סינתזה ירוקה של ננו-חלקיקי זהב וכסף באמצעות תמציות צמחים, סינון פטרייתי ותרביות חיידקים

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטות סינתזה ירוקה הניתנות לשחזור לייצור ננו-חלקיקי זהב וכסף באמצעות תמציות צמחים, סינון פטרייתי ותרביות חיידקים, ולאחר מכן אישור ננו-חלקיקים באמצעות ספקטרוסקופיה אולטרה-סגולה-נראית ומיקרוסקופיית אלקטרונים מעברית.

תקציר

סינתזה ירוקה של ננו-חלקיקי מתכת (NPs) באמצעות מערכות ביולוגיות מספקת חלופה בת קיימא לשיטות ייצור כימיות קונבנציונליות. פרוטוקול זה מציג נהלים ניסיוניים ואנליטיים ניתנים לשחזור לסינתזה של NPs זהב (Au) וכסף (Ag) באמצעות תרביות חיידקים, סינון פטרייתי ותמציות עלי צמחים כסוכני חיזור ומייצבים. AgNPs סונתזו באמצעות תמציות מ-Psidium guayaquilensis, Acanthophora spicifera ו-Earliella sp., והראו פסי ספיגה אופייניים של אולטרה סגול-נראה (UV–Vis) בין 405 ל-425 ננומטר שאישרו היווצרות NP. שיטת עיצוב ניסויים יושמה להערכת השפעת גורמים סביבתיים, כולל תנאי חמצן, pH, ריכוז Au, ריכוז תאים, סוג תורם אלקטרונים וטמפרטורה, על סינתזת AuNPs על ידי Shewanella oneidensis ו-Cupriavidus metallidurans. בתנאים אידיאליים (0.2 mM Au ו-pH 5), S. oneidensis ייצר AuNPs כדוריים ברובם עם גודל ממוצע של 43.6 ± 11.0 ננומטר ושיא ספיגה אופייני ב-520 ננומטר. היווצרות ומורפולוגיית NP אושרו באמצעות ספקטרוסקופיית UV–Vis ומיקרוסקופיית אלקטרונים מעברית. תהליך עבודה זה מספק פלטפורמה ניתנת לשחזור לסינתזת NP ביוגנית ותומך ביישומים בביוסנסינג, ביורימדיציה וטכנולוגיות אנטימיקרוביאליות.

מבוא

לחלקיקים ננו-מתכתיים (NPs) יש תכונות פיזיקוכימיות ייחודיות הקשורות לשטח הפנים הגבוה שלהם, כולל התנהגויות אלקטרוניות, מגנטיות וקטליטיות ייחודיות, וכן תגובתיות גבוהה. תכונות אלו קידמו את יישומם בתחומים רבים, כולל רפואה לאבחון מחלות ואספקת תרופות ^1,2,3,4,5,6, קוסמטיקה לנוסחאות קרם הגנה⁷, אלקטרוניקה לטרנזיסטורים ותאי שמש⁸, הנדסה סביבתית לטיפול במים ^2,9,10, וחקלאות לדשנים וחומרי הדברה^11,12. ההתרחבות המתמשכת של יישומי NP בין תחומים משתקפת במספר ההולך וגדל של פרסומים קשורים שדווחו בשנים האחרונות^13,14.

שיטות סינתטיות ל-NPs מתכתיים מאפשרות שליטה מדויקת על מאפיינים חשובים כמו גודל חלקיקים, מורפולוגיה ויציבות, מה שהופך את תהליך הסינתזה לגורם קריטי בביצועי ה-NP. שיטות סינתזה כימית קונבנציונליות עברו אופטימיזציה נרחבת; עם זאת, לעיתים קרובות הם כוללים תגובות רעילות, צריכת אנרגיה גבוהה ועלויות ייצור גבוהות^{– 14.15}. מגבלות אלו הניעו פיתוח חלופות ירוקות וברות קיימא יותר. גישות סינתזה ירוקה משתמשות במערכות ביולוגיות כגון תמציות צמחים ^16,17, מיקרואורגניזמים כולל פטריות וחיידקים¹⁸, ואצות¹⁹ כסוכנים טבעיים להפחתת ומייצב. במהלך תהליכים אלו, מלחי המתכת מצטמצמים לצורות אפס-ערכיות, ומייצרים NPs דרך מסלולים ידידותיים לסביבה וחסכוניים. בנוסף, NPs מסונתזים ביולוגית לעיתים קרובות תואמים ביולוגית, מה שמקל על השימוש בהם ביישומים רפואיים, חקלאיים וסביבתיים ^8,14.

בחירת מסלול ביולוגי מתאים לסינתזת NP תלויה ביישום המיועד, כמו גם בתשתיות הזמינות ובדרישות התפעוליות. סינתזה מבוססת צמחים מועדפת בדרך כלל לייצור מהיר וזול של NP, משום שהיא דורשת טיפול סטרילי מינימלי; עם זאת, שונות בהרכב התמצית עשויה להשפיע על שחזוריות ^20,21. סינתזה בתיווך פטרייתי יכולה לספק תפוקות NP גבוהות ואנזימים חוץ-תאיים המשפרים את ייצוב NP ואת עיבוד ה-NP במורד הזרם, אם כי גישה זו דורשת תקופות גידול ארוכות יותר^ותנאי גדילה מבוקרים. לעומת זאת, מערכות חיידקיות מאפשרות סינתזה מכוונת בתנאים מטבוליים מוגדרים וייצור ביומסה מהיר, מה שהופך אותן למתאימות למחקרים מכניים וליישומים הקשורים ל-NP²². עם זאת, סינתזת חיידקים דורשת לעיתים טיפול אספטי קפדני, תנאי ביוריאקטור מבוקרים, ועיבוד נוסף במעלה הזרם כאשר NPs תוך-תאיים מתאוששים^21,22.

למרות היתרונות שהוזכרו, שיטות סינתזה ירוקה ממשיכות להתמודד עם אתגרים הקשורים לשחזוריות ולסטנדרטיזציה. יתרה מזאת, פרוטוקולים ויזואליים מפורטים שלב אחר שלב לסינתזה ירוקה של NPs מתכתיים נותרו מוגבלים²³, מה שמגביל את יכולת החוקרים לשחזר וליישם בהצלחה מתודולוגיות קיימות. מטרת עבודה זו היא להציג פרוטוקולי סינתזה ירוקה ניתנים לשחזור עבור NPs זהב (Au) וכסף (Ag) באמצעות תמציות צמחים, סינון פטרייתי ותרביות חיידקים. בפרט, תמציות מימיות מ-Psidium guayaquilensis ו-Acanthophora spicifera, סינון פטרייתי חוץ-תאי מ-Earliella sp., ומערכות חיידקיות שכללו את Shewanella oneidensis ו-Cupriavidus metallidurans שימשו לסינתזת NP. הפרוטוקולים המוצגים מדגישים שלבים קריטיים בהכנת תמצית ביולוגית, סינתזת NP ואפיון ראשוני של NP. בנוסף, זרימת העבודה משלבת תכנון ניסויים, נהלי הכנה סטנדרטיים ואפיון פנימי כדי לתמוך בסינתזת NP ביוגנית שניתנת לשחזור ואופטימיזציה.

פרוטוקול

המחקר בוצע בהתאם להנחיות המוסדיות של Escuela Superior Politécnica del Litoral (ESPOL, אקוודור). הביומסה הצמחית, האצות והפטריות ששימשו במחקר זה נאספו מסביבות נגישות ולא כללו מינים מוגנים או אזורים מוגבלים. לפי תקנות מוסדיות ולאומיות, לא נדרשו היתרים ספציפיים לאיסוף ביומסה חופשית בתנאים אלה. עיין באיור 1 עבור תהליך הניסוי המשולב המשמש לסינתזה ירוקה של AgNPs ו-AuNPs באמצעות מערכות ביולוגיות צמחיות, אצות, פטריות וחיידקיות.

איור 1: זרימת עבודה משולבת לסינתזה ירוקה של ננו-חלקיקי כסף (Ag) וזהב (Au) באמצעות מערכות ביולוגיות. סכמטי של תהליך הניסוי לסינתזה ירוקה של AgNPs ו-AuNPs באמצעות מערכות צמחיות, אצות, פטריות וחיידקיות. תהליך העבודה ממחיש את בחירת המקור הביולוגי, הכנת תמציות או ביומסה, תגובה עם קודמים למתכת (AgNO₃ או HAuCl₄), תנאי תגובה ויצירת NP. המערכות הביולוגיות כוללות תמצית עלי Psidium guayaquilensis , תמצית אצות Acanthophora spicifera , סינון חוץ-תאי Earliella sp. ותרביות חיידקים Shewanella oneidensis MR-1. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הערה: יש לעקוב אחרי כל הנחיות הבטיחות במעבדות המוסדיות בעת טיפול בכימיקלים וחומרים ביולוגיים. עיינו בגיליונות מידע בטיחות לכל החומרים לפני השימוש.

1. סינתזה של AgNPs באמצעות עלי P. guayaquilensis

1. אוסף העלים
   1. איסוף עלים טריים של P. guayaquilensis בעונת היובש בגואיאקיל, מחוז גואיאס, אקוודור (2°10′S, 80°0′W).
      הערה: דגימות בעלות הספק של מין אנדמי זה הונחו בהרבריום GUAY, הפקולטה למדעי הטבע, אוניברסיטת גואיאקיל, אקוודור, ובגן הבוטני של ניו יורק (NYBG) בהרבריום סטירה, ניו יורק, ארה"ב. מידע נוסף זמין בכתובת: http://sweetgum.nybg.org/science/vh/specimen-details/?irn=2602207
2. הכנת תמצית עלים
   1. שטפו היטב את החומר הטרי במים מזוקקים.
      הערה: ודאו הסרה מלאה של זיהומים על פני השטח.
   2. ייבשו את העלים במייבש מגשים עם זרימת אוויר מאולצת בטמפרטורה של 40°C.
      הערה: טמפרטורות ייבוש נמוכות ממזערות את התדרדרות התרמולביליות של תרכובות אורגניות המעורבות בהפחתת Ag⁺ .
   3. טחנו את החומר היבש באמצעות טחנה ידנית כדי לקבל אבקה דקה.
   4. השאירו 10 גרם חומר אבקה ב-200 מ"ל מים מזוקקים.
   5. חממו את המתלה בטמפרטורה של 70°C תחת ערבוב רציף במשך שעה.
   6. תן לתמצית להתקרר לטמפרטורת החדר (RT, ~28°C).
   7. סנן את התמצית תחת ואקום באמצעות נייר פילטר איכותי (דרגה 1, גודל נקבובית 11 מיקרון, קוטר 110 מ"מ).
      הערה: הסר את כל השאריות המוצקות מהחומר הצמח.
   8. אחסן את התמצית המסוננת ב-4°C בבקבוקי ענבר עד לשימוש נוסף.
3. ייצור חקלאות צמחית פיטוגנית באמצעות תמציות עלים
   הערה: במהלך ניסויי אופטימיזציה, יש לשנות פרמטר אחד לכל בדיקה תוך שמירה על שאר הפרמטרים קבועים. העריך את ריכוז ניטראט הכסף (AgNO₃) (1–5 מ"מ), שבר התמצית (10%–50% v/v), זמן תגובה (0.5–1 שעה) וטמפרטורה (25°C–80°C). אופטימיזציה של פרמטרי סינתזה באמצעות מתודולוגיית פני התגובה המבוססת על DoE קומפוזיט מרכזי. למד כל גורם בחמש רמות (-α, -1, 0, +1 ו-+α). השתמשו באורך הגל של שיא תהודה של פלזמון פני השטח (SPR) (λ_SPR), אשר מתאם לגודל NP, כמשתנה תגובה²⁴. עיצוב הניסוי כולל 16 נקודות פקטוריאליות, 8 נקודות ציריות ו-5 שכפולים של נקודת מרכז, מה שמוביל ל-29 ניסויים בסך הכול.
   1. הכינו תמיסות AgNO₃ על ידי המסה המתאימה של AgNO₃ במים מזוקקים לקבלת ריכוזים בין 1 ל-5 מ"מ.
      אזהרה: AgNO₃ הוא קורוזיבי וחומר מחמצן חזק שעלול לגרום לגירוי בעור ובעיניים. לבש ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות והגנה לעיניים. הימנעו מחשיפה לאור והשליכו פסולת המכילה חקלאות בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות.
   2. מערבבים את תמיסת AgNO₃ עם תמצית הצמח כדי לקבל שברי תמצית בין 10% ל-50% (v/v).
   3. חממו וערבבו את תערובת התגובה בטמפרטורה הנבחרת (25°C–80°C) למשך זמן התגובה הרצוי (0.5–1 שעה).
   4. תן לתערובת התגובה לעמוד ב-RT למשך 24 שעות.
   5. צנטריפוגה את תערובת התגובה החומה ב-1660 × גרם למשך 15 דקות ב-RT. זרקו את הסופרנטנט ואספו את השבר המוצק.
   6. ייבשו את ה-NPs שהוחזרו בתנור בטמפרטורה של 60°C.

2. סינתזה של AgNPs באמצעות תמציות אצות A. spicifera

1. אוסף האצות
   1. איסוף אצות A. spicifera בוולדיביה, מחוז סנטה אלנה, אקוודור (1°57′23.91′′S, 80°43′51.33′′W).
2. הכנת תמצית אצות
   1. הכינו את תמצית האצות על ידי ביצוע ההליך המתואר בשלב 1.2. החליפו את עלי הצמח בביומסה של אצות A. spicifera .
3. ייצור AgNPs פיקוגניים באמצעות תמציות אצות
   הערה: בצע סדרה של 12 ניסויים על ידי שינוי פרמטר אחד בכל פעם תוך שמירה על שאר הפרמטרים קבועים. הערך ריכוז AgNO₃ (1–5 מ"מ), שבר התמצית (5%–25% v/v), זמן תגובה (1–4 שעות) וטמפרטורה (25°C–70°C).
   1. הכינו את תמיסות AgNO₃ ותמצית אצות כפי שמתואר בשלבים 1.3.1 ו-2.2.
   2. מערבבים את תמיסת AgNO₃ עם תמצית האצה כדי לקבל שבר תמצית של 5%–25% (v/v). חממו וערבבו את תערובת התגובה בטמפרטורה שנבחרה (25°C–70°C) למשך זמן התגובה הרצוי (1–4 שעות).
   3. תן לפתרון להתקרר ל-RT למשך 24 שעות. אספו את השבר המוצק לאחר הצנטריפוגה וייבשו אותו בתנור כפי שמתואר בשלבים 1.3.5 ו-1.3.6.

3. סינתזה של AgNPs באמצעות Earliella sp.

1. איסוף ותחזוקת התרבות
   1. העבר שברי מיצילים גדלים פעילים של Earliella sp. לצלחות אגר דקסטרוז תפוחי אדמה.
      הערה: הזן הפטרייתי ששימש במחקר זה בודד מדגימות סביבתיות שנאספו בקמפוס של ESPOL, אקוודור. הבידוד זוהה טקסונומית על בסיס מאפיינים מורפולוגיים ונשמר באוסף התרביות של מרכז המחקר הביוטכנולוגי של אקוודור (CIBE, ESPOL) תחת הקוד הפנימי E2. מכיוון שזן זה נשמר באוסף מוסדי ולא הופקד במאגר בינלאומי, אין RRID או מספר הרשמה חיצוני זמין.
   2. דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 28°C למשך 48 שעות.
   3. העבר חתיכת מיציליאל למרק דקסטרוז תפוחי אדמה ודגר את התרבית תחת ערבוב מתמיד במהירות 150 סל"ד במשך 5 ימים.
      הערה: שלב זה מקדם ייצור ביומסה והפרשה של מטבוליטים חוץ-תאיים.
   4. סיננו את התרבית הפטרייתית באמצעות נייר סינון סטרילי כדי להפריד את הביומסה המיצליאלית מהמרק החוץ-תאי. אסוף את הסינון לסינתזה של NP לאחר מכן.
      הערה: המרק החוץ-תאי מכיל מולקולות ביולוגיות המשמשות כסוכנים מפחיתים ומייצבים במהלך סינתזת AgNP.
2. ייצור חקלאי ניקוגניים
   הערה: יצירת 14 תנאים ניסיוניים על ידי שינוי פרמטר אחד לכל בדיקה תוך שמירה על יחסי נפח קבועים בין המרק הפטרייתי לתמיסת AgNO₃ . הערך ריכוז AgNO₃ (1–10 מ"מ), pH (4–10 מותאם באמצעות HCl או NaOH), זמן תגובה (1–4 שעות) וטמפרטורה (25°C–70°C).
   אזהרה: חומצה כלורית (HCl) ונתרן הידרוקסיד (NaOH) הם קורוזיביים מאוד. לבש ציוד מגן אישי מתאים ולבצע התאמות pH באיטיות תחת ערבוב מתמשך כדי למנוע התזות והתחממות מקומית. השתמשו בתמיסות חומצה או בסיס של 1 M במהלך התאמת ה-pH.
   1. מערבבים את המרק החוץ-תאי הפטרייתי עם תמיסת AgNO₃ בריכוז הרצוי (1–10 מ"מ) באמצעות יחס נפח בין 2.5% ל-10% (v/v) כדי לקבל נפח תגובה סופי של 50 מ"ל. כוון את נפח התגובה הסופי בהתאם לתנאי הניסוי הנבדק.
   2. ערבבו את תערובת התגובה בטמפרטורה שנבחרה (25°C–70°C) לזמן התגובה הרצוי (1–4 שעות). תן לפתרון להתקרר ל-RT למשך 24 שעות. אספו את השבר המוצק לאחר הצנטריפוגה וייבשו אותו בתנור כפי שמתואר בשלבים 1.3.5 ו-1.3.6.

4. סינתזה של AuNPs באמצעות C. metallidurans ו-S. oneidensis

1. איסוף ותחזוקת התרבות
   1. מלאי תאים קפואים משומרים ב-20% גליצרול בטמפרטורה של −80°C של C. metallidurans CH34 או S. oneidensis MR-1 על לוחות אגר סויה טריפטיים בתנאים אירוביים. דגרו את הלוחות ב-28°C למשך 24 שעות.
   2. בחרו מושבה בודדת מכל צלחת והחריקו אותה ב-250 מ"ל מרק סויה טריפטי בתנאים אירוביים. דגרו את התרבית ב-28°C בשייקר סיבובי הפועל ב-120 סל"ד.
   3. קצרו את התאים בשלב הנייח לאחר 72 שעות של דגירה, כאשר צפיפות האופט ב-610 ננומטר (OD₆₁₀) מגיעה לכ-1. צנטריפוגה את התרביות ב-10000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה ~20°C.
   4. שטפו את הכדורים שנאספו פעמיים עם תמיסת NaCl סטרילית של 0.9% (עם v/v). רכז את התאים השטופים לערך OD₆₁₀ של כ-7.
   5. יצירת מלאי תאים מרוכזים אנוקסיים על ידי דה-גזים מהמתלים ומילוי המרחב הראשי בגז_N2 .
2. ייצור AuNPs בקטריוגניים
   הערה: השתמש במטריצה חלקית-פקטורית להערכת השפעת הגורמים הסביבתיים על סינתזת AuNP²⁵. בנו את המטריצה באמצעות 7 גורמים בשתי רמות שנבחרו לפי מחקרים קודמים^26,27. סדר את הניסויים במטריצה אורתוגונלית ואקראי את סדר הניסוי כדי למזער הטיית שילוב ניסוי. סדר הניסוי המתקבל מוצג ב- טבלה 1.
   1. המיס טריהידרט כלוריד זהב (HAuCl₄) במים דה-יוניים להכנת תמיסת מלאי ב-5 גרם L⁻¹.
      זהירות: HAuCl₄ הוא רעיל וסוכן מחמצן חזק. לטפל בכל התמיסות בתוך מכסה אדים כימי מוסמך תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים, כולל חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי בטיחות. הימנעו ממגע עם חומרים אורגניים והשלכו פסולת בהתאם לפרוטוקולי פסולת מסוכנת מוסדית.
   2. הכינו את הכורים הניסיוניים על ידי דילול תמיסת המאגר לריכוז היעד בתמיסת NaCl של 0.9% (w/v) והתאמת ה-pH בהתאם לתנאי הניסוי המפורטים בטבלה 1.
   3. שפכו 50 מ"ל מתמיסת המתכת המוכנה לבקבוקי סרום נקיים בנפח 120 מ"ל. סגור מיד כל בקבוק עם פקק גומי בוטיל.
   4. אבטח את הפקק באמצעות אטם אלומיניום ומכשיר קרימפ ידני. סטריליזציה של בקבוקי הסרום האטומים על ידי אוטוקלאב בטמפרטורה של 121°C למשך 21 דקות.
   5. תן לבקבוקים להתקרר כדי להצליח ולבדוק כל בקבוק למשקעים בצורה ויזואלית.
      הערה: השליכו בקבוקים שמראים משקעים נראים והכינו כורים חלופיים.
   6. הקמת תנאי אנוקסיה
      1. חבר כל בקבוק סרום מעוקר למערכת סעפת גז המצוידת במקור חנקן טהור גבוה (_N2) ומשאבת ואקום.
      2. יצירת מרחב ראש אנוקסי על ידי ביצוע 21 מחזורי ניקוי רצופים לכל כור שדורש תנאי אנוקסיקן לפי טבלה 1. במהלך כל מחזור, יש להפעיל ואקום ואחריו מילוי חנקן למשך כ-30 שניות עד שהלחץ הפנימי חוזר ללחץ אטמוספרי בקירוב (~1 אטמוספירה).
         הערה: אין צורך באימות ישיר של מצבים אנוקסיים; עם זאת, ניתוח גזים במרחב ראש, כגון כרומטוגרפיית גז, עשוי לשמש לאישור הסרת חמצן בעת הצורך.
         אזהרה: גז חנקן עלול להזיז חמצן וליצור סכנת חנק במקומות סגורים. ודאו אוורור מספק במעבדה ווודאו חיבורי גז בטוחים לפני השימוש.
      3. שמרו על הכורים תחת לחץ_N2 חיובי קל לאחר מחזור הטיהור הסופי.
      4. יש לסמן את הכורים מ-1–8 לפי סדר הניסוי. לדוגמה, יש לסמן את תנאי הניסוי החמישי כ-R5.
   7. הוספת תורמי אלקטרונים והחיסון
      1. הזרקו את נפח הנוזל הסטרילי של תמיסת תורם אלקטרונים אנוקסית סטרילית, כגון נתרן לקטט, לשלב הנוזלי של הכורים המיועדים לפי טבלה 1 באמצעות מזרק ומחט סטרילית.
      2. הזרקת נפח האלקטרונים הנדרש של תורם האלקטרונים הגזי, כגון_H2, למרחב הראש המיועד של הכור באמצעות מזרק אטום לגז.
      3. חיסון כל הכורים הביוטיים על ידי הזרקה אספטית של נפח תרבית מיקרוביאלית מרוכז אנוקסיק לשלב הנוזלי.
         הערה: יש לאחסן תרביות מרוכזות בטמפרטורה של 4°C לפני החיסון כדי לשמור על חיוניות התאים.
   8. הקמת ניסויי בקרה
      1. הכינו בקרה א-ביוטית על ידי ביצוע כל השלבים המתוארים בשלב 4.2, תוך החלפת החיסון המיקרוביאלי בנפח שווה של מדיום או בופר סטרילי של תרבית אנוקסית.
      2. הכינו בקרה של תאים נהרגים על ידי ביצוע כל השלבים המתוארים בשלב 4.2 באמצעות אינקולום שעובר סטריליזציה על ידי אוטוקלבינג.
         הערה: השתמש בבקרות כדי להתחשב בהפחתת מתכות א-ביוטיות ובספיגת ביולוגית. הכינו את בקרת התאים שהושמדו על ידי אוטוקלב מלאי תאים ברי קיימא בטמפרטורה של 121°C למשך 21 דקות להערכת תרומת המנגנונים המיקרוביאליים הפעילים.
   9. דגירה וזמן תגובה
      1. שים את כל בקבוקי הסרום באינקובטורים מבוקרי טמפרטורה.
      2. כוונן את טמפרטורת הדגירה בהתאם לתנאי הניסוי המפורטים בטבלה 1.
      3. המקם את הדגמים על פלטפורמות שייקר סיבובי ודגר את הכורים במהירות של 120 סל"ד.
      4. תן לתגובות להימשך 72 שעות.
         הערה: עצרו את הניסוי לאחר הדגירה ואחסנו את בקבוקי הסרום בטמפרטורה של 4°C עד לעיבוד הדגימה.
         הערה: באופן אופציונלי, יש לכמת את שארית המתכת המומסת לאחר ביוסינתזה של NP באמצעות ספקטרוסקופיית פליטה אופטית פלזמה מקושרת אינדוקטיבית כדי להעריך את יעילות הסרת המתכות ולהבחין בין היווצרות NP לבין מינים מומסים שאריות.
3. שכפול של תנאים אופטימליים
   1. זהה את מצב הכור הקשור להסרת המתכת המקסימלית לאחר סינון ראשוני וניתוח נתונים.
   2. שכפל את המצב האופטימלי שנבחר בשלושה בקבוקי כור עצמאיים כדי לאשר שחזוריות.
   3. בצע את ההכנה, הקמת הכור ונהלי הדגירה לניסויי האימות המשולשים בהתאם לשלבים 4.1 ו-4.2.
      הערה: לאחר סיום הניסויים, יש לאחסן ולסומן זמנית את כל התמיסות המומסות כפסולת מימית עד להשלכה על ידי חברות ניהול פסולת מוסמכות בהתאם לקוד האורגני הלאומי לסביבה ולהנחיות טכניות מוסדיות.

כור / חיידקים	טמפרטורה (°C)	אטמואלה	תורם אלקטרונים	צפיפות אופטית (OD610)	pH	[זהב] (mM)
1 / CMC	37	N2	H2	0.5	1	2
2 / CMC	28	N2	C3H5O3−	1	1	0.2
3 / SOM	37	O2	C3H5O3−	0.5	1	0.2
4 / CMC	28	O2	H2	1	1	2
5 / SOM	37	N2	H2	1	5	0.2
6 / CMC	37	O2	C3H5O3−	1	5	2
7 / SOM	28	N2	C3H5O3−	0.5	5	2
8 / CMC	28	O2	H2	0.5	5	0.2

טבלה 1: עיצוב ניסויי פקטוריאלי חלקי המשמש לסינתזת AuNP בקטריוגנית. טבלה זו מסכמת את תנאי הניסוי שהוערכו לסינתזת AuNP באמצעות S. oneidensis MR-1 (SOM) או C. metallidurans CH34 (CMC). המשתנים כללו טמפרטורת דגירה, אטמוספירה במרחב ראש, תורם אלקטרונים, צפיפות אופטית של אינוקולום (OD₆₁₀), pH תמיסה, וריכוז ראשוני של Au³⁺ .

5. אפיון של AgNPs ו-AuNPs

הערה: השתמש בספקטרוסקופיה אולטרה-סגולה-נראית (UV–Vis) כשיטה נגישה לאישור היווצרות NP באמצעות תהודה של פלזמון פני השטח. השתמש במיקרוסקופיה אלקטרונית הולכה (TEM) להערכת מורפולוגיית וגודל NP ישירות. ניתן לבצע אפיון פיזיקוכימי נוסף באמצעות טכניקות משלימות כגון פיזור אור דינמי (DLS), דיפרקציית קרני רנטגן (XRD), ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום טרנספורמציה פורייה (FTIR) וספקטרוסקופיית קרני רנטגן מפוזרת אנרגיה (EDS) להערכת התפלגות הגודל, הגבישיות, כימיה של פני השטח והרכב היסודות כאשר נדרשת אפיון מקיף יותר^28,29.

1. ספקטרוסקופיית UV–Vis
   1. הגדרת כלי נגינה
      1. הפעל את ספקטרופוטומטר ה-UV–Vis ואפשר למכשיר להתחמם לפחות 15 דקות כדי להבטיח יציבות אות.
      2. בחר מצב סריקה ספקטרלית והגדר את טווח אורכי הגל בין 300 ל-800 ננומטר באמצעות מרווח נתונים של 1 ננומטר.
2. הכנת דוגמאות
   1. אסוף אליקווטים של מתלים חדשים של AgNP או AuNP. דיללו את הדגימות במים מזוקקים בעת הצורך כדי לשמור על ערכי הספיגה בטווח הזיהוי הליניארי.
3. מדידת UV–Vis של NPs
   1. בצע תיקון בסיס באמצעות מים מזוקקים כתמיסה ריקה.
   2. העבר את הדגימה המוכנה לקובט, הנח את הקובטה במחזיק הדגימה, ותיעד את ספקטרום ה-UV–Vis בטווח של 300–800 ננומטר.
   3. זהה את רצועת ה-SPR המתאימה להיווצרות NP.
      הערה: AgNPs בדרך כלל מציגים תחומי SPR בין 405 ל-425 ננומטר, בעוד ש-AuNPs מציגים בדרך כלל תחומי SPR בין 520 ל-550 ננומטר.
4. מיקרוסקופיית אלקטרונים במעבר
   הערה: נתח את המורפולוגיה והגודל של NP באמצעות TEM המופעל ב-80 קילו-וולט ומצויד במצלמה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה.
   1. העבר 1.5 מ"ל של מתלים NP לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה ב-5000 × גרם למשך 5 דקות ב-RT.
   2. השליכו את הסופרנטנט ושמרו את הכדור.
   3. הוסף 1 מ"ל תמיסת קיבוע המכילה 4% פאראפורמלדהיד ו-5% גלוטראלדהיד שהוכן בבופר קקודילט של 0.1 מטר לכדור. דגור את הדגימה במשך 25 שעות ב-RT. לאחר מכן, שטפו את הכדור למשך הלילה עם בופר קקודילאט נתרן של 0.1 מיליון.
   4. צנטריפוגה את הדגימה ב-5000 × גרם למשך 5 דקות וזרוק את הסופרנטנט.
   5. הוסיפו 1 מ״ל של טטרוקסיד אוסמיום (OsO₄) של 1% (w/v) שהוכן בבופר קקודילט נתרן של 0.1 מ' לקיבוע למשך 3 שעות.
      אזהרה: OsO₄ הוא רעיל ובלתי יציב מאוד. לטפל בכל התמיסות אך ורק בתוך מכסה אדים כימי מוסמך תוך כדי לבישת ציוד מגן אישי מתאים, כולל חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי מגן.
   6. צנטריפוגה את הדגימה ב-5000 × גרם למשך 5 דקות וזרוק את הסופרנטנט.
   7. ייבשו את הדגימה באמצעות סדרת אתנול מדורגת. מוסיפים 50% אתנול, דגרו 15 דקות. חזור על ההליך ברצף עם 70% ו-90%. התייבשות מלאה עם שלוש דגירות רצופות באתנול אבסולוטי למשך 30 דקות בכל דגירה.
   8. הטמיעו את הפלט בשרף אפוקסי ב-RT לפי הוראות היצרן.
   9. הכינו חתכים חצי-דקים (~1 מיקרון) וצבעו את החתכים בכחול טולואידין לתצפית ראשונית.
   10. חתוך חתכים דקים במיוחד (~60 ננומטר) באמצעות סכין יהלום וצבוע את החלקים באצטט אורניל ואחריו בציטרט עופרת.
   11. התקן את המקטעים על רשתות TEM וטען אותם למיקרוסקופ אלקטרוני ההעברה.
   12. רכוש תמונות TEM להערכת מורפולוגיית NP וגודלה.

תוצאות

ה-AgNPs סונתזו בהצלחה בדרכים ירוקות וביוסינתטיות באמצעות סוכנים ביולוגיים מפחיתים שונים, וזוהו תנאי סינתזה אידיאליים לכל שיטה. בסינתזה הירוקה שתיווך תמצית עלי P. guayaquilensis , התנאים האופטימליים כללו ריכוז AgNO₃ של 5 מ"מ, יחס תמצית לתמיסת מתכת של 25% (v/v), טמפרטורת תגובה של 80°C, וזמן ערבוב של 60 דקות ואחריו תקופת מנוחה של 24 שעות. בתנאים אלו, ספקטרוסקופיית UV–Vis הראתה רצועת SPR מוגדרת היטב שמרכזה בין 416 ל-425 ננומטר, מה שמעיד על יצירת NP מוצלחת ופיזור קולואידי ...

דיון

בהשוואה בין מסלולי הסינתזה שהוערכו מבחינת היתכנות, בקרת גודל NP, עלות תפעולית, שחזוריות ויעילות תהליכים כוללת, סינתזה בתיווך צמחי באמצעות תמצית עלה P. guayaquilensis הראתה את האיזון המועדף ביותר בין שיטות הסינתזה של AgNP שנבדקו. פרוטוקול זה סיפק שליטה משופרת על גודל ה-NP באמצעות אופטימיזציה שיטתית ואפיון מיקרוסקופי ישיר תוך כדי עבודה בתנאים מתונים ללא גידול ביולוגי ממושך. בנוסף, השיטה אפשרה יצירת AgNPs אחידים יחסית בתנאים ניסיוניים ניתנים לשחזור. סינתזה מתווכת אצות באמצעות A...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Absolute ethanol	Merck	E7023	TEM dehydration series
Aluminum crimp seals	Dwk Wheaton	224178-01	For serum bottles
Amber glass bottles	Duran	2180154	Light-protected storage
ATR-FTIR spectrometer	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Spectral range: 300–3600 cm-1
Autoclave	Yamato	SM300	Sterilization at 121 °C
Butyl rubber stoppers	Dwk Kimble	73827-21	Gas-tight sealing
Centrifuge	BIOBASE	BKC-TH20RL	Bench-top centrifuge
Chloroauric acid trihydrate (HAuCl4·3H2O)	Sigma-Aldrich	27988-77-8	Gold precursor
Diamond knife	Aurion	Dyatom 45	Ultrathin TEM sectioning
Distilled or deionized water	Methrom	N/A	Solution preparation
Epoxy resin (EMBED 812/Epon)	Aurion	EMBED 812	TEM embedding medium
Filter paper, qualitative Grade 1	Merck Whatman	WHA1001110	Pore size: 11 µm; diameter: 110 mm
Fourier transform infrared spectrometer (FTIR)	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Spectral range: 300–3600 cm-1
Gas manifold system	Custom-built	N/A	For purge cycles
Gas-tight syringe	Hamilton	1001 RN	1 mL
Glutaraldehyde	VWR	219859510	5% Glutaraldehyde, 4% paraformaldehyde in 0.1 M Sodium Cacodylate Buffer
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	20% stock preservation
Handheld crimper	Biomed	USYGQ-20Z	Crimp sealing of serum bottles
Hand mill/grinder	Corona	L10000	Plant biomass grinding
Hydrochloric acid (HCl)	Merck	320331	pH adjustment
Hydrogen (H2) gas	Linde	Industrial grade	Electron donor gas
ICP-OES system	Varian	Vista-MPX	Metal quantification
Incubator	Memmert	SM 400	Temperature-controlled incubation
Laboratory oven	Barnstead	M100	Drying nanoparticles
Lead citrate	Merck	7398	TEM staining
Nitric acid (HNO3)	Chem-Lab	CL00.0125	Acid reagent
Nitrogen (N2) gas	Linde	Industrial grade	Anoxic conditions
Osmium tetroxide (OsO4)	Merck	201030	TEM fixation
Paraformaldehyde	VWR	101176-014	5% Glutaraldehyde, 4% paraformaldehyde in 0.1 M Sodium Cacodylate Buffer
Potato Dextrose Agar (PDA)	Merck	110130	Fungal cultivation
Potato Dextrose Broth (PDB)	Merck	P6685	Microbiological medium
Rotary shaker	JoanLab	OS-20Pro	Incubation at controlled agitation
Serum bottles (120 mL)	Wheaton	223748	Borosilicate glass
Silver nitrate (AgNO3)	Sigma-Aldrich	209139	ACS reagent, ≥99.0%
Sodium cacodylate buffer	VWR	11650	5% Glutaraldehyde, 4% paraformaldehyde in 0.1 M Sodium Cacodylate Buffer
Sodium chloride (NaCl)	Carl Roth	3957.1	0.9% washing solution
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	pH adjustment
Sodium lactate	Sigma-Aldrich	L7022	Electron donor/carbon source
Sterile syringes and needles	BD	Various	Sterile liquid handling
Stirring hot plate	Biologix	01-310X	Heating and agitation
Toluidine blue	EMS	DcU-10	Semi-thin section staining
Transmission electron microscope (TEM)	FEI	Tecnai Spirit Twin G20	Equipped with high-resolution digital camera
Tray dryer with forced airflow	Handmade	N/A	Biomass drying at 40 °C
Tryptic Soy Agar (TSA)	Oxoid	CM01301	Microbiological medium
Tryptic Soy Broth (TSB)	Carl Roth	X938.1	Microbiological medium
Uranyl acetate	Sigma-Aldrich	94260 Fluka	TEM staining
UV–Vis spectrophotometer	Thermo Scientific	Genesys 10S	UV–Vis spectral analysis
Vacuum pump	KNF or equivalent	N 820 G	For anoxic conditions
Biological Materials
Biological Material	Source	Identifier	Comments/Description
Acanthophora spicifera	Local collection	N/A	Marine algal biomass
Cupriavidus metallidurans CH34	SCK-CEN	LMG 1195	Bacterial strain
Earliella scabrosa	CIBE-ESPOL	E2	Institutional fungal collection
Psidium guayaquilensis	Local collection	N/A	Wild plant biomass
Shewanella oneidensis MR-1	BCCM/LMG	LMG 19005	Culture collection strain