זיהוי מועמדים פוטנציאליים לאנטי-שחפת: מדריך שלב אחר שלב לסינתזה, קביעת MIC והערכת ציטוטוקסיות בתאי יונקים

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי מועמדים פוטנציאליים לתרופות נגד שחפת באמצעות סקר פנוטיפי, הכולל סינתזה כימית של תרכובת 4-אמינוקווינולין, קביעת ריכוז המעכב המינימלי שלה נגד מיקובקטריום טוברקולוזיס, והערכת הציטוטוקסיות שלה בקווי תאים יונקים.

תקציר

שחפת (TB) נותרה אחת הסיבות המובילות למוות מגורם זיהומי יחיד בעולם, כאשר שיעורי העמידות לתרופות עולים הופכים את פיתוח תרופות חדשניים לעדיפות בריאותית עולמית. פרוטוקול זה מתאר גישת סקר פנוטיפית לזיהוי מועמדים פוטנציאליים לתרופות נגד שחפת בשלושה שלבים משולבים. ראשית, תרכובת ממחלקת 4-אמינוקווינולין מסונתזת במסלול של שלושה שלבים ומאופיינת במלואה בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) וספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (HRMS). שנית, הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של התרכובת מוערכת מול מיקובקטריום טוברקולוזיס באמצעות בדיקת מיקרופלט קולורימטרית להפחתת רזורין (REMA), הקובעת את ריכוז המעכב המינימלי (MIC) באמצעות קריאת שינוי צבע חזותית פשוטה. שלישית, הציטוטוקסיות של התרכובת מוערכת בשני קווי תאים יונקים, Vero (כליית קוף ירוק אפריקאי) ו-HepG2 (קרצינומה כבדית אנושית), באמצעות בדיקת MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) ובדיקת קליטה אדומה ניטרלית (NRU). שתי הבדיקות המשלימות הללו מודדות פרמטרים תאיים שונים, ומאפשרים אימות הדדי של תוצאות ציטוטוקסיות. יחד, נתוני MIC וציטוטוקסיות מאפשרים חישוב מדד סלקטיביות (SI) להערכת הפוטנציאל הטיפולי של כל תרכובת. פרוטוקול זה מספק מסגרת שלב אחר שלב שניתן לשחזור ולזיהוי פגיעות נגד שחפת בשלבים מוקדמים ולהערכה טרום-קלינית.

מבוא

השחפת, הנגרמת בעיקר על ידי החיידק Mycobacterium tuberculosis (Mtb), היא מחלת נשימה זיהומית בבני אדם שמכוונת בעיקר לריאות, אם כי ייתכן שגם וריאנטים חוץ-ריאתיים מתרחשים. שחפת מתפשטת דרך חיידקי Mtb המנושרים באוויר המשתחררים על ידי אנשים עם מחלה^{פעילה 1}. בהתאם להתקדמות המחלה, אדם שנדבק בשחפת עלול מיד לחלות בשחפת פעילה. בדרך כלל, עם זאת, אדם שנדבק זה עתה מפתח שחפת סמויה, שבה תאי Mtb עם פעילות מטבולית נמוכה שורדים בתוך גרנולומות ^1,2. אדם עם שחפת סמויה עשוי בסופו של דבר לפתח את הצורה הפעילה של המחלה, ולהופיע בתסמינים קליניים³. כיום, ההערכה היא שרבע מאוכלוסיית העולם סובלת מזיהום שחפת סמוי⁴.

למרות התקדמויות רבות, שחפת נותרה בעיה חמורה בבריאות הציבור ברחבי העולם. נתונים מהדוח העולמי האחרון לשחפת מראים כי 10.7 מיליון אנשים פיתחו את המחלה בשנת 2024. באותה שנה, נרשמו 1.23 מיליון מקרי מוות משחפת ברחבי העולם, מה שהופך את השחפת לסיבת המוות המובילה על ידי סוכן מדבק יחיד⁵. מלבד הפתולוגיה והביולוגיה המורכבת של Mtb, היבטים סוציו-אקונומיים כמו עוני ותת-תזונה, יחד עם גורמים בריאותיים כמו עישון, סוכרת וזיהום משותף ב-HIV, הופכים את השליטה במחלות למאתגרת עוד יותר^. דבר זה תורם ליציבות הארוכה של שחפת כנושא בריאות עולמי.

יתרה מזאת, לטיפולי השחפת הנוכחיים יש מגבלות שמסבכות את המאבק במחלה. נגד זנים רגישים של Mtb, הטיפול הסטנדרטי כולל טיפול משולב של 4 תרופות: איזוניאזיד (INH), ריפמפיצין (RIF), אתמבוטול (EMB) ופיראזינמיד (PZA). אנטיביוטיקות אלו ניתנות למשך מינימום של 6 חודשים, ודורשות הקפדה קפדנית לאורך כל הטיפול. משטר טיפולי זה, למרות שהוא יעיל ברוב המקרים ויש לו שיעור הצלחה של כ-85%, עדיין מתמודד^עם אתגרים ^רבים. בין הבעיות הגדולות ביותר הן תופעות הלוואי ומשך הזמן הממושך, שלעיתים מובילים להפסקה מוקדמת על ידי המטופל. הפסקה זו, יחד עם מתן לא נכון של האנטיביוטיקה, מעודדת בחירת זני Mtb עמידים, הדורשים ^{טיפולים} רעילים, יקרים ומקיפים יותר.

בהתחשב בתרחיש זה, פיתוח תרופות חדשות וחזקות נגד שחפת הוא דחוף. פרוטוקול זה מפרט את השלבים הראשונים של מחקר מועמדים לתרופות חדשות באמצעות סקר פנוטיפי. כדי להמחיש את יישום הפרוטוקול הזה, בחרנו תרכובת 4-אמינוקווינולין שמקורה ב-LABIO-17 להערכה. LABIO-17 זוהה בעבר על ידי קבוצת המחקר שלנו כמעכב של האנזים אנואיל-ACP-רדוקטאז (InhA) ב-Mtb, שהוא אותו מטרה מולקולרית כמו איזוניאזיד (INH)^9,10. InhA מעורב בביוסינתזה של חומצה מיקולית ב-M. tuberculosis וחיוני להישרדות החיידק, מה שמדגיש את חשיבותה כמטרה מולקולרית מבטיחה¹¹

פרוטוקול

1. סינתזה כימית ואפיון

הערה: סינתזה ואפיון התרכובת הכימית מתבצעים כפי שתואר קודם¹⁰. כל השלבים מ-1.1 עד 1.4 צריכים להתבצע עם מכסה אדים מאוורר היטב עם כפפות ניטריל.

1. הכנת חומרים
   1. הכנת MeOH/CH₃CN (1:1) עם חומצה פורמית של 0.1%
      1. מדוד נפחים שווים של מתנול (MeOH) ואצטוניטריל (CH₃CN) להכנת תערובת 1:1 (v/v) (דרגת HPLC).
      2. משלבים את הממסים במיכל נקי ויבש (למשל, בקבוק נפחי). הוסיפו חומצה פורמית כדי להגיע לריכוז סופי של 0.1% (v/v) (למשל, מוסיפים 1 מ"ל חומצה פורמית ל-1 ליטר תערובת ממס).
      3. ערבבו היטב על ידי סיבוב עדין או ערבוב. אחסנו במיכל סגור היטב בטמפרטורת החדר, מוגן מאור.
   2. הכנת חומצה אצטית 1% (v/v) במים אולטרה-טהורים
      1. שטוף את הבקבוקון הנפחי במים אולטרה-טהורים, ואז מניח אותו על השולחן. הוסיפו ~80% מנפח המים האולטרה-טהורים הסופי לבקבוק (כלומר, 80 מ"ל לבקבוק של 100 מ"ל; 800 מ"ל לבקבוק של 1 ליטר).
      2. באמצעות פיפטה מכוילת, הוסף חומצה אצטית קרחונית כדי להגיע ל-1% (v/v): לנפח סופי של 100 מ"ל → להוסיף 1.0 מ"ל חומצה אצטית; לנפח סופי של 1 ליטר → להוסיף 10.0 מ"ל חומצה אצטית.
      3. ערבבו היטב על ידי סיבוב או ערבוב. מלאו את הבקבוקון עד הסימן הסופי במים אולטרה-טהורים וערבבו.
      4. הסרת גזים מהתמיסה באמצעות סוניקציה באמצעות מנקה אולטרסוני (תדר המיכל ~40 קילוהרץ) שמוגדר למצב דגז למשך 20 דקות בטמפרטורת הסביבה.
      5. העבר לבקבוק ענבר מסומן (תווית: תכולה, ריכוז, דרגת ממס, תאריך, מכין). אחסן סגור היטב בטמפרטורת החדר.
   3. הכנת אצטוניטריל:מתנול (1:1, v/v), דרגת HPLC
      1. למדוד נפחים שווים של אצטוניטריל ומתנול: עבור נפח סופי של 100 מ"ל → 50.0 מ"ל אצטוניטריל + 50.0 מ"ל מתנול; לנפח סופי של 1 ליטר → 500 מ"ל אצטוניטריל + 500 מ"ל מתנול.
      2. משלבים את הממסים בבקבוק או בקבוק וולומטרי נקי ומערבבים על ידי היפוך או ערבוב. סנן את התערובת דרך מסנן של 0.45 מיקרון למיכל נקי להסרת חלקיקים.
      3. הסרת גזים מהתמיסה באמצעות סוניקציה באמצעות מנקה אולטרסוני (תדר המיכל ~40 קילוהרץ) שמוגדר למצב דגז למשך 20 דקות בטמפרטורת הסביבה.
      4. העבר לבקבוק ענבר מסומן (תווית: הרכב, דרגת ממס, תאריך, מכין). אחסן סגור היטב בטמפרטורת החדר, הרחק מחום ואור.
   4. הכנת תמיסת הקסאן/אתיל אצטט 7:3 (v/v) לכרומטוגרפיית עמודה
      1. מדוד 70% מהנפח הסופי בהקסאן. דוגמה: בנפח סופי של 100 מ"ל → 70 מ"ל הקסאן.
      2. מדוד 30% מהנפח הסופי באתיל אצטט. לדוגמה: בנפח סופי של 100 מ"ל → 30 מ"ל אתיל אצטט.
      3. שלבו את שני הממסים במיכל נקי ויבש (למשל, בקבוק נפחי או בקבוק).
      4. מערבבים היטב על ידי הפיכה או ערבוב עד שהם הומוגניים. סמן את המיכל בהרכב, תאריך, דרגת ממס ומכין.
   5. הכנת תמיסת הקסאן/אתיל אצטט 1:1 (v/v) לכרומטוגרפיית עמודה
      1. מדוד 50% מהנפח הסופי בהקסאן. לדוגמה: בנפח סופי של 100 מ"ל → 50 מ"ל הקסאן.
      2. מדוד 50% מהנפח הסופי באתיל אצטט. דוגמה: בנפח סופי של 100 מ"ל → 50 מ"ל אתיל אצטט.
      3. שלבו את שני הממסים במיכל נקי ויבש (למשל, בקבוק נפחי או בקבוק). מערבבים היטב על ידי הפיכה או ערבוב עד שהם הומוגניים.
      4. סמן את המיכל בהרכב, תאריך, דרגת ממס ומכין.
   6. הכנת תמיסת נתרן ביקרבונט רוויה (NaHCO₃)
      1. שקלו כמות עודפת של נתרן ביקרבונט (NaHCO₃) (כ-15–20 גרם לכל 100 מ"ל מים).
      2. הוסיפו את ביקרבונט הנתרן לבקבוק נקי המכיל נפח ידוע של מים מזוקקים (למשל, 100 מ"ל). ערבבו את התערובת ברציפות בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס) באמצעות ערבוב מגנטי או מוט זכוכית.
      3. המשיכו לערבב עד ששום מוצק לא נמס יותר ונשארת כמות קטנה של נתרן ביקרבונט לא מומס בתחתית — זה מעיד שהתמיסה רוויה.
      4. תן למתלה לנוח 10–15 דקות כדי לאפשר למוצק הלא מומס לשקוע. סננו את התערובת דרך פילטר נייר או משפך זכוכית מסונטרת כדי להסיר את עודפי הביקרבונט הלא מומס.
      5. אסוף את הסינון השקוף, שהוא תמיסת ביקרבונט נתרן רוויה.
      6. אחסן את התמיסה בבקבוק סגור היטב, מסומן כראוי עם שם התרכובת, ריכוז (רווי), תאריך ההכנה וראשי התיבות שלך.
      7. שמרו את התמיסה בטמפרטורת החדר והכינו אותה טרייה כשצריך, כי_CO2 יכול לברוח לאט ולשנות את הריכוז עם הזמן.
2. סינתזה של 6-ברומו-2-מתילקווינולין-4-אול (3)
   1. הכינו תמיסה המכילה 4-ברומואנילין (1.2 גרם, 7.3 מ"מ) ומגנזיום סולפט חסר מים (1.08 גרם, 9.0 מ"מ) באתנול (15 מ"ל).
   2. הוסף לתמיסה חומצה אצטית קרחונית (0.33 מ"ל) ואתיל אצטואצטט (1.8 מ"ל, 14.1 מ"מ) לתמיסה. ערבבו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 90°C למשך 16 שעות.
   3. סיננו את תערובת התגובה דרך תאית, 11 מיקרון, נייר סינון איכותי להסרת גופרית המגנזיום התלויה.
   4. אידוי את האתנול באמצעות אידוי סיבובי כדי לקבל את הביניים האקרילטיים.
   5. חממו את הביניים באמצעות אמבטיית שמן מתאימה המכילה נוזל העברת חום סינתטי בעל ביצועים גבוהים (ראו טבלת חומרים) (15 מ"ל) בטמפרטורה של 230–250 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות להשלמת התגובה.
   6. קרר את התערובת לטמפרטורת החדר. סנן את המשקע שנוצר ושוטף אותו בהקסאן וכלורופורם.
   7. ריכזו את המוצר הסופי בלחץ מופחת באמצעות אידוי סיבובי עד שכל הממסים הנותרים מוסרים (ראו טבלת חומרים).
3. סינתזה של 6-ברומו-4-כלורו-2-מתילקווינולין (4)
   1. הכינו תמיסה של 6-ברומו-2-מתילקווינולין-4-אול (0.65 גרם, 2.8 מ"מ) בטולואן (10 מ"ל). הוסיפו אוקסיכלוריד פוספורוס(V) (0.65 מ"ל, 6.9 מ"מ) לתמיסה.
   2. ערבבו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. הסר את עודפי האוקסיכלוריד של הפוספורוס (V) באמצעות מאייד סיבובי.
   3. קרר את השאריות באמבט קרח. לנטרל את תערובת התגובה עם תמיסת נתרן ביקרבונט רוויה.
   4. חלץ את המוצר עם אתיל אצטט (3 על 50 מ"ל). שלבו את הפאזות האורגניות וייבשו אותן מעל סולפט נתרן חסר מים.
   5. אידוי את הממס באמצעות אידוי סיבובי כדי לקבל שארית מוצקה. ייבשו את המוצק המתקבל באמצעות אידוי סיבובי כדי לספק את המוצר הגולמי.
   6. לטהר את התרכובת באמצעות כרומטוגרפיית פלאש על ג'ל סיליקה (35–70 רשת) באמצעות הקסאן:אתיל אצטט (7:3) כנוזל.
4. סינתזה של 6-ברומו-2-מתיל-N-(4-(פיפרידין-1-יל)פניל)קינולין-4-אמין (6)
   1. הכינו תערובת תגובה המכילה 6-ברומו-4-כלורו-2-מתילקווינולין (0.53 גרם, 2 מ"מ), 4-(פיפרידין-1-יל)אנילין (0.57 גרם, 3 מ"מ), פירידין (0.24 מ"ל) ו-HCl 37% (0.2 מ"ל) באיזופרופנול (20 מ"ל).
   2. ערבבו את תערובת התגובה בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. הסר את הממס באמצעות אידוי סיבובי.
   3. טפל בשאריות בתמיסת ביקרבונט נתרן רוויה.
   4. מסננים את המוצק המתקבל דרך נייר סינון איכותי של תאית, 11 מיקרון, וממוסים אותו בכלורופורם (50 מ"ל).
   5. שטוף את תמיסת הכלורופורם במים (3 על 15 מ"ל). ייבשו את השלב האורגני על סולפט נתרן חסר מים.
   6. אידוי את הממס באמצעות אידוי סיבובי כדי לקבל מוצק ירוק. לטהר את המוצר על ידי שטיפות עוקבות עם הקסן חם (4 על 10 מ"ל).
   7. לבצע טיהור סופי באמצעות כרומטוגרפיית פלאש על ג'ל סיליקה (35–70 רשת) באמצעות הקסאן:אתיל אצטט (1:1) כנוזל שיזוף.
5. כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC)
   1. עקבו אחר התקדמות התגובה באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) על לוחות TLC Silica Gel 60 F254.
   2. השתמש בחומר התחלתי 4 כהפניה כדי לעקוב אחרי התגובה ולהעריך את צריכתה.
6. נקודת ההתכה (חבר פרלמנט)
   1. הוסיפו קצה מרית של התרכובת למכשיר נקודת ההתכה. תעד את טווח נקודת ההתכה.
   2. אל תבצע תיקונים על הערכים הנמדדים. בצע את הניסוי בשלושה עותקים.
7. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC)
   1. שקלו 1–2 מ"ג של תרכובת 6. הכינו תמיסה מלאית של התרכובת ב-1.0 מ"ג/מ"ל באצטוניטריל/מתנול (1:1, v/v).
   2. מדלל את תמיסת המאגר ל-0.5 מ"ג/מ"ל לצורך ניתוח. ניתחו את הדגימות באמצעות מערכת HPLC (ראו טבלת חומרים) המצוידת במשאבה כפולה, מזרק אוטומטי וגלאי UV.
   3. רכישת ועיבוד נתונים באמצעות תוכנת רכישת נתוני כרומטוגרפיה (ראו טבלת חומרים).
   4. הגדר את תנאי הכרומטוגרפיה כך: השתמש בעמודת C18 הפוכה, 5 מיקרון (250 x 4.6 מ"מ) (ראו טבלת חומרים). הגדר את קצב הזרימה ל-1.5 מ"ל/דקה ועקוב אחרי זיהוי UV ב-254 ננומטר. לשמור על שלב הנייד ב-100% מים (0.1% חומצה אצטית) מ-0 עד 7 דקות; יש להחיל גרדיאנט ליניארי מ-100% מים (0.1% חומצה אצטית) ל-90% אצטוניטריל/מתנול (1:1, V/V) בין 7 ל-15 דקות; חזרו ל-100% מים (0.1% חומצה אצטית) במשך 5 דקות והחזקו עוד 10 דקות.
8. תהודה מגנטית גרעינית (^1H, ^13C)
   1. שקלו 15–20 מ"ג תרכובת 6 בתוך צינור NMR. הוסף את_{DMSO-D 6} כממס.
   2. רכישת ספקטרום NMR ^{של 1}H ^ו-13Cעל ספקטרומטר NMR (ראו טבלת חומרים) באמצעות רצפי פולסים סטנדרטיים.
   3. הפעל את המכשיר בתדר 400 מגה-הרץ עבור גרעיני ¹H ו-100 MHz עבור גרעיני ¹³C. השתמשו בטטראמתילסילאן (TMS) כהפניה פנימית.
   4. הביעו הזזות כימיות (δ) בחלקים למיליון (ppm). השתמש בקובץ ה-FID שהושג מהניסוי כדי להמחיש ולעבד את נתוני ה-NMR.
9. ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (HRMS)
   1. שקלו 1–2 מ"ג של תרכובת 6. הכינו את הדגימה בתערובת 1:1 של MeOH/CH₃CN המכילה 0.1% חומצה פורמית.
   2. בצע את הניתוח על ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה של Orbitrap (ראו טבלת חומרים), המשלב ספקטרומטר מסה ליניארי עם מנתח מסה Orbitrap.
   3. הכנסת הדגימה באמצעות עירוי ישיר בקצב זרימה של 10 מיקרוליטר לדקה במצב יוני חיובי באמצעות יינון אלקטרוספריי (ESI).
   4. קבעו את הרכב האלמנטים באמצעות כלי הרכב האלמנטים בתוכנת ניתוח נתוני ספקטרומטריית המסה (ראו טבלת חומרים).
10. כרומטוגרפיית עמודה – תרכובת 4
    1. הכינו עמוד סיליקה ג'ל באמצעות סיליקה ג'ל 60 Å (70–230 רשת, 0.063–0.200 מ"מ). ארזו את העמודה כראוי עם ג'ל הסיליקה.
    2. השתמש בהקסאן/אתיל אצטט (7:3, v/v) כשלב נייד. טען את התרכובת הגולמית 4 על העמוד. שחרר את התרכובת ואסף שברים.
    3. עקוב אחרי החלקים לפי TLC ומשלב את החלקים המכילים את המוצר הטהור.
11. כרומטוגרפיית עמודה – תרכובת 6
    1. הכינו עמוד סיליקה ג'ל באמצעות סיליקה ג'ל 60 Å (70–230 רשת, 0.063–0.200 מ"מ). ארזו את העמודה כראוי עם ג'ל הסיליקה.
    2. השתמש בהקסאן/אתיל אצטט (1:1, v/v) כשלב נייד. טען את התרכובת הגולמית 6 על העמוד. שחרר את התרכובת ואסף שברים.
    3. עקוב אחרי החלקים לפי TLC ומשלב את החלקים המכילים את המוצר הטהור.

איור 1. תגובות ותנאים: i = MgSO₄, AcOH, EtOH, 90 °C, 16 שעות; ii = C₁₂שעות₁₀, C₁₂H₁₀O, 230-250 °C, 15 דקות; iii = נקודת מוצא₃, טולואן, 110 מעלות צלזיוס, 2 שעות; iv = פירידין, HCl, (פרק₃)₂CHOH, 85 °C, 16 שעות. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.

2. קביעת ריכוז מעכב מינימלי

1. עיצוב ניסיוני ופריסת הלוחות
   1. העריכו את התרכובות מבחינת יכולתן לעכב את התפתחות M. tuberculosis באמצעות בדיקת מיקרופלט קולורימטרית להפחתת רזורין (REMA) לקביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC), כפי שתואר קודם 11,12,13.
   2. לבצע שלושה ניסויים עצמאיים (שלושה שכפולים ביולוגיים) לכל תרכובת שנבדקה ללא שכפולים טכניים (שורה אחת לכל תרכובת ולוח אחד לכל ניסוי).
   3. העריכו תרכובות הפועלות כאמצעי בקרה חיוביים יחד עם תרכובות בדיקה כדי לוודא שתנאי הבדיקה מאפשרים עיכוב גדילה.
   4. בדיקה של איזוניאזיד (INH) וריפמפיצין (RIF) כביקורת חיובית.
   5. הקצה שורות A ו-B לתרכובות ביקורת (INH ו-RIF, בהתאמה).
   6. הקצה שורות נוספות לתרכובות בדיקה (תרכובות A עד F באיור 2).
   7. הכינו עמודות 1 עד 10 עם דילול סדרתי כפול של תרכובות בקרה ובדיקה, כאשר כל תרכובת תופסת שורה אחת, כאשר הריכוז הגבוה בעמודה 10 והריכוז הנמוך בעמודה 1.
   8. הכינו את עמודה 11 כבקרה חיונית הכוללת מדיום גדילה וחיידקים בריכוז DMSO סופי של 2.5%, ללא תוספת של תרכובת בקרה או בדיקה.
   9. הכינו את עמודה 12 כבקרת סטריליות על ידי הוספת תרכובות בקרה או בדיקה בריכוז הגבוה יותר של הדילול הסדרתי (זהה לעמודה 10) למדיום גדילה ללא תאי חיידקים.
   10. עיין באיור 2 לפריסה מייצגת של לוח MIC.
2. הכנת חומרים
   1. הכנת מרק מידלברוק 7H9 בתוספת חומצה אולאית, אלבומין, דקסטרוז וקטלאז (OADC).
      1. לבקבוק זכוכית בנפח 200 מ"ל המכיל 90 מ"ל מים אולטרה-טהורים, הוסיפו 0.47 גרם אבקת 7H9, 0.24 מ"ל של 85% גליצרול, ו-0.5 מ"ל של 10% טווין-80.
      2. אוטוקלב את המדיום למשך 10 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס ו-98.07 קילופסקל.
      3. אפשר למדיום להתקרר עד שהוא חם למגע (כ-45–50 מעלות צלזיוס).
      4. הוסף 10 מ"ל של OADC (אנו משתמשים ב-OADC הזמין מסחרית; ראו טבלת חומרים לפרטים).
      5. אחסון ב-4 מעלות צלזיוס.
         הערה: הכינו את הכמות המתאימה לניסוי, תוך התחשבות בפרופורציות של התגובות.
   2. הכנת מרק מידלברוק 7H9 עם ADC
      1. לבקבוק זכוכית בנפח 200 מ"ל המכיל 90 מ"ל מים אולטרה-טהורים, הוסיפו 0.47 גרם אבקת 7H9. אוטוקלב את המדיום למשך 10 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס ו-98.07 קילופסקל.
      2. אפשר למדיום להתקרר עד שהוא חם למגע (כ-45–50 מעלות צלזיוס). הוסף 10 מ"ל של ADC. אחסון ב-4 מעלות צלזיוס.
         הערה: הכינו את הכמות המתאימה לניסוי, תוך שמירה על פרופורציות המגבים.
   3. הכנת תמיסות מלאי מורכבות
      1. הכן תמיסה מלאית של כל תרכובת ב-2 מ"ג/מ"ל מומס ב-DMSO.
      2. אחסון בטמפרטורה של –20°C.
         הערה: לפני הניסוי, הריכוז המרבי של הבדיקה מוגדר על בסיס הערכת מסיסות. כדי לקבוע את מגבלת המסיסות, יש לבדוק ויזואלית את התמיסות לאיתור נוכחות גבישים. אם נצפים גבישים, יש לדלל עוד יותר את האליקו למחצית מהריכוז הקודם. בצע את ההערכה הזו באמצעות 5% DMSO.
   4. הכנת פתרונות עבודה מורכבים
      הערה: תמיסות עבודה צריכות להיות מוכנות טריות בזמן הניסוי על ידי דילול התרכובות המקוריות בציר 7H9 עם תוספת של 10% ADC. הריכוז הסופי של DMSO בתמיסה העובדת צריך להיות 5%, וריכוז התרכובת צריך להיות כפול מהריכוז הגבוה ביותר המיועד לבדיקה. ראוי לציין כי הריכוז הסופי של DMSO אליו חיידקים נחשפים במהלך הבדיקה הוא 2.5%, שכן הנפח מוכפל לאחר הוספת השעון החיידקי (ראו סעיף 2.3, שלב 2.3.8).
      הערה: DMSO 2.5% נסבל על ידי זני החיידקים המשמשים במעבדתנו (M. tuberculosis H37Ra, H37Rv ובידוד קליני). אם עובדים עם זנים אחרים או מינים חיידקיים אחרים, יש לבצע ניסוי MIC ראשוני תוך שימוש ב-DMSO כתרכובת בדיקה כדי לקבוע את הריכוזים הגבוהים ביותר של DMSO שניתן להשתמש בהם מבלי לעודד עיכוב גדילה.
   5. הכנת תמיסת רזורין
      1. הכינו תמיסה של ראזורין של 0.01% על ידי המסה של 1 מ״ג רזאורין ב-10 מ״ל מים אולטרה-טהורים.
      2. חטא את התמיסה באמצעות פילטר של 0.22 מיקרון.
         הערה: רזורין מעוקר במסנן ניתן לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע¹⁴. עם זאת, יש להכין את התמיסה מיד לפני השימוש כפרקטיקה סטנדרטית.
3. הכנת מיקובקטריה
   1. החסן מושבה אחת של M. tuberculosis בצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל מרק 7H9 בתוספת 10% OADC, 0.2% גליצרול ו-0.05% טווין-80.
   2. דגרו ברעידה מתמדת (100 סל"ד) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהתרבית מגיעה לצפיפות אופטית של 600 ננומטר (OD₆₀₀) של 0.6 עד 0.8 (כ-3 עד 4 שבועות).
      אזהרה: M. tuberculosis H37Rv מסווג כפתוגן קבוצת סיכון 3, המסוגל להעברה באוויר ולגרום למחלה קטלנית פוטנציאלית בבני אדם. לבצע את כל המניפולציות בארון בטיחות ביולוגית מוסמך במעבדה ברמת ביו-בטיחות 3 (BSL-3), תוך שימוש בציוד מגן אישי (PPE) מתאים.
   3. הומוגניזציה של תרבית החיידקים על ידי מערבולת עם חרוזי זכוכית סטריליים (1 מ"מ) למשך 3 דקות.
   4. תן למתלה לנוח 15 דקות כדי להתיישב גושים.
   5. מדוד את_{ה-OD 600} של הסופרנטנט ואחסן את האליקווטים בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס.
      הערה: לניסויים, מדלל את ההשעיה החיידקית ל-OD_{תיאורטי 600} של 0.006 בציר 7H9 טרי עם תוספת של 10% ADC. החלק 100 מיקרוליטר לבאר ללוחות עם 96 בארות במהלך הבדיקה.
4. הכנת לוחות 96 בארות
   1. הוסיפו 100 מיקרוליטר של ציר 7H9 בתוספת 10% ADC לעמודה 12.
   2. הוסיפו 100 מיקרוליטר של ציר 7H9 בתוספת 10% ADC (עם 5% DMSO) לעמודות 11 ו-9 עד 1.
   3. הוסף 200 מיקרוליטר מהתמיסה המורכבת (שהוכנה בריכוז בדיקה כפול הגבוה ביותר) לעמודה 10 (הקצה שורה אחת לכל תרכובת).
   4. הוסף 100 מיקרוליטר מהתמיסה המורכבת לעמודה 12. בצע דילול סדרתי כפול: העבר 100 מיקרוליטר מעמודה 10 לעמודה 9 וערבב היטב באמצעות פיפטינג.
   5. המשך את הדילול הסדרתי מעמודה 9 לעמודה 1. השליכו את 100 המיקרוליטר האחרונים מעמודה 1.
   6. הוסיפו 100 מיקרוליטר של השעיה החיידקלית (OD₆₀₀ תיאורטית של 0.006) לעמודות 11 עד 1.
   7. כסו את הצלחת, אטמו בפרה-פילם, ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 7 ימים.
      הערה: איור 2 הוא פריסה מייצגת של לוח MIC. עיין באיור זה כדי לפרש את השלבים 2.3.1 עד 2.3.9.
5. הוספת רזורין וניתוח נתונים
   1. הוסף 60 מיקרוליטר של תמיסת רזאורין של 0.01% לכל באר של הלוח. כסו את הצלחת, אטמו בפראפילם, ודגרו בטמפרטורה של 37°C במשך 48 שעות.
   2. צפו בשינוי הצבע מכחול (עיכוב גדילה) לורוד (צמיחת חיידקים).
      הערה: בחלק מהניסויים, שינוי צבע לא שלם גורם לבאר סגולה. פרש זאת כגידול חיידקים.

איור 2. ייצוג סכמטי של צלחת מיקרודילול בציר המשמש לקביעת ריכוז מעכב מינימלי (MIC). דילול כפול סדרתי של התרכובות שנבדקו התפזרו בין עמודות 1–10, והדילול הבא מבוצע ברצף מעמודה 10 לעמודה 1, כאשר הריכוז הגבוה ביותר של התרכובות נמצא בעמודה 10. שורות A ו-B מתאימות לביקורות חיוביות המכילות את תרופות הייחוס איזוניאזיד וריפמפצין, בהתאמה. השורות C–H מתאימות לתרכובות שנבדקו. עמודה 11 מייצגת שליטה על החיוניות (מדיום המכיל 2.5% DMSO וחינוקולום חיידקים), בעוד שעמודה 12 מתייחסת לבקרת הסטריליות (מדיום המכיל את התרכובות בהיעדר אינקולום חיידקי). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

3. הערכת ציטוטוקסיות בקווי תאים יונקים

הערה: יש לבצע את כל המניפולציות של תרבית תאים בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגי מוסמך מסוג Class II.

1. הכנת קווי תאים יונקים
   1. תרבית קווי תאי קרצינומה של כבד אנושי (HepG2) וכליית קוף ירוק אפריקאי (Vero) ב-Modified Eagle Medium (DMEM) בדולבקו.
   2. הוסיפו למדיום 1.8 גרם לליטר נתרן ביקרבונט, 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין, ו-0.1% אמפוטריצין B (המכונה מדיום שלם).
   3. דגרו את תרביות התאים בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה לחה המכילה 5%_CO2.
   4. קציר תאים תת-מתכנסים (70%–80%) על ידי טיפול בהם בתמיסת טריפסין-EDTA של 0.25% למשך 5–10 דקות.
   5. לנטרל את הטריפסין על ידי הוספת נפח שווה של מדיום שלם. העבר את תליית התא לצינור קוני של 15 מ"ל וצנטריפוגה בעוצמה של 200 x g למשך 5 דקות.
   6. זרוק את הסופרנטנט ותלה את כדור התא ב-10 מ"ל של מדיום טרי מלא.
   7. קבעו את ריכוז התאים ויכולת הקיימות באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוסיטומומטר עם החרגת כחול טרייפן.
      הערה: לצורך החרגת כחול טריפן, ערבב 10 מיקרוליטר של תליית תא עם 10 מיקרוליטר של תמיסת כחולה של 0.4% טרייפן וטעינה על ההמוציטומטר (או סלייד הספירה). תאים מתים או פגומים בממברנה נראים כחולים, בעוד שתאים חיים נשארים ללא צבע. חשב את הקיימות כ-% חיוניות = (תאים לא מוצבעים / סך התאים) x 100. יש להמשיך בזריעה רק אם הכדאיות ≥ 90%.
   8. דילל את תליית התא לצפיפות הזריעה היעדית. זרע 100 מיקרוליטר של תליית תאים בכל באר של עמודים 2 עד 12 של לוח שטוח בעל 96 בארות.
      צפיפויות זריעה: 4,000 תאים לבאר לתאי Vero; 5,000 תאים לבאר לתאי HepG2.
      הערה: אופטימיזציה של צפיפויות אלו כדי להבטיח שהתאים יישארו בשלב הצמיחה הלוגריתמי ולא יגיעו ל-100% מפגש לפני נקודת הסיום של 48 שעות.
   9. מלאו את עמודה 1 ב-100 מיקרוליטר של מדיום שלם (ללא תאים) כדי לשמש כחלל ריק למדידות ספיגה.
   10. הכינו ארבעה לוחות זהים לכל קו תאים: שתיים למבחן MTT ושניים למבחן NRU.
   11. דגרו את הלוחות למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם 5%_CO2 כדי לאפשר חיבור תאים.
2. דילול תרכובות וטיפול בתאים
   1. הכינו תמיסות מלאי לכל תרכובת בדיקה במי מלח מפוזרים פוספט (DPBS) של Dulbecco או בממס מתאים (למשל, דימתיל סולפוקסיד; DMSO).
      הערה: ודאו שהתרכובת מסיסת במדיום תרבית התאים ושהריכוז של הממס אינו רעיל (למשל, <0.1% v/v עבור DMSO) לפני הבדיקה.
   2. עצב את פריסת הלוחות כך שתכלול ריקים, בקרות מתאימות ושכפולים טכניים. פריסה מייצגת לבדיקת עד 9 תרכובות ב-8 ריכוזים מוצגת באיור 3.
   3. הכינו דילול סדרתי של תרכובת הבדיקה במדיום מלא כדי לכסות את טווח הריכוז המיועד. ודא שיש מספיק נפח לכל לוחות השכפול.
      הערה: אם משתמשים בממס (למשל, DMSO), יש להוסיף את מדיום הדילול כך שריכוז הממס הסופי יישאר קבוע לאורך כל סדרת הדילול הסדרתי.
      הערה: בארות מטופלות בממס (בקרת רכב) משמשות כבקרה השלילית הפונקציונלית, ומגדירה 100% חיוניות תאית שבאמצעותה מנורמל בארות מטופלות בתרכובת. לצורך אימות בדיקה, כללו תרכובת ייחוס ציטוטוקסית (למשל, 0.1% טריטון X-100 או 1 מילימולר נתרן דודציל סולפט) בריכוז הידוע כגורם למוות תאי מלא (0% חיוניות). ערכי הספיגה בבארות הבקרה החיוביות הללו לא אמורים להיות שונים משמעותית מבארות ריקות, מה שמאשר כדאיות של 0%.
   4. לאחר תקופת חיבור תאים בת 24 שעות, יש לבדוק את הלוחות תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שהתאים מחוברים, מתפשטים ומכסים כ-70%–80% משטח הבאר עם מפגש הומוגני. להשליך לוחות שמראים זיהום או חיבור לא מספק.
   5. שאף בזהירות את מדיום התרבית באמצעות קצה פיפטה, תוך זווית הקצה לצד כל באר כדי לא להפריע לשכבת התא. לעבד לוחות בחתכים כדי למנוע ייבוש.
   6. מיד הוסיפו 100 מיקרוליטר של דילול תרכובות הבדיקה או מדיום בקרה המתאים לבארות המתאימות.
   7. דגרו את הצלחות המטופלות במשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%_CO2.
3. פרוטוקול מבחן MTT
   1. הכינו תמיסת MTT של 0.5 מ"ג/מ"ל ב-DMEM ללא סרום. לסנן דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרון ולהגן מפני אור.
   2. לאחר 48 שעות הטיפול, יש לבדוק את התאים באופן ויזואלי כדי לאשר את השפעות הטיפול הצפויות.
   3. שאפו בזהירות את המדיום מפלטות ה-MTT. הוסף 50 מיקרוליטר מתמיסת MTT של 0.5 מ"ג/מ"ל לכל באר.
   4. דגרו במשך 3 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%_CO2, מוגן מאור.
      הערה: למרות ש-2–4 שעות הן נפוצות, דגירה של 3 שעות בדרך כלל מספיקה לתאי Vero ו-HepG2. אופטימיזציה אם צריך.
   5. הוסף 100 מיקרוליטר של 100% DMSO לכל באר כדי להמיס את גבישי הפורמזן. הניחו את הלוחות על שייקר אורביטלי במהירות 100 סל"ד למשך 15 דקות, מוגנים מאור. בדוק בארות בקרה כדי להבטיח המסה מלאה של הגבישים. קרא את הספיגה ב-570 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט. אם זמין, קבע אורך גל ייחוס של 630–690 ננומטר.
4. פרוטוקול בדיקת קליטה אדומה ניטרלית (NRU)
   1. הכן תמיסה ניטרלית אדומה (NR) של 40 מיקרוגרם/מ"ל ב-DMEM ומסנן ללא סרום. הכינו את תמיסת הספיחה של NR: 1% (v/v) חומצה אצטית קרחונית, 49% (v/v) אתנול, ו-50% (v/v) מים אולטרה-טהורים.
      אזהרה: חומצה אצטית קרחונית היא קורוזיבית; ידית עם קפוצ'ון אדים.
   2. לאחר הטיפול של 48 שעות, בדוק את התאים בצורה ויזואלית. שאפו בזהירות את המדיום מפלטות NRU.
   3. הוסף 100 מיקרוליטר מהתמיסה העובדת של 40 מיקרוגרם/מ"ל NR לכל באר. דגרו במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5%_CO2.
      הערה: דגירה של 2 שעות מספיקה לספיגת צבע מקסימלית בקווי תאים אלו.
   4. שאפו את פתרון העבודה של NR. שטוף בעדינות כל באר פעם אחת עם 150 מיקרוליטר של PBS סטרילי.
   5. הוסף 150 מיקרו-ליטר של תמיסת הספיחה של NR לכל באר. הנח על שייקר אורביטלי במהירות 150 סל"ד למשך 15 דקות כדי להוציא את הצבע.
   6. בדוק בארות בקרה כדי להבטיח חילוץ צבע מלא. קרא את הספיגה ב-540 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט.
5. ניתוח נתונים
   1. בצע חיסור רקע על ידי חישוב הספיגה הממוצעת של העמודות הריקות והחסרת ערך זה מכל הבארות.
   2. בצע בדיקת רעילות ממס על ידי השוואת בארות בקרת ממס לבקרות לא מטופלות. אם הקיימות נמוכה מסף מוגדר (למשל, 80%), יש לשקול ציטוטוקסיות של ממס.
   3. חישב אחוז הקיימות ביחס לבארות בקרה בממס:
      % חיוניות = (ספיגת היטב המטופל / ספיגה ממוצעת של בקרת ממס) x 100.
   4. תרשום את אחוז הכדאיות (ציר y) מול log₁₀ של ריכוז התרכובות (ציר x). השתמש במודל רגרסיה לא ליניארי (תגובת מינון סיגמואידלית, שיפוע משתנה) כדי לקבוע CC₅₀.
   5. חשב את מדד הסלקטיביות (SI) על ידי חלוקת CC₅₀ ב-MIC.

איור 3. דוגמה לעיצוב לוח לבדיקת עמידות תאי MTT/NRU, סינון מוקדם לבדיקת ציטוטוקסיות של עד 9 תרכובות. (א) תכנית עיצוב לוחית. עמודה 1 מוקצית "ריק", ללא תאים, וממולאת ב-DPBS או מדיה מלאה. עמודות 2 ו-12 מוזרעות בתאים ומטופלות במדיה מלאה ("בקרה לא מטופלת") או במדיום מלא עם ממס ("בקרת ממס"). עמודות 3 עד 11 מוזרעות בתאים ומטופלות בדילול סדרתי של התרכובות הנבדקות, עד 9 תרכובות עם שכפול אחד לכל ריכוז שנבדק לכל תרכובת. (ב) תמונות מייצגות של לוח Vero NRU (למעלה) ולוחית Vero MTT (למטה) לאחר 48 שעות הטיפול ושלבי הבדיקה הסופיים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

תוצאות

הסינתזה הניבה את התרכובת 6 היעד כמוצק ירוק בהיר (0.53 גרם, 67% תפוקה). התרכובת מציגה נקודת התכה של 227–229 מעלות צלזיוס וטוהר UHPLC של 99% (t_R = 14.11 דקות) (איור 4). המבנה הכימי אושר באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) וספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (HRMS). ספקטרום ה-NMR ^{של 1}H (איור 5) הראה אותות התואמים לחתיכת הפיפרידין בין 1.50 ל-3.13 ppm. קבוצת המתיל במיקום 2 הופיעה כסינגלט טיפוסי ב-2.38 ppm. המימן במיקום ה-3 הופיע כסינגלט ב-6.56 ppm. טבעת הפניל הציגה שני דאבלט ב-6.97 ו-7.17 ppm, עם קבוע צימוד של 8.9 הרץ. המימן במיקום 7 ו-8 יצר מולטיפלט ב-7.63–7.75 ppm, בעוד המימן במיקום 5 של ליבת הקינולין יצר דו-פלט ב-8.59 ppm (J = 2.0 הרץ). המימן אמין נצפה כסינגלט בעוצמה של 8.66 ppm. ספקטרום ה-NMR ^{של 13}מעלות צלזיוס (איור 6) הציג אות בעוצמה של 23.81 חלקים למיליון המיוחס לקבוצת המתיל במיקום השני, בעוד שאותות בין 24.85 ל-49.70 חלקים למיליון התאימו לחתיכת הפיפרידין. הפחמן במיקום ה-3 הופיע ב-100.52 חלקים למילקון. האותות שנותרו בשדה המרכזי יוחסו לליבת הקינולין ולפחמני טבעת פניל. HRMS אישר את הנוסחה המולקולרית של תרכובת 6, והראה יון [M+H^]+ ב-m/z 396.1063 (חשבון עבור C₂₁H₂₃BrN₃: 396.1070).

איור 4. כרומטוגרם HPLC וספקטרום UV של תרכובת 6. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5. ^{ספקטרות H}NMR (400 MHz, DMSO-d6) של תרכובת 6. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 6. ^{ספקטרום 13C}NMR (101 MHz, DMSO-d6) של תרכובת 6. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הפעילות המעכבת של התרכובת נגד M. tuberculosis הוערכה על ידי קביעת ה-MIC, שהוגדר כרכוז הנמוך ביותר של תרכובת שמונעת לחלוטין גדילה חיידקית נראית לעין. במבחן REMA, חוסר שינוי צבע (נשאר כחול) מצביע על עיכוב גדילה, בעוד ששינוי לורוד מצביע על צמיחת חיידקים. איזוניאזיד (INH) וריפמפיצין (RIF) שימשו כבקרת תרופות. התוצאות מוצגות באיור 7. כל פלטה כללה בקרת גדילה (עמודה 11, ללא תרופות) ובקרת עקר (עמודה 12, ללא מיקובקטריה). התרכובות דוללו באופן סדרתי מעמודה 10 (הריכוז הגבוה ביותר) לעמודה 1 (הריכוז הנמוך ביותר). כפי שמוצג באיור 7, ערך ה-MIC של התרכובת בשורה A (איזוניאזיד) נצפה בעמודה 4, בעוד שערכי ה-MIC עבור התרכובות בשורות B (ריפמפיצין) ו-C (תרכובת מסונתזת) נצפים בעמודה 5. בידינו, ערכי MIC עבור INH הם 0.31 מיקרוגרם/מ"ל למאמץ H37Rv ו-0.16 מיקרוגרם/מ"ל עבור H37Ra, בעוד שב-RIF אנו מקבלים 0.08 מיקרוגרם/מ"ל עבור H37Rv ו-0.01 מיקרוגרם/מ"ל עבור עיוות H37Ra.

איור 7. קביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) במיקובקטריום טוברקולוזיס באמצעות מבחן מיקרופלט רזורין (REMA). שורות A–C, עמודות 1–10: דילול סדרתי כפול של איזוניאזיד (שורה A), ריפמפיצין (שורה B) והתרכובת הסינתטית (שורה C). עמודה 11: בקרת חיוניות (מדיום המכיל 2.5% DMSO + חיידקים). עמודה 12: בקרת סטריליות (בינוני + תרכובת). צבע כחול מסמל עיכוב צמיחת חיידקים, בעוד שצבע ורוד מציין את חיוניות החיידקים בעקבות הפחתה של ראזורין לרסורופין. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

לוח מייצג של 96 בארות עבור מבחני NRU (Vero, למעלה) ו-MTT (Vero, למטה) מוצג באיור 3B. בלוח ה-MTT נראה גרדיאנט צבע שקוף, המשתנה משקופות (ללא תאים חיוניים) בריכוזים גבוהים לסגול עמוק (חיות תאית גבוהה) בריכוזים נמוכים. באופן דומה, לוח NRU מציג גרדיאנט משקוף לורוד עמוק, מה שמעיד על קליטת הצבע האדום הנייטרלי לליזוזומים של תאים ברי קיימא.

מיקרוסקופיה מספקת אישור חזותי למצב הבדיקה לאחר זמן הדגירה של 48 שעות (איור 8). איור 8A משווה בין תאי ביקורת בריאים ולא מטופלים (Vero ו-HepG2) לתאים שטופלו בריכוז ציטוטוקסי של התרכובת. התאים המטופלים נראים מעוגלים, מנותקים ולא חיים. איור 8B מספק נקודת ביקורת ויזואלית קריטית לפני שלב המיסה הסופי. המחקר מראה את היווצרות גבישי פורמזן סגולים כהים בתוך תאים חיים (בדיקת MTT) ואת הצטברות צבע אדום בתוך הליזוזומים (בדיקת NRU) בשני סוגי התאים.

נתוני הספיגה הגולמיים ננורמו לבקרת הרכב ונותחו באמצעות רגרסיה לא ליניארית ליצירת עקומות מינון-תגובה כפי שמפורט בפרוטוקול שלב 3.5. עבור תרכובת היעד 6 (שמקורה ב-LABIO-17), ניתוח זה הניב CC₅₀ של 12.2 מיקרומום (Vero) ו-18.3 מיקרומום (HepG2) במבחן NRU, ו-CC₅₀ >20 מיקרומום לשני קווי התאים במבחן MTT. כתוצאה מכך, מדד סלקטיביות (SI) נע בין 30.5 ל->50, כפי שדווח קודם^{לכן 10}.

איור 8. תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של בדיקות ציטוטוקסיות בתאי Vero ו-HepG2. כל התמונות צולמו בהגדלה של פי 100. (א) השוואת מורפולוגיית התאים לאחר 48 שעות של טיפול. בארות בקרה לא מטופלות לתאי Vero (למעלה) ו-HepG2 (תחתונה) מראות שכבה מונו-שכבה בריאה ומתלכדת. לעומת זאת, תאים שטופלו בריכוז ציטוטוקסי של תרכובת נראים עגולים, מצומצמים ומנותקים מפני השטח של הלוח. (ב) נקודות ביקורת ויזואליות קריטיות לאחר הוספת מגיב ולפני המסיסה. במבחן MTT (פאנלים שמאליים לכל קו תאים), תאים חיים מכילים גבישי פורמזן סגולים כהים גלויים. במבחן NRU (פאנלים ימינים לכל קו תאים), תאים חיים מראים הצטברות של צבע אדום בתוך ליזוזומים שלמים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

גישת סקר פנוטיפית, המתבססת על פעילות תאית שלמה ולא על אנזימים מבודדים, היא אסטרטגיה יעילה לזיהוי תרכובות פעילות נגד M. tuberculosis. כאן תיארנו את השלבים הראשונים של הגישה הזו, שכללו את הסינתזה הכימית של תרכובת מועמדת, הערכת פעילותה המעכבת באמצעות קביעת ריכוז מעכב מינימלי (MIC), והערכת הציטוטוקסיות שלה בתאי יונקים (Vero ו-HepG2) באמצעות בדיקות MTT ו-NRU.

המסלול הסינתטי כלל שלושה שלבים עיקריים (איור 1), שמספקים את התרכובת המטרה בטוהר גבוה באמצעות טרנספורמציות תפעוליות פשוטות. מספר שלבים קריטיים זוהו כגורם גורם לשחזוריות וליעילות. העיבוי הראשוני דורש שליטה סטואיכיומטרית מדויקת וריפלוקס מתמשך כדי להבטיח היווצרות ביניים מלאה. הסרה חלקית של ממס לפני מחזוריות תרמית עלולה להשפיע לרעה על יעילות סגירת הטבעות. שלב המחזוריות עצמו דורש שליטה קפדנית בטמפרטורה, שכן חימום לא מספק גורם לאארומטיזציה לא שלמה, בעוד שחימום מופרז או ממושך עלול לקדם היווצרות תוצרי לוואי. במהלך הכלור, מומלץ שליטה מדויקת בטמפרטורת התגובה ותוספת הדרגתית של כלוריד פוספוריל כדי למזער תגובות צדדיות ולהבטיח הפעלה סלקטיבית בעמדה 4. במהלך אופטימיזציית השיטה, התאמות פרוצדורליות קלות שיפרו את החוסן. במקרים של משקעים לא שלמים לאחר מחזוריות, קירור הדרגתי במקום קירור מהיר שיפר את ההתאוששות המוצקה. אם נצפו ירידה בתפוקה בשלב ההחלפה הנוקלאופילית, הארכת זמן התגובה או אימות טוהר האמינים התבררו כמועילות.

המגבלות העיקריות של השיטה הן הצורך במחזוריות בטמפרטורות גבוהות ותגובות כלורין קורוזיביות כמו פוספוריל כלוריד, הדורשות תשתית מעבדה ובטיחות ספציפית. השפעות אלקטרוניות חלופיות עשויות לדרוש אופטימיזציה מחדש עבור אנילינים או אמינים שונים, מה שמגביל את הגיוון הרחב של הפיגומים ללא התאמה. עם זאת, גישת קונרד–לימפאך פשוטה יותר מבחינה תפעולית מסינתזות מסוג סקראופ (מחמצנים חזקים) או פרוטוקולים עם מתכות מעבר (קטליזטורים מיוחדים/אטמוספירות אינרטיות). אסטרטגיה נטולת מתכות זו מניבה ביעילות מתווכים של קינולין פונקציונליים לכימיה רפואית.

הפרוטוקול המשמש לקביעת ה-MIC הוא מבחן קולורימטרי המבוסס על בדיקה ויזואלית. אתגר פוטנציאלי בשיטה זו הוא שינוי צבע לא שלם, מה שמוביל לבאר סגולה במקום כחול מובחן (עיכוב) או ורוד (צמיחה). אם זה קורה, יש לפרש זאת ככישלון בעיכוב צמיחת מיקובקטריאלי. בנוסף, כאשר התרכובת מוערכת באמצעות דילול סדרתי, הריכוז המקסימלי שניתן לבדוק נקבע לפי מסיסותה. כתוצאה מכך, במקרים מסוימים, התוצאה עלולה להיות לא חד-משמעית אם לא נצפה עיכוב בריכוז המסיסי המרבי. יתרה מזאת, חשוב להכיר בכך שמעבדות אחרות עשויות להתאים שלבים מסוימים של הפרוטוקול לתנאים הספציפיים שלהן, מה שעלול להוביל לשינויים בתוצאות שהושגו. כדי להגדיל את התפוקה, ניתן להתאים פרוטוקול זה לאוטומציה. יישום מערכות טיפול בנוזלים להכנת לוחות ב-96 בארות יפחית את שגיאות הפיפטרה, ובכך ישפר את הדיוק והשחזור.

פרוטוקול הערכת הציטוטוקסיות עושה שימוש בשני קווי תאים יונקים נפרדים (Vero ו-HepG2) ושני מבחני חיוניות משלימים (MTT ו-NRU). מספר שלבים בפרוטוקול זה קריטיים להבטחת שכפול ודיוק נתונים, וכל מעבדה צריכה לבצע את האימות שלה. לדוגמה, צפיפות הזריעה הראשונית של התאים חייבת להיות מאופטמת בקפידה, שכן התנגשות יתר עלולה להוביל לעיכוב מגע ולשינויים במצבים מטבוליים, מה שמבלבל את התוצאות, בעוד שהזרעה תת-חלקית עלולה לגרום לתאים להיות רגישים יותר לפגיעות קלות, מה שעלול להעריך יתר על המידה את הרעילות¹⁵. יתרה מזאת, הריכוז הגבוה ביותר שנבדק מוגבל לעיתים קרובות על ידי מסיסות התרכובת, והמשקעים עלולים להוביל לתוצאות לא מדויקות. כמו כן, פריסת הלוחות המוצעת (איור 3A) מיועדת לסינון ראשוני, הממקסם את מספר התרכובות שנבדקו על ידי ויתור על שכפולים טכניים והתעלמות מהשפעות קצה לטובת אימות באמצעות שכפולים ביולוגיים עצמאיים.

חוזקה מרכזית של פרוטוקול זה היא היישום המקביל של בדיקות MTT ו-NRU. למרות ששניהם מבוססים היטב, הם מודדים פרמטרים תאיים שונים. מבחן ה-MTT מכמת את הפעילות המטבולית של דה-הידרוגנאזות מיטוכונדריאליות, אשר בדרך כלל מתואמת עם חיוניות התאים¹⁶. עם זאת, בדיקה זו רגישה להפרעות מתרכובות בעלות תכונות מחמצות או מחמצנות או כאלה שמפריעות לנשימה המיטוכונדריאלית, מה שמוביל^{לתוצאות} שגויות פוטנציאליות. הרצת מבחן NRU במקביל מסייעת באיתור תקלות כאלה. מבחן NRU מודד את יכולתם של תאים בריאים לשמור על שלמות הליזוזומלית ומדרגות ה-pH הנדרשות לספיגת צבע¹⁷. פערים בין תוצאות MTT ל-NRU יכולים לחשוף מנגנונים מסוימים של רעילות, כגון תפקוד לקוי של מיטוכונדריה, המחייבים חקירה נוספת.

לסיכום, פרוטוקול זה מפרט את השלבים הבסיסיים לזיהוי מועמדים פוטנציאליים לתרופות אנטי-שחפת. תרכובות המפגינות סלקטיביות ועוצמה מבטיחות יכולות להתקדם לאחר מכן למודלים מורכבים יותר של זיהום, כמו מחקרים in vivo .

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קווי תאים
HepG2 (סרטן כבד אנושי)	ATCC	HB-8065	קו תאים של סרטן כבד אנושי
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	ATCC	25177
Mycobacterium tuberculosis H37Rv	ATCC	27294
Vero (כליה של קוף ירוק אפריקאי)	ATCC	CCL-81	קו תאים של אפיתל כליה פרימטית
כימיקלים – סינתזה
4-(Piperidin-1-yl)aniline	Sigma-Aldrich	TCI: P0887	חומר מוצא לתרכובת 5/6
4-Bromoaniline	Sigma-Aldrich	108-67-8	חומר מוצא לסינתזה של קווינולין
חומצה אצטית (glacial)	Sigma-Aldrich	695092	חומר ריאגנטי בסינתזה והכנת שלב נייד
אצטוניטריל (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	34967	מרכיב שלב נייד של HPLC וממס NMR
כלורופורם	Sigma-Aldrich	C2432	ממס לחילוץ מוצר
DMSO-d6 (deuterated)	Sigma-Aldrich	175641	ממס NMR
Dowtherm A (נוזל העברת חום)	Sigma-Aldrich / Solutia	TBD	ממס רתיחה גבוהה לציקליזציה תרמית (230–250 °C); בעבר הוגדר כ-Dowtherm® A
Ethanol (absolute)	Sigma-Aldrich	459836	ממס תגובה לשלב Conrad–Limpach
Ethyl acetate (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	270989	מרכיב אלונט של העמודה
Ethyl acetoacetate	Sigma-Aldrich	E12806	חומר ריאגנטי β-ketoester להיווצרות טבעת קווינולין
חומצה פורמית (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	F0507	חומר תוסף של 0.1% בשלב נייד ל-HPLC ו-HRMS
חרוזי זכוכית (1 ממ, סטריליים)	Sigma-Aldrich	G8772	להמוגניזציה של תרבית M. tuberculosis
HCl (חומצה הידרוכלורית, 37%)	Sigma-Aldrich	320331	חומר זרז חומצי בהחלפה נוקלאופילית
הקסאן (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	34859	אלונט לא קוטבי לכרומטוגרפיה בעמודה
איזופרופנול	Sigma-Aldrich	278475	ממס תגובה לסינתזה של תרכובת 6
מגנזיום סולפט (MgSO4, anhydrous)	Sigma-Aldrich	M7506	חומר ייבוש וזרז תגובה
מתנול (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	34860	מרכיב שלב נייד של HPLC וממס NMR
חמצן פחמן (POCl3)	Sigma-Aldrich	201170	חומר ריאגנטי כלורינציה לחומר ביניים 4
פִּירִידִין	Sigma-Aldrich	270970	חומר זרז בסיסי בהחלפה נוקלאופילית
ג'ל סיליקה (35–70 mesh) לכרומטוגרפיה פלאש	Macherey-Nagel	815349	שלב נייח לצעדי כרומטוגרפיה פלאש
ג'ל סיליקה 60 Å (70–230 mesh) לכרומטוגרפיה בעמודה	Macherey-Nagel	815381	שלב נייח לכרומטוגרפיה בעמודה
סולפט נתרן (Na2SO4, anhydrous)	Sigma-Aldrich	239313	חומר ייבוש לשלב האורגני
לוחות TLC ג'ל סיליקה 60 F254	Merck	1.05554	ניטור של כרומטוגרפיה דק-שכבה
טולואן	Sigma-Aldrich	244511	ממס לשלב הכלורינציה
מים אולטרה-טהורים	Millipore / שקול	N/A	משמש להכנת שלב נייד; בעבר הוזכר כמים Milli-Q בטקסט
ציוד ומכשירים
מסנן מזרק 0.22 µm	Millipore / כל	SLGP033RS	סטריליזציה של תמיסת רזאזורין (2.1.4); סינון תמיסת MTT (3.3); סינון תמיסת Neutral Red (3.4)
מסנן מזרק 0.45 µm	Millipore / כל	SLHA033SS	סינון פתרונות השלב הנייד
צינורית 15 מ"ל (סטרילית)	Falcon / כל	352097 או שקול	איסוף וצנטריפוגה של מתלה תאים לאחר טריפסיניזציה
צלחת 96-בור (תחתית שטוחה, מטופלת בתרבות תאים)	Corning / כל	3596	למבחני ציטוטוקסיות ו-MIC
רדיד אלומיניום	כל	—	הגנה מפני אור של צלחות במהלך דגירה ונענוע של MTT ו-NRU
אוטוקלב	כל	—	סטריליזציה של המדיום (121 °C, 98.07 kPa, 10 דקות)
ארון בטיחות ביולו