים SA-β-גלון ליחידת שטח:
  צפיפות תאים = תאים חיוביים/שטח תשואה (מ"מ²)
4. הגדרת סף ובקרות: קביעת ספי זיהוי אמפירית:
5. השתמש בבקרות שליליות כדי להגדיר רמות אות רקע.
6. כלול ביקורות חיוביות (למשל, רקמת מוח מזדקנת או מודלים שנגרמו מלחץ) כדי לאמת רגישות.
7. הפעילו הגדרות סף זהות על כל הדגימות בתוך הניסוי. תעד את כל פרמטרי הסף כדי להבטיח שחזוריות.

5. נרמול נתונים וניתוח סטטיסטי

נרמול נטל ההזדקנות כדי להתחשב בהבדלים אזוריים בצפיפות התאים; השתמש בצביעת Nissl כדי להעריך את מספר התאים הכולל לכל ROI—מדידות ממוצעות בין ROIs, מקטעים ובעלי חיים. לבצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות מבחנים מתאימים (למשל, t-test, ANOVA) בהתאם לעיצוב הניסוי.
דווח על הנתונים כממוצע ± SEM או SD, תוך ציון מספר השכפולים הביולוגיים (n).
עיוורון ושחזוריות: בצע את כל ניתוחי הכימות בתנאים עיוורים. אימות שחזוריות על ידי: (א) ניתוח עצמאי על ידי לפחות שני צופים, או (ב) ניתוח מחדש של תת-קבוצה של תמונות להערכת שונות תוך-צופה.
מגבלות אסטרטגיית הכמות: פרש תוצאות כמותיות לצד סמנים משלימים כאשר ניתן. בנוסף, שונות בעוצמת הצביעה בין חתכים עשויה להשפיע על כימות מבוסס סף ויש לשלוט בה בקפידה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השילוב של צביעת β-גלקטוזידאז (SA-β-gal) הקשורה להזדקנות וצביעת Nissl מאפשר הדמיה בו-זמנית של עומס תאי הזקנה וארכיטקטורה ציטוארכיטלית נוירונית באותו חלק מוח.

לאחר תהליך צביעת SA-β-gal (שלב 1), בדקו את השקופיות תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. צביעה מוצלחת מתבטאת בנוכחות משקע כחול מובחן הממוקם בתוך תאים המפגינים פעילות β-גלקטוזידאז (איור 1). בהגדלה נמוכה, יש לזהות אזורים מרכזיים במוח כמו ההיפוקמפוס והקורטקס המוחי (איור 1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

נכון להיום, הזמינות המוגבלת של כלים חזקים וספציפיים לזיהוי, בידוד והסרה סלקטיבית של תאים מזדקנים במערכת העצבים המרכזית ממשיכה להוות מחסום מרכזי למחקרים מכניים. פער מתודולוגי זה מגביל את יכולתנו להפריד בין התרומות הסיבתיות של הזדקנות תאית לנוירופתולוגיה מהקשר בלבד עם התקדמות המחלה. זרימת העבודה המוצגת כאן משלבת זיהוי אנזימטי של SA-β-gal עם צביעת נגד Nissl כדי למפות את העומס המשוער של תאי הזקנה בתוך הקשרים נוירואנטומיים מוגדרים, ובכך לקשר בין קריאות אנזימטיות לשינויים ציטוארכיטקטולוגיים הא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המנהל הכללי לאקדמיה אישית, UNAM (PAPIIT IN224624), ותוכניות מזכירות המדע, ההומנידות, הטכנולוגיה והחדשנות (SECIHTI) כמו Science de Frontera CBF-2025-I-1337 ותוכנית הפוסדוקטורט של UNAM (POSDOC). RJRC קיבל מלגה מספר 1020262 מה-CONAHCyT. VSV קיבלה מלגת פוסט-דוקטורט מתוכנית הפוסט-דוקטורט של בקס, המנהל הכללי של האקדמיה האישית (DGAPA), UNAM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-מתילבוטאן	SIGMA	M32631-500ML
5-ברומו-4-כלורו-3-אינדול β-D-גלקטופירנוזיד (X-Gal)	PROMEGA	V394A	יש לאחסן בטווח טמפרטורות של -30 עד -10 °C
חומצת לימון	MERCK	251275-5G
כרמין ויולט אצטט	SIGMA	C5042-10G
חומר התפלגות להיסטולוגיה DPX	SIGMA	06522-500ML
נייר סינון	Whatman	WHA1001929
חומצה אצטית גלינית	SIGMA	695092-500ML
עט הידרופובי	MERCK	Z672548
קסילן בדרגה היסטולוגית	SIGMA	534056-500ML
תא לחות	STAINTRAY	25501
מגנזיום כלוריד נטול מים	SIGMA	M8266-100G	יש לכוונן את המולריות אם משתמשים במגנזיום כלוריד מלוח.
OCT	SAKURA FINE TEK	4583
מלח פוספט מזוקק (PBS)	SIGMA	P4417-50TAB	משתמשים בטבליות מסחריות.
אשלגן פריאניד (אשלגן הקסאציאנופרט(III))]	SIGMA	P8131-100G
אשלגן פרוסיאניד (אשלגן הקסאציאנופרט(II) טרי-הידראט)	SIGMA	P9387-100G
נתרן אצטט נטול מים	SIGMA	S2889-250G	יש לכוונן את המולריות אם משתמשים בנתרן אצטט מלוח.
נתרן כלורי	SIGMA	S9888-2.5KG
נתרן פוספט (נתרן פוספט דו-בסיסי דו-דהידרטי)	SIGMA	71649-500G

מקורות

Melo Dos Santos, L., et al. Cellular senescence in brain aging and neurodegeneration. Ageing Res Rev. 93, 102141(2024).
Chinta, S. J., et al. Cellular senescence and the aging brain. Exp Gerontol. 68, 3-7 (2015).
Baker, D. J., Petersen, R. C. Cellular senescence in brain aging and neurodegenerative diseases: evidence and perspectives. J Clin Invest. 128 (4), 1208-1216 (2018).
Kuźniar, J., et al. Connections between cellular senescence and Alzheimer’s disease—a narrative review. Int J Mol Sci. 26 (17), 8638(2025).
Martínez-Cué, C., Rueda, N. Cellular senescence in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 14, 16(2020).
Wang, Y., et al. The role of cellular senescence in neurodegenerative diseases. Arch Toxicol. 98 (8), 2393-2408 (2024).
Piechota, M., et al. Is senescence-associated β-galactosidase a marker of neuronal senescence? Oncotarget. 7 (49), 81099-81109 (2016).
Zhang, H., et al. Mangiferin alleviated poststroke cognitive impairment by modulating lipid metabolism in rats with cerebral ischemia/reperfusion. Eur J Pharmacol. 977, 176724(2024).
Hussain, M. S., et al. Autophagy and cellular senescence in Alzheimer’s disease: key drivers of neurodegeneration. CNS Neurosci Ther. 31 (7), e70503(2025).
Si, Z., Sun, L., Wang, X. Evidence and perspectives of cell senescence in neurodegenerative diseases. Biomed Pharmacother. 137, 111327(2021).
Meystre, J., et al. Cell density quantification of high resolution Nissl images of the juvenile rat brain. Front Neuroanat. 18, 1463632(2024).
Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), (2021).
Lozano-Gerona, J., García-Otín, Á-L. ImageJ-based semiautomatic method to analyze senescence in cell culture. Anal Biochem. 543, 30-32 (2018).
Huang, W., et al. Cellular senescence: the good, the bad and the unknown. Nat Rev Nephrol. 18 (10), 611-627 (2022).
Zeng, W. -J., et al. A novel inflammation-related lncRNAs prognostic signature identifies LINC00346 in promoting proliferation, migration, and immune infiltration of glioma. Front Immunol. 13, 810572(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

233 233 JoVE