מאמר שיטה

פלטפורמת תרביות עצם תלת-ממדית המשתמשת באוסטאוציטים אנושיים ובמטריצה חוץ-תאית מנותקת למידול מחלות שריר-שלד

DOI:

10.3791/70782

⸱

23 ביוני 2026

 ,  ,  ,  , 
1Facultad de Odontología, Universidad San Sebastián, 2Laboratorio de Biotecnología y Biofarmacia, Departamento de Fisiopatología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción, 3Hospital Traumatológico de Concepción, Servicio Salud Concepción

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את ייצור מבני העצם התלת-ממדיים באמצעות אוסטאוציטים אנושיים המוטמעים בהידרוג'לים של ג'לטין מתקרילט (GelMA) בתוספת מטריצה חוץ-תאית מפורקת תאים. השיטה זולה, ניתנת להרחבה ותואמת לציוד מעבדה בסיסי, ומספקת פלטפורמה תרגומית לחקר תהליכי מחלות שריר-שלד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מידול מחלות שריר-שלד כמו אוסטאופורוזיס דורש פלטפורמות חוץ-גופיות המשחזרות במדויק תכונות מרכזיות של ביולוגיית העצם האנושית. מערכות תרביות תלת-ממדיות קונבנציונליות מספקות תובנות חשובות לגבי אינטראקציות תא-תא ומטריצת תא, אך התלות שלהן בחומרים יקרים, ביומדפסות או תשתיות מיוחדות מגבילה את אימוץ הרחב יותר. כאן, אנו מתארים פרוטוקול חזק וחסכוני ליצירת מבני עצם תלת-ממדיים באמצעות אוסטאוציטים שמקורם באדם המוטמעים בהידרוג'לים של GelMA, בתוספת מטריצה חוץ-תאית (dECM) מפורקת תאית שהושגה מראשי ירך שנתרמו. שיטה מבוססת פיפטינג זו מאפשרת ייצור מבנים דמויי עצם שניתן לשחזר בטמפרטורה פיזיולוגית (37 מעלות צלזיוס), באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי.

המבנים המתקבלים שומרים על חיוניות גבוהה ושלמות מבנית, ותומכים ביישומים בהמשך כמו הדמיית אימונופלואורסצנציה ובדיקות מולקולריות. שילוב dECM שמקורו במטופלים משפר את הרלוונטיות התרגומית על ידי שיקוף טוב יותר של עיצוב עצם אנושי והתקדמות המחלה. גישה זו מספקת פלטפורמה נגישה וניתנת להרחבה לבדיקות סמים, רפואה רגנרטיבית ומחקרים מכניים של ביולוגיית העצם. בסך הכול, הפרוטוקול מציע אלטרנטיבה מעשית לטכניקות ביופרינטינג יקרות וניתן להתאים אותו בקלות למקורות dECM ספציפיים לרקמות אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה זו שואפת להקים פלטפורמת תרבית תאים תלת-ממדית חסכונית וניתנת לשחזור למידול מחלות שריר-שלד, כולל אוסטאופורוזיס, על ידי שילוב GelMA עם dECM שמקורו ברקמת עצם אנושית. אסטרטגיה זו מאפשרת יצירת מבנים דמויי עצם המדמים יותר את המיקרו-סביבה הפיזיולוגית מאשר תרביות דו-ממדיות קונבנציונליות, ותומכות בלימוד אינטראקציות תא-תא ומטריצת תא בתנאים ביולוגייםרלוונטיים 1. השימוש באוסטאוציטים שמקורם במטופלים וב-dECM שמקורם קליני מראשי הירך משפר את הערך התרגומי ומספק קשר מעשי בין ניסויים במבחנה לצרכים מחקריים קליניים2.

שיטה זו פותחה כדי להתמודד עם מגבלות מרכזיות של מערכות תרביות תלת-ממדיות וביופבריקציה קיימות, שלרוב דורשות מדפסות ביולוגיות, ביוחומרים קנייניים או מוצרי צריכה יקרים (למשל, Matrigel), מה שמגביל את הנגישות ברביםמ-3,4. יתרה מזאת, הידרוגלים סינתטיים לעיתים קרובות אינם מצליחים לשחזר את המורכבות הביוכימית של מטריצת העצם המינרלית החוץ-תאית או את התנהגות האוסטאוציטים התושבים5. לעומת זאת, פרוטוקול זה משלב dECM שמקורו בעצמות האדם, תוך שמירה על תוכן מינרלי, חלבונים טבעיים ומולקולות איתות, תוך הימנעות מהדרישות התשתיתיות הקשורות לטכנולוגיות ייצור תוספתיות6.

השילוב בין GelMA ל-dECM מספק מספר יתרונות. GelMA תומך בהיצמדות, בחיוניות ובהתמיינות תאית, וניתן לעבד אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מה שמאפשר עטיפת תאים ללא ציוד מיוחד. קישור צולב באמצעות מקורות אולטרה סגול (UV) זולים (365 ננומטר) מעלה עוד יותר את הנגישות7. תוספת dECM מעשירה את המבנה ברמזים ספציפיים לרקמה שאינם קיימים בתחליפים סינתטיים, משפרת את התאימות האוסטוגנית ומקלה על בדיקות בהמשך כמו אימונופלואורסצנציה ופרופיל מולקולרי8.

שיטה זו מתיישבת עם המאמצים הנוכחיים לפתח מודלים רלוונטיים לבני אדם שמפחיתים את התלות במחקרי בעלי חיים, שדיוק התרגום שלהם מוגבל לעיתים קרובות על ידי הבדלים בין-מינים 1,9,10. הפרוטוקול תואם את עקרונות ה-3Rs11, וניתן להתאים אותו ליצירת מבנים באמצעות dECMs ייעודיים לרקמות אחרים, ובכך להרחיב יישומים פוטנציאליים להנדסת סחוס, עור ורקמות לב וכלי דם12.

בסך הכול, טכניקה זו מספקת פלטפורמה נגישה וניתנת להרחבה ללימוד ביולוגיית העצם במצבים פיזיולוגיים רלוונטיים. ההתאמה שלו לתשתיות המעבדה השגרתיות והיכולת שלה לשלב דגימות קליניות אנושיות הופכות אותה למתאימה במיוחד לקבוצות מחקר אקדמיות ובתי חולים. השיטה תומכת לא רק בפלטפורמה למחקרי עצם נוספים של תהליכי עצם, אלא גם יכולה להיות נקודת התחלה ליישומים תרגומיים נוספים ברפואה רגנרטיבית ובפיתוח טיפולי מותאם אישית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה המדעית של שירות הבריאות קונספסיון. רקמת עצם אנושית נאספה מראש עצם הירך שנתרמו על ידי מטופלים שעברו ניתוח להחלפת ירך בבית החולים לטראומטולוגיה בקונספסיון, צ'ילה, לאחר הסכמה כתובה מדעת. הדגימות נשמרו בטמפרטורה של −80°C עד לשימוש. כל ההליכים עמדו בהנחיות מוסדיות לשימוש אתי ברקמות אנושיות במחקר. כל רקמת העצם האנושית נאספה מראש עצם הירך שנתרמו על ידי מטופלים בבית החולים לטראומטולוגיה בקונספסיון, צ'ילה, לאחר הסכמה מדעת ואישור הוועדה המדעית לאתיקה של שירות הבריאות קונספסיון. כל ההליכים עומדים בהנחיות המוסדיות לשימוש ברקמות אנושיות.

1. סינתזת GelMA

  1. המיס 10 גרם ג'לטין מסוג A ב-100 מ"ל של מלח מפוזר בפוספט (PBS, pH 7.5) בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס תחת ערבוב מתמיד.
  2. הורידו את הטמפרטורה ל-50 מעלות צלזיוס והוסיפו 5 מ"ל של מתאקריליק אנידריק בקצב של 0.5 מ"ל לדקה עם ערבוב עדין למשך 1–3 שעות.
  3. מדלל את תערובת התגובה 5× עם PBS מחומם מראש ב-40 מעלות צלזיוס כדי לעצור את התגובה.
  4. יש לדיאליזציה את התמיסה באמצעות ממברנה של 12–14 קילו-דלטון מול 3–5 ליטר מים מזוקקים בטמפרטורה של 40°C למשך 5–7 ימים, תוך החלפת המים מדי יום.
    הערה: (שלב קריטי) ודא החלפת מים יומית מלאה להסרת מתאקריליק אנידריק שלא הגיב.
  5. ליופיליזציה של התמיסה המסוכרת למשך 24 שעות ואחסן את ה-GelMA הליופילי בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.

2. הכנת הידרוג'ל GelMA

  1. הכינו אצולות של 10 מ"ל של הידרוג'לים של GelMA ב-5, 10 או 15 w/v%.
  2. המיס 0.5, 1.0 או 1.5 גרם של GelMA ליופילי ב-9.5 מ"ל מים דה-יוניים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס.
  3. קרר את התמיסה ל-37 מעלות צלזיוס.
  4. הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת Irgacure 2959 פוטוניטייטור (0.5 w/v% באתנול אבסולוטי).
  5. ערבבו בעדינות ושמרו על התמיסה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לסינון סטרילי דרך מסנן ממברנת אצטט תאית של 0.22 מיקרון.

3. דה-סלולריזציה של עצם

  1. הפשרת ראשי הירך בהדרגה ל-25 מעלות צלזיוס. חתוך כל ראש ירך לשניים ואז לחתיכות קטנות יותר.
  2. טבלו חתיכות במים מזוקקים סטריליים בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס וסוניקט במשך 15 דקות (40 קילוהרץ, רציף).
  3. שטוף דגימות ב-300 מ"ל מים מזוקקים מחוממים מראש ב-60°C תוך ניעור ב-200 סל"ד למשך 5 דקות.
  4. צנטריפוגה ב-1850 × גרם למשך 15 דקות ב-25 מעלות צלזיוס. חזור על שלבי הכביסה והצנטריפוגה שלוש פעמים.
  5. סטריליזציה של הרקמה באמצעות סוניקציה (40 קילוהרץ, רציפה) למשך 10 דקות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס בתמיסה המכילה 3% מי חמצן ו-0.02% חומצה פרוקסיצטית.
  6. העבר את הרקמה ל-300 מ"ל של 70% אתנול וסוניקט (40 קילוהרץ, רציף) למשך 10 דקות בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס.
  7. שטוף את הדגימות פעמיים עם 300 מ"ל מים מזוקקים, נער ב-200 סל"ד במשך 10 דקות ב-60 מעלות צלזיוס, וצנטריפוגה ב-1850 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
  8. ראשית, הקפיאו את העצם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות, לאחר מכן ליופיליזציה של העצם המנותקת לתאי למשך 24 שעות בבסיס רחב כדי להבטיח ייבוש אחיד ולמנוע גובה דגימה מופרז בטמפרטורה של 0.05 מ"בר בטמפרטורה של מינוס 40 עד מינוס 60 מעלות צלזיוס.
    הערה: (שלב קריטי) ודא שהדגימה אינה עולה על 2–3 ס"מ בגובה בתוך המיכל כדי למנוע ליופיליזציה לא שלמה.

4. הכנת מיקרוחלקיקים בעצם

  1. הניחו את שברי העצם המנותקים בבקבוקי ארלןמאייר בנפח 250 מ"ל בתמיסת הסטריליזציה והומוגנזור באמצעות הומוגניזר עד לקבלת תמיסה לבנה אחידה (סרטון משלים 1).
  2. צנטריפוגה ב-1850 × גרם למשך 15 דקות ב-25 מעלות צלזיוס, זרקו את הסופרנטנט, ושוטפים את הכדור פעמיים עם 300 מ"ל מים מזוקקים בטמפרטורה של 25°C תחת ערבוב ב-200 סל"ד למשך 10 דקות. בצע צנטריפוגה סופית ב-1850 × גרם למשך 15 דקות ב-25 מעלות צלזיוס.
  3. ליופיליזציה (0.05 מ"בר בטמפרטורה של -40 עד -60 מעלות צלזיוס) החומר המתקבל למשך 48 שעות ומאוחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  4. טחנו מכנית את עצם הקורטיקלית או המדולרית הליופילית באמצעות טיט קרמי מעוקר עד שמתקבלת אבקה דקה (איור 1).
  5. העבר את האבקה דרך רשת או מסננת של 200 מיקרון, שקול את החומר הסופי ואחסן בטמפרטורה של -80°C.
    הערה: (שלב קריטי) ודאו שהאבקה יבשה לחלוטין לפני המסננת כדי למנוע הצטברות ובחירת גודל חלקיקים לא מדויקת.

סרטון משלים 1: הליך הומוגניזציה של עצם. הומוגניזציה של שברי עצם מפורקים באמצעות הומוגניזר עד שנוצר תלייה לבנה אחידה. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

figure-protocol-1
איור 1: הכנת מיקרוחלקיקי עצם. (א) שברי עצם מפורקים לאחר הומוגניזציה עם הומוגניזר OV5 ואחסון בטמפרטורה של -80°C. (B,C) טיט קרמי סטרילי המשמש לטחינת עצם מפורקת תאים לאבקה דקה. (D) חלקיקי העצם הסופיים המפורקים לאחר הסינון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

5. ייצור ג'ל עצם

  1. הכינו 10 W/v% GelMA על ידי המסה של 1 גרם GelMA במים דה-יוניים של 9.5 מ"ל בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס.
  2. קרר את התמיסה ל-37 מעלות צלזיוס והוסיף את תמיסת הפוטו-יוזם Irgacure 2959.
  3. שמרו על התמיסה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ובצעו סינון סטרילי באמצעות מסנן של 0.22 מיקרון.
  4. הוסיפו מיקרוחלקיקי עצם דה-תאיים (DBMP) ב-1% w/v.
  5. מערבבים ופיפטה למעלה ולמטה בזהירות, תוך הימנעות מיצירת בועות, בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס עד שמתקבל תלייה הומוגנית ליצירת ג'ל עצם (BG).
  6. אחסן את הסוכר ב-4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.
    הערה: (שלב קריטי) שמרו על ההידרוג'ל מעל טמפרטורת הג'לינג שלו (≥37 מעלות צלזיוס) לפני השילוב של התא כדי למנוע התגבשות מוקדמת.

6. תרבית ראשונית של האוסטאוציטים

  1. הוצאת מח עצם ושטיפה ראשונית
    1. להוציא ולקצוץ רקמת מח עצם מהפנים של ראש הירך באמצעות כלים כירורגיים סטריליים (איור 2).
    2. העבר את הרקמה הטחונה לצלחת פטרי סטרילית.
    3. שטוף את הרקמה שלוש פעמים עם מדיום תרבית α-MEM בתוספת תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית (100 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין).
    4. שטוף פעם אחת עם תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS).
      הערה: (שלב קריטי) מזעור את הזמן בין שאיבת הרקמות לעיבוד כדי לשמור על חיוניות התא.
  2. עיכול אנזימטי
    1. דגרו את הרקמה בתמיסת קולגנאז סוג I למשך 25 דקות בטמפרטורה של 37°C עם ערבוב עדין.
    2. תשטוף עם HBSS.
    3. חזור על שלבים 6.2.1–6.2.2 פעמיים נוספות (שלוש עיכולות קולגנאז בסך הכל).
    4. דגרו את הרקמה בחומצה של 0.5 מ"מ אתילנדיאמינטרטראאצטית (EDTA) למשך 25 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    5. שטפו עם HBSS וחזרו על שלב ה-EDTA פעמיים נוספות.
    6. בצע עיכול קולגנאז סוג I אחרון (25 דקות ב-37 מעלות צלזיוס), ואחריו שטיפת HBSS.
      הערה: (פתרון תקלות) עיכול לקוי עלול לגרום לתפוקת תאים נמוכה; האריך את הדגירה האנזימטית ב-5–10 דקות במידת הצורך.
  3. שיחזור תאים ותרבות
    1. אסוף את תמיסת הקולגנאז והעבר את שטיפת ה-HBSS הסופית לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
    2. צנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. השליכו את הסופרנטנט ותחזירו את הכדור ל-2 מ"ל של α-MEM מלא.
    4. זורעים את תליית התא לשני בקבוקי תרבית T75 ודגרו בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂.
      הערה: החלפת מדיום התרבית כל 2–3 ימים עד להשגת חיבור מספק (איור 3).

figure-protocol-2
איור 2: שאיבת רקמת מח עצם. (א) ראש הירך שהושג מניתוח החלפת ירך, המציג את האזור המדולרי המשמש לבידוד תאים. (ב) חתיכות עצם מדולרי טחונים המונחות בצלחת פטרי סטרילית לפני עיכול אנזימטי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-protocol-3
איור 3: תרבית אוסטאוציטים ראשונית. אוסטאוציטים נצמדו ומתרבים בשכבה מונולרית בתוך T75 לאחר בידוד מעצם המדולרית האנושית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

7. 3D תרבית תאים

  1. חממו מראש את כמות הידרוג'ל BG בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: (שלב קריטי) ודא שאזור העבודה נקי מטיוטות; הקירור מאיץ ג'ל מוקדם.
  2. נתק אוסטאוציטים מתרבתים וצנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 5 דקות בצינור של 15 מ"ל.
  3. החזירו את הכדור ל-200 מיקרוליטר של מדיום תרבית וערבבו עם ההידרוג'ל של BG כדי להגיע לצפיפות תאים סופית של לפחות 1000 תאים/מיקרוליטר (מהיום נקרא ביואינק).
  4. שואף 50 מיקרו-ליטר של הביו-אינק באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר ושמור על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לשקיעה.
  5. פיפטה של 50 מיקרולטר של הביודיו לכל מבנה לכל באר בלוח התרבית (וידאו משלים 2); יש להמתין בערך 5 דקות לג'לציה פיזית בטמפרטורת החדר (איור 4).
  6. חשפו כל באר לאור UV של 365 ננומטר למשך דקה אחת כדי להשיג קישור צולב בלתי הפיך (0.30 J/cm2).
  7. הוסף מדיום תרבית ודגר את המבנים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לנקודות הזמן הנדרשות. השתמש בצלחת נפרדת לכל נקודת זמן.

figure-protocol-4
איור 4: הכנת מבנה תרבית תאים תלת-ממדית. פלטת באר המכילה GelMA טעון תאים נבנית מיד לאחר פיפטינג ואחרי קישור צולב UV (365 ננומטר). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

סרטון משלים 2: הכנת מבנים תלת-ממדיים מלאי תאים. הצטברות תערובות הידרוג'ל-תאי מים לפלטת 12 בארות באמצעות טכניקת פיפטינג פשוטה לפני קישוריות צולבות UV. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

8. בדיקות תאימות ביולוגית

  1. כתמים חיים/מתים
    1. תגדלו את הפיגומים המלאים בתאים לפרקי זמן רצויים.
    2. שטוף בעדינות עם PBS סטרילי.
    3. דגרו את המבנים למשך 30 דקות בחושך עם תמיסה חיה/מתה המכילה 0.2% אתידיום הודימר-1 (EthD-1) ו-0.05% קלסין AM ב-PBS.
    4. תמונה מיידית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה עם מסננים לקלסין AM (~495/515 ננומטר) ו-EthD-1 ( ~495/635 ננומטר). סטים סטנדרטיים של פלואורסאין איזותיוסיאנאט (FITC) ו-Texas Red תואמים לזיהוי קלצין AM ו-EthD-1, בהתאמה.
    5. זהה תאים חיים לפי פלואורסצנציה ציטופלסמית ירוקה ותאים מתים באמצעות פלואורסצנציה גרעינית אדומה.
      הערה: ניתן לעבד תמונות מישוריות באמצעות ImageJ (פיג'י). עדשת האובייקטיבית, זמן החשיפה, הרווח ועוצמת התאורה נשמרו קבועים לכל הדגימות שהושוו והותאמו רק כדי למנוע רוויה באות. כדי למזער פרשנות שגויה הנגרמת מאוטופלואורסצנציה, נשמרו הגדרות רכישה זהות לכל הדגימות בכל ניסוי, ותצפיות בקרה של מבני מיקרו-חלקיקים של פיגומים/עצם ללא תאים שימשו לזיהוי דפוס הפלואורסצנציה הרקע הקשור לביומטריה. בקרות אלו אפשרו לנו להבחין בין אות שמקורו בחלקיקים לבין צביעת תאים מעוגלת אמיתית במהלך פרשנות התמונה.
  2. כימות אלמרבלו
    1. הכינו תמיסת עבודה של 5% אלאמרבלו במדיום מלא.
    2. דגמו פיגומים בתמיסת alamarBlue למשך 2.5 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂, מוגנים מאור.
    3. העבר 100 מיקרול של סופרנטנט ללוח עם 96 בארות בשלושה כפילות, כולל בקרות.
    4. מדדו פלואורסצנציה ב-360/40 ננומטר בפליטה של 460/40 ננומטר.
    5. נרמול ערכי פלואורסצנציה לבקרות כדי לקבוע פעילות מטבולית יחסית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוסטאוציטים ראשוניים בודדו בהצלחה מראשי הירך האנושיים והיו ניתנים לזיהוי בתרבות כ-5 ימים לאחר ההוצאה. התאים הציגו מורפולוגיה כוכבית ויצרו רשתות מקושרות האופייניות למורפולוגיית האוסטאוציטים, מה שמאשר בידוד, חיבור ויכולת קיום מוצלחת (איור 5).

figure-results-1
איור 5: פעילות מטבולית של תרביות אוסט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המוצג מציע שיטה נגישה ותרגומית ליצירת מבנים תלת-ממדיים דמויי עצם, תוך התמודדות עם מגבלות מרכזיות של גישות עכשוויות כגון הסתמכות על מדפסות ביולוגיות יקרות או מטריצות קנייניות13. על ידי שילוב GelMA עם מטריקס חוץ-תאי8 של עצם מנותקת תאים, ניתן לייצר מבנים פיזיולוגיים רלוונטיים באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי בלבד. פשטות זו מאפשרת אימוץ בסביבות מוגבלות במשאבים, תוך שמירה על רמזים חיוניים לחקר מנגנוני מחלות השרירים והשלד. השימוש באוסטאוציטים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לד"ר קרולינה דלגאדו מיחידת האנטומיה הפתולוגית של אוניברסיטת קונספסיון על תמיכתה ועל מתן גישה למשאבי מיקרוסקופיה.

המחברים מבקשים להודות לתמיכה המימונית מ-Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo VIU24P0041 SUC260026 קודי ANID.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (Irgacure 2959)Sigma-Aldrich410896-10Gמחלחל פוטו-חומר יזום לפולימריזציה של הידרוגל
AlamarBlue חומר מדד לחיוניות תאים InvitrogenDAL1100למדד חיוניות כמותי
אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוטית (100´) Gibco15240-062מרכיב מדיום תרביות
בקבוק תרביות תאים (T75)SPL Life Sciences70075לתרביות אוסטאוציטים
קולאגנאז סוג 1Gibco17100-017לעיכול אנזימטי של דגימות עצם
צינורית חרוטית, 15 מ"לSPL Life Sciences50015להכנת הידרוגל
DarkDawn D15-365 nmDarkDawn-לצימוד UV של הידרוגל
DPBS, אבקה, ללא סידן, ללא מגנזיוםgibco21600069ממס הידרוגל, ממס ערכת LIVE/DEAD
EDTA די-נתרן מלח 2-HIDWinklerED-0760לעיכול אנזימטי של דגימות עצם
צנטריפוגת Eppendorf 5702Eppendorf5702000010להכנת מיקרו-חלקיקי עצם
אתנול מוחלט לניתוחSupelco1,00,98,32,511להסרת תאים מהעצם (מודלל ל-70%), ממס מחלחל
סרום בקר עובריGibcoA52567-01מרכיב מדיום תרביות
ג'לטין מעור חזירSigma-AldrichG1890-500Gמרכיב הידרוגל
HBSS (10´)Gibco14185-052לשטיפת דגימות מח עצם
L-חומצה אסקורבית 2-פוספטSigma-AldrichA8960-5Gמרכיב מדיום תרביות
ערכת LIVE/DEAD למדד חיוניות/רעילותInvitrogenL3224למדד חיוניות/רעילות איכותי
MEM Alpha (1´)Gibco12571-063מרכיב מדיום תרביות
אנהידריד מתאקריליSigma-Aldrich276685-500Gמרכיב הידרוגל
צינורית מיקרו-צנטריפוגהCitotest4610-1844להכנת צבעי alamarBlue ו-LIVE/DEAD
NuncIon delta surface Thermoscientific150628צלחת 12 באר לזריעת דגימות
מקור אור פלואורסצנטי OLYMPUS BX43 מקור אור Olympus U- LH100HGEvidentU- LH100HGמקור אור לניתוח פלואורסצנטי
צנטריפוגת RC-6 PlusThermo Scientific Sorvall46910להסרת תאים מהעצם והכנת מיקרו-חלקיקי עצם
קורא Synergy HTX רב-מצביBioTek Instruments-ספקטרופוטומטר 
מזרק עם מחטNIPROSY3-WN-R-03לסינון הידרוגל
צלחת תרביות רקמות 96 בארJet BiofilTCP00109696 באר למדד חיוניות alamarBlue.
מנקה אולטרסאונדיVWE97043-958לסוניקציה של דגימות עצם

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

3D Bone CultureHuman OsteocytesDecellularized Extracellular MatrixMusculoskeletal Disease ModelingGelMA HydrogelsBone RemodelingIn Vitro BoneImmunofluorescence ImagingBone Construct FabricationRegenerative Medicine
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים