אינטגרציה חצי-אוטומטית של ניתוח תוחלת הבריאות המוטורית ותוחלת החיים באמצעות צינור העיבוד FlyTrDT ב-Drosophila melanogaster

Durga Nandan; Nikhil Raj Selvaraj; Bipin G. Nair; Parvathy Venugopal; Rajaguru Aradhya

doi:10.3791/70697

מאמר שיטה

אינטגרציה חצי-אוטומטית של ניתוח תוחלת הבריאות המוטורית ותוחלת החיים באמצעות צינור העיבוד FlyTrDT ב-Drosophila melanogaster

8 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70697

⸱

30 באוקטובר 2026

Durga Nandan^*¹ , Nikhil Raj Selvaraj^*¹ , Bipin G. Nair¹ , Parvathy Venugopal¹ , Rajaguru Aradhya¹

¹Amrita School of Biotechnology, Amrita Vishwa Vidyapeetham, Amrita University campus

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

Drosophila melanogaster משמשת כאורגניזם מודל רב עוצמה למחקר על הזדקנות. פרוטוקול זה מפרט את השלבים הנדרשים ליצירת מדידה הניתנת לשחזור, המבוססת על אוכלוסייה, הן של תוחלת החיים והן של טווח הבריאות התפקודי (functional healthspan).

תקציר

הזדקנות מאופיינת בירידה תפקודית הדרגתית ובקיצור תוחלת החיים; שני פרמטרים אלו מוערכים לעיתים קרובות באופן עצמאי במחקרים ניסיוניים. ב-Drosophila melanogaster, מבחני תוחלת חיים ומדידות לוקומטוריות המבוססות על גאוטקסיס שלילי משמשים נפוצות לחקר הזדקנות וניוון עצבי. עם זאת, קיים חסר במסגרות סטנדרטיות המשלבות באופן כמותי ביצועים מוטוריים מוקדמים עם הישרדות לטווח ארוך. כאן, אנו מתארים תהליך עבודה שחזור וחצי-אוטומטי המשלב ניתוח תוחלת חיים עם כימות אובייקטיבי של בריאות מוטורית (healthspan) בזבובים מזדקנים.

הפרוטוקול משלב תנאי גידל מבוקרים של זבובים, מעקב אחר תמותה ובדיקות גיאוטקסיס שלילי המבוססות על וידאו תוך שימוש בהקלטות MP4 סטנדרטיות (רזולוציה מינימלית של 1280 × 720, 30 פריימים לשנייה). ביצועי התנועה מכומתים באמצעות צינור עיבוד (pipeline) מותאם המבוסס על Python, שיושם ב-Python 3.12.1 עם OpenCV 4.9.0, NumPy 1.26.4, Pandas 2.2.0 ו-Matplotlib 3.5.2. זרימת העבודה מבצעת זיהוי מרכז מסה (centroid) פריימ-ב-פריימ ומחלצת את שיפוע הטיפוס הפעיל (pixels/s) כמדד רציף של תפקוד מוטורי. מסלולי הישרדות מנותחים על ידי חישוב חלק ההישרדות וביצוע אינטגרציה נומרית טרפזית כדי לקבל את שטח השטח תחת העקומה (AUC) של ההישרדות. נרמול של ביצועים מוטוריים מוקדמים מאפשר השוואה ישירה בין הירידה התפקודית לבין אורך החיים הכללי.

תהליך העבודה הוערך על ידי השוואה בין מדידות חצי-אוטומטיות של שיפוע הטיפוס לבין דירוג ידני קונבנציונלי של נקודת סיום בזבובים של קבוצת ביקורת ובזבובים המבטאים amyloid-β, כאשר שתי השיטות זיהו ירידה מוטורית תלוית גיל. מערכי נתונים מייצגים הדגימו מסלולי תוחלת חיים הניתנים לשחזור בביקורות מסוג Canton S ולירידה מוטורית מוקדמת מדידה במודל הנוירודגנרטיבי. שיטה זו מצמצמת הטיות של הצופה, משפרת את השחזור, ונשארת תואמת למערכות רכישת וידאו בעלות נמוכה. ניתן להתאים בקלות את תהליך העבודה למודלים גנטיים, להתערבויות פרמקולוגיות ולפראדיגמות נוירודגנרטיביות, ובכך לספק פלטפורמה ניתנת להרחבה לצופני aging משולבים ב-Drosophila.

מבוא

הזדקנות מאופיינת לא רק בקיצור תוחלת החיים, אלא גם בירידה הדרגתית בתפקוד הפיזיולוגי וההתנהגותי¹. במצבים ניורודגנרטיביים, ליקויים מוקדמים בקו-אורדינציה מוטורית מתרחשים לעיתים קרובות לפני תמותה ניכרת ומשקפים תפקוד עצבי לקוי בבסיסם²^,³. זבוב הפירות Drosophila melanogaster הפך למערכת מודל רבת עוצמה לחקר הזדקנות וניורודגנרציה בשל תוחלת חייו הקצרה, הנגישות הגנטית שלו ובדיקות התנהגותיות מבוססות⁴. ניתוח תוחלת חיים ב-Drosophila מספק מדד חסון להישרדות האורגניזם, בעוד שבדיקות גאוטקסיס שלילי (negative geotaxis) נמצאות בשימוש נרחב להערכת תפקוד לוקומוטורי וירידה מוטורית תלוית גיל⁵^,⁶. עם זאת, שני המדדים הללו מנותחים לעיתים קרובות באופן בלתי תלוי, מה שמגביל את היכולת לקשור כמותית בין ליקוי תפקודי מוקדם לבין מסלולי הישרדות ארוכי טווח. ניתוח משולב של בריאות מוטורית (healthspan) ותוחלת חיים עשוי לספק תובנה מכניסטית לגבי השאלה האם התערבויות משפיעות על קצב ההזדקנות, על התקדמות המחלה או על מערכות פיזיולוגיות ספציפיות. גישה זו מתאימה במיוחד למודלים גנטיים, פרמקולוגיים וניורודגנרטיביים שבהם גירעונות לוקומוטוריים מוקדמים קודמים לתמותה ניכרת, ובכך היא מאפשרת זיהוי רגיש של ירידה תפקודית לפני שמופיעים הבדלי הישרדות ניתנים לצפייה.

בדיקות גיאוטקסיס שלילי מסורתיות מסתמכות על דירוג מבוסס נקודת-סיום, כגון פרופורציית הזבובים המגיעים לגובה מוגדר בתוך פרק זמן קבוע. למרות ששיטה זו היא פשוטה וזולה, דירוג ידני עלול להחדיר הטיות של הצופה ועשוי להחמיץ הבדלים דקים בקינטיקה המוטורית. מדידות נגזרות ממסלול רציף עשויות לשפר את הרגישות לזיהוי ליקויים תנועתיים קלים בהשוואה לגישות דירוג קונבנציונליות המבוססות על נקודת-סיום. באופן דומה, בדיקות אורך חיים דורשות מעקב קפדני אחר תמותה וסטנדרטיזציה סביבתית כדי להבטיח הדירות⁷. נותר צורך בגישות נגישות וניתנות לשחזור, המשלבות מדדי בריאות תפקודית (healthspan) עם נתוני הישרדות בתוך אותה קבוצה.

כאן אנו מתארים תהליך עבודה חצי-אוטומטי המשלב ניתוח סטנדרטי של תוחלת חיים עם כימות מבוסס-וידאו של ביצועים מוטוריים ב-Drosophila מזדקנת. באמצעות כלים חישוביים בקוד פתוח, מבוצע זיהוי מרכז המסה (centroid) פרימה-פרימה כדי להוציא את שיפוע הטיפוס (pixels/s) כמדד רציף של תפקוד מוטורי. נתוני הישרדות מעובדים על ידי חישוב שיעור ההישרדות וביצוע אינטגרציה נומרית טרפזית כדי לקבל את שטח ההישרדות מתחת לעקום (AUC). על ידי נרמול של ביצועים מוטוריים מוקדמים ושילובם עם ה-AUC של ההישרדות, פרוטוקול זה מאפשר השוואה ישירה בין ירידה תפקודית לבין אורך חיים כולל. גישה זו מספקת מסגרת אובייקטיבית וחסכונית לקישור בין בריאות מוטורית (healthspan) לתוצאות תוחלת החיים, ומאפשרת פנוטיפיקה מקיפה של מסלולי הזדקנות ב-Drosophila (איור 1).

פרוטוקול

כל הניסויים בוצעו באמצעות Drosophila melanogaster ונערכו בהתאם להנחיות המעבדה המוסדיות . אישור אתי לא היה נדרש מאחר שהמחקר כלל אורגניזמים חסרי חולבקים. יש לבצע את כל ההליכים בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים למחקר בבעלי חולבקים.

הערה: יש לאחסן את המזונות הניסיוניים בטמפרטורה של 4 °C ולהשתמש בהם תוך שבוע, בתנאי שהם נשארים יבשים. יש לשמור על תנאים סביבתיים סטנדרטיים על ידי דגירה של הזבובים בטמפרטורה של 25 °C במחזור של 12:12 שעות אור-חושך ובלחות יחסית של כ-60%.

1. הכנת מזון סטנדרטי לזבובים

הכנת מזון בסיסי
1. ערבבו 6 g קורנפלור, 5 g שמרים, 4 g D-glucose, 3 g סוכרוז, 1 g תמצית שמרים, 1 g אגר and 0.25 g תמצית מאלט במיכל המכיל 100 mL מים מזוקקים.
2. ערבבו את התוכן היטב באמצעות שפכטל עד להשגת תמיסה אחידה.
3. חממו את התערובת לטמפרטורה של כ-85–100 °C על גבי כיריים אינדוקציה במשך 12–15 דקות כאשר מכינים נפחים של ≥500 mL, או במשך 5–10 דקות כאשר מכינים נפחים שבין 100–400 mL. ערבבו ללא הפסקה במהלך החימום.
4. בצעו אוטוקלאב לתערובת המחוממת בהתאם לנהלי הסטריליזציה הסטנדרטיים במעבדה.
5. הניחו למצע שעבר אוטוקלאב להתקרר. עקבו אחר הטמפרטורה באמצעות מדחום עד שהיא תגיע ל-50–55 °C.
6. הוסיפו 600 µL של חומצה פרופיונית ו-100 mg חומצה בןזואית ב-1 mL של 100% אתנול למצע המקורר וערבבו היטב.
7. אזהרה: יש לטפל בחומצה פרופיונית ובאתנול באזור מאוורר היטב תוך כדי חבישת כפפות והגנה על העיניים, מכיוון ששני החומרים נדיפים ועשויים לגרום לגירוי בשאיפה או במגע עם העור.
8. חלקו 5 mL מזון לכל מבחנה סטרילית באורך 10 cm ובקוטר 20 mm.
9. השאירו את המבחנות ללא כיסוי למשך 5–6 שעות לפחות בטמפרטורת החדר. כסו אותן בנייר סופג כדי למנוע כניסת זבובים תלושים. השתמשו בשלב זה כדי למזער שונות במדידות אורך החיים הנובעת מהבדלים בתנאי הכנת המצע והאחסון.
הכנת מזון עם תרופה
1. הכינו כמות קטנה של מזון למבוגרים כפי שמתואר בשלבים 1.1.1–1.1.5.
2. הניחו למזון להתקרר ל-50–55 °C.
3. הכינו תמיסת מלאי של התרכובת הנבדקת בריכוז הרצוי באמצעות נשאי תרופה מתאים, כגון מים מזוקקים או dimethyl sulfoxide (DMSO). המיסו את התרכובת הנבדקת בנשא שנבחר כדי ליצור תמיסת מלאי רכזית, והוסיפו את המלאי למזון המקורר (50–55 °C) כדי להשיג את הריכוז הסופי הרצוי, תוך שמירה על ריכוזי נשא זהים בין קבוצות הטיפול לקבוצות הביקורת.
4. ערבבו היטב כדי להבטיח פיזור אחיד.
5. חלקו 2 mL של המזון המכיל את התרופה לכל מבחנה ניסויית על ידי מריחתו כשכבה מעל פני מזון בסיס שכבר התגבש.
6. הכינו מבחנות ביקורת על ידי הוספת נפח שווה של הנשא בלבד (למשל, מים מזוקקים או DMSO בריכוז סופי זהה לזה שנעשה בו שימוש בקבוצות הטיפול) למזון שנמרח על מזון הבסיס.
7. הניחו למזון השכבתי להתגבש לחלוטין בטמפרטורת החדר לפני הכנסת הזבובים.
  הערה: טיפול ואחסון מזון: אם המזון הוכן בשעות הערב, השאירו את המבחנות מכוסות בנייר סופג למשך הלילה בטמפרטורת החדר והכניסו פקקי כותנה בבוקר למחרת. תמיד שטפו, חטאו ובצעו אוטוקלאב למבחנות לפני השימוש. בצעו אוטוקלאב לגלילי כותנה בנפרד לפני הפקיקה. הכניסו פקקי כותנה רק לאחר שהמזון התגבש לחלוטין למשך 5–6 שעות לפחות.

2. יצירת D. melanogaster המבטאים amyloid-β

איסוף ואימות של נקבות דרייבר בתולות
1. יש לתחזק את קו זבובים הדרייבר בטמפרטורה של 25 °C תחת מחזור של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך לפני איסוף הבתולות.
2. יש לאסוף נקבות שבקעו זה עתה מקו הדרייבר פעמיים ביום, פעם אחת בבוקר ופעם אחת בשעות אחה"צ המאוחרות, תוך שימוש בהרדמה קצרה של פחמן דו-חמצני.
3. יש להעביר את הנקבות שנאספו למבחנות חדשות עם מין אחד מיד לאחר האיסוף כדי למנוע הזדווגות.
4. יש להדגיר את המבחנות בטמפרטורה של 25 °C למשך 48 שעות נוספות לצורך אימות הבתוליים.
5. יש לבדוק את המבחנות מדי יום לאיתור זחלים.
6. יש לאשר את מצב הבתוליים על ידי אימות היעדרה של ביצים או צאצאים בשלב הזחל.
7. יש להשאיר רק נקבות שאינן מראות עדות לייצור זחלים לצורך שימוש בהכלאות גנטיות.
הקמת הכלאה גנטית
1. יש לאסוף זכרים בוגרים שובקעו זה עתה מסוג UAS-APPE693G באמצעות הרדמה קצרה של פחמן דו-חמצני ביום הקמת ההכלאה.
2. יש להקים את ההכלאות על ידי הנחת 20 נקבות elav-GAL4 בתולות עם 10 זכרים מסוג UAS-APPE693G בתוך מבחנה עם מזון טרי.
3. יש להדגיר את מבחנות ההכלאה בטמפרטורה של 25 °C תחת לחות מבוקרת ומחזור של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך.
4. יש לאפשר לזבובים להזדווג ולהטיל ביצים למשך 48 שעות.
5. יש להעביר את הבוגרים למבחנות טריות במידה ונדרשים צאצאים נוספים.
6. יש להסיר את זבובי ההורים לאחר הטילת הביצים כדי למנוע צפיפות יתר וחפיפה בין דורות.
7. יש לאפשר לצאצאים להתפתח לשלב הבגרות תחת תנאים סטנדרטיים עד הבקיעה.
8. יש להשתמש בזבובים בוגרים מדור F1 המבטאים amyloid-β בנוירונים עבור ניסויי תוחלת חיים ותוחלת בריאות בהמשך.
  הערה: הדרייבר elav-GAL4 מאפשר ביטוי פאן-נוירונלי של חלבון המקדים לאמילואיד האנושי הנושא את מוטציית Arctic E693G. הביטוי מתרחש לאורך כל תקופת הפיתוח והבגרות תחת תנאי גידול סטנדרטיים. עבור ניסויי הזדקנות, יש להשתמש ברקעים גנטיים עקביים ובביקורות מתאימות. יש לשמור על תנאי טמפרטורה עקביים בתוך כל
  ניסוי. ניתן להשתמש בטמפרטורות הדגרה נמוכות יותר, כגון 18 °C, במהלך הפיתוח כדי
  לעכב פתולוגיה הקשורה לטרנסגן לפני שלב הבגרות.

3. איסוף זבובים

איסוף זבובים עבור בדיקת גאוטקסיס שלילי
1. יש לתחזק את כל מאגרי הזבובים על מזון זבובים סטנדרטי בטמפרטורה של 25 °C, לחות יחסית של כ-60%, ומחזור אור-חושך של 12 שעות:12 שעות לפני ההקמה הניסיונית.
2. יש לאסוף זבובים זכרים בוגרים שזה עתה בקעו בתוך חלון זמן של 2–3 ימים, תוך שימוש בהרדמה קצרה בבלרי פחמן דו-חמצני.
3. יש להעביר את הזבובים הזכרים למבחנות מזון המכילות תרופה או למבחנות מזון ביקורת, בהתאם לתנאי הניסוי.
4. יש להחליף את המזון בכל 3 ימים, או מוקדם יותר אם איכות המזון יורדת.
5. יש לתחזק את הזבובים תחת תנאים אלה עד לגילים שנקבעו להערכת הגאוטקסיס השלילי.
  הערה: רק זבובים זכרים משמשים לבדיקת הגאוטקסיס השלילי כדי למנוע שונות הנובעת מהבדלים מגדריים בביצועי תנועה ובהזדקנות.
איסוף זבובים עבור בדיקת תוחלת חיים
1. יש להרדימ קבוצות קטנות של זבובים לזמן קצר על פד הרדמה.
2. יש לזהות את הזבובים הזכרים באמצעות מברשת צבע רכה.
3. יש למזער את החשיפה לפחמן דו-חמצני במהלך המיון כדי למנוע השפעות פיזיולוגיות ארוכות טווח שעלולות להטעות את מדידות תוחלת החיים.
4. יש להניח 10 זבובים זכרים ו-10 זבובים נקבות, ביחס מגדרי של 1:1, לתוך כל מבחנת מזון רעננה, בהתאם לתכנון הניסויי.
5. יש להשלים את המיון והחלוקה למנות בתוך 3–4 דקות לכל סבב.
6. יש לוודא שסך זמן החשיפה להרדמה לא יעלה על 9–10 דקות.
7. זהירות: יש להשתמש בהרדמת פחמן דו-חמצני באמצעות ווסתים מתאימים ואוורור מעבדה הולם כדי למזער את חשיפת המפעיל ולמנוע עקה פיזיולוגית ממושכת הנגרמת מהרדמה בזבובים.
8. יש לחזור על שלבים 3.2.1–3.2.6 עד להקמת 4–6 מבחנות שחזור לכל תנאי ניסיוני.

4. ניסוי אריכות ימים

העברה ותחזוקה של זבובים
1. יש לתחזק את הזבובים בתנאים סטנדרטיים.
2. יש להעביר את הזבובים לבקבוקוני מזון טריים במרווחי זמן קבועים כדי למנוע צפיפות יתר, זיהום על ידי זחלים והתדרדרות של המזון.
3. יש להעביר את הזבובים למזון טרי מדי 3 ימים.
4. יש להשתמש בתדירות העברה זו כדי למזער הפרעות לתנאי ההזנה על ידי מניעת גדילת זחלים בבקבוקון.
5. יש לבצע את כל ההעברות ללא הרדמה.
  הערה: יש להימנע מהרדמה במהלך ניסויי אורך חיים כיוון שהיא עלולה לגרום לתמותה חריפה, במיוחד בזבובים מזדקנים.
הערכת תמותה במהלך ההעברות
1. יש לתעד את גיל הקוהורטה בימים בכל העברה.
2. יש לבחון בקפידה את הבקבוקון הישן.
3. יש לספור ולתעד את מספר הזבובים המתים שנותרו בבקבוקון הישן.
4. יש לספור ולתעד את מספר הזבובים המתים שהועברו לבקבוקון החדש.
5. יש לתעד ערכים אלו בנפרד כדי למנוע ספירה כפולה.
6. יש לחשב את מספר התמותות הכולל עבור כל העברה באמצעות המשוואה הבאה:
  סך התמותות = זבובים מתים בבקבוקון הישן + זבובים מתים שהועברו לבקבוקון החדש.
7. יש לקבוע את מספר התמותות החדשות מאז ההעברה הקודמת על ידי חיסור מספר הזבובים שתועדו כ"מועברים" בהעברה הקודמת מסך התמותות בהעברה הנוכחית.
8. יש להשתמש בחישוב זה כדי להבטיח שזבובים שהועברו בין בקבוקונים לא ייספרו מספר פעמים.
זיהוי זבובים חיים אך לא פעילים
1. יש להקיש בעדינות על דופן הבקבוקון לפני הגדרת זבוב כמת, כאשר זבובים מזדקנים נראים ללא תנועה או שוכבים על גבם.
2. יש לבחון אם מתרחשת תנועה כלשהי.
3. יש להגדיר זבובים המראים תנועה בעקבות גירוי כחיים.
4. אין לתעד זבובים המראים תנועה בעקבות גירוי כמתים.
5. יש להקיש בעדינות על הבקבוקון כדי לשחרר זבובים חיים שנדבקו לפני השטח של המזון בבקבוקון הישן.
6. יש להעביר זבובים חיים ששוחררו לבקבוקון החדש.
7. אין להגדיר זבובים חיים ששוחררו כמתים.
  הערה: הבחנה מדויקת בין זבובים מתים ללא פעילים היא קריטית בשלבי חיים מאוחרים. יש להשתמש תמיד בגירוי מכני עדין לפני קביעת סטטוס מוות.
קריטריונים לצנזור (Censoring)
1. יש להגדיר זבוב כצנזור ימני אם הוא יוצא מהניסוי לפני מוות טבעי בשל בריחה מהבקבוקון, פציעה מקרית או בעיות בטיפול.
2. יש לתעד זבובים מצונזרים בעמודה נפרדת ביום שבו הזבוב יוצא מהניסוי.
3. אין לתעד זבובים מצונזרים כמתים.
4. יש להוציא זבובים מצונזרים מספירות התמותה בניתוח הישרדות.
5. יש להשתמש בצנזור במידה שמרנית כיוון שצנזור מרובה עלול להוביל להטיה ניסויית.
  הערה: הפרדה בין זבובים "מתים" ל"מועברים" במהלך הזנת הנתונים מונעת ניפוח של ספירות התמותה ומבטיחה שחזור נכון של עקומת ההישרדות.
המשך הבדיקה
1. יש לחזור על שלבים 4.1–4.4 לאורך כל הניסוי.
2. יש להמשיך בבדיקה עד למות הזבוב האחרון ששרד.

5. ניסוי גיאוטקסיס שלילי

הכנת הזבובים
1. אסוף זבובים מבקבוקי המזון הניסויים ללא הרדמה ב-CO₂.
2. העבר את הזבובים בעדינות לתוך צינור טיפוס נקי, או צינור גאוטקסיס שלילי, באמצעות משפך קטן למניעת בריחה.
3. אפשר לזבובים להסתגל בתא הבדיקה למשך 5 min לפני תחילת המבחן.
4. בצע את כל מבחני הטיפוס באותה שעה ביום, למשל בשעות אחר הצהריים, כדי למזער שונות צירקדית.
  הערה: הימנע מאור שמש ישיר במהלך הבדיקה, שכן עוצמת האור עלולה לשנות את התנהגות התנועה.
הגדרת צינור הטיפוס
1. השתמש בצינור טיפוס גלילי שקוף בגובה 12 cm ובקוטר 2 cm.
2. סמן קו אופקי במרחק 10 cm מבסיס הצינור.
3. מקם את הצינור בצורה אנכית על רקע לבן אחיד כדי להקל על מעקב וידאו.
4. התקן סמארטפון או מצלמה דיגיטלית על מעמד יציב.
5. ודא שכל הצינור נמצא בתוך הפריים.
פרוטוקול המבחן
1. הקש בחוזקה שלוש פעמים על הצינור על גבי פד ספוג או פד לעכבר המונחים על משטח יציב, כך שכל הזבובים יפלו לתחתית בו-זמנית.
2. התחל מיד בהקלטת וידאו למשך 10–12 s בקצב של כ-30 frames/s.
3. אפשר לזבובים לטפס בחופשיות במשך 10 s.
4. בצע לפחות שלושה ניסיונות עצמאיים לכל בקבוק.
5. השאר מרווח מנוחה של 10 min בין הניסיונות.
6. בצע את המבחן עבור כל תנאי ניסוי, כגון קבוצת ביקורת, קבוצה שטופלה בתרופה וקבוצת ביקורת לממס.
7. ספור את מספר הזבובים שהגיעו או חצו את סימן ה-10 cm בתוך 10 s.
8. רשום את E כמספר הזבובים שהגיעו ל-10 cm.
9. רשום את T כמספר הכולל של הזבובים החיים שנבדקו.
10. חשב את אחוז פעילות הטיפוס כ-(E/T) × 100.
11. חשב ממוצע של הערכים לאורך שלושה ניסיונות.
12. דווח על הערכים כ-mean ± SD.
ניתוח טיפוס חצי-אוטומטי באמצעות סקריפט Python
1. רכישת וידאו
  1. הקלט מבחני גאוטקסיס שלילי באמצעות מצלמת סמארטפון הממוקמת בניצב לצינור טיפוס שקוף בגובה 12 cm ובקוטר 2 cm. הקלט סרטונים באמצעות סמארטפון או מצלמה דיגיטלית בקצב של כ-30 frames/s וברזולוציה מינימלית של 1280 × 720 pixels. מקם את המצלמה במרחק קבוע של כ-15–20 cm מצינור הטיפוס ושמור על אותה גיאומטריית רכישה בכל ההקלטות. השתמש בגובה הצינור הידוע (12 cm) כסימוכין כיול מרחבי פנימי למדידות מבוססות פיקסלים.
  2. מקם את הצינור על רקע לבן אחיד.
  3. הקלט סרטונים למשך 10–12 s.
  4. שמור על תנאי תאורה קבועים בכל ההקלטות.
  5. שמור על מרחק מצלמה קבוע בכל ההקלטות.
  6. שמור על מיקום צינור קבוע בכל ההקלטות.
  7. מזער שונות בזיהוי המרכז (centroid).
  8. שמור את הסרטונים המוקלטים בפורמט .mp4.
  9. העבר את הסרטונים המוקלטים למחשב שולחני לצורך ניתוח.
2. עיבוד וידאו מבוסס Python
  1. נתח את הסרטונים באמצעות סקריפט Python פנימי מותאם שסופק כ-Supplementary File 1. בצע את כל הניתוחים באמצעות Python 3.12.1 עם OpenCV (cv2) גרסה 4.9.0, NumPy גרסה 1.26.4, Pandas גרסה 2.2.0, Matplotlib גרסה 3.5.2, ו-Scikit-learn גרסה 1.4.2.
    1. ציין את נתיב וידאו הקלט ואת ספריית הפלט בתוך Supplementary File 1 לפני הרצת הסקריפט מסביבת Python או מממשק שורת הפקודה.
    2. הרץ את הסקריפט באמצעות python climbing_analysis.py לאחר עריכת המשתנים VIDEO_PATH ו-OUTPUT_CSV.
  2. השתמש ב-OpenCV, או cv2, לעיבוד פריימים וזיהוי אובייקטים.
  3. השתמש ב-NumPy לחישובים נומריים.
  4. השתמש ב-Pandas לייצוא נתונים.
  5. השתמש ב-Matplotlib לוויזואליזציה.
  6. עבד כל סרטון פריים אחר פריים.
  7. קרא את הווידאו באמצעות פונקציית VideoCapture של OpenCV.
  8. עבד פריימים בודדים באופן רצף.
  9. המר פריימים לגווני אפור (grayscale).
  10. החל טשטוש גאוסיאני להפחתת רעשי רקע.
  11. החל סף של Otsu במצב binary inverse כדי לבודד את הזבובים מהרקע.
  12. בצע פעולות מורפולוגיות של פתיחה וסגירה להסרת ארטיפקטים קטנים ומילוי פערים בקווי המתאר.
  13. זהה קווי מתאר העולים על סף שטח מינימלי של 60 pixels² כדי להוציא ארטיפקטים של רקע וחלקיקי רעש קטנים.
  14. חשב מומנטים מרחביים עבור כל קו מתאר תקין.
  15. קבע קואורדינטות מרכז, x ו-y, עבור כל קו מתאר תקין.
  16. חשב ממוצע של קואורדינטות המרכז כאשר מזוהים מספר זבובים בפריים.
  17. השג מיקום קוהורט ממוצע יחיד לכל פריים.
3. הערכת בקרת איכות
  1. אמת בידוד מוצלח של הזבובים על ידי אישור שקווי המתאר המזוהים תואמים לזבובים הנראים לאורך כל ההקלטה.
  2. הבטח ניגודיות מספקת בין הזבובים לרקע על ידי שימוש ברקע לבן אחיד ותנאי תאורה יציבים.
  3. הסר סרטונים המכילים סנוורים מוגברים, צללים, תזוזת צינור, חפיפה חמורה של זבובים או נראות חלקית של הצינור.
  4. הגדר סרטונים כבלתי מתאימים לניתוח כאשר מעקב המרכז נכשל בחלקים נרחבים של ההקלטה או כאשר סף הבידוד מייצר ארטיפקטים קבועים ברקע.
4. הפקת מדדי טיפוס
  1. חשב את ציון הטיפוס באופן ידני כפי שמתואר בשלב 5.3.7.
  2. חשב גובה טיפוס בפיקסלים כהפרש בין מיקומי המרכז האנכיים ההתחלתיים והסופיים.
  3. חשב מהירות ממוצעת ב-pixels/s כאורך המסלול הכולל חלקי משך ההקלטה.
  4. חשב מהירות שיא ב-pixels/s כהעתקה הרגעית המקסימלית בין פריימים עוקבים.
  5. חשב אורך מסלול בפיקסלים כמרחק המצטבר שעבר לאורך הפריימים.
  6. חשב שטח מסלול ב-pixels² כשטח המעטפת הקמורה (convex hull) הסוגרת את כל מיקומי המרכז.
  7. חשב מספר פניות כמספר שינויי הכיוון האופקיים.
  8. חשב מספר עצירות כמספר הפריימים שבהם תזוזת המרכז נותרת מתחת לסף מרחק עצירה של 3 pixels בין פריימים עוקבים.
  9. שרטט את המיקום האנכי כפונקציה של הזמן כדי לקבל מדד אובייקטיבי של ביצועי טיפוס פעילים.
  10. חשב את שיפוע הטיפוס בפיקסלים לשנייה באמצעות חלון רגרסיה לינארית נגלגלת של 1-second במהלך שלב הטיפוס הפעיל של ההקלטה.
  11. השתמש בערך השיפוע כמדד ביצועים מוטורי עיקרי לשילוב עם ניתוח הישרדות.
  12. ייצא מדדי תנועה מכומתים, כולל גובה טיפוס, מהירות ממוצעת, מהירות שיא, אורך מסלול, שטח מסלול, מספר פניות, מספר עצירות ושיפוע טיפוס, כקבצי .csv. שמור תרשימי ויזואליזציה של השיפוע כקבצי תמונה בפורמט .png לצורך אימות איכות וניתוח המשכי.

6. שילוב ניתוח הישרדות ובריאות מוטורית מוקדמת

ייצא את נתוני ההישרדות כקובץ .csv המכיל עמודות עבור קבוצה, יום ומספר הזבובים החיים.
חשבו את שיעור ההישרדות עבור כל קבוצה בכל נקודת זמן, על ידי חילוק מספר הזבובים החיים בגודל העשרה הראשוני.
חשב את השטח תחת העקומה של ההישרדות, או AUC, באמצעות אינטגרציה נומרית בשיטת הטרפז של שבר ההישרדות לעומת הזמן.
ייצא את נתוני ביצועי המוטוריקה כקובץ .csv המכיל את שיפוע הטיפוס של יום 7 עבור כל קבוצה.
נרמלו את ביצועי המוטוריקה ביום 7 ביחס לקבוצת הביקורת, Canton S, על ידי חלוקת ערך השיפוע של כל קבוצה ביום 7 בערך השיפוע המתאים של קבוצת הביקורת.
מזג את ערכי התפקוד המוטורי הנורמליים מהיום ה-7 עם ערכי ה-AUC התואמים של ההישרדות עבור כל גנוטיפ.
בצע השוואה תיאורית בין ביצועי מוטוריקה מנורמלים ביום 7 לבין שטח הפס (AUC) של השרידות, כדי להעריך את הקשר בין ירידה מוטורית מוקדמת לתוצאות השרידות.
צור ויזואליזציה גרפית של ביצועי מוטוריקה מנורמלים ביום 7 וערכי AUC של הישרדות (קובץ משלים 2).
הערה: בצע את כל ניתוחי האינטגרציה של הישרדות-מוטוריקה באמצעות סקריפט ה-Python המותאם אישית שסופק כ- קובץ משלים 2. השתמש ב-Pandas לניהול נתונים ומיזוג סטים של נתונים, ב-NumPy לאינטגרציה נומרית בשיטת הטרפז, וב-Matplotlib לוויזואליזציה גרפית.

7. ניתוח סטטיסטי

הציגו מדידות של תנועתיות והישרדות כסטים מייצגים של נתונים שהתקבלו מבקבוקוני שיכפולים ביולוגיים.
דווחו על מדידות תנועתיות כערכי ממוצע שחושבו על פני ניסיונות טיפוס עצמאיים.
השתמשו בויזואליזציה גרפית של שיפוע הטיפוס (pixels/s) וערכי AUC של הישרדות כדי להדגים קשרים מייצגים בין ביצועים מוטוריים לתוצאות הישרדות.

תוצאות

פרופילי תוחלת חיים ניתנים לשחזור תחת תנאי גידול סטנדרטיים
כאשר הזבובים הוחזקו תחת תנאים סביבתיים מבוקרים (25 °C, 60% לחות, מחזור אור-חושך של 12 h:12 h) תוך שימוש במזון סטנדרטי שהוכן טרי, קבוצות הביקורת הראו מסלולי הישרדות עקביים בניסויים בלתי תלויים. זבובים מקבוצת הביקורת Canton S הראו תוחלת חיים חציונית של כ-65–72 ימים, כאשר ההישרדות המקסימלית הגיעה ל-75 ימים (איור 2). ניסויי תוחלת החיים בוצעו עם 2 חזרות ביולוגיות לכל תנאי, כאשר כל אחת הכילה 20 זבובים. מסלולי הישרדות מייצגים שהתקבלו תחת תנאי סביבה ומזון סטנדרטיים הדגימו פרופילי תוחלת חיים ניתנים לשחזור בקבוצות הביקורת.

בניגוד לכך, זבובים המבטאים amyloid-β בכל הנוירונים הראו הישרדות מופחתת ביחס לבקרי Canton S, ממצא העולה בקנה אחד עם פנוטיפים ניורודגנרטיביים שדווחו בעבר במודלים של מחלת אלצהיימר ב-Drosophila⁴^,⁵^,⁶.

תוצאות תוחלת חיים תת-אופטימליות עלולות להתרחש כאשר איכות המזון יורדת או כאשר תנאי הטיפול אינם עקביים. בתנאים אלו, זוהו שיאים של תמותה מוקדמת במהלך 7–10 הימים הראשונים ושונות מוגברת בין מבחנות (>25%), דבר המעיד על פגיעה בשחזור הניסיוני ועל עקביות מופחתת בין חזרות ביולוגיות.

ירידה מוטורית תלוית-גיל שזוהתה באמצעות ניתוח טיפוס חצי-אוטומטי
דירוג ידני קונבנציונלי של גאוטקסיס שלילי (negative geotaxis) זיהה ירידה לוקומטורית תלוית-גיל בזבובים המבטאים amyloid-β בהשוואה לקבוצות ביקורת של Canton S (איור 3). ביום 7, ביצועי הטיפוס נותרו דומים באופן כללי בין הקבוצות, בעוד שביום 28, זבובים המבטאים amyloid-β הראו ירידה בפעילות הטיפוס ביחס לזבובים בביקורת. קבוצות הביקורת שמרו על ביצועי טיפוס יציבים יחסית לאורך נקודות הזמן של ההזדקנות. מגמות התנהגותיות אלו, שדורגו ידנית, תאמו ירידות בערכי שיפוע הטיפוס מתוך צינור העיבוד החצי-אוטומטי FlyTrDT, והראו מגמות תלויות-גיל דומות לאלו של דירוג נקודת-סוף קונבנציונלי ושל זרימת העבודה של המעקב המחשוב (איור 4). הירידה הלוקומטורית שנצפתה בזבובים המבטאים amyloid-β עקבית עם ליקוי התנהגותי תלוי-גיל ידוע שדווח במודלים של ניוון עצבי ב-Drosophila באמצעות בדיקות גאוטקסיס שלילי קונבנציונליות⁶^,⁷.

ניתוח טיפוס חלקי-אוטומטי באמצעות FlyTrDT חשף תפקוד מוטורי מוקדם שנשמר בזבובים של קבוצת הביקורת. ביום 7, זבובי הביקורת הראו שיפוע טיפוס ממוצע של 86.64 pixels/s, המשקף התפתחות כלפי מעלה מתמשכת במהלך שלב הטיפוס הפעיל (איור 4). ביום 28, השיפוע התקרב לאפס (−1.50 pixels/s), ממצא העולה בקנה אחד עם האטה הקשורה לגיל.

בניגוד לכך, זבובים המבטאים amyloid-β הראו ליקוי מוטורי מוקדם. ביום 7, שיפוע הטיפוס פחת ל-34.25 pixels/s, נתון המייצג כ-39% מביצועי הביקורת לאחר נורמליזציה. עד יום 28, שיפוע הטיפוס ירד משמעותית ל-−72.25 pixels/s, דבר המעיד על פגיעה בביצועי התנועה כלפי מעלה.

המדד המבוסס על שיפוע לוכד את מקטע הטיפוס הפעיל ומפחית תרומות הנובעות מזמן השהייה ראשוני של בהלה, שלבי פלטוא וארטיפקטים של תנועה סטוכסטית. שיפועים חיוביים מעידים על התקדמות נטו כלפי מעלה, שיפועים קרובים לאפס מעידים על תזוזה אנכית מוגבלת, ושיפועים שליליים מעידים על תזוזה נטו כלפי מטה. מסלולים מייצגים אלה ממחישים ירידה מוטורית הדרגתית בזבובים המבטאים amyloid-β בהשוואה לקבוצות ביקורת תואמות בגילן.

תחת תנאי הקלטה אופטימליים, צינור העיבוד (pipeline) של FlyTrDT ייצר מסלולי מרכז מסה (centroid trajectories) רציפים עם סגמנטציית קו מתאר יציבה ופרופילי תזוזה אנכיים עקביים (איור 4A). ירידה בביצועי הלוקומוטוריקה בזבובים המבטאים amyloid-β באה לידי ביטוי במסלולי עלייה פחות ממושכים ובערכי שיפוע נמוכים יותר (איור 4B–D). סרטונים שהוקלטו עם סנוור מוגבר, מיקום לא יציב של הצינור, תאורה לא עקבית או ניגודיות רקע לא מספקת, ייצרו מסלולי מרכז מסה לא רציפים וארטיפקטי מעקב לסירוגין, והוצאו מהניתוח במהלך הערכת בקרת האיכות.

הקשר בין ביצועים מוטוריים מוקדמים לתוצאות הישרדות
כדי לבחון את הקשרים בין ביצועים מוטוריים מוקדמים לתוצאות הישרדות, ערכי שיפוע הטיפוס המנורמלים ביום 7 הושוו ל-AUC (שטח תחת העקומה) של ההישרדות בין הגנוטיפים השונים (איור 5). זבובים של קבוצת הביקורת עם ביצועים מוטוריים מוקדמים שנשמרו (מדד מוטורי מנורמל = 1.0) הראו ערכי AUC של הישרדות גבוהים יותר (48.2), בעוד שזבובים המבטאים amyloid-β עם ביצועים מוטוריים מוקדמים מופחתים (מדד מוטורי מנורמל = 0.395) הראו ערכי AUC של הישרדות נמוכים יותר (24.65). מערכי נתונים ייצוגיים של תנועתיות הופקו משני מבחנות של חזרות ביולוגיות לכל תנאי. מערכי נתונים ייצוגיים אלה מצביעים על קשר בין ירידה בביצועים המוטוריים המוקדמים לבין קיצור משך ההישרדות במודל המחלה של amyloid-β. מכיוון שנותחו שני גנוטיפים ייצוגיים בלבד, ממצאים אלה מוצגים באופן תיאורי ולא כמתאם חיזוי בעל עוצמה סטטיסטית.

בדיקת טיפוס של Drosophila טרנסגנית; תרשים קופסה ועקום קפלמייר-מייר עבור מחקר על מחלת אלצהיימר.
איור 1: סקירת זרימת העבודה של צינור העיבוד FlyTrDT החצי-אוטומטי, המשלב מדדי בריאות תנועתית עם ניתוח הישרדות. זרימת העבודה כוללת גידול סטנדרטי של זבובים וניתוח משך חיים, הערכת גאוטקסיס שלילית ידנית וחצי-אוטומטית, חילוץ מרכזים (centroids) בכל פריים מסרטוני טיפוס, חישוב שיפוע הטיפוס (pixels/s), ניתוח שטח תחת העקום (AUC) של ההישרדות, ושילוב של ביצועים מוטוריים עם תוצאות הישרדות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

גרף ניתוח הישרדות המשווה בין קבוצת ביקורת CS לקבוצות Aβ; הסתברות לאורך ימים.
איור 2: ניתוח הישרדות Kaplan–Meier של זבובים מקבוצת ביקורת Canton S וזבובים המבטאים amyloid-β. עקומות הישרדות הממחישות את מסלולי תוחלת החיים תחת תנאים סביבתיים ותזונתיים סטנדרטיים. זבובים מקבוצת ביקורת Canton S הפגינו הישרדות ממושכת יותר ביחס לזבובים המבטאים amyloid-β באופן פאן-נוירונלי, אשר הראו תוחלת חיים מופחתת לאורך נקודות זמן של הזדקנות. הנתונים מייצגים מסלולי הישרדות מייצגים שהתקבלו משני מבחנות חזרה ביולוגיות לכל תנאי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות מבחן טיפוס של Drosophila; תרשימי קופסה משווים בין CS לבין elav-Gal4/UAS-Aβ42 בימים 7 ו-28.
איור 3: ביצועי גיאוטקסיס שלילי ידני בזבובים של קבוצת הביקורת ובזבובים המבטאים amyloid-β ביום 7 וביום 28. תרשימי קופסה (Box plots) מציגים מדידות מייצגות של פעילות טיפוס, המבוטאות כאחוז הזבובים שחצו את סף ה-10 ס"מ בתוך 10 שניות. זבובי ביקורת מסוג Canton S (CS) שמרו על פעילות טיפוס יציבה יחסית לאורך נקודות הזמן של ההזדקנות, בעוד שזבובים המבטאים amyloid-β הראו ביצועי טיפוס מופחתים עד ליום ה-28. כל נקודה מייצגת מדידה של מבחנה בודדת. מערכי נתונים מייצגים הופקו משני מבחנות חזרות ביולוגיות לכל תנאי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח גובה טיפוס; גרפים A-D מראים שיפועים של פיקסלים/שנייה; תרשימי זמן מול גובה; מגמות נתונים.
איור 4: חילוץ חצי-אוטומטי של מסלולי טיפוס ושיפוע טיפוס פעיל בזבובים של קבוצת הביקורת ובזבובים המבטאים amyloid-β. מסלולי מיקום אנכיים ממוצעים מייצגים חולצו מסרטוני גאוטקסיס שלילי באמצעות צינור המעקב FlyTrDT. קווים כחולים מייצגים את מיקום המרכז האנכי הממוצע של הזבובים שזוהו בכל פריים לאורך זמן, וקטעים אדומים מציינים קטע טיפוס פעיל מייצג שזוהה באמצעות חלון רגרסיה ליניארית נגלגלת. ערכי השיפוע מבוטאים ב-pixels/s. (A) זבובי ביקורת Canton S ביום 7. (B) זבובים המבטאים amyloid-β ביום 7. (C) זבובי ביקורת Canton S ביום 28. (D) זבובים המבטאים amyloid-β ביום 28. מסלולים מייצגים הופקו מ-2 מבחנות של חזרות ביולוגיות לכל תנאי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

גרף של בריאות מוטורית מוקדמת לעומת הישרדות; הצירים מציגים בריאות מוטורית מנורמלת ביום 7 ו-AUC של הישרדות.
איור 5הקשר בין ביצועים מוטוריים מוקדמים לבין תוצאות הישרדות במודל Drosophila לרעילות של עמילואיד-בטא (amyloid-β). ערכי שיפוע הטיפוס מנורמלים ליום 7 שורטטו אל מול שטח תחת העקום (AUC) של הישרדות עבור זבובים ביקורת מסוג Canton S (CS) וזבובים המבטאים amyloid-β (AD) (n = 2). זבובים ביקורת הראו ביצועים מוטוריים מוקדמים גבוהים יותר וערכי AUC של הישרדות מוגברים ביחס לזבובים המבטאים amyloid-β. מערכי נתונים מייצגים אלו ממחישים קשר בין ביצועי תנועה מוקדמים לבין תוצאות הישרדות. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

קובץ משלים 1: סקריפט FlyTrDT מבוסס Python לניתוח טיפוס, המשמש לכימות חצי-אוטומטי של תנועה (locomotor) מסרטוני גאוטקסיס שלילי (negative geotaxis). הסקריפט מבצע עיבוד תמונה פרימיימית, זיהוי מרכז מסה (centroid), חילוץ מסלול וחישוב מדדי טיפוס, כולל שיפוע טיפוס, מהירות, אורך מסלול, שטח מסלול, מספר עצירות ומספר פניות.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 2: סקריפט Python לאינטגרציה של נתוני תוחלת חיים ותוחלת בריאות מוטורית. הסקריפט מבצע חישוב של שיעור השרידות, ניתוח שטח תחת העקומה (AUC) בשיטת הטרפז, נורמליזציה של ערכי שיפוע הטיפוס ביום 7, מיזוג מערכי נתונים והדמיה גרפית של תוצאות ביצועים מוטוריים ושרידות.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

דיון

כאן אנו מציגים פרוטוקול המשלב ניתוח של תוחלת חיים עם כימות חצי-אוטומטי של בריאות מוטורית (healthspan) ב-Drosophila melanogaster. שילוב מהימן של מדידות תוחלת חיים ותנועתיות תלוי במידה רבה בעקביות סביבתית, באיכות המזון ובנהלי טיפול סטנדרטיים לאורך חזרות ביולוגיות⁷. שונות ביובש המזון, העברות מאוחרות או רישום לא עקבי של תמותה עלולים להוביל לעליות חדות בתמותה מוקדמת ולהגביר את השונות בין המבחנות, ובכך להשפיע על שחזור עקומות השרידות ועל הפרשנות של פנוטיפים של הזדקנות.

במהלך בדיקת הגאוטקסיס השלילי, נדרשים תנאי תאורה עקביים, מיקום מצלמה קבוע ויישור של הפחית כדי להבטיח זיהוי אמין של המרכז (centroid) במהלך עיבוד הווידאו. יש למזער חשיפה מרובה ל-CO₂ במהלך המיון, שכן הרדמה עלולה להשפיע הן על תוחלת החיים והן על ביצועי התנועה. בעת ביצוע מדידות התנהגותיות חוזרות מאותה קבוצה, יש לערוך את הבדיקות באותה שעה ביום כדי להפחית שונות צירקדית. ניגודיות רקע לא מספקת או תאורה לא עקבית עלולות לפגוע בסף הזיהוי (thresholding) ובזיהוי קווי המתאר במהלך ניתוח אוטומטי. אם נצפו פירור של קווי מתאר או מסלולי מרכז לא יציבים במהלך עיבוד הווידאו, יש לשפר את ניגודיות הרקע, להפחית סנוור, לייצב את מיקום המצלמה ולשמור על תאורה אחידה לאורך ההקלטות. ניתן למזער ארטיפקטים מתמשכים של סף זיהוי על ידי התאמת זווית ההקלטה, הפחתת צללים, או הבטחה כי כל פחית הטיפוס נשארת גלויה ללא הפסקה בתוך הפריים. התקבצות מרובה של זבובים בתוך הפחית עלולה לפגוע בהערכה מדויקת של המרכז ויש למזערה על ידי שמירה על גודלי קבוצות עקביים בין הניסויים.

בדיקות גאוטקסיס שלילית מסורתיות מכמתות בדרך כלל את פרופורציית הזבובים המגיעים לגובה מוגדר מראש בתוך פרק זמן קבוע, ונשגגות באופן נרחב להערכת ירידה בתפקוד המוטורי במהלך הזדקנות וניוון עצבי⁵^,⁶. לעומת זאת, תהליך העבודה החצי-אוטומטי הנוכחי מחלץ שלב טיפוס פעיל של תנועה כלפי מעלה ומחשב את שיפוע הטיפוס הפעיל (pixels/s) מתוך מסלולי צנטרואיד עבור כל פריים. מכיוון שמיקומי הצנטרואידים מחושבים כממוצע עבור כל הזבובים שזוהו בכל פריים, מסלולי תנועה אינדיבידואליים והטרוגניות התנהגותית בין זבוב לזבוב אינן מבודלות. גישה זו מפחיתה השפעות של השהיית בהלה, הפסקות זמניות והתנהגות של התקבצות המשפיעות על דירוג ידני מבוסס נקודת סיום. בניגוד לדירוג קונבנציונלי המבוסס על נקודת סיום, תהליך העבודה הנוכחי מספק גם מדידות רציפות של שיפוע עולה (pixels/s), המאפשרות השוואה כמותית של הירידה המוטורית לאורך הגיל והגנוטיפ. גישות מעקב חישוביות דומות יושמו יותר ויותר כדי לשפר את האובייקטיביות והעקביות בניתוח התנהגותי של Drosophila באמצעות פלטפורמות אוטומטיות לכימות תנועה⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹².

יש לשקול מספר מגבלות נוספות. מדידות של שיפוע הטיפוס המבוססות על פיקסלים (pixels/s) תלויות בכיול עקבי של המצלמה ובגאומטריית ההקלטה לאורך הניסויים. הבדלים במרחק המצלמה או ברזולוציה עשויים להשפיע על ערכי השיפוע המוחלטים, דבר המחייב נורמליזציה לבקרות פנימיות. יתרה מכך, בעוד שדעיכה מוטורית מוקדמת נקשרה באופן איכותי להישרדות מופחתת במודל ה-amyloid-β המוצג כאן, תיקוף רחב יותר על גבי גנוטיפים, התערבויות או טיפולים פרמקולוגיים נוספים יחזק את פרשנות הקשר בין הביצועים המוטוריים לתוצאות ההישרדות. מערכי הנתונים המייצגים המוצגים כאן נועדו להדגים את יישום זרימת העבודה והפרשנות שלה, ולא כדי לבסס מודל חיזוי כללי על פני הקשרי מחלה שונים.

למרות מגבלות אלו, פרוטוקול זה מספק מסגרת הניתנת לשחזור וחסכונית לקישור בין מדדי בריאות (healthspan) תפקודיים לבין תוצאות הישרדות במחקרי הזדקנות. השיטה ניתנת להתאמה בקלות למניפולציות גנטיות, פרדיגמות של סריקת תרופות ומודלים של ניוון עצבי שבהם הירידה התפקודית קודמת לתמותה. באמצעות שילוב של כימות אובייקטיבי של שיפוע הטיפוס (pixels/s) עם ניתוח הישרדות סטנדרטי, גישה זו מאפשרת פנוטיפוּג מקיף של מסלולי הזדקנות ב-Drosophila. מחקרים עתידיים שישלבו גנוטיפים ניווניים נוספים, התערבויות פרמקולוגיות ומאגרי נתונים התנהגותיים ארוכי טווח עשויים לחזק עוד יותר את התועלת של זרימת העבודה לניתוח משולב של בריאות (healthspan)¹³^,¹⁴.

גילויים

למחברים אין הצהרות לגבי ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה בכספים מבית הספר לביוטכנולוגיה של Amrita, Amrita Vishwa Vidyapeetham, Amritapuri.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגר	Himedia	GRM666	חומר מוצק (Solidifying agent)
חומצה בנזואית	Himedia	GRM488	חומר משמר אנטימיקרוביאלי
Canton-S	מרכז מאגרי הדרוזופילה של בלומינגטון (Bloomington Drosophila Stock Center)	BDSC #1	זן ייחוס מסוג פרא (Wild-type)
צינור טיפוס	בנייה מותאמת אישית	לא רלוונטי	שפופרת גלילית שקופה, גובה 12 ס"מ × בקוטר 2 ס"מ, פלסטיק שקוף או זכוכית
קמח תירס	ספק מקומי	לא רלוונטי	הכנת מזון לזבובים
מחשב שולחני/נייד	כל יצרן	מוגדר על ידי המשתמש	מעבד בעל שני ליבות לפחות, ≥זיכרון RAM בנפח 8 GB, מערכת הפעלה תואמת Python 3.x
D-גלוקוז	Himedia	MB037	רכיב מזון לזבובים
elav-GAL4	מרכז מאגרי הדרוזופילה של בלומינגטון	BDSC #458	דרייבר GAL4 פאן-נוירונלי
Matplotlib	ספרייה בקוד פתוח	גרסה 3.5.2	שרטוט והדמיה
NumPy	ספרייה בקוד פתוח	גרסה 1.26.4	חישובים מספריים
OpenCV	ספרייה בקוד פתוח	גרסה 4.9.0	עיבוד וידאו
פנדות	ספרייה בקוד פתוח	גרסה 2.2.0	טיפול בנתונים
חומצה פרופיונית	Himedia	GRM3658	חומר משמר אנטי-פטרייתי
פייתון	Python Software Foundation	גרסה 3.12.1	סביבת ניתוח
Scikit-learn	ספרייה בקוד פתוח	גרסה 1.4.2	ניתוח רגרסיה לינארית
מצלמת סמארטפון / מצלמה דיגיטלית	כל יצרן	הגדרת משתמש	הקלטה של 30 פריימים לשנייה לכל הפחות, מיקוד יציב, מיקום בניצב, רזולוציה של 1280 לכל הפחות × רזולוציית 720
סוכרוז	Himedia	GRM601	מרכיב מזון לזבובים
UAS-APP.AβE693G.	מרכז מאגרי הדרוזופילה של בלומינגטון (Bloomington Drosophila Stock Center)	BDSC #33774	מודל מוטציית Arctic של APP אנושי
שמרים	Himedia	RM027	תוסף תזונה

מקורות

López-Otín C, et al. The hallmarks of aging. Cell. 2013;153(6):1194-217.
Caligiore D, Giocondo F, Silvetti M. The Neurodegenerative Elderly Syndrome (NES) hypothesis: Alzheimer and Parkinson are two faces of the same disease. IBRO Neurosci Rep. 2022;13:330-43.
Buchman AS, Bennett DA. Loss of motor function in preclinical Alzheimer’s disease. Expert Rev Neurother. 2011;11(5):665-76.
Sivanantharajah L, Mudher A, Shepherd D. An evaluation of Drosophila as a model system for studying tauopathies such as Alzheimer’s disease. J Neurosci Methods. 2019;319:77-88.
Jones MA, Grotewiel M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Exp Gerontol. 2011;46(5):320-5.
Gargano JW, Martin I, Bhandari P, Grotewiel MS. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 2005;40(5):386-95.
Linford NJ, Bilgir C, Ro J, Pletcher SD. Measurement of lifespan in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. 2013;(71):50068.
Spierer AN, Yoon D, Zhu CT, Rand DM. FreeClimber: automated quantification of climbing performance in Drosophila. J Exp Biol. 2021;224(2).
Taylor MJ, Tuxworth RI. Continuous tracking of startled Drosophila as an alternative to the negative geotaxis climbing assay. J Neurogenet. 2019;33(3):190-8.
Cao W, et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. J Vis Exp. 2017;(127):56507.
Liu H, et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Aβ42-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 2015;31(5):541-9.
Rhodenizer D, et al. Genetic and environmental factors impact age-related impairment of negative geotaxis in Drosophila by altering age-dependent climbing speed. Exp Gerontol. 2008;43(8):739-48.
Tsintzas E, Niccoli T. Using Drosophila amyloid toxicity models to study Alzheimer’s disease. Ann Hum Genet. 2024;88(5):149-65.
O’Keefe L, Denton D. Using Drosophila models of amyloid toxicity to study autophagy in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Biomed Res Int. 2018;2018:5195416.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

גאוטקסיס שלילי ביצועים מוטוריים מסלולי הישרדות בדיקה מבוססת וידאו זיהוי מרכז מסה שיפוע טיפוס מודל נוירודגנרטיבי

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

עדכנו אותי: