מחקר רטרוספקטיבי זה מציג תהליך שחזורי לאיסוף דם מוקדם לאחר האשפוז, מדידת ציטוקינים בסרום וקולטני Toll-like, גנוטיפינג של פולימורפיזמים גנטיים דלקתיים, והערכת סיכון לזיהום אצל מטופלים עם דימום תוך-מוחי ספונטני.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר מחקר
מחקר רטרוספקטיבי זה מציג תהליך שחזורי לאיסוף דם מוקדם לאחר האשפוז, מדידת ציטוקינים בסרום וקולטני Toll-like, גנוטיפינג של פולימורפיזמים גנטיים דלקתיים, והערכת סיכון לזיהום אצל מטופלים עם דימום תוך-מוחי ספונטני.
זיהום ריאתי נוזוקומיאלי הוא סיבוך שכיח לאחר דימום תוך-מוחי ספונטני, ועלול להחמיר את ההתאוששות הנוירולוגית, להאריך את האשפוז ולהגביר את העומס הקליני. מחקר קליני-מעבדה רטרוספקטיבי זה מציג תהליך עבודה שניתן לשחזור עליו להערכת פרופילים ביולוגיים דלקתיים של סמן דלקתי ופרופילים גנטיים חיסוניים של המארח הקשורים לזיהום ריאתי נוזוקומיאלי לאחר דימום תוך-מוחי ספונטני ראשוני. המטופלים מסווגים לפי האם מתרחש זיהום ריאתי נוזוקומיאלי לאחר האשפוז. דם ורידי היקפי נאסף בתקופה המוקדמת שלאחר האשפוז בתנאים טרום-אנליטיים סטנדרטיים. הסרום מופרד, מופרד ומאוחסן למדידת בדיקות אימונוסורבנט הקשורות לאנזימים של IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α, TLR2, TLR4 ו-TLR9. במקביל, DNA גנומי מופק מדם מלא שנוגד קרישה ומשמש לגנוטיפינג פולימורפיזם אורך קטעים של תגובת שרשרת פולימראז של לוקוסים נבחרים הקשורים לקולטני ציטוקין וקולטנים דמויי טול. תהליך העבודה כולל גם נהלי בקרת איכות לטיפול בדגימות, מדידות ELISA כפולות, הערכת טוהר DNA, קריאת גנוטיפ וגנוטיפינג חוזר. ניתוח סטטיסטי כולל השוואה בין קבוצות של מאפיינים קליניים ורמות סמן ביולוגי, בדיקות שיווי משקל הארדי-ויינברג, ניתוח רגרסיה לוגיסטית לקשרי גנוטיפ ואללים, התאמה למשתנים קליניים רלוונטיים, ותיקון קצב גילוי שגוי להשוואות גנטיות מרובות. שילוב זה של תהליך קליני, דלקתי וחיסוני-גנטי עשוי לסייע באפיון פרופילי סיכון לזיהום לאחר דימום תוך-מוחי ספונטני, אם כי עדיין נדרש אימות רב-מרכזי פרוספקטיבי לפני יישום קליני שגרתי.
דימום תוך-מוחי ספונטני (ICH) הוא תת-סוג חמור של שבץ הנגרם מקרע לא טראומטי של כלי הדם המוחיים, ונותר מקור מרכזי למוות נוירולוגי ולנכות. קלינית, ICH מסווג בדרך כלל כראשוני או משני. ICH ראשוני אחראי לרוב המקרים וקשור בעיקר ליתר לחץ דם לארטריופתיה או לאנגיופתיה עמילואידית מוחית1. לעומת זאת, ICH משני קשור לגורמים מבניים או המטולוגיים, כולל מפרצות, מומים עורקיים-ורידיים, מחלת מויאמויה והפרעות קרישה. למרות ש-ICH מהווה חלק קטן יותר מכל אירועי השבץ מאשר שבץ איסכמי, הוא נושא תמותה קצרה טווח גבוהה באופן לא פרופורציונלי ועומס תפקודי ארוך טווח 2,3,4,5.
מבין הסיבוכים המרכזיים בבית החולים לאחר ICH, זיהום ריאתי נוזוקומיאלי הוא שכיח במיוחד ובעל השפעה קלינית. מחקרים קודמים הראו כי זיהום ריאתי יכול להתרחש באחוז משמעותי מהמטופלים המאושפזים לאחר שבץ מוחי או דימום תוך-מוחי, והוא קשור לאשפוז ארוך יותר, עומס רפואי גבוה יותר, החלמה נוירולוגית גרועה יותר ותמותה מוגברת 6,7,8. החשיבות הקלינית של הסיבוך הזה חורגת מעבר לניהול נשימתי בלבד. ירידה בהכרה, פגיעה ברפלקסים של בליעה ושיעול, קיבוע תנועה, תמיכה מכנית בדרכי האוויר והליכים פולשניים של ניקוז עשויים כולם להעלות את הסיכון לזיהום בשלב האקוטי לאחר ICH. במקביל, זיהום ריאתי עלול להחמיר עוד יותר דלקת מערכתית, לפגוע באספקת חמצן ולסבך את הטיפול הנוירוקריטי, ובכך להגביר תהליכי פגיעה משניים.
קשר זה סביר ביולוגית משום ש-ICH הוא לא רק אירוע מוקד במוח אלא גם גורם לדיסרגולציה חיסונית מערכתית. דימום מוחי אקוטי יכול להפעיל מפלים דלקתיים, לשנות את האיתות החיסוני המולד ולשבש את האיזון בין דלקת עצבית להגנת המארח ההיקפי. בהקשר זה, חלק מהמטופלים עלולים להיות רגישים יותר לזיהומים שנרכשו בבית החולים גם תחת ניהול קליני דומה. לכן, זיהום ריאתי לאחר ICH לא צריך להיחשב רק כתוצאה מחשיפה למיטה או טיפול תומך; הוא עשוי גם לשקף הבדלים בהפעלה דלקתית של המארח ובתגובה החיסונית.
למרות הרלוונטיות הקלינית של סיבוך זה, גישות מעשיות לשיבוש סיכון מוקדם נשארות מוגבלות9. גישות סיכון קליניות קיימות לזיהומים ריאתיים לאחר ICH מסתמכות בדרך כלל על משתנים הקשורים למטופל ולאשפוז, כגון חומרה נוירולוגית, גיל, פגיעה בבליעה, מחלות נלוות, פרוצדורות פולשניות ואורך החשיפה למכשיר. כלים אלו שימושיים קלינית משום שניתן ליישם אותם במהירות בסביבות חירום, טיפול נמרץ או טיפול נוירוקריטי. עם זאת, משתנים קליניים לבדם עשויים שלא להסביר במלואם מדוע מטופלים עם חומרה נוירולוגית דומה וחשיפה לטיפול דומה מראים תוצאות זיהום שונות. סמנים דלקתיים וגורמים גנטיים חיסוניים של המאכסן עשויים לספק מידע נוסף על רגישות ביולוגית, במיוחד בתקופה המוקדמת לאחר האשפוז, כאשר מתקבלות החלטות על ניטור מונע וניהול נשימה.
ציטוקינים הם מתווכים מרכזיים לתגובות חיסוניות ודלקתיות, ומסלולי קולטן דמויי טול (TLR) ממלאים תפקידים מרכזיים בזיהוי פתוגנים ובהפעלה חיסונית מולדת. מדידות של ציטוקינים בסרום וחלבון TLR יכולות לספק תמונת מצב של הפעלה דלקתית מערכתית מוקדמת, בעוד שפולימורפיזמים נבחרים של גנים חיסונים עשויים לשקף הבדלים יציבים יותר במארח בייצור ציטוקינים, איתות קולטנים או ויסות דלקתי. בהשוואה להערכה קלינית בלבד, שילוב של סמן ביולוגי ופולימורפיזם יכול ללכוד הן את מצב הדלקת הנוכחי והן את התגובה החיסונית הבסיסית של כל מטופל. גישה זו אינה נועדת להחליף את ההערכה הקלינית ליד המיטה, אלא להשלים אותה על ידי הוספת מידע גנטי מעבדה ומארח שעשוי לסייע בזיהוי מטופלים שדורשים מעקב הדבקה קרוב יותר לאחר ICH ספונטני.
על בסיס זה, השענו כי חולים עם ICH ספונטני שמפתחים זיהום ריאתי נוסוקומיאלי יפגינו פרופיל דלקתי מובחן יחד עם התפלגות שונה של פולימורפיזמים גנטיים נבחרים הקשורים למערכת החיסון, לעומת מטופלים שנותרו חופשיים מזיהום. כדי לבדוק השערה זו, המחקר הקליני-מעבדה הרטרוספקטיבי הנוכחי ניתח ציטוקינים בסרום מוקדם לאחר האשפוז, רמות חלבוני TLR2, TLR4 ו-TLR9 בסרום ונבחר פולימורפיזמים גנטיים דלקתיים בחולים עם ICH ספונטני ראשוני. תהליך העבודה עושה שימוש בדם היקפי שנאסף במהלך אשפוז חריף, כימות חלבונים מבוסס ELISA, גנוטיפינג מבוסס PCR-RFLP, והשוואה סטטיסטית בין מטופלים עם וללא זיהום ריאתי נוזוקומיאלי. המטרה הייתה לספק מסגרת שחזורית לאפיון פרופילים דלקתיים וגנטיים של מארח הקשורים לסיכון לזיהומים, ובכך לתמוך בזיהוי מוקדם יותר של חולים בסיכון גבוה בסביבת אשפוז אקוטי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים המסונף של אוניברסיטת ג'יאשינג, בית החולים הראשון של ג'יאשינג, ג'יאשינג, ג'ג'יאנג, סין (אישור מס' 2025-LP-599). כל ההליכים הכוללים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם לדרישות המוסדיות ולעקרונות הצהרת הלסינקי. הסכמה מדעת בכתב לאיסוף דם ולשימוש בנתונים התקבלה מכל המשתתפים ו/או נציגיהם המורשים חוקית לפני איסוף הדגימות.
כל הערכות המסחריות, המגבים, הצרכנים, המכשירים, התוכנה, היצרנים, מספרי הקטלוג ומפרטי הפעולה המרכזיים המשמשים בזרימת עבודה זו מופיעים בטבלת החומרים.
היקף המחקר, זכאות וקבוצות מטופלים
מחקר זה נערך כניתוח קוהורט קליני-מעבדה רטרואקטיבי במרכז יחיד של מטופלים עם דימום תוך-מוחי ספונטני ראשוני (ICH) שאושפזו במרכז חירום וטיפול נמרץ או ביחידת טיפול נמרץ בבית החולים המשויך של אוניברסיטת ג'יאשינג, בית החולים הראשון של ג'יאשינג, ג'יאקסינג, ג'ג'יאנג, סין, בין מאי 2019 לספטמבר 2024. האבחנה של ICH אושרה באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת גולגולתית או הדמיית תהודה מגנטית בהתאם להנחיות הסיניות לאבחון וטיפול בדימום מוחי (2019)10.
המטופלים היו זכאים אם היו להם ICH ספונטני ראשוני שאושר על ידי הדמיה, אושפזו תוך 3 ימים מהופעת התסמינים, והיו להם משתנים קליניים מרכזיים מלאים, יחד עם דגימות דם היקפיות זמינות למדידת סמנים דלקתיים וניתוח גנטי. מטופלים הוצאו מהמצב אם היו להם דימום תוך-גולגולתי טראומטי, ICH משני, זיהום ריאתי שהיה נוכח לפני הקבלה או בתוך 48 שעות לאחר האשפוז, שחרור בניגוד לייעוץ רפואי, או מוות בתוך 48 שעות לאחר האשפוז, היסטוריה של ממאיריות או מחלות אוטואימוניות, או רישומים קליניים, מעבדייתיים או גנוטיפיים מרכזיים לא שלמים. לאחר הסקר, 360 מטופלים עמדו בקריטריוני הזכאות ונכללו בניתוח הסופי. מתוכם, 180 מטופלים פיתחו זיהום ריאתי נוזוקומי במהלך האשפוז, ו-180 חולים לא. המטופלים שובצו לקבוצת זיהום ריאתי או לקבוצת ללא זיהום ריאתי, בהתבסס על השאלה האם התרחש זיהום ריאתי נוזוקומי לאחר האשפוז.
לפני הקבוצה הסופית, נבדקו אבחנה דימותית, זמן אשפוז, זמן זיהום, זמינות דגימות דם ושלמות הרשומות הקליניות והמעבדתיות. שלב זה שימש להפחתת סיווג שגוי ולהבטיח שלכל המקרים הכלולים יהיו נתונים מלאים להשוואה קלינית, מדידת סמנים דלקתיים וגנוטיפינג.
הגדרה של זיהום ריאתי נוזוקומיאלי
זיהום ריאתי נוזוקומיאלי הוגדר על בסיס ראיות רדיולוגיות בשילוב עם קריטריונים קליניים11. אישור רדיולוגי דרש נגע חדש או מתקדם של חדירה, קונסולידטיבית או זכוכית קרקעית ברדיוגרפיית חזה או טומוגרפיה ממוחשבת. בנוסף, לפחות שניים מהקריטריונים הבאים היו חייבים להיות נוכחים: טמפרטורת גוף > 38 מעלות צלזיוס, הפרשות נשימתיות פליליות, או ספירת תאי דם לבנים לא תקינה עם דם לבנים < 4 × 109/ליטר או > 10 × 109/ליטר.
זיהום ריאתי שהיה נוכח לפני הקבלה או אובחן בתוך 48 השעות הראשונות לאחר הקבלה לא סווג כזיהום ריאתי נוזוקומיאלי. סיווג הזיהומים אומת באמצעות דוחות רדיולוגיים, רשומות טמפרטורת גוף, תיעוד של הפרשות נשימתיות, תוצאות ספירת דם היקפית ורשומות אבחון קליניות.
בטיחות ביולוגית וסילוק פסולת
דם אנושי, סרום ו-DNA שמקורו בדם טופלו תחת אמצעי זהירות ביו-בטיחותיים סטנדרטיים ברמה 2. אנשי המעבדה לבשו כפפות, מעילי מעבדה, מסכות ומשקפיים מגנים במהלך טיפול בדם, בדיקת דם, בדיקת ELISA, חילוץ DNA, הכנת PCR, אלקטרופורזה בג'ל, עיכול הגבלה והדמיית UV. צינורות הדם נבדקו לדליפה או שבירה לפני העיבוד. הצנטריפוגה בוצעה באמצעות צינורות עם כיסוי או, במידת האפשרות, דלי צנטריפוגה אטומים.
הגזעים הושלכו מיד למיכלים מאושרים. צינורות מזוהמים בדם, קצות פיפטה, כפפות, לוחות ELISA וחומרים חד-פעמיים נוספים הושלכו כפסולת מעבדה ביולוגית. הפסולת הביולוגית הנוזלית חוטאה בהתאם לנהלים המוסדיים לפני ההשלכה. ג'לי אגרוז, ג'לים פוליאקרילאמיד, מגיבים לצביעה וחומרים הקשורים לאלקטרופורזה הושלכו בהתאם לדרישות הפסולת הכימית והמעבדתית המוסדית.
הכנת תגובת PCR, הוספת תבנית DNA, טיפול מוגבר במוצר, עיכול הגבלה ואלקטרופורזה ג'ל הופרדו ככל האפשר כדי להפחית זיהום. קצות פיפטות עמידות לאירוסולים שימשו לטיפול ב-PCR וב-DNA. הדגשת UV בוצעה רק באמצעות מגן מגן או מערכת תיעוד ג'ל, וחשיפה ישירה לעיניים או לעור לאור UV נמנעה.
איסוף דם היקפי ועיבוד דגימות
כדי להפחית את השונות הטרום-אנליטית, נאספו 10 מ"ל דם ורידי פריפרי בשעה 08:00 בבוקר שלאחר הקבלה, לאחר צום לילה של לפחות 12 שעות. 5 מ"ל דם נלקחו לצינור ואקום פשוט להכנת הסרום, ו-5 מ"ל הנותרים נשאבו לצינור הפאריני לצורך חילוץ DNA גנומי.
לפני העיבוד, כל צינור נבדק לזיהוי המטופל, זמן האיסוף, סוג הצינורה, נפח הדם, דליפה, קרישה נראית לעין וההמוליזה הגסה. דגימות עם סימון שגוי, נפח דם לא מספק, דליפת צינור או קרישה נראית לעין בצינור נוגד הקרישה הוצאו מהניתוח במורד הזרם. הדם בצינור הפשוט הורשה להיקרש בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות, ואז צונטריפוגה ב-1,500 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסופרנטנט של הסרום הועבר לצינורות פוליפרופילן סטריליים עם קשר חלבון נמוך מבלי להפריע לשכבת התא, חולק לשברים של 0.5 מ"ל, ואוחסן בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס עד לניתוח.
דגימות שהראו המוליזה בינונית או חמורה נראית לעין הוצאו מכימות מבוסס ELISA. נרשמו דגימות עם המוליזציה קלה ולא שימשו לניתוח הציטוקינים הראשוני. דגימות עם עכירות נראית לעין, לימפיה ברורה, נפח שאריתי לא מספק או חשיפה חוזרת להקפאה והפשרה סומנו לפני הבדיקה. אף אליקוט סרום לא עבר יותר ממחזור הקפאה והפשרה אחד לפני הניתוח.
כימות ציטוקינים על ידי ELISA
ריכוזי הססם של IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ ו-TNF-α נמדדו באמצעות ערכות ELISA סנדוויץ' אנושיות מסחריות שאומתו לדגימות סרום. אליקווטים בסרום הופסמו, ערבבו בעדינות ונבדקו להמוליזה, עכיפות, ליפימיה, נפח לא מספק והיסטוריית הקפאה והפשרה לפני הטעינה.
דגימות סטנדרטיות, בארות ריקות ודגימות סרום הועמסו בשכפול. עקומות סטנדרטיות נוצרו על כל לוח באמצעות דילול סדרתי של ריכוזים סטנדרטיים ובקרת בקרה ריקה, בהתאם להוראות הערכה. צפיפות אופטית נמדדה ב-450 ננומטר, עם תיקון ייחוס ב-570 ננומטר, באמצעות קורא מיקרופלט מכויל. הריכוזים חושבו באמצעות התאמת עקומה לוגיסטית בת ארבעה פרמטרים.
תוצאות הבדיקה התקבלו רק כאשר העקומה הסטנדרטית הראתה דפוס ריכוז-תגובה מתאים, בארות ריקות הראו רקע נמוך, ומקדם השונות של המדגם הכפול היה ≤ 10%. דגימות עם CV כפול > 10% נבדקו מחדש מהאליקווט המקורי של הסרום כאשר היה נפח מספק זמין. דגימות מחוץ לטווח העקומה הסטנדרטית האמינה דוללו או חזרו על עצמן בהתאם להוראות הערכה. לוחות שהציגו סטנדרטים לא עקביים, רקע מופרז או אפקטים ברורים של קצה חזרו על עצמם.
גבולות הגילוי האנליטי הנמוכים ביותר לקבלת נתונים היו 2.0 pg/mL עבור IL-1β, 1.5pg/mL עבור IL-6, 2.0pg/mL עבור IL-10, 3.0pg/mL עבור IL-17, 4.0pg/mL עבור IFN-γ, ו-2.5pg/mL עבור TNF-α. ערכי הציטוקינים הסופיים נבדקו מול מזהי מדגם, מפות לוחות, רשומות קריאה כפולות והערות איכות מדגם לפני ניתוח סטטיסטי.
כימות הסרום TLR2, TLR4 ו-TLR9 על ידי ELISA
רמות חלבוני TLR2, TLR4 ו-TLR9 בסרום נמדדו באמצעות ערכות ELISA אנושיות מסחריות שאומתו לדגימות סרום. דגימות הסרום הופסמו, מעורבבות בעדינות ונבדקו לפי אותם קריטריונים לאיכות הדגימה שהחלו על מדידת ציטוקינים.
סטנדרטים, בארות ריקות ודגימות סרום נותחו בשכפול. הלוחות נקראו ב-450 ננומטר עם תיקון ייחוס ב-570 ננומטר, והריכוזים חושבו באמצעות רגרסיה לוגיסטית בארבעה פרמטרים. התוצאות התקבלו כאשר העקומה הסטנדרטית הייתה תקפה, בארות ריקות היו בטווח הרקע הצפוי, וה-CV הכפול היה ≤ 10%. דגימות שעברו את סף ה-CV הכפול הזה נבדקו מחדש כאשר נותרו מספיק דגמים.
גבולות הגילוי האנליטי הנמוכים יותר לקבלת התוצאות היו 0.10 ng/mL עבור TLR2, 0.12 ng/mL עבור TLR4, ו-0.15 ng/mL עבור TLR9. ערכי TLR2, TLR4 ו-TLR9 הסופיים נבדקו מול מזהי מדגם, מפות לוח, רשומות קריאה כפולות והערות איכות המדגם לפני ניתוח סטטיסטי.
חילוץ DNA גנומי
DNA גנומי הופק מדם מלא שנוגד בהפריט באמצעות ערכת חילוץ DNA גנומי מבוססת עמודת סיליקה. לפני ההוצאה, נבדקו דגימות דם שנוגדות קרישה לסימון נכון, נפח מספק, קרישה נראית לעין, דליפה ומצב אחסון.
טוהר וריכוז ה-DNA הוערכו באמצעות ספקטרופוטומטריה. רק דגימות עם יחס A260/A280 בין 1.80 ל-2.00 התקבלו להגברת PCR במורד הזרם. דגימות מחוץ לטווח זה נמדדו מחדש לאחר ערבוב עדין. אם יחס הטוהר החריג נמשך, חילוץ ה-DNA חזר על עצמו כאשר נותר מספיק דם מלא.
ה-DNA דולל במים ללא נוקלאז לריכוז עבודה של 50 ng/μL ואוחסן בטמפרטורה של -20°C עד להגברת PCR. לפני הקמת ה-PCR, כל דגימת DNA נבדקה לריכוז, טוהר, מזהה דגימה והיסטוריית הקפאה והפשרה.
גנוטיפינג PCR-RFLP וקריאת גנוטיפ
הגנוטיפינג בוצע באמצעות פולימורפיזם אורך מקטעי תגובת שרשרת והגבלה של פולימראז (PCR-RFLP) עבור IL-1B +3954 C/T, IL-10-1082 G/A, IL-10-819 T/C, TNF-α-308 G/A, TLR2-196 עד 174 אינץ' לדל, TLR4 Asp299Gly, TLR4 Thr399Ile, TLR9 rs187084, IFN-γ +874 A/T, ו-IFN-γ +2108 A/G. רצפי פריימר ספציפיים ללוקוס, גודל אמפליקון צפוי, אנזימי הגבלה ודפוסי עיכול ספציפיים לגנוטיפ מוצגים בטבלה משלימה 1.
הגברת PCR בוצעה בנפח תגובה סופי של 25 מיקרוליטר הכולל 2.5 מיקרוליטר של 10 × בופר, 2.0 מיקרוליטר של תערובת dNTP ב-2.5 מילימטר כל אחד, 1.0 מיקרוליטר של פריימר קדמי ב-10 מיקרומון, 1.0 מיקרוליטר של פריימר הפוך ב-10 מיקרומון, 0.25 מיקרוליטר של פולימראז DNA טאק ב-5 U/μL, 2.0 מיקרוליטר DNA גנומי ב-50 ננוגרם/μL, ו-16.25 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז. תערובת ה-PCR הראשית הוכנה באזור נקי לפני ה-PCR, ותבנית ה-DNA נוספה אחרונה. בקרה שלילית ללא תבנית נכללה בכל הרצת PCR.
הפרופיל התרמי כלל דנאטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואחריה 35 מחזורי דנאטורציה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, אנילינג בטמפרטורה של 58–62 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות בהתאם לזוג הפריימר, והרחבה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, עם הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. מוצרי PCR אושרו תחילה על ג'ל אגרוז 1.5% לפני עיכול הגבלה.
הגברת PCR התקבלה רק כאשר רצועת האמפליקון הצפויה הייתה גלויה, והבקרה ללא תבנית לא הראתה הגברה. תגובות שהראו פסים חלשים, הגברה לא ספציפית, הפרעות פריימר-דימר או זיהום בבקרה השלילית חזרו על עצמן מתבנית ה-DNA המקורית.
מוצרי PCR עוכלו עם אנדונוקלאז ההגבלה המתאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות בנפח עיכול כולל של 15 מיקרוליטר לפי הוראות היצרן. שברים מעוכלים נפתרו על ג'ל אגרוז של 2.5% עבור רוב הלוקוסיים. ה-TLR2-196 עד -174 אינץ' ללוקוס נפתר על ג'ל פוליאקרילאמיד 8% לשיפור ההבחנה בין המקטעים.
עיכול הגבלה התקבל רק כאשר דפוסי המקטעים תואמים את פרופיל העיכול הספציפי לגנוטיפ הצפוי. תגובות הראו עיכול לא שלם, פסים מרוחות, גודל שברים בלתי צפוי או הפרדה לא ברורה חזרו על עצמם. הפסים הוצגו תחת תאורה אולטרה-סגולה לאחר צביעת חומצות גרעין. תמונות ג'ל נשמרו עם מזהה הדגימה, שם המקום, תאריך הרצה ומספר הג'ל.
הקצאת הגנוטיפ בוצעה באופן עצמאי על ידי שני חוקרי מעבדה עיוורים. קריאות גנוטיפ לא תואמות או מעורפלות נבדקו באמצעות תמונת הג'ל המקורית וחזרו על עצמן מהגברת PCR בעת הצורך. עשרה אחוזים מהדגימות שנבחרו באקראי עברו גנוטיפ מחדש לבקרת איכות, ושיעור ההתאמה עמד על 99.2%. נתוני הגנוטיפ הסופיים הוזנו למאגר הניתוח רק לאחר שנבדקו מזהי מדגם, שמות לוקוס, קריאות גנוטיפ ורשומות בקרת איכות.
ניתוח סטטיסטי
ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטית מתאימה. מאגרי הנתונים הקליניים, ELISA והגנוטיפ אוחדו באמצעות קודי מטופלים שלא מזוהו. קודי המטופלים נבדקו לאיתור כפילות, אי-התאמה וערכים חסרים לפני הניתוח. שימשה אסטרטגיית מקרה מלא משום שכל המטופלים הכלולים החזיקו בנתונים קליניים, דלקתיים וגנוטיפיים חשובים זמינים.
בתוכנת ניתוח סטטיסטי מתאימה, מצב זיהום ריאתי קודד כמשתנה הקבוצה, כאשר קבוצת היעדר זיהום ריאתי שימשה כקטגוריית ייחוס. משתנים רציפים נבדקו לראשונה לנורמליות באמצעות מבחן שפירו-וילק. משתנים רציפים בהתפזרות נורמלית הובאו לידי ביטוי כסטיית תקן ממוצעת ± והושוו באמצעות מבחן t של סטודנט במדגמים בלתי תלויים. משתנים רציפים שאינם מתפלגים נורמלית דווחו כחציונים עם טווחי בין-רבעוניים והושוו באמצעות מבחן מאן-וויטני U. משתנים קטגוריים הוצגו כספירות ואחוזים והושוו באמצעות מבחן חי-ריבוע או מבחן פישר המדויק, לפי הצורך.
התפלגות הגנוטיפ בקבוצת ללא זיהום ריאתי הוערכה לשיווי משקל הארדי-ויינברג לפני ניתוח האסוציאציה. תדירויות הגנוטיפ והאללים סוכמו כ-n (%). יחסי סיכויים ורווחי ביטחון של 95% לסיכון לזיהום ריאתי הוערכו באמצעות מודלים רגרסיה לוגיסטית רב-משתנית. סטטוס זיהום ריאתי נרשם כמשתנה התלוי. משתני גנוטיפ, אלל או ביומרקר הוזנו כמשתנים בלתי תלויים, כפי שצוינו בכל ניתוח.
גיל ומין הוכנסו מראש למודל הראשי. BMI, מחלת ריאות חסימתית כרונית, מחלות לב, דליפת נוזל מוח-שדרה, זמן שהייה בניקוז וקטגוריית הקבלה בסולם התרדמת גלאזגו הוזנו בו-זמנית למודל המתואם במלואו משום שמשתנים אלו היו רלוונטיים קלינית או הראו חוסר איזון בסיסי בין הקבוצות. רב-קולינאריות הוערכה באמצעות גורמי אינפלציה של שונות (VIFs), ו-VIFs <5.0 נחשבו מקובלים.
מכיוון שנבדקו פולימורפיזמים מרובים, יושם תיקון קצב גילוי שגוי של בנג'מיני-הוכברג בניתוחי האסוציאציות הגנטיות12. ערכי ה-P מבדיקות האסוציאציה הגנטית דורגו מהקטן ביותר לגדול, ונקבעה מובהקות מתוקנת לפי הליך בנג'מיני-הוכברג. כל המבחנים היו דו-צדדיים, ו-P <0.05 נחשב מובהק סטטיסטית אלא אם צוין אחרת לאחר התאמת השוואות מרובות.
התוצרים הסופיים נבדקו מול מאגר המקור, רשומות בקרת איכות ELISA, רשומות קריאת גנוטיפ וערכי טבלאות לפני הכנת כתב היד. התוצאות פורשו כאסוציאציות ולא כתופעות סיבתיות, משום שהמחקר השתמש בעיצוב תצפיתי רטרוספקטיבי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
אינדיקטורים קליניים
המאפיינים הקליניים הבסיסיים מסוכמים בטבלה 1. בסך הכול נכללו בניתוח הסופי 360 מטופלים עם דימום תוך-מוחי ספונטני, שכללו 180 מטופלים שפיתחו זיהום ריאתי נוזוקומיאלי במהלך האשפוז ו-180 מטופלים שלא. לא היו הבדלים משמעותיים בין הקבוצות בגיל (62.4 שנים ± 6.8 שנים לעומת 63.6 שנים ± 7.0 שנים, P > 0.05), התפלגות מגדרית (142/180, 78.9% לעומת 137/180, 76.1%, P > 0.05), היסטוריית עישון (94/180, 52.2% לע...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דימום תוך-מוחי ספונטני (ICH) נותר אחד מתתי-הסוגים החמורים ביותר של שבץ וממשיך להטיל עומס משמעותי על תמותה מוקדמת ונכות ארוכת טווח13. בפרקטיקה קלינית, מטופלים עם ICH פגיעים במיוחד לסיבוכים בבית החולים, שכן פגיעה נוירולוגית עלולה להחליש את ההגנה על דרכי הנשימה, להפחית את יעילות השיעול, להגביל את הניידות ולהגביר חשיפה לפרוצדורות תומכות פולשניות. מבין הסיבוכים הללו, זיהום ריאתי נוזוקומיאלי חשוב במיוחד משום שהוא עלול להאריך את האשפוז, להגדיל את השימוש במשאבים, ולפגוע ע...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים הקשורים לעבודה זו.
המחברים מודים לצוות הקליני המעורב בטיפול במטופלים ולאנשים שסייעו באיסוף ספרות ובארגון נתונים. מחקר זה נתמך על ידי פרויקט תכנון המדע והטכנולוגיה הבריאותית של עיריית ג'יאשינג (מענק מס' JWKJ-25005).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Human TNF-α ELISA Kit | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | KHC3011 | ערכת ELISA למדידה כמותית של TNF-α אנושי בסרום. |
| Human TLR2 / Toll-like Receptor 2 ELISA Kit | Sigma-Aldrich / Merck | RAB0744-1KT | ערכת ELISA של 96 באר למדידת TLR2 אנושי בדגימות סרום או פלזמה. |
| Human TLR4 ELISA Kit, colorimetric | Novus Biologicals / Bio-Techne | NBP3-11807 | ערכת ELISA סנדוויץ' קולורומטרית למדידת TLR4 אנושי בסרום, פלזמה או נוזלים ביולוגיים אחרים. |
| Human TLR9 ELISA Kit, colorimetric | Novus Biologicals / Bio-Techne | NBP2-76574 | ערכת ELISA קולורומטרית למדידת TLR9 בדגימות סרום. |
| Absorbance microplate reader | Agilent BioTek | 800 TS | קורא מיקרופלט עבור מדידת צפיפות אופטית ELISA ב-450 ננומטר עם תיקון התייחסות ב-570 ננומטר. |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | QIAGEN | 51104 | ערכה מבוססת ממברנת סיליקה למיצוי DNA גנומי מדם שלם מדולל. |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W | ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח UV-Vis למדידת ריכוז DNA והערכת טוהר A260/A280. |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific | A24811 | מחזור תרמי המשמש להגברה ב-PCR בנקודת סיום בגנוטיפציה PCR-RFLP. |
| PCR Master Mix, 2X | Thermo Scientific | K0171 | תערובת PCR מוכנה המכילה פולימראז DNA Taq, dNTPs, MgCl2, ומאגר תגובה; המשמשת להגברה PCR קונבנציונלית. |
| Recombinant Taq DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0401 | מקור אנזים חלופי להגברה PCR לוקוס-ספציפית כאשר משתמשים ברכיבים נפרדים של PCR במקום תערובת מאסטר 2X. |
| Nuclease-free water | Thermo Scientific | R0581 | מים בדרגת איכות ביולוגיה מולקולרית המשמשים להגדרת PCR, דילול DNA ובקרות ללא תבנית. |
| Custom DNA primers | Sangon Biotech | Custom synthesis | פריימרים לוקוס-ספציפיים להגברת PCR-RFLP; רצפי הפריימרים מפורטים בטבלה משלימה S1. |
| Restriction endonucleases for PCR-RFLP | Thermo Scientific / New England Biolabs | אנזימים לוקוס-ספציפיים המפורטים בטבלה משלימה S1 | אנזימי הגבלה המשמשים לעיכול ספציפי לגנוטיפ של תוצרי PCR. האנזים שנבחר עבור כל לוקוס צריך להתאים לתבנית העיכול המפורטת בטבלה משלימה S1. |
| Agarose I, molecular biology grade | Thermo Scientific | 17850 | אגרוז לייצור ג'לים של 1.5% ו-2.5% המשמשים לאישור תוצרי PCR ולפתרון רוב שברי ה-RFLP. |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0371 | סמן גודל DNA לחישוב גודל אמפליקונים PCR ושברי RFLP. |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | S33102 | צבע ג'ל חומצות גרעין לויזואליזציה של DNA בג'לים של אגרוז או אקרילאמיד; משמש כחלופה בעלת סיכון מופחת לאתידיום ברומיד. |
| Horizontal agarose gel electrophoresis system | Bio-Rad | Mini-Sub Cell GT system / 1704360 base | מערכת אלקטרופורזה להפרדה של תוצרי PCR ו-RFLP בג'ל אגרוז. |
| Vertical PAGE electrophoresis system | Bio-Rad | Mini-PROTEAN Tetra Cell / 1658001 | מערכת אלקטרופורזה אנכית להפרדה בג'ל פוליאקרילאמיד של 8% כאשר נדרשת אפליה ברורה של שברים. |
| Gel documentation system with UV or blue-light transillumination | Bio-Rad / מערכת מעבדה מקבילה | Gel Doc XR+ או מקבילה | מערכת הדמיה לתיעוד רצועות DNA צבועות לאחר אלקטרופורזה בג'ל. השתמש במגן UV או במצב אור כחול כאשר קיים. |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf / מרכזית מעבדה מקבילה | 5424 R או מקבילה | מרכזית מקוררת המשמשת להפרדת סרום ב-1,500 × g ו-4 °C. |
| −80 °C ultra-low temperature freezer | Thermo Scientific / מקפיא מעבדה מקביל | Forma 900 Series או מקבילה | אחסון של תמציות סרום לפני ניתוח ELISA. |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 25.0 | תוכנת סטטיסטיקה המשמשת לסטטיסטיקה תיאורית, בדיקת נורמליות, השוואות קבוצתיות, רגרסיה לוגיסטית וייצוא תוצאות מודל. |
| Spreadsheet software | Microsoft | Excel for Microsoft 365 | משמש לבדיקת נתונים, ארגון מפת צלחות, בדיקת ערכים כפולים והכנה של קבצי ניתוח ממוזגים לפני ניתוח SPSS. |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.