הערכת גדילה מבוססת תרבית ופרופילינג נוגדי חמצון של תמצית ג'ל אלוורה טרייה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר הכנה אספטית של תמצית ג'ל פנימית טרייה של אלוורה ורה, מדידת pH פוטנציומטרית, הערכת קיבולת נוגדי חמצון כוללת באמצעות מבחן קולורימטרי אוטומטי מבוסס ABTS, הערכת גדילה בלתי ניתנת לזיהוי מבוססת תרבית בתנאי דגירה מוגדרים, וסינון אנטימיקרוביאלי ראשוני של אלוורה ביחס 70:30 (v/v).תערובת בדיקת N-אצטיל-L-ציסטאין באמצעות דיפוזיה של דיסק ודילול איכותני דו-חלקי של שפופרת.

תקציר

אלוורה (Aloe barbadensis Miller) נמצאת בשימוש נרחב במוצרים מקומיים ורפואה משלימה. עם זאת, תהליכי עבודה סטנדרטיים במעבדה להערכה סימולטנית של קיבולת נוגדי החמצון הכוללת (TAC), התנהגות ה-pH, מצב גדילה מבוסס תרבית ללא זיהוי בתנאים מוגדרים, וסינון אנטי-מיקרוביאלי ראשוני עדיין מוגבלים. תמצית אלוורה טרייה בג'ל הפנימי הוכנה באופן אספטי ונוסחה ב-5%, 10%, 15% ו-20% (לצד זה). ה-pH נמדד פוטנציומטרית, ו-TAC נקבע באמצעות מבחן קולורימטרי רדיקלי מבוסס קטיון אוטומטי של ABTS. בוצעה הערכת גדילה מבוססת תרבית ללא זיהוי על ידי חיסון התמצית על אגר דם, אגר כחול אאוזין מתילן ואגר דקסטרוז סבורו, ואחריה דגירה אירובית ובדיקה ויזואלית ב-24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות. בוצעה סקר אנטימיקרוביאלי של תערובת בדיקת אלוורה/N-אצטיל-L-ציסטאין ביחס 70:30 (v/v) נגד זני ייחוס סטנדרטיים באמצעות דיפוזיה בדיסק ובדיקות דילול דו-חלקיות איכותיות של שפופרות. TAC היה שונה באופן משמעותי בין הקבוצות (Kruskal-Wallis, p = 0.014), כאשר הערכים הגבוהים ביותר נצפו בניסוח של 20%. לא נצפה צמיחה נראית לעין של חיידקים או פטריות בתנאי התרבית שנבדקו במהלך תקופת התצפית של 72 שעות. תערובת הבדיקה של אלוורה ו-N-אצטיל-L-ציסטאין יצרה אזורי עיכוב בטווח של 11 מ"מ עד 17 מ"מ, כאשר האזור הגדול ביותר נצפה נגד Pseudomonas aeruginosa. תהליך עבודה זה מספק גישה מעבדה מעשית להכנת ואפיון ראשוני של אלוורה טרייה.נוסחאות מבוססות -למחקר ברפואה משלימה בשלבים מוקדמים.

מבוא

אלוורה ממשיכה למשוך תשומת לב מדעית רבה בזכות השימוש הוותיק שלה ברפואה המסורתית והרלוונטיות הגוברת שלה במחקר פרמצבטי, ביומדיק, קוסמטיקה ומזון ^1,2,3. צמח מרפא זה מכיל מגוון רחב של רכיבים ביולוגיים פעילים, כולל פוליסכרידים, תרכובות פנוליות, אנתרקינונים, ויטמינים, מינרלים, אנזימים ומטבוליטים בעלי משקל מולקולרי נמוך נוספים שעשויים לתרום לתכונותיו הטיפוליות והפונקציונליות ^1,2,3. מבין הרכיבים הללו, אקמנן הודגש בשל הפוטנציאל הביומטריאלי שלו ותפקידיו המדווחים בתיקון רקמות, אימונומודולציה ויישומים רגנרטיביים ^4,5. במקביל, תרכובות פנוליות ופעילות נוגדי חמצון נוספות נקשרו להשפעות האיסוף החופשיות, ההגנות והתומכות ביולוגית של תכשירים של אלוורה ^2,3.

בשנים האחרונות נרשמה התעניינות גוברת בשילוב אלוורה במערכות פורמולציה מתקדמות ובחומרים ביואקטיביים. הידרוגלים מבוססי אלוורה, דיו ביומטריים, ננו-קומפוזיטים ופיגומים מודפסים תלת-ממדיים נחקרו ליישומים בריפוי פצעים ותמיכה ברקמה בשל יכולת ההידרציה הגבוהה, התאימות הביולוגית והתכונות הביולוגיות הרב-תכליתיות שלהם 4,6,8,9,10,11. מחקרים ניסיוניים הראו שחומרים המכילים אלוורה עשויים לתמוך בניהול פצעים על ידי תרומה לסביבה לחה, שיפור התכונות הפיזיקוכימיות של הנוסחה, ומתן תמיכה נוגדת חמצון או אנטימיקרוביאלית בתנאים נבחרים במבחנה, בחיים ובתנאים התלויים בנוסחה 4,7,8,9,10,11. בנוסף, אלוורה נחקרה ביישומי שימור ופורמולציה של מזון, כאשר ציפויים מבוססי ג'ל ומערכות קשורות נקשרו לשיפור ביציבות חמצנית, איכות חושית טובה יותר וביצועים מיקרוביולוגיים משופרים ^12,13. התפתחויות אלו מצביעות על כך שאלוורה. נחשבת יותר ויותר לא רק למוצר צמחי מסורתי אלא גם כחומר טבעי רב-תכליתי עם פוטנציאל רחב לניסוח 2,3,12,13.

הרלוונטיות הביולוגית של אלוורה מתרחבת גם ליישומים אנטימיקרוביאליים ומיקרוביולוגיים. מחקרים עדכניים תיארו השפעות מעכבות של תכשירים המכילים אלוורה או אלוורה נגד מיקרואורגניזמים קליניים חשובים, כולל Propionibacterium acnes, Enterococcus faecalis, מיני קנדידה, ובודדים קליניים שבודדו מזיהומים פצעים 14,15,16,17. עדויות מוקדמות במבחנה הראו גם פעילות של אלוורה ג'ל פנימי נגד זני ייחוס Helicobacter pylori ובידוד קליני¹⁸. יתרה מזאת, דווח כי מערכות היברידיות המכילות אלוורה מפגינות יכולות משולבות של ריפוי אנטימיקרוביאלי, נוגדי חמצון ופצעים, מה שתומך עוד יותר באופיו הרב-תכליתי של חומר זה שמקורו בצמחים¹⁹. עם זאת, הביצועים הביולוגיים של אלוורה מושפעים ממספר משתנים מתודולוגיים, כולל שיעור הצמח, הליך החילוץ, ריכוז, תנאי טיפול, טריות הג'ל, והאם התכשיר שנבדק מכיל רק ג'ל פנימי או מכיל רכיבים הקשורים ללטקס ^2,20. גורמים אלו חשובים במיוחד משום שחלקי הג'ל הפנימי והחיצוני של העלים שונים הן בהרכב והן בפרופיל הטוקסיקולוגי²⁰.

למרות גוף הספרות ההולך וגדל, נותרו פערים מתודולוגיים חשובים. במחקרים רבים שפורסמו, התנהגות נוגדי חמצון, תכונות פיזיקוכימיות, הערכה מיקרוביולוגית וביצועים אנטימיקרוביאליים מוערכים לעיתים קרובות בנפרד ולא במסגרת זרימת עבודה משולבת אחת. עם זאת, במחקר ממוקד נוסחה, פרמטרים אלו קשורים זה בזה באופן הדוק. תכשיר עשוי להציג פעילות נוגדת חמצון חיובית אך עדיין לדרוש הערכה מיקרוביולוגית מדוקדקת ואפיון פיזיקוכימי לפני שניתן לראות בו מתאים לפיתוח ניסויי נוסף. לכן, תהליכי עבודה במעבדה המשלבות הערכה הקשורה לחמצון אדום, הערכת pH, בדיקות גידול מבוססות תרביות ללא זיהוי בתנאים מוגדרים, וסינון אנטימיקרוביאלי ראשוני עשויים לספק בסיס מעשי ומעשיר יותר לאפיון מוקדם של נוסחאות אלוורה טריות.

בהתאם לכך, מחקר זה נועד להעריך נוסחאות חדשות של תמצית אלוורה ג'ל פנימי שהוכנו בריכוזים שונים מבחינת מאפייני pH, קיבולת נוגדי חמצון כוללת, מצב גדילה מבוססת תרבית ללא זיהוי בתנאי מעבדה מוגדרים, וסינון אנטימיקרוביאלי ראשוני באמצעות דיפוזיה בדיסק ודילול איכותי דו-חלקי של שפופרות. על ידי שילוב הערכות אלו בתוך זרימת עבודה ניסיונית אחת, המחקר תוכנן לספק גישה בסיסית מעשית לאפיון ראשוני של אלוורה.נוסחאות מבוססות -המיועדות למחקר רפואה משלימה.

פרוטוקול

1. הכנת תמצית אלוורה וסדרת דילול

1. קצור את העלים הבוגרים של צמח אלוורה שגדל בטמפרטורת החדר ושטוף אותם היטב במים זורמים כדי להסיר שאריות.
2. בארון ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2), חטא את פני העלה עם 70% אתנול באמצעות כפפות סטריליות. לאחר מריחת 70% אתנול, אפשר למשטח העלה להתייבש לחלוטין באוויר לפחות 2 דקות לפני החתך האספטי.
3. באמצעות סכין סטרילית, הסר את הקצה הרחוק והשוליים של העלה, מאפשר ללטקס הצהוב להתנקז לחלוטין למשך כ-30 דקות, ואז פיל את העלה לאורך זמן. הפרדו בזהירות ואספו רק את הג'ל הפנימי השקוף, תוך הימנעות מהקליפה החיצונית ושכבת הלטקס שנותרה.
4. העבר בזהירות את הג'ל הפנימי של אלוורה למיכל סטרילי והומוגן על ידי מערבולת לסירוגין למשך כ-5-10 דקות במהירות של כ-2,500 סל"ד (או הגדרת מערבולת בינונית-גבוהה שווה ערך); בצע את ההליך בטמפרטורת החדר אלא אם כן נדרשת שליטה בטמפרטורה עבור המכשיר הספציפי.
5. בתנאים אספטיים, יש להכין נוסחאות טריות של תמצית אלוורה בג'ל פנימי ב-5%, 10%, 15% ו-20% (לצד מים) באמצעות מים מזוקקים סטריליים; לדוגמה, להכין 5% (w/v) כאשר ג'ל של 5 גרם מגיע לנפח הסופי של 100 מ"ל, ולהתאים את הריכוזים הנותרים באופן דומה.

2. מדידת pH

1. בצע כיול מד pH בשלוש נקודות באמצעות פתרונות בופר pH 4.01, 7.00 ו-10.01 סטנדרטיים עם מעקב NIST לפני כל סדרת מדידה.
2. מדדו pH לכל ריכוז בטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס); להקליט לפחות שלושה שכפולים טכניים לכל ריכוז.

3. מדידת קיבולת נוגדי חמצון כוללת (TAC)

1. השתמשו בנוסחאות תמצית אלוורה שהוכנו בשלב 1 (5%, 10%, 15% ו-20%) למדידת TAC.
2. הביאו את כל המגבים והדגימות לטמפרטורת החדר (20–25 מעלות צלזיוס) לפני הניתוח כדי להבטיח עקביות אנליטית.
3. כיולו את האנלייזר הביוכימי האוטומטי (Rel Assay, טורקיה) בהתאם לנהלי הפעולה הסטנדרטיים של היצרן לפני תחילת הבדיקה.
4. טעין את תגובות קיבולת נוגדי החמצון הכוללת (TAC) המבוססים על שיטת ארל לתאי התגובה של האנלייזר.
5. פיפט האלוורה (Aloe vera). מוציא דגימות לכוסות הדגימה המתאימות או לבארות תגובה באמצעות מיקרופיפטות מכוילות. (נפח דגימה: 5 מיקרוליטר)
6. התחל את ריצת הבדיקה של ה-TAC באמצעות הפרוטוקול המתוכנת של האנלייזר עבור שיטת ABTS מבוססת קטיון, בהתאם לנפחי המגיב והגדרות הדגירה שנקבעו על ידי היצרן.
7. אפשר לתגובה להתקדם אוטומטית, כאשר נוגדי החמצון הנמצאים בדגימה מפחיתים את קטיון הרדיקל הצבעוני של ABTS, מה שמוביל לירידה בספיגה.
8. מדוד את השינוי בספיגה ספקטרופוטומטרית באורך הגל שמוגדר בשיטת TAC. (אורך גל: 660 ננומטר)
9. חשב ערכי קיבולת נוגדי חמצון כוללת באמצעות תוכנת האנלייזר על ידי השוואת שינויים בספיגת הדגימה לעקומת הכיול המקבילה לטרולוקס.
10. Express TAC מתקבל כמקביל ל-MMOL טרולוקס / ליטר ליחידת נפח תמצית.
11. בצע את כל המדידות בשכפול כדי להבטיח אמינות אנליטית.

4. הערכת גדילה מבוססת תרבית ללא זיהוי של ג'ל פנימי של אלוורה

1. החרינו 10 מיקרוליטר מכל תמצית על אגר דם, אגר כחול אאוזין מתילן, ואגר דקסטרוז סבוראוד באמצעות לולאה מכויילת (10 מיקרוליטר) (שיטת ספירת מושבה).
2. להערכת גדילה ללא גילוי מבוססת תרבית, יש לשחרר באופן אספטי אליקווט סטנדרטי של 50 מיקרולטר באמצעות מיקרופיפטה מכוילה על אגר דם, אגר כחול אאוזין מתילן וצלחות אגר דקסטרוז של סבורו, ומרח אותו בעדינות באמצעות לולאה חד-פעמית סטרילית (10 מיקרוליטר) (הערכת רבייה מבוססת תרבית בשיטת הטפטוף הישיר).
3. דגרו את לוחות האגר הכחול של האגר בדם ואאוזין מתילן באופן אירובי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ואת לוחות האגר סאבורו דקסטרוז אירובי בטמפרטורה של 25–28 מעלות צלזיוס, ואז בדקו את הלוחות ויזואלית לצורך גדילה ב-24, 48 ו-72 שעות. דגרו צלחת אחת לא מחוסנת מכל מדיום במקביל כבקרה שלילית.

5. הערכת פעילות אנטימיקרוביאלית של תערובת בדיקת אלוורה

1. בתנאים סטריליים, יש להכין תמיסת בדיקה הומוגנית על ידי ערבוב תמצית ג'ל פנימית סטרילית של אלוורה ו-70% עם תמיסת N-אצטיל-L-ציסטאין (10% w/v במים סטריליים).
   הערה: תערובת זו מפחיתה את הצמיגות הגבוהה של הג'ל שנגרד מהעלה ומקבלת מרקם נוזלי יותר. שקלו את הנוסחה המורכבת הזו כתערובת סינון ראשונית. לכן, יש לפרש את הממצאים האנטימיקרוביאליים כך שישקפו את הפעילות המשולבת של שני הרכיבים.
2. מערבל את התערובת ההומוגנית ביסודיות עד שמתקבלת תמיסה אחידה.
3. תת-תרבות של מאגרי חיידקים סטנדרטיים שהוקפאו בעבר של Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, ו-Escherichia coli. ATCC 25922, מאוחסן בטמפרטורה של -80°C, על אגר דם סטנדרטי (לחיידקים גרם-חיוביים) ואגר כחול סטנדרטי אאוזין מתילן (לחיידקים גרם-שליליים), ודוגר ב-37°C למשך 18-24 שעות.
4. בסיום הדגירה, יש להכין תסמיני חיידקים מותאמים ל-0.5 עכירות מקפרלנד באמצעות סליין סטרילי מהמושבות המגודלות, בהתאם להמלצות הכנת החיסון הסטנדרטיות לבדיקת רגישות אנטימיקרוביאלית³⁸.
5. לחסן לוחות אגר מולר-הינטון באופן אחיד עם כל מתלה חיידקי סטנדרטי באמצעות מטוש סטרילי.
6. יש להניח נפח סטנדרטי של 15 מיקרוליטר של תערובת בדיקת אלוורה ו-NAC סטרילית על כל דיסק אנטימיקרוביאלי סטרילי בקוטר 6 מ"מ באמצעות מיקרופיפט מכויל. אותו נפח טעינה, זמן ספיגה (לפחות 2 דקות) וזמן ייבוש באוויר (כ-5 דקות) הוחלו על כל הדיסקים ברפליקטים כדי להבטיח עקביות פרוצדורלית. נפח זה נבחר ככמות טעינה מעשית לדיסקים של 6 מ"מ בסינון דיפוזיה מבוסס תמצית צמחית ונשמר קבוע לכל הניסויים.
7. הניחו את הדיסקים הספוגים בתמצית על פני לוחות האגר המחוסנים באמצעות מלקחיים סטריליים.
8. דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 37°C למשך 18–24 שעות בתנאים אירוביים.
9. לאחר הדגירה, יש למדוד ידנית את קוטר כל אזור עיכוב, כולל קוטר הדיסק, עד למילימטר הקרוב ביותר באמצעות סרגל. בצע את הניסוי כמדידה תיאורית אחת, המדווח על קטרי האזורים המתועדים כערכים שנצפו בנפרד. בצע מדידות על ידי בדיקה ויזואלית של הלוחות לפי ההמלצות הסטנדרטיות לקריאת דיפוזיה דיסקית³⁸.
10. הכינו דילול סדרתי כפול (1/2, 1/4, 1/8 ו-1/16) של תערובת בדיקת אלוורה/NAC 70:30 (v/v) במרק מולר-הינטון.
11. החרינו כל שפופרת ב-500 מיקרוליטר מהמתנה החיידקית הסטנדרטית של 0.5 מקפרלנד המוכן במי מלח סטריליים. הכינו סדרת דילול נפרדת לכל זן ייחוס ודגרו את הצינורות המחוסנים בתנאים המפורטים להלן.
12. דגרו את הצינורות המחוסנים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18–24 שעות.
13. הערכת גדילה מיקרוביאלית חזותית לפי עכירות ביחס לבקרת המרק; לפרש את הבדיקה באופן איכותי ולא כקביעת MIC פורמלית.
14. השתמש בדיסק ציפרופלוקסין (5 מיקרוגרם) כבקרה חיובית במקביל לדיסקים ספוגים באלוורה ו-NAC. יש להחיל את אותו דיסק בקרה חיובי עבור Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, ו-Escherichia coli ATCC 25922 כדי לאשר רגישות בתנאי דיפוזיה של דיסק.
    הערה: לבצע את כל ההליכים המיקרוביולוגיים בתנאי BSL-2 ולתעד את כל תצפיות קוטר האזור והעכירות מיד לאחר הדגירה לניתוח תיאורי נוסף. פרוטוקול זה משלב הכנה אספטית של A. vera.תמצית עם בדיקות ביוכימיות ומיקרוביולוגיות משלימות לתמיכה בפיתוח נוסחאות מבוססות צמחים לשימוש מקומי ורפואה משלימה. תהליך העבודה מיועד להיות מעשי למעבדות שגרתיות: ניתן לבצע סקר pH וחמצון רדוקסי (TAC) לצד תרבית סטריליות ושתי בדיקות אנטימיקרוביאליות נפוצות (דיפוזיית דיסק ודילול צינורות).

תוצאות

ערכי ה-pH של תמצית אלוורה בריכוזים שונים

פרופיל ה-pH הראה דפוס לא מונוטוני בין ריכוזים. ערכי ה-pH הממוצעים היו 6.47, 6.60, 6.26 ו-6.28 עבור הנוסחאות של 5%, 10%, 15% ו-20%, בהתאמה. ההבדלים הכלליים בקבוצות היו מובהקים (p = 0.024). הנוסחאות של 5% ו-10% הציגו ערכי pH יחסית גבוהים יותר, בעוד שהנוסחאות של 15% ו-20% התאספו בערכי pH נמוכים יותר (p < 0.05) (טבלה 1 וטבלה 2).

...

דיון

המחקר הנוכחי מספק זרימת עבודה משולבת במעבדה לאפיון ראשוני של נוסחאות תמצית אלוורה טרייה בג'ל הפנימי, באמצעות שילוב מדידת pH, ניתוח קיבולת נוגדי חמצון כוללת (TAC), הערכת צמיחה מבוססת תרבית ללא זיהוי וסקר אנטימיקרוביאלי תיאורי. ריכוזים הולכים וגדלים של אלוורה ג'ל פנימי טרי היו קשורים לערכי TAC גבוהים יותר, בעוד שלא נצפתה גדילה נראית לעין של חיידקים או פטריות במהלך ניטור תרביות קצר טווח בתנאי המעבדה המוגדרים. ממצאים אלה צריכים להתפרש כהוכחה לפעילות נוגדי חמצון מדידה וצמיחה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
(-)80 C Deep Freezer	Thermofisher/USA	אחסון דגימות	TSX40086A
Vortex	Thermofisher/USA	הכנת דגימות	88882010
Blood Agar	RTA/Turkey	חיסון תרבית	2001
Eosine Methilene Blue Agar	RTA/Turkey	חיסון תרבית	2010
SDA Agar	RTA/Turkey	חיסון תרבית	2036
Müller Hinton Agar	RTA/Turkey	חיסון תרבית	2022
Müller Hinton Broth	RTA/Turkey	דילול תרבית	1018
Pipettes	Thermofisher/USA	הכנת דגימות	4642090N
Hanna pH Meters	Hitachi/JAPAN	ניתוח דגימות	HI2211-02
Rel Assay Plate Reader	Rel Assay(Turkey)	ניתוח TAC של דגימות	M201 (Smart Model)
TAC Kits	Rel Assay(Turkey)	ערכה	RL0017