הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה בזמן אמת של תגובה ללחץ המושרה על ידי המארח באגרגטים של Pseudomonas aeruginosa

173 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70682

⸱

15 במאי 2026

 , 
1Department of Molecular Medicine, University of South Florida

במאמר זה

סיכום

האגרגטים של Pseudomonas aeruginosa מראים סבילות מוגברת לאנטיביוטיקה ולתאי מערכת החיסון. תפקיד שלמות הממברנה בהישרדות מצטברת אינו נחקר כיום. מחקר זה מדגים שיטה לכימות שינויים בדינמיקת ממברנת התא בתוך אגרגטים של P. aeruginosa כדי להבין כיצד שלמות התא יכולה להשפיע על הקיימות הכוללת של האגרג.

תקציר

זיהומים כרוניים, כמו אלו בסיסטיק פיברוזיס (CF), נתמכים על ידי מצברים קטנים ועמידים מאוד של Pseudomonas aeruginosa , שנשארים למרות לחצים חיסוניים וטיפוליים. בניגוד לביופילמים קלאסיים, אגרגטים אלו מייצגים יחידה פתוגנית מובחנת – קהילות מיקרוסקאליות, מאורגנות מרחבי, השומרות על שלמות מבנית והומאוסטזיס פיזיולוגי תחת לחץ מונע על ידי המארח. עם זאת, המנגנונים שמאפשרים לאגרגטים להישאר שלמים בתנאים אלו, והאם ניתן לשבש תהליכים הומאוסטטיים אלה באופן סלקטיבי, נותרו לא מוגדרים היטב. מחסום מרכזי לטיפול בפער זה היה היעדר כלים המסוגלים ללכוד תהליכים דינמיים ומרחביים שמקשרים בין לחץ פיזיולוגי ליציבות מבנית וקריסה בזמן אמת. מחקר זה מציג תהליך משולב של דימות ואנליט לכימות תגובות מצטברות ללחצים הרלוונטיים למארח. באמצעות הצבע הרגיש למתח DiBAC4(5), דפולריזציה של הממברנה נבדקה כאינדיקטור מוקדם להפרעה פיזיולוגית בתוך אגרגטים שנוצרו במידת ליחה סיסטטית סינתטית (SCFM2). מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה מאפשרת הדמיה של אגרגטים הן במצב יציב והן במצבים מושפעים ממתח, בעוד שסגמנטציה של תמונה וניתוח מבוסס ווקסלים מספקים מיפוי כמותי של הטרוגניות מרחבית בשלמות הממברנה ובפירוק האגרגציה ברזולוציה של תא יחיד. תהליך עבודה זה יוצר פלטפורמה ניתנת לשחזור והתאמה לקישור בין לחץ פיזיולוגי לתוצאות מבניות באגרגטים חיידקיים רב-תאיים. על ידי אפשרות ניתוח כמותי של התהליכים השומרים – או פוגעים – בשלמות המצטברת, גישה זו מספקת בסיס קריטי לזיהוי ומיקוד במנגנונים ההומאוסטטיים התומכים בעמידות המצטברת, ומקדמת אסטרטגיות חדשות לשיבוש מצב קליני משמעותי זה של התמדה חיידקית.

מבוא

זיהומים חיידקיים כרוניים נשמרים לעיתים קרובות לא על ידי ביופילמים גדולים מחוברים למשטח, אלא על ידי מצברים קטנים ורב-תאיים הנוצרים בסביבות הקשורות למארח. בציסטיק פיברוזיס (CF) ובמחלות כרוניות אחרות בדרכי הנשימה, Pseudomonas aeruginosa מופיעה בדרך כלל כאגרגטים תלויים המוטבעים בתוך ריר או ליחה, ולא כביופילמים קלאסיים המחוברים למשטחי אפיתל. אגרגטים אלו מייצגים מצב צמיחה מובחן, המאופיין בארגון מרחבי בקנה מידה מיקרו, הטרוגניות פיזיולוגית בולטת וסבילות יוצאת דופן ללחצים חיסוניים ואנטימיקרוביאליים 1,2,3,4. למרות הרלוונטיות הקלינית שלהם, המנגנונים השולטים ביציבות המצטברת, אשר בפרוטוקול זה מוגדרים כיכולת לשמור על שלמות הממברנה וארגון מרחבי תחת לחצים כאלה, נותרו מובנים היטב, כאשר מחקרים קודמים התמקדו יותר ברכיבי מטריצה התומכים ביצירת ביופילם מחובר למשטח 5,6.

מכשול מרכזי לחקר אירועים התורמים לחוסר יציבות מצטברת, כגון שינויים בדפולריזציה של ממברנה וארכיטקטורת אגרגט, הוא היעדר זרימות עבודה ניסיוניות שתופסות שינויים פיזיולוגיים ומבניים דינמיים בזמן אמת 7,8. בדיקות נפוצות מסורתיות ודימות נקודות קצה אינן יכולות לפתור כיצד תגובות הלחץ מתפתחות בתוך אגרגטים, כיצד תגובות אלו מתפזרות במרחב, או כיצד היחלשות פיזיולוגית, כגון דה-פולריזציה של ממברנה ואובדן הומאוסטזיס יונים, מתורגמות לסימנים מוקדמים ללחץ תאי ולקריסה פיזית בסופו של דבר. בעוד שמיקרוסקופיה קונפוקלית יושמה באופן נרחב בביופילמים מחוברים למשטח, פחות גישות משלבות דימות בטווח זמן עם ניתוח כמותי שמקשר ישירות את פיזיולוגיה תאית לארכיטקטורה האגרגטיבית ולפעילות הממברנה.

שינויים בפוטנציאל הממברנה החיידקיים מספקים אינדיקטור מוקדם ורגיש ללחץ תאי ואובדן הומאוסטזיס. צבעים רגישים למתח כגון bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) פנטמתין אוקסונול (DiBAC4(5)) מצטברים בתאים דה-פולריים ומציעים קריאה לא הרסנית מבוססת פלואורסצנציה של שלמות הממברנה. למרות שצבעי DiBAC שימשו להערכת דה-פולריזציה של ממברנה בתרביות פלנקטוניות ובביופילמים מחוברים לפני השטח 9,10, יישומם באגרגטים רב-תאיים, במיוחד בתנאי גדילה פיזיולוגיים רלוונטיים ודימות טיים-לפס, היה מוגבל.

כאן אנו מציגים תהליך משולב של הדמיה וניתוח המאפשר ויזואליזציה בזמן אמת וכימות של דה-פולריזציה של ממברנה וכשל מבני באגרגטים של P. aeruginosa. אגרגטים נוצרים במדיום ליחה סיסטיק סינתטי (SCFM2), מדיום מוגדר כימית שמסכם תכונות תזונתיות ויוניות מרכזיות של נתיב הנשימה CF ותומך ביצירת אגרגטים ספונטנית ללא משטחים או זרימה11,12. בתנאים אלו, P. aeruginosa יוצרת אגרגטים תלויים בגדלים ובהטרוגניות מבנית הדומה לאלו שנצפו בדגימות ליחה ובדרכי הנשימה של CF, ומספקת פלטפורמה פיזיולוגית רלוונטית לחקר התנהגות מצטברת13.

באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי סורק בטיימ-לפס תחת טמפרטורה ולחות מבוקרות, זרימת עבודה זו לוכדת הן מצבים מצטברים יציבים והן מצבים מונעים ממתח, המסומנים בדפולריזציה מוגברת של הממברנה ואובדן הומאוסטזיס תאי לאורך תקופות דימות ממושכות. על ידי שילוב דיווח פוטנציאל ממברנה מבוסס DiBAC עם הדמיית z-stack ברזולוציה גבוהה, שיטה זו מאפשרת כימות של פלואורסצנציה DiBAC₄(5) ברמת תא יחיד, עם ערכים הממופים והמנותחים בהקשר המרחבי של אגרגטים בודדים. סגמנטציה במורד התמונה וניתוח פני שטח מבוסס ווקסלים מאפשרים לכמת שינויים בארכיטקטורה האגרגטיבית ובדה-פולריזציה של הממברנה במקביל.

חשוב לציין כי למרות שפרוטוקול זה מוצג באמצעות אגרגטים של P. aeruginosa שנוצרו ב-SCFM2, זרימת העבודה ניתנת להכללה רחבה. אסטרטגיית ההדמיה, הקריאה הפיזיולוגית המבוססת על צבע והמסגרת האנליטית ניתנות להתאמה בקלות למינים אחרים של חיידקים, מדיות מקדמות אגרגציה ולגורמי לחץ, כולל סוכנים אנטי-מיקרוביאליים, משפיעני מערכת החיסון או הפרעות סביבתיות. לכן, גישה זו מספקת פלטפורמה ניתנת להעברה וניתנת לשחזור לחקירת יציבות קהילות חיידקים בהקשרים ניסיוניים מגוונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל העבודה עם P. aeruginosa חייבת להתבצע תחת תנאי הכלה מתאימים של BSL-2 ואישורי בטיחות ביולוגית מוסדית. הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. יצירת אגרגטים של Pseudomonas aeruginosa בתווך ליחה סינתטי של פיברוזיס (SCFM2)

הערה: שלב זה מתאר הכנת תרביות P. aeruginosa והיווצרות אגרגטים רב-תאיים תלויים בתנאים פיזיולוגיים המדמים את סביבת דרכי הנשימה של ה-CF.

  1. הכנת תרביות חיידקים
    1. יום לפני הניסוי, יש לחסן את סוג הבר Pseudomonas aeruginosa PAO1 הנושא פלסמיד pMRP9-1 (GFP)14 ממאגרי גליצרול קפואים, לתוך מרק ליזוגני של 5 מ"ל (LB).
    2. הוסף קרבניצילין (300 מיקרוגרם/מ"ל) כדי לשמור על ברירה בפלסמיד.
    3. גידול תרביות בלילה בטמפרטורה של 37°C עם ניעור ב-200 סל"ד.
  2. דילול אחורי והכנה ליצירת אגרגט
    1. ביום הניסוי, יש לדלל מחדש תרביות לילה ביחס 1:5 (1 מ"ל בלילה: 4 מ"ל פאונד. אנטיביוטיקה אינה מוסיפה מחדש בשלב זה; ההשפעה השארית מינימלית ואינה משפיעה על הגדילה).
    2. גידול תרביות ל-~2 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור (200 סל"ד) כדי להגיע לשלב לוגריתמי.
      הערה: תאים נמצאים בדרך כלל בשלב האקספוננציאלי המוקדם לאחר ~2 שעות בתנאים אלה. בנוסף, תאים נשטפים לאחר מכן לפני ההזרקה ל-SCFM2 כדי למזער שאריות האנטיביוטיקה.
  3. הכנה ואיזון של SCFM2
    1. כ-30 דקות לפני סיום תקופת הדילול האחורית, יש לשלב את SCFM2 המוכן מראש לצינורות סטריליים ולחמם אותו ל-37 מעלות צלזיוס.
    2. להדמיה בצלחת אופטית עם 4 בארות עם תחתית זכוכית, יש להקצות 500 מיקרו-ליטר SCFM2 לכל באר. הכין נפח עודף כדי להתחשב בטעות בפיפטינג.
      הערה: SCFM2 מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. חימום מוקדם ממזער את זעזוע הטמפרטורה ומשפר את השחזור של היווצרות האגרג.
  4. שטיפה וסטנדרטיזציה של אינקולום
    1. תרביות פלט בצנטריפוגציה ב-4200 x גרם למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: אם נדרשים חישובים לסל"ד, רדיוס הרוטור של רוטור הדלי המתנדנד הוא 172 מ"מ.
    2. הסר את הסופרנטנט והחזיר את הכדורים ב-3 מ"ל של PBS סטרילי (pH 7.0).
    3. חזור על שלבי הכביסה פעמיים נוספות (סך הכל שלוש שטיפות נוספות).
    4. מדוד OD₆₀₀ וחשב את הנפח הנדרש לחיסון SCFM2 ל-OD₆₀₀ התחלתי של 0.05.
    5. Vortex לזמן קצר כדי להומוגן תאים ולהחסין כל באר המכילה 500 מיקרו-ליטר SCFM2.
  5. היווצרות אגרגטים בתנאים סטטיים
    1. דגירה סטטית של SCFM2 בטמפרטורה סטטית של 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות כדי לאפשר היווצרות אגרג.
      הערה: דגירה של 4 שעות מניבה באופן שכפולי אגרגטים תלויים בגודל והטרוגניות דומים לאלו שנצפו בליחה ובדגימות דרכי הנשימה של CF, תוך מזעור הבשלה הביופילמית בשלבים מתקדמים 1,15.

2. הכנת גורם לחץ הקשור למערכת החיסון (אלסטאז נויטרופילי אנושי)

הערה: שלב זה מתאר את הכנת גורם לחץ שמקורו במארח, המשמש לגרימת מתח תאי וחוסר יציבות של אגרגטים חיידקיים.

  1. שיקום ואחסון אלסטאז נויטרופילי אנושי (HNE)
    1. שחזור אלסטאז נויטרופילי אנושי לפי המלצות היצרן באמצעות 50 מילימטר נתרן אצטט, 200 מ"מ NaCl ומים סטריליים.
    2. מכינים תמיסה של 50 מיקרוגרם/ליטר ומעטאים את המסנן באמצעות פילטר של 0.2 מיקרון.
    3. אליקווט לנפחים של 50 מ"ל ואחסן בטמפרטורה של −20°C.
    4. בלילה שלפני השימוש, הפשיר אליקו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: אליקוטינג ממזער מחזורי קיפאון–הפשרה, שיכולים להפחית פעילות אנזימטית ולהכניס שונות. אליקווטים יציבים בטמפרטורה של 4°C למשך כחודש אחד.

3. הכנה ויישום של DiBAC4(5) לדיווח על דה-פולריזציה של ממברנה

הערה: שלב זה מתאר את ההכנה והשימוש בצבע רגיש למתח כדי להמחיש דה-פולריזציה של ממברנה בתוך אגרגטים.

  1. הכנה ואחסון של DiBAC4(5)
    1. התחילו בהכנת תמיסה מקורת של DiBAC4(5). שחזר אבקת DiBAC4(5) ב-DMSO חסר מים ל-1 מ"ג/מ"ל.
      הערה: שיקום DiBAC4(5) ב-DMSO עוקב אחר המלצות יצרן סטנדרטיות.
    2. אליקווט בנפחים של 100 מיקרוליטר ואחסן בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס מוגן מאור.
    3. השתמש בכל אליקווט לא יותר מפעמיים.
      הערה: DiBAC4(5) שקול פונקציונלית ל-DiBAC4(3) אך נבחר כאן כדי להתאים לספקטרום הגירוי/פליטה של GFP. בפרוטוקול זה, DiBAC4(3) משמש רק לצביעה נוספת שנדונה בסעיף התוצאות. הצבע העיקרי המשמש לאורך פרוטוקול זה הוא DiBAC4(5).

4. הדמיה קונפוקלית בזמן-לפס של דה-פולריזציה של ממברנה באגרגטים של P. aeruginosa

הערה: שלב זה מתאר רכישת תמונות קונפוקליות ברזולוציה גבוהה, ברזולוציה של זמן, כדי ללכוד שינויים פיזיולוגיים ומבניים דינמיים באגרגטים.

  1. הכנה למיקרוסקופ ולתא סביבתי
    1. התקן מיקרופלטה מחוממת או תא סביבתי על שלב המיקרוסקופ הקונפוקלי.
    2. הפעל את בקרת הטמפרטורה והלחות לפחות שעה לפני ההדמיה והגדר ל-37 מעלות צלזיוס.
    3. בלשונית הרכישה , אתר את לשונית הלייזר וכשע לפני השימוש, הפעל את הלייזרים הנדרשים כדי לאפשר חימום מספק (לייזר ארגון ל-GFP; DPSS 561-10 עבור DiBAC4(5)) (איור משלים 1A).
      הערה: שליטה סביבתית יציבה מפחיתה סטיית פוקוס ושומרת על שלמות האגרגטיבית במהלך ניסויים עם זמן קצר ארוך.
  2. שימוש בגורם הלחץ החיסוני
    1. לאחר 4 שעות של היווצרות אגרגט, הוסף HNE לבארות הניסוי לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם/ליטר 16.
    2. להשאיר את בארות השליטה ללא טיפול.
    3. העבר את הצלחת עם 4 בארות לשלב המיקרוסקופ.
      הערה: HNE הוכן בריכוזים פיזיולוגיים רלוונטיים (μg/L), בהתבסס על רמות מדווחות בליחה מושרת, ולא כמלאי מרוכז. הריכוזים המשמשים למחקר זה נמצאים ב-McGarvey ואחרים, 16 תחת IS (ליחה מושרת), NE-AAT (קומפלקס NE/a1-אנטי-טריפסין), HV (מתנדב בריא).
  3. זיהוי אזורים מצטברים בעלי עניין
    1. באמצעות לשונית Locate ומטרת 20×, הפעל את האור המשודר כדי לזהות אזורים עשירים באגרגט באמצעות הדמיית שדה בהיר (איור 1B משלים).
    2. בזמן שאתה עדיין משתמש בהדמיית שדות בהירים, נווט ללשונית הרכישה ושמור קואורדינטות x-, y- ו-z באמצעות מודול מיקומים (איור משלים 1C).
    3. חזור על זה עבור מספר שכפולים טכניים בכל באר.
  4. רכישת z-stack ברזולוציה גבוהה ורכישת סדרות זמן
    1. עבור למיקום שמור ועבר למטרה של טבילה בשמן בגובה 63×.
    2. מרחו שמן טבילה לפני מיקום המערכת.
    3. בלשונית הרכישה , הגדר ערוצים באמצעות Smart Setup (איור משלים 1D): GFP (488/509 ננומטר) – הקצאת ירוק, DiBAC4(5) (591/615 ננומטר) – הקצאת אדום.
    4. נווט לתצוגת Live , ואז באמצעות מודול Z-stack , זהה את תחתית ה-coverslip על ידי כוונון המיקוד העדין ואז הגדר אותו כמיקום z הראשון על ידי לחיצה על Set First (איור משלים 1E).
    5. התקדמו כלפי מעלה עד שהטווח מציין 60 מיקרון ומגדירים את מיקום ה-z הסופי על ידי לחיצה על Set Last (איור משלים 1E).
    6. כבה את התצוגה החיה והפעיל את Definite Focus. בחר ב-Find Surface, ולאחר מכן בחר ב-Store Focus רק כאשר הסטטוס מציין Reflex Found (איור משלים 1F).
    7. כיול פוקוס חוזר עבור כל מיקום שנשמר באמצעות מודולי Z-stack ומודולים Definite Focus .
    8. הגדר את רכישת סדרת הזמן כדי לצלם כל מיקום כל 3 דקות למשך 6 שעות (איור משלים 1G).
      הערה: ניתן להשהות כאן את הפרוטוקול להפשרה, הוספה ודגירה של צבע DiBAC4(5), וניתן להמשיך בו לאחר תקופת הדגירה.
    9. בחר התחל ניסוי.
      הערה: מרווחי שלוש דקות מאזנים בין רזולוציה זמנית לבין פוטוטוקסיות ושיקולי פוטו-לבנה.
  5. תוספת ודגירה ב-DiBAC4(5)
    1. הוסף DiBAC4(5) לכל באר לריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל9.
    2. דגרו בחושך במשך 30 דקות לפני שמתחילים בהדמיית טיים-לאפס.
      הערה: דגירה זו מאפשרת איזון צבע תוך מזעור הפלואורסצנציה ברקע.

5. ניתוח תמונה כמותי של מבנה מצטבר וקולוקליזציה DiBAC4(5)

הערה: שלב זה מתאר תהליך כמותי לקישור דה-פולריזציה של ממברנה לארכיטקטורת אגרגט וחוסר יציבות.

  1. ייבוא תמונה והפרדת ערוצים
    1. העלה קבצי תמונה (.czi או שווה ערך) לתוכנת Imaris x64 גרסה 10.2.0 ומעלה.
    2. אימות כיול הווקסלים על ידי בדיקת מידות הפיקסלים x, y ו-z (גודל הווקסל) במטא-דאטה של התמונה משקפים במדויק את פרמטרי הרכישה הקונפוקליים (אובייקטיביה, זום, גודל z-step). כיול שגוי יגרום לשגיאות במדידות מרחביות ונפחיות.
  2. הדמיית פני שטח של אגרגטים חיידקיים ואות DiBAC4(5)
    1. השתמש במודול Surfaces כדי להציג אגרגטים של P. aeruginosa :
      1. תחת הגדרת סגמנטציה, בחרו בערוץ GFP (איור משלים 2A).
      2. בחר להפעיל פיצול מגע באובייקטים (אזור גדל) ולהתאים את סף העוצמה כדי ללכוד מלא את האגרגטים (איור משלים 2B).
      3. במודול נקודות זרעי המסנן , שנו את סוג המסנן למספר הווקסלים Img = 1 והגדרו ל-90% (איור משלים 2C).
      4. לאחר עיבוד ההדמיה, כוון את המשטחים ל-100% (איור משלים 2D).
    2. השלים את ההדמיה והקצה צבע ירוק למשטחי חיידקים (איור משלים 2E).
    3. חזור על הרינדור עבור ערוץ DiBAC4(5) והקצה צבע אדום.
  3. קו-לוקליזציה וכימות מבוסס נפח
    1. בחר את רינדור השטח DiBAC4(5) (איור משלים 3A) וקבע באיזה נקודת זמן תתבצע ניתוח הקולוקליזציה.
    2. עבור לסטטיסטיקה > לשונית מפורטת > ערכים ספציפיים (איור משלים 3B).
    3. הגדר קו-לוקליזציה על ידי בחירת אובייקטים עם המרחק הקצר ביותר למשטחי החיידק של 0.00 (איור משלים 3B).
    4. אתר עריכה, ואז שכפל את האובייקטים הללו כדי ליצור משטח חופף ל-DiBAC עם תאים (איור משלים 3C). ודאו שאתם משנים את שם המשטח כדי לציין את האיכויות החופפות שלו.
    5. בלשונית המפורט תחת ערכים ממוצעים, רשמו ערכי נפח מסוכמים בכל נקודת זמן נבחרת עבור: (1) אות כולל DiBAC4(5) (איור משלים 3D); (2) אות DiBAC4(5) מוקם (איור משלים 3E).
    6. חשב אחוזי חפיפה כך:
      figure-protocol-1
      הערה: אחוז החפיפה משקף את שיעור האות DiBAC₄(5) המקושר לתאים בתוך אגרגטים, המשקף דפולריזציה של ממברנה בנקודת זמן נתונה.
      הערה: למרות שהודגמה באמצעות אגרגטים של P. aeruginosa ב-SCFM2 והודגשה עם HNE, זרימת עבודה זו מותאמת באופן רחב למינים חיידקיים אחרים, מדיות מעודדות אגרג, מדווחי פלואורסצנט, וגורמי לחץ, כולל חומרים אנטי-מיקרוביאליים או הפרעות סביבתיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בפרוטוקול שתואר לעיל מסופקת שיטה למעקב אחר שינויים בדינמיקת הממברנה של אגרגטים של P. aeruginosa שמודל בסביבה ריאתית של סיסטיק פיברוזיס (איור 1). באמצעות זן מסוג פראי מסוג PAO1 הנושא פלסמיד pMRP9-1 (GFP) (איור 1A), HNE לסימולציה של לחץ חיסוני, וצבע ממברנה DiBAC4(5) (איור 1C), נמדדו שינויים בדפולריזציה של הממברנה, המשקפים שיבוש פוטנציאל הממברנה וההומאוסטזיס התאי, (...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פוטנציאל הממברנה משמש כקריאה רגישה ומוקדמת של לחץ תאי והומאוסטזיס מופרע. בתוך אגרגטים חיידקיים רב-תאיים, שינויים פיזיולוגיים אלו מתרחשים לפני, ועשויים להוביל לחוסר יציבות מבני לאחר מכן. כאן אנו מציגים תהליך עבודה מבוסס הדמיה המשתמש באוקסונול הפנטמתין בתגובה איטית ורגיש לפוטנציאל ביס-(1,3-דיבוטילברביטורית חומצה) פנטמתין (DiBAC4(5)) כדי לעקוב אחר דפולריזציה באגרגטים של Pseudomonas aeruginosa שנחשפו ללחץ שמקורו במארח. מעקב אחר דה-פולריזציה מספק תובנות חשובות לגבי הפיזיול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

S.E.D נתמכת על ידי מימון התחלתי הניתנים על ידי המחלקה לרפואה מולקולרית באוניברסיטת דרום פלורידה, וכן מענקי מחקר מקרן סיסטיק פיברוזיס (CFF) (DARCH19G0, DARCH22P0, DARCH25G0).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה 1,3-דיבוטילברביטורית) פנטמתין אוקסונול (DiBAC4(3))AAT ביוקווסט21411  ליפופילית, מולקולה אניונית 
חומצה 1,3-דיבוטילברביטורית) פנטמתין אוקסונול (DiBAC4(5))AAT ביוקווסט21410  ליפופילית, מולקולה אניונית 
קרבניצילין Research Products International  C46000-5.0משמש לבחירת זנים מבטאים GFP של PAO1
צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ Cellvis 4 תאיםפישרNC0600518צלחת תא תחתית זכוכית מאפשרת שמירה על מצברים תלויים במדיום הצמיחה בזמן הדמיה 
צנטריפוגהבקמן קולטר מדעי החיים  B06320בשילוב עם רוטור דלי מתנדנד Beckman Coulter Life Sciences SX4400 (מספר חלק: B01425)
מיקרוסקופ סורק לייזר קונפוקלי (CLSM)צייסLSM 880מודל ה-CLSM ששימש לניסויים המתוארים בפרוטוקול זה כבר אינו זמין, אך ה-LSM 900 הוא אפשרות מקבילה מעודכנת 
צינורות תרבותג'נסי21-130סטרילי; פוליפרופילן 
DAPIתרמו פישר62248שימש ליישומים מוצעים עתידיים לצביעת נויטרופילים ב-DiBAC4(5)
קובטות חד-פעמיות  ברנד טק759086D1.5 מ"ל, חצי-מיקרו
DMSOמיליפור-סיגמא276855-100MLשימש לשיקום DiBAC4(3,5)
DRAQ5תרמו פישר65-0880-92שימש ליישומים עתידיים מוצעים לצביעת נויטרופילים עם DiBAC4(3)
לשכת הסביבה של CLSMPECONLSM 880מערכת זו יוצרה במיוחד עבור מוצרי Zeiss ומכונה בדרך כלל "Incubation System S" וכל הרכיבים ניתנים להזמנה דרך Zeiss כתוספת ל-LSM 880 (או מערכת דומה)
גנטמיצין סולפט פישרBP918-1משמש לבחירת זנים מבטאים RFP של PA1633
גליצרול ג'נסי18-205שימש להקפאת זנים לאחסון ארוך טווח ב-80  ° C
נויטרופיל אלסטאז אנושי (HNE)מיליפור-סיגמא324681-50UGלאחר ההתארגנות מחודשת, היא יציבה למשך חודש אחד ב-4  ° C או שנה אחת בגיל 20  ° C
תוכנת Imaris x64אוקספורד אינסטרומנטס גרסה 10.2.0
שמן טבילה  מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים  16919-12לא מייבשת; סטנדרטי ב-37  ° C
אינקובטור Benchmark ScientificH1001-Mמסוגל לרעוד
מרק ליזוגני (LB)ג'נסי11-118מילר מיקס
mCherry plasmid התקבל משותף 
זן מוטנטי של PA1633 טרנספוזון התקבל משותף 
מלח זרחן (PBS)תרמו פישר3002pH 7.0
נתרן אצטטתרמו פישרAM9740בן 3; pH 5.5; ללא RNase
כלוריד נתרןפישר S271-500שימש לאיחוד מחדש של HNE
ספקטרופוטומטר&nb;VWR634-0882משמש למדידת צפיפות תאים לצורך חיסון PAO1/PA1633 לתוך SCFM2
.22 ומיקרו סטרילי; מסנן mג'נסי25-244שימש לטיהור HNE משוחזר
צינורות מיקרוצנטריפוגה סטרילייםג'נסי24-272LR0.6 מ"ל
מזרק סטריליפישר14955459שימש לטיהור HNE משוחזר
רוטור דלי מתנדנד SX4400  בקמן קולטר מדעי החיים  B01425הוצמד עם צנטריפוגת Beckman Coulter Life Sciences (מספר חלק: B06320)
מדיום ליחה סיסטטי סינתטי (SCFM2)סינתביום10002-500אצווה #: 001-CF2-0724
מים טהורים במיוחדג'נסי18-195שימש לשיקום HNE
סוג בר Pseudomonas aeruginosa PAO1 עם pMRP9-1 פלסמיד פלסמיד pMRP9-1 זה מכיל GFP ומבטא עמידות לקרבניצילין&nb;
ZEN Black Edition 2.3 תוכנת Zeiss Imaging  צייסתואם ל-LSM 880

מקורות

  1. Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. mBio. 8 (2), e00240-17(2017).
  2. Rada, B. Interactions between neutrophils and Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis. Pathogens. 6 (1), 10(2017).
  3. Kragh, K. N., Tolker-Nielsen, T., Lichtenberg, M. The non-attached biofilm aggregate. Commun Biol. 6 (1), 898(2023).
  4. Gannon, A. D., Matlack, J., Darch, S. E. Exploring aggregation genes in a P. aeruginosa chronic infection model. J Bacteriol. 207 (1), e00429-24(2025).
  5. Melaugh, G., et al. Distinct types of multicellular aggregates in Pseudomonas aeruginosa liquid cultures. npj Biofilms Microbiomes. 9 (1), 52(2023).
  6. Letizia, M., Diggle, S. P., Whiteley, M. Pseudomonas aeruginosa: Ecology, evolution, pathogenesis and antimicrobial susceptibility. Nat Rev Microbiol. 23, 701-717 (2025).
  7. Andersen, J. B., et al. Identification of small molecules that interfere with c-di-GMP signaling and induce dispersal of Pseudomonas aeruginosa biofilms. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 59(2021).
  8. Andersen, J. B., et al. Induction of native c-di-GMP phosphodiesterases leads to dispersal of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 65 (4), e02431-20(2021).
  9. Lee, W., Woo, E. R., Lee, D. G. Phytol exhibits antibacterial activity by inducing oxidative stress in Pseudomonas aeruginosa. Free Radic Res. 50 (12), 1309-1318 (2016).
  10. Shirazi, F., et al. Biofilm filtrates of Pseudomonas aeruginosa inhibit preformed Aspergillus fumigatus biofilms via apoptosis. PLoS One. 11 (3), e0150155(2016).
  11. Palmer, K. L., Mashburn, L. M., Singh, P. K., Whiteley, M. Cystic fibrosis sputum supports growth and key physiological traits of Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187 (15), 5267-5277 (2005).
  12. Turner, K. H., et al. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  13. Gannon, A. D., Darch, S. E. Tools for real-time assessment of a Pseudomonas aeruginosa infection model. J Vis Exp. (170), e62420(2021).
  14. Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
  15. Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (18), 4779-4784 (2018).
  16. McGarvey, L. P. A., et al. Cytokine concentrations and neutrophil elastase activity in bronchoalveolar lavage and sputum in cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 1 (4), 269-275 (2002).
  17. Adams, D. S., Levin, M. Measuring resting membrane potential using fluorescent voltage reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 459-464 (2012).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  19. Lagendijk, E. L., et al. Genetic tools for tagging Gram-negative bacteria with mCherry for visualization. FEMS Microbiol Lett. 305 (1), 81-90 (2010).
  20. Meylan, S., et al. Carbon sources tune antibiotic susceptibility in Pseudomonas aeruginosa via TCA cycle control. Cell Chem Biol. 24 (2), 195-206 (2017).
  21. Wickremasinghe, H., et al. Polymyxin B and meropenem synergistically kill multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and reduce biofilm formation. Antibiotics (Basel). 10 (4), 405(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.