Sophora flavescens בחמישה טעמים קפסולות מצופות אנטרי מקלות על קוליטיס ניסיוני ושינויים הקשורים לפרופטוזיס

סיכום

במודל עכבר של קוליטיס כיבית, קפסולות Sophora flavescens עם חמישה טעמים מצופות מעי הקלו על פגיעת המעי הגס ושיפרו את הלחץ החמצוני, חוסר איזון ציטוקינים דלקתי, איתות JAK2/STAT3 ושינויים בסמנים הקשורים לפרופטוזיס.

תקציר

קוליטיס כיבית נותר קשה לניהול מכיוון שאפשרויות טיפוליות יעילות וממוקדות מוגבלות, ולחץ חמצוני, איתות דלקתי ומסלולי מוות תאים מוסדרים עלולים לתרום לפגיעה ברירית. מחקר זה העריך האם קפסולות Sophora flavescens מצופות אנטרי (FSEC) בחמישה טעמים מקלות על קוליטיס ניסיוני וחקר שינויים נלווים בעקה חמצנית, דלקת וסמנים של פרופטוזיס. מודל עכבר של קוליטיס כיבית הוכח באמצעות חשיפה מחזורית ל-2.5% דסקסטרן סולפט נתרן, בשילוב עם אתגר גורם נמק הגידול אלפא. העכברים טופלו ב-FSEC במינון נמוך, בינוני או גבוה, או באנטגוניסט TLR4 CRX-526 כהתערבות ביקורת חיובית. ההיסטופתולוגיה של המעי הגס הוערכה באמצעות צביעת המטוקסילין ואאוזין. רמות סופר-אוקסיד דיסמוטס, קטלאז, גלוטתיון, מיאלופרוקסידאז ו-Fe²⁺ נמדדו באמצעות בדיקות ביוכימיות. ציטוקינים של רקמת המעי הגס נמדדו באמצעות בדיקת אימונוסורבנט קשורה לאנזימים, ביטוי JAK2 ו-STAT3 הוערכו באמצעות אימונוהיסטוכימיה, וביטוי GPX4, FTH1 ו-ACSL4 נותחו באמצעות Western blotting. טיפול ב-FSEC הפחית פגיעה ברירית המעי הגס וחדירת תאי דלקת, העלה את מדדי נוגדי החמצון, והפחית את רמות המילופרוקסידאז. FSEC גם הפחית את רמות TNF-α ו-IL-1α, החזיר חלקית את רמות IL-13, והיה קשור לחלשות חיסוניות JAK2 ו-STAT3. במקביל, FSEC שיפר שינויים בסמנים הקשורים לפרופטוזיס, כולל הפחתת רמות Fe²⁺ ו-ACSL4 והגברת ביטוי GPX4 ו-FTH1. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-FSEC מקל על קוליטיס כיבית ניסיוני בעכברים, לפחות בחלקו על ידי שיפור מצב הסטרס החמצוני, מתן אותות דלקתיים ושיקום פרופילי הסמנים הקשורים לפרופטוזיס.

מבוא

קוליטיס כיבית (UC) היא הפרעה דלקתית כרונית המשפיעה בעיקר על רירית המעי הגס והרקטום, ומתאפיינת בפרקים חוזרים של דלקת רירית, כיבים ופגיעה בתפקוד המחסום ^1,2,3. למרות שרגישות גנטית, גורמים סביבתיים, תפקוד לקוי של מחסום אפיתל וחוסר ויסות חיסוני היו מעורבים בפתוגנזה של UC, המנגנונים שמאחורי הפגיעה הרירית המתמשכת עדיין אינם מובנים במלואם. טיפולים פרמקולוגיים עכשוויים, כולל אמינוסליצילטים, קורטיקוסטרואידים, מדכאי חיסון וסוכנים ביולוגיים, יכולים להפחית את פעילות המחלה אצל מטופלים רבים; עם זאת, השימוש הקליני בהם עשוי להיות מוגבל בשל הישנות לאחר הפסקת הטיפול, תופעות לוואי, עלות גבוהה ותגובות טיפוליות לא שלמות³.

פרופטוזיס, צורה תלויה בברזל של מוות תאי מבוקר, המאופיינת בפרוקסידציה של שומנים ושינוי במטבוליזם של הברזל, מעורבת יותר ויותר בדלקת מעיים ובפגיעה אפיתלית הקשורה ל-UFC 4,5,6,7,8. במקביל, נוסחאות ברפואה הסינית המסורתית זכו לתשומת לב גוברת כגישות משלימות לטיפול ב-UC בשל הפוטנציאל הטיפולי הרב-מטרתי שלהן.

קפסולות Sophora flavescens עם ציפוי מעיים (FSEC) בחמישה טעמים משמשות קלינית לטיפול ב-UC פעיל קל עד בינוני ברפואה הסינית המסורתית. מחקרים קודמים מצביעים על כך ש-FSEC עשוי לשפר את תסמיני ה-UC^{באמצעות מנגנונים} מרובי רכיבים ורב-מטרות. עם זאת, השפעות FSEC על לחץ חמצוני, איתות דלקתי, פעילות JAK2/STAT3 ושינויים הקשורים לפרופטוזיס ב-UC ניסיוני עדיין לא מאופיינים מספיק.

לחץ חמצוני ואיתות דלקתי הם גורמים חשובים לפגיעה ברירית המעי ב-UC. ייצור יתר של מיני חמצן תגובתיים עלול להפר את שלמות האפיתל, לקדם חדירת תאים דלקתיים ולפגוע במערכות ההגנה נוגדי החמצון. מסלולים המתווכים על ידי ציטוקין כגון איתות JAK2/STAT3 תורמים להגברה דלקתית ולפגיעה ברקמות 11,12,13,14,15. בנוסף, לחץ חמצוני ופרופטוזיס קשורים קשר הדוק דרך שינויים בהגנות נוגדי חמצון, מטבוליזם ברזל וחמצון ליפידים 16,17,18,19,20. לכן, הערכה סימולטנית של מדדי לחץ חמצוני, ציטוקינים דלקתיים, איתות JAK2/STAT3 וסמנים הקשורים לפרופטוזיס עשויה לספק הבנה מקיפה יותר של פגיעות ריריות ותגובות טיפוליות ב-UC ניסיוני.

במחקר הנוכחי, נעשה שימוש במודל עכבר מחזורי של דקסטרן סולפט סולפט ונמק גידול עם אתגר אלפא לצורך הערכת השפעות של FSEC במינון נמוך, בינוני וגבוה. חוזק מתודולוגי מרכזי של עיצוב זה הוא שילוב הערכה היסטופתולוגית עם מדידות מדדי עומס חמצוני בסרום, ציטוקינים של רקמת המעי הגס, אימונוהיסטוכימיה JAK2/STAT3, וניתוח ווסטרן בלוט של חלבונים הקשורים לפרופטוזיס במסגרת ניסויית אחת. גישה זו שימשה לקביעת האם FSEC מקל על UC ניסיוני ולאפיון שינויים נלווים בעקה חמצנית, איתות דלקתי ופרופילי סמנים הקשורים לפרופטוזיס. תכנון הניסוי הכולל וזרימת העבודה האנליטית מסוכמים באיור 1.

איור 1: זרימת עבודה ניסיונית של מודל העכבר וניתוחים במורד הזרם. קוליטיס כיבית כרוני ניסיוני נגרם מחשיפה מחזורית ל-2.5% דקסטרן סולפט נתרן (DSS) בשילוב עם אתגר גורם נמק גידול אלפא (TNF-α) במהלך השבוע האחרון של הפרוטוקול הניסוי. העכברים שובצו לקבוצות ביקורת תקינה, מודל, FSEC במינון נמוך, FSEC במינון בינוני, FSEC במינון גבוה ו-CRX-526 חיובי-ביקורת. FSEC ניתן באמצעות גאווג' תוך-קיביתי במינונים של 108, 216 או 432 מ"ג/ק"ג משקל גוף. CRX-526 שימש כהתערבות ביקורת חיובית. לאחר הטיפול הסופי, נאספו דגימות להערכה היסטופתולוגית, בדיקות ביוכימיות הקשורות למתח חמצוני, ניתוח ציטוקינים באמצעות ELISA, אימונוהיסטוכימיה וניתוח ווסטרן בלוט. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

פרוטוקול

כל ההליכים לבעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת רווחת בעלי החיים ואתיקה של המכללה הרפואית נאנצ'אנג (אישור מס' NY2SC 20250407). כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. הכימיקלים, הריאגנטים והציוד מופיעים בטבלת החומרים.

1. בעלי חיים וטיפול

עכברים זכרים מסוג C57BL/6J (סוג פראי, בני 8 שבועות) שימשו במחקר זה. בעלי החיים הוחזקו בתנאי מעבדה סטנדרטיים עם טמפרטורה ולחות מבוקרות, וקיבלו גישה חופשית למזון ולמים. לאחר ההסתגלות, נגרם קוליטיס כרוני על ידי מתן שלושה מחזורים של 2.5% דקסטרן סולפט נתרן (DSS) במי השתייה. כל מחזור נמשך שבוע והיה מופרד על ידי תקופת התאוששות של שבועיים עם מים קבועים. בשבוע האחרון של הפרוטוקול הניסוי, עכברים בקבוצת המודל והטיפול קיבלו פקטור נמק גידולי אלפא (TNF-α; 10 מיקרוגרם/100 גרם משקל גוף, פעמיים ביום) באמצעות ניתוח תוך-קיבה להחמרת פגיעת המעי הגס. עכברי בקרה רגילים קיבלו רק כלי רכב ולא נחשפו ל-DSS או TNF-α.

קפסולות Sophora flavescens עם ציפוי מעיים (FSEC) בחמישה טעמים שימשו כתרופה סינית מסחרית מאושרת ומוכרת. הנוסח כלל את Sophora flavescens Aiton, Sanguisorba officinalis L., Indigo naturalis, Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f., ו-Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC. תכולת הקפסולה מאותה אצווה של ייצור נשקלה והושתה במים מזוקקים סטריליים להכנת השענות טריות לפני ההעברה. המתלים עורבבו היטב לפני כל גוואג' כדי להבטיח פיזור אחיד. מקור המוצר, מספר אישור, מפרטי תרופות ומידע בקרת איכות מופיעים בטבלת החומרים. איכות המוצר תוארה בהתאם למפרט התרופות המאושר ולמידע שסופק על ידי היצרן, כולל מפרטי קפסולות, מראה, דרישות שחרור והתפוררות, דרישות מגבלת מיקרואורגניזמים ותקני בקרת איכות.

עכברים שטופלו ב-FSEC קיבלו FSEC במינון נמוך (108 מ"ג/ק"ג משקל גוף), FSEC במינון בינוני (216 מ"ג/ק"ג משקל גוף), או FSEC במינון גבוה (432 מ"ג/ק"ג משקל גוף) באמצעות ניתוח תוך-קיבה פעמיים ביום במהלך השבוע האחרון של המודל. רמות המינון נבחרו על פי המינון הקליני המאושר, המרת שטח גוף-פני הגוף, ושיקולי מדידת מינון ראשוניים. עכברים שטופלו ברכב קיבלו את אותו נפח מים מזוקקים סטריליים באמצעות גאבאז' תוך-קיבתי.

קבוצת הביקורת החיובית קיבלה את האנטגוניסט TLR4 CRX-526 בעוצמה של 1 מ"ג/ק"ג באמצעות הזרקת וריד הזנב בשבוע האחרון של המידול. CRX-526 שימש כהתערבות אנטי-דלקתית ייחוס. המחקר כלל שש קבוצות (n = 6 לכל קבוצה): קבוצת ביקורת תקינה, מודל, FSEC במינון נמוך, FSEC במינון בינוני, FSEC במינון גבוה, וקבוצות CRX-526 חיוביות-ביקורת. העכברים הוקרבו 24 שעות לאחר הטיפול האחרון במחקר. המתת חסד בוצעה באמצעות פריקה צווארית תחת הרדמה איזופלורנית, בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה.

2. הערכה היסטולוגית באמצעות צביעת המטוקסילין ואאוזין

רקמות המעי הגס נאספו מהאזור המקרוסקופי שנפגע ביותר בין פי הטבעת לאזור האילאוסקלי. עבור כל עכבר, מקטע מעי ייצוגי אחד מאזור זה נקבע ב-10% פורמלין ניטרלי עם בופר, מוטמע בפרפין, חתך וצובע בהמטוקסילין ואאוזין. להערכה היסטולוגית, הוכנו לפחות שלושה מקטעים מכל בעל חיים, וחמישה שדות בעלי הספק גבוה לא חופפים נבדקו בכל מקטע. השדות נבחרו באופן שיטתי באקראי על ידי סריקת הקטע מקצה לקצה, תוך הימנעות מאזורים קרועים, מקופלים או מוכתמים בצורה גרועה. שינויים היסטופתולוגיים, כולל כיב רירירי, הרס בלוטות, גודש וחדירת תאים דלקתיים, הוערכו תחת מיקרוסקופיה אור.

3. מדידת מדדים ביוכימיים הקשורים ללחץ חמצוני

דגימות דם (0.5 מ"ל) נאספו לצינורות המכילים נוגדי קרישה וצנטריפוגה בכ-1160 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסופרנטנט נאסף ושימש למדידת רמות ברזל בסרום, סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD), גלוטתיון (GSH), קטלז (CAT) ומיאלופרוקסידאז (MPO) באמצעות ערכות הבדיקה המתאימות המפורטות בטבלת החומרים בהתאם להוראות היצרנים.

4. ניתוח אימונוהיסטוכימי של JAK2 ו-STAT3

חתכי רקמת המעי הגס המוטמעים בפרפין (5 מיקרון) עברו דה-פרפין בקסילן, הודרו מחדש באמצעות סדרת אתנול מדורגת, ונשטפו במלח עם בופר פוספט. שליפת אנטיגנים בוצעה בבופר ציטראט (pH 6.0) באמצעות חימום במיקרוגל. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, פעילות פרוקסידאז אנדוגנית נחסמה עם 3% H₂O₂ למשך 10 דקות. החתכים נחסמו בסרום עזים תקין של 5% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ודגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם נוגדנים ראשוניים נגד JAK2 ו-STAT3 בדילול של 1:50 ו-1:80, בהתאמה. לאחר שטיפות מלח עם בופר פוספט, הקטעים דוגרו בנוגדן משני מצמיד עם פרוקסידאז על ידי חזרת, בהתאם להוראות היצרן. אותות אימונוראקטיביים הוצגו באמצעות 3,3′-דיאמינובנזידין, והגרעינים צוברו נגד המטוקסילין. החתכים יובשו, הותקנו ונבדקו תחת מיקרוסקופ אור.

5. כימות ציטוקינים באמצעות בדיקת אימונוסורבנט המקושרת באנזימים

רקמות המעי הגס נחתכו ל-2–3 מ"מ³ חתיכות, הומוגנו על קרח במי מלח עם בופר פוספט, וצונטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסופרנטנט נאסף, וריכוזי TNF-α, IL-1α ו-IL-13 נמדדו באמצעות ערכות ELISA המתאימות בהתאם להוראות היצרנים. ערכי הספיגה נמדדו באמצעות קורא מיקרופלט, וריכוזי הציטוקינים חושבו מהעקומות הסטנדרטיות שנוצרו עבור כל מבחן.

6. ניתוח ווסטרן בלוט של חלבונים הקשורים לפרופטוזיס

חלבונים כוללים הופקו מרקמות המעי הגס, וריכוזי החלבון נקבעו באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונינית. כמויות שוות של חלבון מכל דגימה הופרדו על ידי SDS-PAGE והועברו לממברנות. לאחר חסימה עם חלב דל שומן 5% או בופר חסימה שווה ערך במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, הממברנות דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים נגד GPX4, FTH1, ACSL4 וחלבון בקרת הטעינה β-אקטין, כפי שמפורט בטבלת החומרים. ביום הבא, הממברנות נשטפו ודגרו עם הנוגדן המשני המתאים פרוקסידאז ל-2 שעות בטמפרטורת החדר. רצועות החלבון הוצגו באמצעות מצע כימילומינסנטי והודגמו באמצעות מערכת הדמיה כימימיומינסנציה. עוצמות הרצועות נמדדו באמצעות תוכנת צפיפות. רמות הביטוי של GPX4, FTH1 ו-ACSL4 נורמל ל-β-אקטין, והביטוי היחסי של חלבונים חושב לניתוח סטטיסטי.

7. ניתוח סטטיסטי

הנתונים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). בוצעו השוואות בין קבוצות שונות באמצעות ניתוח חד-כיווני של השנות, ואחריו מבחן פוסט-הוק של בונפרוני כאשר התקיימו ההנחות של נורמליות והומוגניות של שונות. ערך של P < 0.05 נחשב למובהק סטטיסטית.

תוצאות

FSEC מקל על פגיעות היסטופתולוגיות ומשפר את האינדקסים הקשורים ללחץ חמצוני בעכברים עם קוליטיס כיבית
כפי שמוצג באיור 2, קבוצת הביקורת התקינה הציגה ארכיטקטורה של רירית המעי הגס שלמה, עם בלוטות מאורגנות היטב וחדירת תאים דלקתית מינימלית. לעומת זאת, קבוצת המודל הראתה פגיעה רירית חמורה שהתאפיינה בהפרעה אפיתלית, כיב רירירי, הרס בלוטות, גודש וחדירה בולטת לתאי דלקת. בהשוואה לקבוצת המודל, עכברים שטופלו ב-FSEC במינון גבוה, בינוני או נמוך הראו פגיעה הי...

דיון

מחקר זה חקר את השפעות קפסולות Sophora flavescens מצופות אנטריקה (FSEC) בחמישה טעמים במודל עכבר של קוליטיס כיבית ניסיוני (UC) והעריך שינויים נלווים באינדקסים הקשורים לעומס חמצוני, ציטוקינים דלקתיים, איתות JAK2/STAT3 וסמנים הקשורים לפרופטוזיס. הממצאים העיקריים היו שטיפול ב-FSEC הקל על פגיעות היסטופתולוגיות במעי הגס, שיפר את המדדים הביוכימיים הקשורים לנוגדי חמצון, הפחית את רמות TNF-α ו-IL-1α, החזיר חלקית את רמות IL-13, היה קשור לחלשות צביעת חיסון JAK2 ו-STAT3, ושיפור פרופילי הסמנים...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate kit	ZSGB-BIO	ZLI-9018	חומר מצע כרומוגני עבור אימונוהיסטוכימיה מבוססת HRP.
ACSL4 antibody (F-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-365230	נוגדן ראשוני מונוקלונלי מעכבר עבור western blot; משמש ב-1:500; RRID: AB_10842002.
Antigen retrieval solution, citrate buffer, pH 6.0	Beyotime Biotechnology	P0081	מאגר שחזור אפיטופים בחום עבור אימונוהיסטוכימיה של חתכים פרפין.
BCA protein assay kit	Beyotime Biotechnology	P0012	כמות חלבון לפני בליטת ווסטרן.
C57BL/6J mice	Fujian Anburui Biotechnology Co., Ltd.	N/A	עכברים זכרים SPF בני 8 שבועות; מקור בעלי חיים תואם לחומר אישור האתיקה שהוגש.
Catalase (CAT) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1	ערכת צבעונית למדידת פעילות CAT בסרום.
ChemiDoc XRS+ imaging system	Bio-Rad Laboratories	1708265	מערכת הדמיית זרחן כימי עבור גילוי ווסטרן בלוט.
CRX-526	TargetMol	T27090	אנטגוניסט של TLR4 המשמש כממשק בקרת חיובית; מספר CAS 245515-64-4.
Dextran sulfate sodium salt (DSS), colitis grade	MP Biomedicals	160110	DSS, דרגת קוליטיס, משקל מולקולרי 36,000–50,000 דה; משמש ב-2.5% במי שתייה.
ECL chemiluminescent substrate	Bio-Rad Laboratories	1705061	חומר מצע זורח כימי עבור זיהוי אותות ווסטרן מבוסס HRP.
ELISA kit, mouse IL-13	Abcam	ab219634	ערכת ELISA צנדוויץ' צבעונית להכמות IL-13 מעכבר; קריאה 450 ננומטר.
ELISA kit, mouse IL-1α	Abcam	ab199076	ערכת ELISA צנדוויץ' צבעונית להכמות IL-1α מעכבר; קריאה 450 ננומטר.
ELISA kit, mouse TNF-α	Abcam	ab208348	ערכת ELISA צנדוויץ' צבעונית להכמות TNF-α מעכבר; קריאה 450 ננומטר.
Ethanol, absolute	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	משמש לעיבוד רקמות, התייבשות והכנת ריאגנטים.
Ferrous iron (Fe2+) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A039-2-1	ערכת צבעונית למדידת Fe2+ בדגימות סרום או רקמה.
Five-flavor Sophora flavescens enteric-coated capsules	Beijing Zhonghui Pharmaceutical Co., Ltd.	NMPA approval no. Z20150002	תרופה סינית פטנטית; 0.4 גרם/כמוסה; הרכב כולל Sophora flavescens Aiton, Sanguisorba officinalis L., Indigo naturalis, Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f., ו-Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC.; מפרט תרופות YBZ00152015
Glutathione (GSH) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A006-2-1	ערכת מדידת גלוטתיון מופחת להכמות GSH בסרום.
GPX4 antibody (E-12)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166570	נוגדן ראשוני מונוקלונלי מעכבר עבור ווסטרן בלוט; משמש ב-1:500; RRID: לא רשום בגליון הנתונים של הספק.
Hematoxylin and eosin staining kit	Solarbio	G1120	צביעת H&E של חתכים פרפין משובצים של רקמת המעי הגס.
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	נוגדן משני עבור ווסטרן בלוט; משמש ב-1:50,000; RRID: AB_631736.
ImageJ software	National Institutes of Health	Version 1.54	תוכנת ניתוח תמונה וצפיפות המשמשת לכימות רצועות ווסטרן בלוט.
Immunohistochemistry detection kit	ZSGB-BIO	PV-9000	ערכת זיהוי HRP מבוססת פולימר עבור אימונוהיסטוכימיה של חתכים פרפין.
JAK2 antibody (D2E12)	Cell Signaling Technology	3230	נוגדן ראשוני מונוקלונלי מארנב עבור אימונוהיסטוכימיה של JAK2 על חתכים פרפין; RRID: AB_2128522.
Microplate reader	BioTek Instruments	Synergy H1	קורא לוחות למדידת ספיגה של ELISA ב-450 ננומטר.
Myeloperoxidase (MPO) activity assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A044-1-1	ערכת צבעונית למדידת פעילות MPO בסרום.
Neutral buffered formalin, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	קיבוע רקמת המעי הגס לפני השינוע לפרפין.
Normal goat serum	Solarbio	SL038	חומר חוסם עבור אימונוהיסטוכימיה.
Paraffin	Leica Biosystems	39601006	מדיום הטמעה לעיבוד רקמת המעי הגס.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Solarbio	P10