טרנסדוקציה לנטיוויראלית כפולה ליצירת תאי גזע עצביים מוטנטיים למחקר גליומה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את יצירת תאי גזע עצביים של עכברים מוטנטים (NSCs) למחקר גליומה באמצעות טרנסדוקציות לנטיויראליות עוקבות. מוטציות אונקוגניות מוכנסות תחילה ל-NSCs, ואחריהן לנטיווירוס ביציסטרוני המכיל גני מדווח. לאחר בחירת אנטיביוטיקה כפולה, NSCs מוטנטיים מאפשרים הדמיה בזמן אמת של צמיחת הגידול ותגובת הטיפול.

תקציר

גליומות הן הגידולים הראשוניים הנפוצים ביותר במבוגרים, ומודלים של עכברים מצביעים על כך שהן עשויות להיגרם ממוטציות אונקוגניות ב-NSCs או בגורמים אב מוקדמים שמבדילים אותם מוקדם. מודלים של השתלות אורטופוקיים שמקורם ב-NSCs מוטנטיים יכולים להניב מידע פרה-קליני חשוב על פתוגנזה, תוצאות ותגובת הטיפול בגליומה. מודלים אלה דורשים הכנסת מוטציה אונקוגנית ל-NSCs, בשילוב מועדף עם כתבים כדי לסייע בקביעת יעילות הטרנספקציה/טרנסדוקציה ולניטור גדילה בגידול בגוף. פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת טרנסדוקציה כפולה ליצירת NSCs מוטנטיים המתאימים למעקב גידולים בתוך החיים . בטכניקה זו, NSCs מבודדים מועברים תחילה עם לנטי-וירוסים המכילים גן מעניין (מוטציה אונקוגנית או בקרת חלבון פלואורסצנטי ירוק [GFP]) בנוסף לאלמנט עמיד לבלסטיצידין. לאחר ברירה של בלסטיצידין, התאים עוברים שינוי משני עם וקטור לנטיוויראלי ביציסטרוני המבטא לוסיפראז וחלבון פלואורסצנטי אדום (RFP), וכן אלמנט עמיד לפורומיצין. לאחר ברירה של פורומיצין, ניתן להרחיב תאים לבדיקות רבייה, השתלות אורטופטיות או יישומים אחרים במורד הזרם. גישה זו של טרנסדוקציה כפולה מאפשרת הערכת יעילות ההעברה בשני שלבי הזיהום וכן ניטור היווצרות, גדילה ותגובת גידולים ב-vivo באמצעות הדמיה ביולוגית לא פולשנית (BLI). מערכת זו מהווה כלי שימושי למחקר גליומה, ומאחדת את הרלוונטיות הביולוגית של מידול גידולים שמקורם בתאי גזע עצביים במבוגרים עם היתרון המעשי של יכולת הדמיה בזמן אמת, ובסופו של דבר משפרת את ההבנה של ביולוגיית גליומה וקידום גישות טיפוליות חדשות.

מבוא

גליומות הן הצורה הנפוצה ביותר של גידולים ראשוניים במוח הפוגעים במבוגרים, ומהוות כ-80% מכלל הניאופלזמות הממאירות במוח באוכלוסייה זו¹. רובם הם גליומות בדרגה^{גבוהה 2}, שלרוב הן פולשניות מאוד ונושאות תחזית גרועה ^3,4 למרות התקדמות משמעותית בטכניקות נוירוכירורגיות, טיפול קרינתי וגישות כימותרפיות⁵. שיעור התמותה הגבוה בקרב חולים שנפגעו מגידולים אלו מדגיש את הצורך במחקר מתמשך על היווצרות והתקדמות גליומה.

גליומגנזה במערכת העצבים המרכזית יכולה להתעורר על ידי הכנסת מוטציות אונקוגניות ל-NSCs 6,7,8,9 או לצאצאים המוקדמים ^שלהם 10,11,12 במחקרי מודלים של עכברים. ראוי לציין כי מחקרים אלו הראו כי אותן מוטציות אונקוגניות לעיתים קרובות אינן מייצרות גידולים כאשר הן מובלות לתאים ממוינים^{יותר 13}, מה שיוצר היררכיה של תא המקור שבה הגבלת שושלת מוגברת קשורה לירידה ברגישות לטרנספורמציה¹⁴. לפיכך, NSCs מהונדסים גנטית משמשים לעיתים קרובות ליצירת מודלים ביולוגיים ורסטיליים של גליומה, באמצעות טכניקות טרנסגניות או שיטות השתלה אורתוטופיות¹⁵. שתי הגישות מאפשרות חקר היווצרות גידול דה נובו בסביבת המוח הטבעית מתא שלא עבר טרנספורמציה. מודלים מהונדסים גנטית מאפשרים מחקר זה בבעלי חיים עם מערכת חיסון שלמה, לעיתים קרובות מחקים טוב יותר את ההיסטולוגיה וההטרוגניות התאית שנצפו בגידולים^{אנושיים.} עם זאת, יצירת מודלים אלו דורשת עבודה ועלות, ולעיתים קרובות הם מציגים זמני השהייה ארוכים ותדירות נמוכה של היווצרות גידולים¹⁶. לעומת זאת, מודלים אורטופיקיים של NSC ניתנים למניפולציה וחסכוניים יותר. NSCs מוטנטים יכולים להיווצר מתאים ראשוניים או מונצחים מעכברים או בני אדם, בהתאם לצרכים ניסיוניים, ומתאימים גם לניסויים במבחנה ^16,17. בנוסף, מודלים אלו מאפשרים התאמה מדויקת של שלב ההתפתחות של עכברים מקבלים, וכן את המיקום המרחבי שממנו נגזרים ועכברים מקבלים. דבר זה מאפשר לחוקרים לחקור כיצד גיל ואזורים ספציפיים במוח משפיעים על יצירת גידולים המונעים על ידי מוטציות מסוימות¹⁷.

פרוטוקול זה מפרט את המתודולוגיה ליצירת חוצני NSC של עכברים מוטנטים מתרבות ראשונית, המתאימות ליישומים ניסיוניים הן במבחנה והן ליישומים ניסיוניים ב-in vivo (איור 1). הפרוטוקול מורכב משני שלבי טרנסדוקציה מובחנים המתרחשים ברצף זמני מסוים. בשלב ההעברה הראשוני, NSCs מבודדים של עכברים נדבקים בלנטי-וירוסים רקומביננטיים הנושאים את המבנה הגנטי המטרה, מוטציה אונקוגנית או בקרה של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), לצד קסטה עמידה לבלסטיצידין. לאחר מכן, מופעל לחץ ברירה אנטיביוטי באמצעות בלאסטיצידין, ומאפשר רק לתאים ששרדו לעבור לאירוע טרנסדוקציה משני. אירוע משני זה עושה שימוש במבנה לנטיוויראלי ביציסטרוני שמקודד גם גני מדווח של לוסיפראז גחלילית וגם גני מדווח חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP), יחד עם אלמנטים עמידות לפורומיצין לבחירה נוספת. לאחר הבחירה בפורומיצין, אוכלוסיות ה-NSC המועברות בשתי הדרגים מתרחבות במבחנה לפני הניסויים הבאים. גישה זו של טרנסדוקציה רציפה מציעה מספר יתרונות מתודולוגיים: (1) היא מסייעת בהערכה כמותית של יעילות ההעברה בכל שלב¹⁸, (2) היא מבססת קווי תאים יציבים של מדווח מתאימים למעקב לאורך זמן, ו-(3) היא מאפשרת ניטור לא פולשני של התחלת גידול, קינטיקת התקדמות ותגובות טיפוליות באמצעות מתודולוגיות BLI 18,19,20. ניתן להשתמש בו גם עם NSCs ראשוניים או מונצחים 21,22,23.

הפרוטוקול המוצג כאן עונה על הצורך הדחוף בגישה סטנדרטית, יעילה ורלוונטית ביולוגית ליצירת מודלים של גליומה שמקורם ב-NSC מבעלי חיים בוגרים עם יכולות דימות משולבות. צפוי שהמודלים שיתקבלו יספקו תובנות קליניות רלוונטיות לגבי פתוגנזה של גליומה, יקלו על זיהוי מטרות טיפוליות חדשות, ויציגו פלטפורמות מוצקות להערכה טרום-קלינית של אסטרטגיות טיפול מתפתחות.

פרוטוקול

מחקר זה נערך בהתאם לסטנדרטים האתיים ולהנחיות הרגולציה שנקבעו על ידי אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס. לפרוטוקול זה, קליפת העכברים הבוגרת עברה מיקרו-פירוט לפי טכניקת²⁴ שתוארה קודם במעבדת ברוסייה ושימש לבידוד NSCs ראשוניים של עכברים להתרחבות בהמשך בתרבית שאינה דבקה בהתאם לפרוטוקול 24,25,26. כל התגובות המשמשים בתרבות מסופקים בפורמט סטרילי או מועברים דרך מסנן ממברנה של 0.2 מיקרומטר כדי להבטיח סטריליות. החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. בידוד תאי גזע עצביים מרקמה מיקרו-מפורקת

1. הכינו מדיום דיסוציאציה (DM) ומדיום דיגסט טריפסין (TDM), בהתאם למתכונים המוצגים באיור 2.
   1. הוסף 200 מיקרוליטר של Trypsin Digest Medium לצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל והשאר על הקרח לפחות 20 דקות לפני השימוש. ניתן להשאיר את ה-DM בטמפרטורת החדר לשלבים מאוחרים יותר בפרוטוקול.
   2. בזמן שהצינורות מתקררים מראש, הכינו את מדיום תאי הגזע העצביים הבסיסי (NSC; המתכון המוצג באיור 2) והניחו את NSC וסרום בקר עוברי (FBS) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים או חרוזים לחימום מוקדם. הניחו אליקווטים של תוספים (B27, N2) וגורמי גדילה (EGF, FGF) בדלי קרח כדי להפשיר לאט.
      הערה: יש להכין את ה-TDM טרי בכל פעם לפני השימוש, אם כי ניתן לאחסן את NSC ו-DM בטמפרטורה של 4°C בין שימושים; מתכונים מוצגים באיור 2. מלאי N2, B27, EGF ו-FGF צריך להיות מאוחסן בטמפרטורה של מינוס 20°C עד לשימוש; הימנעו מהפשרות חוזרות של מלאי EGF ו-FGF (ראו טבלת חומרים לפרטים נוספים בהכנת מלאי EGF ו-FGF).
2. לאחר שצינורות מיקרוצנטריפוגות המכילים TDM מקוררים מספיק, רקמות מיקרו-דיסקציה כפי שתואר קודם²⁴. לאחר כל מיקרו-דיסקציה, מניחים את הרקמה בצינור מיקרוצנטריפוגה. החזירו את הצינור לקרח עד שכל הניתוחים יושלמו, שכן כל חימום של רקמה עלול להתחיל את תהליך העיכול האנזימטי מוקדם ולגרום לעיכול יתר.
3. דגרו את צינור(ים) המיקרוצנטריפוגה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים או חרוזים למשך 15 דקות כדי להתחיל עיכול אנזימטי. במהלך הדגירה, יש להכין 10% FBS ב-NSC על ידי הוספת 0.5 מ"ל FBS ל-4.5 מ"ל NSC.
   1. לאחר הדגירה, דגימות פיפטות בעדינות 5–10 פעמים עם מיקרופיפטה של 1 מ"ל כדי להפריד תאים עוד יותר, ואז מנטרלים את הטריפסין על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של 10% FBS ב-NSC לכל דגימה. פיפט למעלה ולמטה בעדינות לערבוב.
      הערה: חשוב לעקוב אחרי זמן הדגירה המומלץ ב-37 מעלות צלזיוס. טריפסיניזציה מופרזת עלולה להוביל למוות תאי, בעוד שתת-טריפסיניזציה עלול להקשות על ניתוק הדגימה (ראו טבלה 1, נקודות 1–2 לטיפים אלו ולטיפים נוספים לפתרון תקלות).
      הערה: ניתן להשתמש באמבט מים או באמבט חרוזים לדגירה של דגימות; האחרון עשוי להפחית את הסיכון לזיהום²⁷, אך זה עשוי לכלול סיכון להעברת חום פחות יעילה²⁸.
4. סובבו את התאים הראשוניים המבודדים בטמפרטורה של 630 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנאנט, תוך זהירות לא להפריע לתאים בתחתית הבאר. שטפו את התאים על ידי הוספת 2.5 מ"ל DM לכדור התא והשהיה מחדש על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה 3–4 פעמים. סובבו שוב כלפי מטה ב-630 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ושאבו בזהירות את הסופרנאנט.
5. חזור על שלב 1.3 כדי לבצע שטיפה שנייה. במהלך השטיפה הסופית, הוסף B27, N2, FGF ו-EGF למדיום הבסיסי המחומם מראש ליצירת מדיום NSC מלא (המתכון המוצג באיור 2).
6. שאפו את הסופרנטנט. הוסף 2 מ"ל מדיום NSC מלא וחם לכל כדור תא, ואז להחזיר אותו על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה 3–4 פעמים. הניחו תאים תלויים בבאר אחת של לוח חיבור נמוך עם 6 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: למרות שניתן לאחסן את המדיום הבסיסי NSC בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בין שימושים, תוספים וגורמי גדילה עלולים לעבור פירוק בטמפרטורה זו. לכן, יש להוסיף B27, N2, FGF ו-EGF למדיום NSC כדי ליצור מדיום NSC מלא מיד לפני השימוש.

2. הקמת והתרחבות תרבות הנוירוספירה

1. הזרקו 0.5–1 מ"ל של מדיום האכלה טרי של ה-NSC (המתכון המוצג באיור 2) לכל באר של תרביות ה-NSC כל 3 ימים.
2. לעקוב אחרי היווצרות נוירוספירה. כאשר כדורים קטנים ומעוצבים במלואם נראים לעין, התרבית מוכנה למעבר (בדרך כלל 5–10 ימים מהציפוי הראשוני).
   הערה: תאים גדלים בצורה הטובה ביותר כאשר הם עוברים לעיתים קרובות וכשהם עדיין בשלב הצמיחה הלוגריתמי. נוירוספירות גדולות יותר קשות יותר להתנתקות ונוטות יותר למוות תאים במהלך התהליך הזה. לכן, מומלץ לעבור מוקדם ובתדירות גבוהה יותר כדי לקדם את בריאות התאים. כאשר הן מוכנות למעבר, הנוירוספירות המבודדות יהיו בקוטר ~100–200 מיקרון, עם תאים דחוסים וגבולות חלקים ומוגדרים היטב תחת מיקרוסקופיית שדה בהיר. נוירוספירות לא יציגו הקרנות או הרחבות לא סדירות. מרכז הנוירוספירות יהיה כהה מעט מהקצוות החיצוניים, אך לא בצורה מופרזת; ליבות כהות מדי נובעות לעיתים קרובות מנמק של תאים מרכזיים עקב מחסור בחומרים מזינים כאשר הנוירוספירות גדלות יתר על המידה. העברת נוירוספירות שגדלו יתר על המידה גורמת לעיתים קרובות לכמות גבוהה של מוות תאי, מה שיכול להשפיע על יישומים בהמשך. ראו טבלה 1, נקודות 3–4 עבור טיפים נוספים לפתרון תקלות.
3. חממו מראש את מדיום ה-NSC, DM, 0.05% טריפסין-EDTA, ומלח עם בופר פוספט (PBS) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמצעות אמבט מים או חרוזים. שימו מלאי B27, N2, FGF, EGF ו-FBS על הקרח עד שיהיה צורך.
4. כדי לעבור, יש להעביר נוירוספירות שגדלו היטב לצינור חרוטי סטרילי בקוטר 15 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית. צנטריפוגה ב-630 × גרם למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס כדי לייצב את הנוירוספירות. שאפו סופרנאנט, זהירים לא להפריע לנוירוספירות הכדוריות. שטוף את התאים על ידי השעיה סטרילית של 1x PBS, ואז צנטריפוגה נוספת ב-630 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ושאיפת הסופרנאנט.
5. הוסף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין/EDTA לכדור התא. פיפט למעלה ולמטה 3–5 פעמים עם מיקרופיפטה בנפח 1 מ"ל לערבוב, ואז דגור ב-37 מעלות צלזיוס באמבט מים או חרוזים למשך 5–6 דקות.
   1. לאחר הדגירה, יש פיפטה עדינה למעלה ולמטה 5–10 פעמים עם מיקרופיפטה של 1 מ"ל כדי לפרק נוירוספירות. לנטרל טריפסין על ידי הוספת 1 מ"ל 10% FBS ב-NSC Medium; פיפט לערבוב עדין.
      הערה: הימנעו מטריפסיניזציה מופרזת ו/או פיפטינג נמרץ מדי של הנוירוספירות, שכן זה עלול להזיק ל-NSCs ולהשפיע על חיוניות התאים.
6. הוסף 2.5 מ"ל DM וצנטריפוגה ב-630 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט. חזור על שלב השטיפה עם 2.5 מ"ל DM נוסף, ואחריו צנטריפוגה ושאיפת סופרנאנט, כדי להסיר שאריות של FBS במדיום.
7. להחזיר תאים לתוך 1 מ"ל מדיום NSC מלא וטרי. השעיית תאי סינון על ידי הנחת מסנן סטרילי של 40 מיקרון בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 50 מ"ל, ואז הוספת תמיסת התאים לחלק העליון של המסנן ומתן אפשרות לכוח הכבידה לרוקן את התמיסה לתוך הצינור. כל תא לא מפורק שנותר יילכד על ידי המסנן, בעוד שתאים בודדים יעברו לתמיסה שמתחת.
8. מהתאים המושבים והמסוננים, יש לקחת 10 מיקרוליטר לספירת תאים ולערבב עם 10 מיקרוליטר טרייפן בלו. באמצעות המוציטומטר ידני, טעין 10 מיקרוליטר מהדגימה וספור תאים ברי קיימא (כלומר, תאים שאינם כחולים) לפי הנוהג^{הסטנדרטי 29}. חלופה נוספת היא להשתמש במונה תאים אוטומטי, אם כי ייתכן שהוא פחות מדויק בנוכחות פסולת תא או אגרגטים^30,31.
   הערה: בדרך כלל, פחות מ-10%–15% מכלל התאים אמורים להראות סימני מוות תאים (למשל, אי אפשרות לשלול את הכחול הטריפאן). שיעורי מוות תאים גבוהים יותר עשויים לנבוע מטריפסיניזציה מופרזת, כוח מכני מופרז בהפרדת תאים, או בריאות כללית לקויה של התרבית לפני הטריפסיניזציה (ראו טבלה 1, נקודות 1–3). מכיוון שזה עלול להשפיע לרעה על יישומים במורד הזרם, מומלץ לצלוח מחדש את התאים (שלב 2.9) ולהרחיב אותם שוב (למשל, חזרה על שלבים 2.1–2.9) אם נצפים שיעורי תמותה גבוהים של תאים, במקום להמשיך לטרנסדוקציה.
9. מדלל 5 x^{10 תאים} לתוך מדיום NSC מלא של 2 מ"ל וצלח לבאר אחת של פלטת 6 בארות עם חיבור נמוך במיוחד. הזרקו 0.5–1 מ"ל של האכלה טרייה של NSC לכל באר כל שלושה ימים כדי להבטיח בריאות תרבית מיטבית. כאשר כדורים בריאים ומעוצבים במלואם נראים (ראו טבלה 1, נקודה מספר 4), התרבית מוכנה לשימוש בשלב 3 או 4.
   הערה: ניתן לאחסן NSCs נוספים בשלב זה על ידי השעיית מיליון NSCs ב-1 מ"ל של מדיום הקפאה ללא סרום במקרר קריוביאלי של 1.5 מ"ל ואחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. ניתן גם להרחיב NSCs נוספים במידת הצורך על ידי ציפוי תאים נוספים בבארות נוספות של לוח 6 הבארות או ציפוי לבקבוקי T-25.

3. עקומת הרג בלסטיצידין בתאים הורים

הערה: לאחר שה-NSCs שעברו יוצרים נוירוספירות בריאות, התאים מוכנים לניסויים נוספים. לפני ההעברה, חשוב לקבוע את הריכוז האופטימלי של אנטיביוטיקת הבחירה (במקרה זה בלסטיצידין). יש לבצע זאת באופן אמפירי, שכן אוכלוסיות שונות של NSCs עשויות להיות רגישות שונה לאנטיביוטיקה. אם זה כבר נקבע עבור סוג התא הנתון, דלגו לשלב 4.

1. חממו מראש את מדיום הבסיס NSC, DM, 0.05% טריפסין-EDTA, ו-PBS ב-37 מעלות צלזיוס. הפשרה מלאי B27, N2, FGF, EGF, FBS ובלסטיצידין. לפני ההתחלה, או במהלך שלבי הדגירה למטה, יש לייצר מדיום NSC מלא ו-10% FBS בתווך NSC כפי שתואר לעיל.
2. באמצעות נוירוספירות שהורחבו זה עתה (לאחר תרבית משלב 2.9 למעלה), טריפסינז ומפצל לפי שלבים 2.5–2.6, ואז הושיה מחדש ב-1 מ"ל NSC טרי לספירה. מסננים תאים דרך מסנן סטרילי של 40 מיקרומטר כפי שתואר לעיל כדי להסיר תאים לא מפורקים, ואז סופרים תאים כפי שמתואר בשלב 2.8.
3. החזירו 25,000 תאים ברי קיימא ל-2.5 מ"ל אליקוות של NSC מלא טרי ב-15 מ"ל קוניקלים, כאשר 1 אליקו מוכן לכל ריכוז אנטיביוטי לבדיקה. מתכננים לבדוק לפחות 4–6 ריכוזים שונים, אם כי ניתן לבדוק עוד אם רוצים.
4. הוסף את הכמות המתאימה של בלסטיצידין לכל 2.5 מ"ל אליקוט כדי להגיע לריכוז הרצוי (ראו חישובי דוגמה בטבלה 2). לוח של 500 מיקרוליטר של תאים תלויים (5,000 תאים) לכל באר בלוח חיבור נמוך במיוחד עם 24 בארות, כאשר כל ריכוז מצופה במצב מרובע.
   הערה: כדי להגיע לריכוז הסופי הנכון, ייתכן שיש לדלל את מלאי הבלסטיצידין לפני הוספה למדיה. ניתן לדלל בלסטיצידין במדיום NSC או PBS; עבור מלאי מדולל של 1:1000 (10 מ"ג/מ"ל), הוסף 1 מ"ל של בלסטיצידין לא מדולל (10 מ"ג/מ"ל) ל-999 מ"ל NSC או PBS. מומלץ שהחוקרים יבצעו את כל החישובים הנדרשים כדי להשיג את הריכוזים הרצויים בזמן שהחומרים מתחממים בשלב 3.1; חישובים לדוגמה המוצגים בטבלה 2.
5. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בדוק תאים בקפידה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד כל 24 שעות לשינויים במורפולוגיה ובמוות של תאים/נוירוספירה. האכלת תאי המזון כל 3 ימים על ידי הוספת 0.5–1 מ"ל של מדיום האכלה טרי של NSC עם ריכוז נכון של בלסטיצידין.
6. קבעו את הריכוז המתאים לבחירת בלסטיצידינים לאחר מכן על ידי זיהוי הריכוז הנמוך ביותר של בלסטיצידין שהורג תאים לא מועברים בין 72–120 שעות לאחר הציפוי.
   הערה: עבור עכברים בוגרים, זוהה 1000 ng/mL (1 mg/mL) בלסטיצידין כרכוז הטוב ביותר לבחירת אנטיביוטיקה (איור 3). השלבים הבאים מתבצעים באמצעות בלסטיצידין בריכוז זה. יש לציין כי ריכוז הבלסטיצידין האופטימלי יכול להשתנות משמעותית בין תכשירים של תאים, בדרך כלל בין 0.5–10 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאם לסוג הדגימה, מספר המעבר ותנאי התרבית^32,33; לכן, עקומות הריגה אמפיריות הן חיוניות ולא אופציונליות לכל סוג תא חדש. ראו טבלה 1, נקודה מספר 5 לטיפים נוספים לפתרון תקלות.

4. טרנסדוקציה לנטיוויראלית ראשונה

הערה: לפני המשך הטרנסדוקציה, חשוב לדעת את ריבוי ההדבקה האופטימלי (MOI) שבו יש להעביר את חלקיקי הלנטי-ויראליים (LVPs). יש לקבוע זאת אמפירית עבור סוגי תאים שונים; השיטות לכך תוארו בעבר היטב^34,35. בתוצאות המהמחשות המוצגות, נעשה שימוש ב-MOI של 20 בהתבסס על ניסיון קודם בהמרת משטחי NSC ראשוניים של עכברים.

1. נתחיל עם NSCs מורחבים, לא מועברים, היוצרים נוירוספירות בריאות (שנוצרו לאחר התרחבות תאים בשלב 2.9 למעלה). פיצול, השהייה, סינון וספירה של תאים לפי שלבים 2.3–2.8 לעיל, ולאחר מכן לחלק תאי לוחות בצפיפות של 1.5 על 10⁶ תאים בכל באר לשני בארות (אחד לוירוס אונקוגני, אחד לבקרה) של צלחת 6 בארות עם הידבקות נמוכה במיוחד. דגרו את הצלחות בלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
2. ביום הבא, בדוק את התאים. ה-NSCs יהיו מוכנים לזיהום אם הם יוצרים גושים קטנים.
3. לפני הדבקת התאים, יש להפשיר בזהירות את האליקווט הלנטיויראלי על הקרח, כדי לאפשר הפשרה הדרגתית. חשוב לא למהר בתהליך הזה.
   הערה: לצורך המחשה, פרוטוקול זה מתאר טרנסדוקציה לנטיויראלית באמצעות שני מבנים מייצגים: (1) וקטור בקרה המבטא GFP תחת פרומוטר EF1-α עם עמידות לבלסטיצידין, ו-(2) וקטור ניסיוני המבטא מוטנט אונקוגני BRAF V600E עם תג HA בקצה N תחת פרומוטר EF1-α, גם הוא עם עמידות לבלסטיצידין. יצירת הלנטי-וירוסים חורגת מהיקף הפרוטוקול הזה, אך בעבר תוארה היטב^36,37.
4. לאחר הפשרה, חממו את הווירוס לזמן קצר ל-37 מעלות צלזיוס מיד לפני ההדבקה. קבע את נפח ה-LVP שיש להוסיף לכל באר, באמצעות הנוסחה MOI x מספר תאים/טיטר וירוסים. באמצעות מיקרופיפטות שנקבעה בנפח המחושב, הוסף לאט LVPs בטיפה לתאים המתורבתים. סובב את הצלחת בעדינות כדי לחלק אותה, תוך זהירות לא להפיל את המדיה לבארות סמוכות. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
   הערה: לאחר שהאליקו הוויראלי הפשיר לטמפרטורת החדר, לא ניתן להקפיא אותו מחדש ויש להשתמש בו תוך 24 שעות. לאחר שהאליקווט מחומם ל-37 מעלות צלזיוס, יש להשתמש בו תוך מסגרת זמן של 30 דקות.
5. לאחר תקופת דגירה זו, צנטריפוגה את הנוירוספירות בעוצמה של 630 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ואז שואפים סופרנאנט. החזירו את השערה ב-2 מ"ל NSC מלא וטרי, ללא וירוס או אנטיביוטיקה, והפכו לבאר חדשה של צלחת 6 בארות עם חיבור נמוך.
6. ביום הבא, הערך את יעילות ההעברה בתאי הבקרה של GFP על ידי קביעת היחס של תאים/גושים מתויגים פלואורסצנטית לבין סך התאים/גושים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי במספר תחומים. הביטוי הצפוי של המדווח (GFP) צריך להיות מעל 80% להצלחת המרה.
   הערה: אם נצפתה יעילות ההמרה לא מיטבית, ניתן לבצע סבב זיהום שני (חוזר על שלבים 4.4–4.6). אם היעילות לא משתפרת, שקול אופטימיזציה מחדש של MOI או ניסוי תכשיר אחר של לנטיווירוס. ראו טבלה 1, נקודה מספר 6, עבור טיפים אלו ואחרים לפתרון תקלות.
7. לאחר הבחנה שהנוירוספירות המתפתחות נראות בריאות ושיש עדויות לזיהום (GFP חיובי; ~80%), יש להמשיך בפיצול התאים לפי שלבים 2.3–2.6 לעיל. השעתי מחדש את התאים ב-5 מ"ל של מדיום NSC מלא המכיל את הריכוז המתאים של בלסטיצידין (1000 ng/mL), ואז סינן דרך מסנני סטריליים של 40 מיקרון כדי להסיר גושים של תאים. לספור תאים, ואז לוחן בכ-5 על 10⁴ תאים למ"ל בבקבוקי T-25 עם חיבור נמוך במיוחד.
   הערה: לאחר התוספת הראשונית של אנטיביוטיקה, ייתכן שיש שיעור גבוה של תמותת תאים כאשר תאים לא מועברים מתים; זה צפוי, וצפוי להשתפר עם הבחירה המתמשכת.
8. הרחבו תאים על ידי הזנה כל 3 ימים עם תוסף הזנה המכיל בלסטיצידין. כאשר כדורים בריאים ומעוצבים במלואם נראים לעין, בדרך כלל 5–10 ימים לאחר הפיצול, התרבית מוכנה לשימוש בשלב 5 או 6.
   הערה: לאחר הרחבה נוספת של השיבוטים העמידים, ניתן לאסוף תאים ל-Western bloting (המתואר בשלב 7) כדי לאמת שהמבנה האונקוגני הלא-מסומן פלואורסצנטי ומתויג HA מתבטא כראוי. אם מתבצע ווסטרן בלוטינג בשלב זה, עדיין מומלץ לבדוק את הביטוי^לאחר הטרנסדוקציה השנייה (בשלב 7), כדי להבטיח ביטוי מתמשך ונכון.

5. עקומת השמדת פורומיצין ב-NSCs עמידים לבלסטיצידין

הערה: ריכוז הבחירה האופטימלי לטרנסדוקציה השנייה חייב להיקבע גם הוא אמפירית. בשלב זה נעשה שימוש ב-NSCs מועברים העמידים לבלסטיצידין, והתאים נשמרים תחת סלקציה של בלסטיצידין (1000 ng/mL) לאורך כל הדרך, שכן טרנסדוקציה ובחירה מקבילה של בלסטיצידין עלולות לשנות את הרגישות לפורומיצין.

1. חממו מראש את מדיום הבסיס NSC, DM, 0.05% טריפסין-EDTA, ו-PBS ב-37 מעלות צלזיוס. הפשרה מלאי B27, N2, FGF, EGF, FBS, BLASTICIDIN, ופורומיצין. לפני ההתחלה, או במהלך שלבי הדגירה למטה, יש לייצר מדיום NSC מלא ו-10% FBS בתווך NSC כפי שתואר לעיל.
2. באמצעות נוירוספירות עמידות לבלסטיצידין, טריפסיניזציה ומפצל בהתאם לשלבים 2.5–2.7, תוך השעיה מחדש ב-1 מ"ל NSC טרי לספירה וסינון להסרת גושים. ספרו את התאים כפי שמתואר בשלב 2.8, ואז החזירו 25,000 תאים ברי קיימא ל-2.5 מ"ל אליקווטים של NSC מלא טרי ב-15 מ"ל קוניקלים, כאשר 1 אליקו מוכן לכל ריכוז אנטיביוטי לבדיקה. מתכננים לבדוק לפחות 4–6 ריכוזים שונים, אם כי ניתן לבדוק עוד אם רוצים.
3. מוסיפים בלסטיצידין כדי להגיע לריכוז האופטימלי מראש (1000 ng/mL = 0.25 מ"ל של מלאי לא מדולל / 2.5 מ"ל אליקווט). לאחר מכן מוסיפים את הכמות המתאימה של פורומיצין לכל צינור כדי להגיע לריכוז הרצוי בקצה (ראו חישובי דגימה בטבלה 2).
4. לוח של 500 מיקרוליטר של תאים תלויים (5,000 תאים) לכל באר בלוח חיבור נמוך במיוחד עם 24 בארות, כאשר כל ריכוז מצופה במצב מרובע.
5. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בדוק תאים בקפידה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד כל 24 שעות לשינויים במורפולוגיה ובמוות של תאים/נוירוספירה. האכלת תאי המזון כל 3 ימים על ידי הוספת 0.25 מ"ל של מדיום מזון טרי ל-NSC, בתוספת בלסטיצידין והריכוז הנכון של פורומיצין.
6. קבעו את הריכוז המתאים לבחירת פורומיצין לאחר מכן על ידי זיהוי הריכוז הנמוך ביותר של פורומיצין שמחסל תאים בין 72–120 שעות לאחר הציפוי.
   הערה: עבור NSCs של עכברים בוגרים שהועברו עם וירוסי GFP ו/או BRAF-V600E לנטיווירוסים, 100 ng/mL פורומיצין נקבעו אמפירית כרכוז הטוב ביותר לבחירת אנטיביוטיקה (איור 4). לדוגמה, השלבים הבאים בוצעו באמצעות 1000 ng/mL בלסטיצידין (מהשלב 3 לעיל) ו-100 ng/mL פורומיצין (מהשלב 5 למעלה). ראו טבלה 1, נקודה מספר 5 לטיפים לפתרון תקלות.

6. טרנסדוקציה לנטיוויראלית שנייה

הערה: התאים נשארים במדיה המכילה בלסטיצידין במהלך שלב ההעברה השני כדי להבטיח שהמבנה האונקוגני או בקרת ה-GFP שהוכנסה בשלב ההעברה הראשון נשמר בתאים.

1. התחילו את ההליך באמצעות NSCs עמידים לבלסטיצידין המתרבים באופן פעיל ויציבים (שנוצרו בשלב 4). התחילו בפירוק ה-NSCs לתלייה חד-תאית (שלבים 2.3–2.7) כדי להבטיח אחידות במהלך הציפוי.
2. תאי לוח בצפיפות של 1.5 על 10⁶ תאים לבאר בתווך NSC מלא עם בלסטיצידין (1000 ng/mL, כפי שנקבע בשלב 3) לפלטת 6 בארות עם הידבקות נמוכה מאוד. דגרו את הצלחות בלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
3. ביום הבא, התאים יהיו מוכנים להמרת דם אם הם יוצרים גושים קטנים. הפשיר את הלנטיווירוס הביציסטרוני (המכיל לוסיפראז ו-RFP) על הקרח, ואז חימום קצר ל-37 מעלות צלזיוס מיד לפני ההדבקה. קבעו את נפח ה-LVP שיש להוסיף לכל באר, באמצעות הנוסחה MOI x מספר תאים/טיטר וירוסים; כאן משתמשים ב-MOI של 20.
   1. באמצעות מיקרופיפטות שנקבעה בנפח המחושב, הוסף לאט LVPs בטיפה לתאים המתורבתים. סובב את הצלחת בעדינות כדי לחלק אותה, תוך זהירות לא להפיל את המדיה לבארות סמוכות. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
4. ביום הבא, צנטריפוגה את הנוירוספירות ב-630 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס וציפו אותן מחדש בנוזל NSC מלא חדש המכיל בלסטיצידין (1000 ng/mL, בהתאם לשלב 3).
5. ביום הבא, הערך את יעילות שלב ההעברה השני על ידי קביעת היחס של תאים/גושים חיוביים ל-RFP לבין סך התאים/גושים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי במספר תחומים, עם יעילות אופטימלית של ~60%.
6. כאשר מתבוננים שנוירוספירות נראות בריאות ושהשלב השני של הטרנסדוקציה היה יעיל (למשל, רוב גושי התאים הם RFP+), התאים מוכנים לברירה כפולה. התחילו בפירוק ה-NSCs לתלייה חד-תאית (שלבים 2.3–2.7), ואז החליפו בציפוי של כ-5 x 10⁴ תאים/מ"ל בבקבוקי T-25 בעלי חיבור נמוך במיוחד ב-NSC מלא המכיל בלסטיצידין (1000 ng/mL) ופורומיצין (100 ng/mL).
   הערה: כמו בשלב 4.6 לעיל, אם נצפתה יעילות טרנסדוקציה לא אופטימלית, ניתן לבצע סבב זיהום שני (חוזר על שלבים 6.3–6.6). ראו טבלה 1 לטיפים נוספים לפתרון תקלות.
7. האכלו תאים כל 3 ימים עם תוסף הזנה המכיל בלסטיצידין ופורומיצין.
   הערה: מעקב קפדני אחר התרביות חיוני לזיהוי שיבוטים עמידים לשני הצדדים, אשר יתאפיינו בהישרדותם תחת שני הלחצים הסלקטיביים. כאשר הכדורים הבריאים נראים במלואם, בדרך כלל 5–10 ימים לאחר הפיצול, התרבות מוכנה לאימות נוסף (שלב 7).

7. אימות ואפיון של NSCs המועברים דו-פעמיים

הערה: לפני ביצוע ניסוי נוסף במבחנה או בתחום , מומלץ אימות נוסף כדי לוודא שמבנים ותייגים HA ולוציפראז מבוטאים כראוי.

1. סימון מערבי לאימות ביטוי של הקונסטרוקטור המתויג HA
   1. מערכות NSC תרבותיות (בקרת GFP ו-BRAF עם תגית HA). V600E, בדוגמה שניתנה) בבקבוקי T-25 בעלי דבקות נמוכה במיוחד עד למוכן לפיצול (בהתאם לשלב 2.2).
      הערה: לפני המעבר לשלב הבא, מומלץ לבדוק תרביות פעמיים ביטוי GFP מתמשך (בתאי ביקורת GFP) וביטוי RFP (בכל התאים).
   2. הסר חצי מהתרבית ופצל לפי שלבים 2.2–2.7, ואז הצבת מחדש במדיום NSC מלא טרי עם בלסטיצידין (1000 ng/mL) ופורומיצין (100 ng/mL) להרחבת תרבית מתמשכת. סובב את שאר הנוירוספירות כלפי מטה בטמפרטורה של 630 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס, ואז שואף את הסופרנאנט.
   3. לאחר מכן, יש לשטוף את ה-NSC עם כדורי שטיפה פעמיים עם PBS קר כקרח, להסתובב כלפי מטה בטמפרטורה של 630 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס ולשאף את הסופרנטנט לאחר כל שטיפה. הוסף כ-200 מיקרוליטר של בופר RIPA קר עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז לכל דגימה.
   4. אפשרו לליזיטים לדגור על קרח למשך 30 דקות, תוך הבטחת מערבולת לסירוגין כל 10 דקות. צנטריפוגה את הדגימות ב-14,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C. העבר בזהירות את הסופרנטנט, המסומן כליזאט הנקי, לצינור טרי מקורר מראש. אחסן את הליזאטים בטמפרטורה של -80°C במקפיא עמוק.
   5. ליזאט יכול לשמש לאחר מכן ל-Western bloting (לאימות ביטוי של מבנים) בהתאם לפרוטוקולים שנקבעו בעבר³⁸.
      הערה: אם לא משתמשים מיד, יש לאחסן ליזטים בטמפרטורה של מינוס 80°C עד לשימוש. הימנעו ממחזורי הקפאה והפשרה חוזרים כדי לשמור על שלמות הדגימה (ראו טבלה 1, נקודה מס' 7).
2. עוצמת ביולומינסנציה (BLI) לאימות הביטוי המתאים של לוסיפראז של גחלילית
   הערה: פרוטוקול זה מאמת ביטוי לוסיפראז באמצעות ניטור BLI של תאים חיים באמצעות חומרה ותוכנה ספציפית (ראו טבלת חומרים לפרטים נוספים). אם משתמשים במערכת שונה לזיהוי וכימות BLI, המתודולוגיה עשויה להשתנות.
   1. פיצל את ה-NSCs וכימות לפי שלבים 2.2–2.8 לעיל, ואז דילל תאים בתווך ולוח NSC מלאים בריכוזים משתנים (למשל, 2.5 x 10⁴ תאים, 1 x 10⁵ תאים/באר) בלוח עם 24 בארות עם דבקות אולטרה-נמוכה (500 מ"ל לבאר), כאשר כל ריכוז תא מצופה בארבעה כפולים. התאים נשמרים במדיום NSC מלא המכיל בלסטיצידין (1000 ng/mL) ופורומיצין (100 ng/mL).
      הערה: כדי למנוע את עוצמת הזוהר המופרשת על ידי לוציפראז של באר אחת לדלוף לבארות סמוכות במהלך המדידה, הימנעו מציפוי NSCs בבארות סמוכות.
   2. הפעל את מערכת ההדמיה לפחות 30 דקות מראש כדי לאפשר למצלמת המכשיר המחובר לטעינה להתקרר לטמפרטורת הפעולה האופטימלית שלה (כ-90°C). הפעל את תוכנת הכמות, וחטא את תא ההדמיה באמצעות 70% אתנול, כדי לאפשר לו להתייבש לחלוטין לפני השימוש.
      הערה: שמרו על טמפרטורת תא ההדמיה ב-37 מעלות צלזיוס כדי להבטיח את חיוניות התא במהלך סשנים ממושכים של הדמיה.
   3. הפשיר את הנוזלים המקוריים של D-לוסיפרין, כדי להבטיח שהם מוגנים מחשיפה לאור. הוסף נפח של 5 מיקרוליטר של תמיסת עבודה של 15 מ"ג/מ"ל D-luciferin בעדינות לכל תא המכיל באר כדי להגיע לריכוז סופי של 150 מ"ג/מ"ל. סובב את הפלטה בעדינות כדי להבטיח פיזור אחיד של התמיסה.
   4. דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להקל על דיפוזיית הסובסטרט לתוך התאים, ובכך לקדם ייצור אור מרבי.
   5. מקם את הלוח בתוך מערכת ההדמיה הרגישה של ביולומינסצנציה. הניחו רשת מעל הצלחת. בחר במצב הדמיית הזוהר , החל מחשיפה אוטומטית בזמן החשיפה. הגדר את ה-binning לבינוני, וכוון את ה-f-stop ל-1 כדי למקסם את איסוף האור.
      1. כוון את שדה הראייה ל-'D' עבור לוחות עם 24 בארות, וקבע את גובה הנושא ל-1.5 ס"מ. צלם תמונות באמצעות תוכנת ההדמיה. אם האות נראה נמוך, ניתן לכוונן את זמן החשיפה ידנית (ראו נקודת פתרון תקלות מס' 8).
   6. לבצע תיקון רקע מול בארות הבקרה וכימות יחידות האור היחסיות לפי הצורך לניתוח עתידי באמצעות תוכנת ההדמיה.
      הערה: לאחר אימות BLI, ניתן להשתיל את התאים באופן אורתוטופי למוחם של עכברים סינגניים או עם מערכת חיסון מוחשית, בהתאם לפרוטוקולים שנקבעו^{קודם לכן 19}.

תוצאות

NSCs בוגרים בודדו מקורטקס עכברי C57BL/6 בוגרים וגודלו בתרבות לא דבקה³⁹, מה שהוביל להיווצרות נוירוספירות ראשוניות (20–250 מיקרון) בתוך 7 עד 10 ימים (איור 1). תאים הורחבו לאחר מכן במבחנה. לאחר מכן בוצעה אופטימיזציה של בחירת בלסטיצידינים ב-NSCs לא מועברים (שלב 3). לאחר 24 שעות של ברירה, ריכוזים של 1000 ננוגרם/מ"ל (1 מיקרוגרם/מ"ל) בלסטיצידין גרמו להקטנת גודל הנוירוספירה (איור 3A).

דיון

שיטת הטרנסדוקציה הלנטיוויראלית הדו-שלבית זו יצרה בהצלחה NSCs מהונדסים גנטית המתאימים למחקר אונקולוגי. כאן, הוצגה אינטגרציה אפקטיבית של מוטציה אונקוגנית BRAF V600E (שנמצאה בתת-קבוצה של גליומות בוגרות בדרגה גבוהה ומשמשת כאן כהוכחת היתכנות) או בקרת GFP עם מערכות דיווח כפולות להדמיה ביולומינסצנטית (לוסיפראז) וזיהוי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (RFP). טרנסדוקציה עוקבת ב-MOI קבוע של 20, יחד עם שיטת סלקציה אנטיביוטית כפולה באמצעות בלסטיצידין ואחריו פורומיצין, הובילה ליעילות הטרנסדוקציה גבוהה,...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
β-mercaptoethanol (BME)	סיגמה	M3148-25ML	יש להשתמש בארון בטיחות ביולוגית. להכין מאגרי 50 mM על ידי הוספת 35 מ"ל BME ל-10 מ"ל DMEM עם תכולת גלוקוז נמוכה, לסנן באופן סטרילי ולהפריד ל-500 מ"ל מנות לשימוש בהכנת המדיום.
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signal Technology	7076	משתמשים בדילול 1:2000 ב-1% חלב ללא שומן
B-27 Supplement (50X),	Gibco	17504-044	בשימוש ראשון, להפשיר ולהכין חלקים של 1 מ"ל לשימוש עתידי; לאחסן חלקים ב- -20 °C. לשמור את התוספים על קרח לאחר הפשרה עד להכנה לתוספת למדיום
Blasticidin S HCl (10 מ"ג/מ"ל)	Gibco	A1113903	להכין מנות של מלאי 10 מ"ג/מ"ל; להניח בצינורות קטנים של 200 מ"ל ולאחסן ב- -20 °C עד להשתמש.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Millipore-Sigma	A1470-10G	משתמשים ב-10% BSA משקל/נפח ב-1x PBS. BSA הוא דביק; לוודא לשקול אותו כראוי ולהוסיף נפח מתאים של ממיס להכנת הפתרון המדויק.
Cell Strainer (40 µמ"מ)	Midsci	40ICS	מוכן מראש ונארז בנפרד. יש לפתוח בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. אין לגעת בידיים חשופות
D-Luciferin, Potassium Salt	Gold Biotechnology	eLUCK-100	להכין פתרון עבודה של 15 מ"ג/מ"ל (מודלל במים מדרגת מולקולרית) ולסנן באופן סטרילי לפני השימוש. להכין מאגר טרי כל פעם ולהוסיף ישירות למדיום להשגת ריכוז עבודה סופי של 150 מ"ג/מ"ל (למשל 5 מ"ל פתרון עבודה לכל 500 מ"ל תרבית)
DMEM, Low-Glucose	Gibco	11885-084	משתמשים בה להכנת מדיום NSC בסיסי
Epidermal Growth Factor (EGF)	Corning	354001	מסופק כאבקת אבקה מעוקרת; לשחזור מלאי 1000X, להוסיף 4.95 מ"ל PBS ו-50 µL 10% BSA (ב-1x PBS) ל-100 µg אבקת EGF מיובא, ולהשתמש בצינורית להקצפה.  להכין מנות של 500 µL או קטנות יותר בצינורות קטנים ולאחסן ב- -20° C עד להשתמש למדיום NSC שלם ותוספת האכלה ל-NSC. להימנע מהקפאה ופירוק חוזרים ונשנים.
Fibroblast Growth Factor, Basic (FGF)	R&D systems	233-FB	מסופק כאבקת אבקה מעוקרת; לשחזור מלאי 1000X, להוסיף 1.24 מ"ל PBS ו-12.5  µL 10% BSA (ב-1x PBS) ל-25 µg אבקת FGF מיובא, ולהשתמש בצינורית להקצפה.  להכין מנות של 500 µL או קטנות יותר בצינורות קטנים ולאחסן ב- -20° C עד להשתמש למדיום NSC שלם ותוספת האכלה ל-NSC. להימנע מהקפאה ופירוק חוזרים ונשנים.
Glucose, 45%	Corning	25-037-CI	מסופק כפתרון סטרילי. אין לפתוח מחוץ לארון הבטיחות הביולוגית
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb	Cell Signal Technology	3724	משתמשים בדילול 1: 1000 ב-3% אלבומין מסום בקר (Western blotting, כדי לאמת את הבעת התג HA)
HBSS, 10x	Gibco	14185-052	מסופק כפתרון סטרילי. אין לפתוח מחוץ לארון הבטיחות הביולוגית
HEPES, 1 M	Corning	25-060-CI	מסופק כפתרון סטרילי. אין לפתוח מחוץ לארון הבטיחות הביולוגית
IVIS 50	PerkinElmer		יש להדליק את המכשיר 30 דקות לפני השימוש כדי לאפשר למצלמה להתקרר לטמפרטורה אופטימלית. תוכנת Living Image (גרסה 4.3.1) משמשת לכימות.
Lentivirus-Luciferase (Firefly)-2A-RFP	AMSBio	LVP324-PBS	יש להפריד את ה-LVP ולשמור ב- -80 °C במקרר
L-Glutamine, 200 mM	Corning	25-005-CI	מסופק כפתרון סטרילי. אין לפתוח מחוץ לארון הבטיחות הביולוגית
Molecular-Grade Water	Corning	46-000-CM	מסופק כפתרון סטרילי. אין לפתוח מחוץ לארון הבטיחות הביולוגית
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048	בשימוש ראשון, להפשיר ולהכין חלקים של 1 מ"ל לשימוש עתידי; לאחס