פרמקולוגיה ברשתות ואימות ניסויי לחקר קורטקס סינמומי נגד אוסטאונקרוזה המושרה סטרואידים בראש הירך

סיכום

מחקר זה נועד לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של Cinnamomi Cortex בטיפול באוסטאונקרוזיס של ראש הירך על ידי שילוב פרמקולוגיה רשתית, סימולציות דינמיקה מולקולרית וניסויים בבעלי חיים.

תקציר

אוסטאונקרוזה בראש הירך (SONFH) המושרה על ידי סטרואידים גורמת לכאב חמור ולהגבלת תנועה, ופוגעת משמעותית באיכות החיים של המטופלים. הוכח כי Cinnamomi Cortex (CC) מקל ביעילות על מצב זה, אך מנגנון הפעולה שלו נותר לא ברור. מחקר זה שואף לזהות את התרכובות הפעילות של CC ולחקור את המנגנונים שלהן ב-SONFH. מרכיבים פעילים נבדקו באמצעות מסדי הנתונים HERB 2.0, PubChem ו-SwissADME, והיעדים המתאימים שלהם נחזו באמצעות מאגר Swiss Target Prediction. מטרות ל-SONFH זוהו על ידי הצטלבות מטרות ממאגרי GEO, DisGeNET, GeneCards ו-OMIM עם המטרות הקשורות לתרכובות. רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) נבנתה באמצעות מאגר הנתונים STRING, וניתוחי העשרת GO ו-KEGG בוצעו באמצעות מאגר DAVID. האינטראקציות המבטיחות ביותר בין תרכובות למטרה אושרו באמצעות עגינה מולקולרית (MD) וסימולציות דינמיקה מולקולרית. החוקרים זיהו 563 מטרות פוטנציאליות, כולל 61 מטרות הקשורות ל-SONFH, כאשר AKT1, HIF-1α ו-STAT3 משמשים כנקודות מרכזיות. ניתוח העשרת KEGG הדגיש את מסלול האיתות HIF-1α כמנגנון מרכזי. יתרה מזאת, ניסויים בבעלי חיים הראו כי החלק הפעיל של ה-CC הפחית ביעילות את הנזק המבני לראש הירך במודל עכבר עם SONFH. הממצאים מצביעים על כך ש-CC עשוי לשפר את SONFH על ידי תיאום התאמת היפוקסיה וויסות אנגיוגנזה ואוסטאוגנזה.

מבוא

אוסטאונקרוזה של ראש הירך (SONFH) הנגרמת על ידי סטרואידים היא הפרעה אוסטיאוארטיקולרית קריטית, הנגרמת מהפרעה או ירידה באספקת הדם לראש הירך כתוצאה^מ-1. מוות תאי עצם ורכיבי מח עצם מוביל לנזק מבני בראש הירך ולפגיעה תפקודית במפרק הירך². קלינית, מטופלים בדרך כלל סובלים מכאבי ירך ומוגבלות בתנועה³. ללא טיפול יעיל, 80% מחולות SONFH יתקדמו לקריסת ראש הירך, מה שדורש החלפת ירך מלאה⁴. זה מפעיל לחץ פסיכולוגי כבד ועומס כלכלי כבד על המטופלים⁵. הפרקטיקה הקלינית ממליצה להשתמש בשילוב של נוגדי קרישה, תרופות פיברינוליטיות, מרחיבי כלי דם ותרופות להורדת שומנים לטיפול ב-SONFH, שהוכיחו פוטנציאל קליני מסוים אך בדרך כלל יעילות טיפולית מוגבלת.

הרפואה הסינית המסורתית (TCM) הוכיחה יותר ויותר את השפעתה החיובית בטיפול ב-SONFH⁷. הרפואה הסינית הסינית מראה פוטנציאל להקלה בתסמינים, שליטה במחלה, שיפור בניידות המפרקים ואיכות החיים של המטופלים⁸. קלינית, CC ורכיביו שימשו רבות לשיפור SONFH, והראו יעילות משמעותית⁹. חומרים ביואקטיביים רבים הנמצאים ב-CC פועלים במגוון פעולות ביולוגיות, כולל תכונות אנטי-דלקתיות, נוגדי חמצון, מקדם אנגיוגנזה ומשפרים מיקרוקולציה¹⁰. מחקרים קודמים בהנדסת רקמות עצם ומטבוליזם הראו כי קינמלדהיד, רכיב פעיל עיקרי ב-CC, יכול לווסת מסלולי איתות הקשורים לשיפוץ עצם¹¹. המחקר הראשוני הצביע על כך שלכדורי יוגווי (YGPs) יש פוטנציאל טיפולי ל-SONFH על ידי קידום אנגיוגנזה והגברת תגובות^{דלקתיות.} בתור התרופה הריבונית ב-YGPs, CC יכול לחמם את היאנג ולהועיל לצ'י ולשחרר את המרידיאנים, וליצור השפעות טיפוליות מועילות על SONFH¹³. עם זאת, המנגנונים המדויקים שעומדים מאחורי יעילותו נותרו לא ברורים. הבהרת רשת הרגולציה הרב-מטרתית שבה משתמש CC לשיפור SONFH לא רק תסייע להבנת אופיו הפרמקולוגי, אלא גם תעודד שימוש קליני סביר בה ויצירת שיפור קשור. שילוב ביואינפורמטיקה עם פרמקולוגיה רשתית מספק גישה יעילה להבהרת מנגנוני פעולה¹⁴.

פרמקולוגיית הרשת יכולה לזהות רכיבים ביואקטיביים בצמחי מרפא ולחזות את הקשרים בין רכיבי התרופות הללו לבין יעדי הגנים¹⁵. MD משמש לאימות האינטראקציות הקשירה בין תרכובות פעילות מועמדות לבין מטרות טיפוליות מרכזיות. דינמיקה מולקולרית משתמשת במכניקה ניוטונית להערכת יציבות וגמישות קישור בין ליגנדים לקולטנים באמצעות סימולציית תנועה¹⁶. המחברים חקרו באופן מקיף את ההשפעות האפשריות של CC על SONFH באמצעות סימולציות של פרמקולוגיה רשתית, MD ודינמיקה מולקולרית. הממצאים מהווים מקור למחקר מעמיק עתידי על הבסיס והמנגנון של חומר פרמקודינמי לשיפור SONFH. תרשים הזרימה של המחקר מוצג באיור 1.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים הניסיוניים אושרו על ידי ועדת האתיקה הניסיונית של בעלי החיים של אוניברסיטת הרפואה הסינית בז'ג'יאנג (IACUC-20240708-22) ועמדו במדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה שפורסם על ידי המכון הלאומי לבריאות. בניסוי זה, השתמשו עשרים עכברים נקביים בני 10 שבועות מסוג C57BL/6J במשקל 20 עד 22 גרם. עכברים אלו הושגו ממרכז בעלי החיים של האוניברסיטה הרפואית הסינית בז'ג'יאנג. ראו את טבלת החומרים לרשימה של כל המגבים, הציוד והתוכנה המשמשים בפרוטוקול זה.

סינון של תרכובות פעילות ומטרות של CC
תרכובות כימיות של CC זוהו באמצעות ה-Herb^{2.0 17} עם מילת המפתח "CC". כימיקלים ללא מזהה PubChem או עם אותו ID סיננו החוצה. לאחר מכן מיזוג והסרת כפילויות כדי לקבל את אתרי היעד התואמים ל-CC. בצע סינון ראשוני באמצעות מסד הנתונים PubChem¹⁸ בהתבסס על כלל החמישה של ליפינסקי (Mw ≤ 500, miLogP ≤ 5, nOHNH ≤ 5, nOH ≤ 10)¹⁹. המחברים משתמשים במאגר PubChem כדי לקבוע את ייצוג SMILES עבור כל תרכובת כימית. באמצעות מאגר הנתונים SwissADME, המחברים בוחרים תרכובות עם הגבלה של ספיגת מערכת העיכול "גבוהה" וערכי "כן" ≥2 ב-Druglikeness²⁰. השתמש במסד הנתונים Swiss-Target^{Prediction 21} כדי להפיק חלבוני מטרה שיש להם הסתברות גבוהה מאפס. לאחר מכן מיזוג והסרת כפילויות כדי לקבל את אתרי היעד התואמים ל-CC.

איסוף מטרות גנים הקשורות ל-SONFH
מטרות הקשורות ל-SONFH הושגו ממאגרי נתונים: מסד הנתונים DisGeNET²²; מאגר GeneCards²³; מסד נתונים OMIM²⁴, ומסד נתונים GEO²⁵. המחברים הורידו והסירו את הגנים של SONFH ממאגרי הנתונים OMIM ו-DisGeNET. בסך הכל הושגו 233 מטרות הקשורות למחלה ממאגר GeneCards לאחר הסרת כפילויות. כל היעדים שנאספו קיבלו ציוני רלוונטיות גבוהים מ-0 ונכללו לניתוחים הבאים. ציון הרלוונטיות המינימלי בקרב הגנים שנאספו היה 6.48. גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) הקשורים ל-SONFH התקבלו מסדרת GSE123568 בפלטפורמת GPL15207 במאגר GEO. השפעות אצווה תוקנו באמצעות חבילת הלימה ב-R, וגנים מבוטאים באופן שונה (DEGs) זוהו בקריטריונים של |logFC| > 1 ו-P < 0.05²⁶. חבילת ggplot2 שימשה ליצירת תרשים הר געשי להמחשת התפלגות ה-DEGs, והופקה מפת חום להצגת הממצאים. ספריית מטרות מחלת SONFH הוקמה על ידי הסרת מטרות כפולות באמצעות חבילת Venn ב-R.

הקמת רשת PPI
בהתבסס על המטרות הצפויות של הרכיבים הפעילים של CC ומטרות הקשורות ל-SONFH, נוצר דיאגרמת ון על ידי Venny 2.1.0²⁷. במטרה להשיג נתוני PPI, המחברים ייבאו את היעדים למסד הנתונים STRING²⁸. המגבלה של קריטריון הסינון של האורגניזם הייתה "הומו ספיינס" עם מדד ביטחון ≥0.4. המחברים השתמשו ב-Cytoscape 3.7.2 כדי לקבוע את יעדי המפתחות ברשת PPI. מרכזיות דרגה (DC) שימשה לבחינת מטרות מפתח ברשת PPI. מסנן הפרמטרים הוא יותר מפעמיים מהערך החציוני. במטרה להגדיר עוד יותר את היעדים המרכזיים, השתמשו בתוסף ל-Cytoscape.

ניתוחי העשרה בוצעו באמצעות אונטולוגיית גנים (GO) ומאגרי הנתונים של אנציקלופדיה קיוטו של גנים וגנומים (KEGG)
היעדים המשותפים של CC ו-SONFH נותחו לניתוחי העשרת GO ו-KEGG דרך מאגר הנתונים DAVID²⁹. כדי להמחיש את עשרת מונחי GO המובילים ואת 20 מסלולי KEGG המובילים, נעשה שימוש ב-Wei Sheng^{Xin 30} כדי לצייר את טבלת בועות נקודות ההעשרה.

בניית רשת
המנגנונים המולקולריים של CC בשיפור SONFH הובארו דרך רשתות תרכובת עשב-מטרה (H-C-T) ומסלול תרכובת-יעד (C-T-P). תוכנת Cytoscape 3.10.3 הדגימה את הרשתות. רשת H-C-T פותחה באמצעות התרכובות הפעילות מ-CC והיעדים המשותפים שלהן. לאחר מכן השתמש בכלי Analyze Network. כדי לשפר את ההבנה של הקשרים בין מסלולים, תרכובות ומטרות, 20 המסלולים המובילים, יחד עם היעדים והתרכובות הקשורים להם, אורגנו לרשת C-T-P על ידי Network Tools.

אימות MD
היעדים המרכזיים: HIF-1α, STAT3, ESR1, AKT1, SRC, ERBB2, CASP3 ו-EGFR התקבלו מניתוח PPI. המטרה נבדקה על ידי מסד הנתונים Uniport³¹ עם הגבלת Human ונבדקה על ידי מסד הנתונים של RCSB PDB³². נבחרו מבני חלבון אנושיים ברזולוציה יחסית גבוהה. המרכיבים הפעילים זוהו מרשת C-T-P. המבנים התלת-ממדיים המתאימים שלהם הורדו בפורמט mol2 ממסד הנתונים של PubChem. כל קובץ נפתח ב-Chem3D והאנרגיה הוקטנה. לאחר מכן השתמשו המחברים בתוכנת AutoDockTools³³ כדי לבצע ייבוש, הידרוגנציה וחישוב מטעני הגסטייגר של חלבון הקולטן. גם הליגנדים וגם הקולטנים נשמרו בפורמט PDBQT. בהתבסס על המיקום המרחבי ויכולת הקשירה, המחברים מעריכים את ההיתכנות והיציבות של העגינה. באמצעות האוטודוק וינה, חזו את תיבת רשת העגינה והמקרומולקולה. במחקר זה, כל הקשרים המסתובבים של הליגנד הורשו להסתובב בחופשיות, בעוד שהקולטנים הוגדרו כקשיחים. ציון העגינה מציין את הזיקה הקשירה בין הקולטן לליגנד; ככל שהציון נמוך יותר, כך הזיקה לקישור גבוהה יותר. בהתאם לעיקרון זה, המחברים בוחרים את הקונפורמציות עם אנרגיית הקישור המועדפת ביותר כדי לחקור אינטראקציות קישור בין ליגנדים לחלבונים. התוצאות הוויזואליות הוצגו על ידי PyMOL.

סימולציית דינמיקה מולקולרית
סימולציות דינמיקה מולקולרית בוצעו באמצעות GROMACS³⁴ עם שדה כוח CHARMM36. קומפלקס החלבון-ליגנד היה מרוכז בקופסת סימולציה מחזורית קובייבית עם מרחק מינימלי של תיבת מומס של 1.0 ננומטר, והמערכת פוססה באמצעות מודל המים SPC216. המערכת נוטרלה על ידי הוספת נגדי Na⁺ ו-Cl⁻ מתאימים. מזעור האנרגיה בוצע ברצף באמצעות אלגוריתם הירידה התלולה ביותר ואחריו שיטת הגרדיאנט הצמוד להסרת מגעים אטומיים לא נוחים. אינטראקציות אלקטרוסטטיות ארוכות טווח חושבו באמצעות שיטת רשת חלקיקים Ewald (PME) עם מרחק חיתוך של 10 Å. כל הקשרים הקוולנטיים הכוללים אטומי מימן הוגבלו באמצעות אלגוריתם LINCS. הטמפרטורה נשמרה על 300 קלווין באמצעות תרמוסטט V-rescale, והלחץ נשלט ב-1 בר באמצעות ברוסטט ברנדסן עם צימוד איזוטרופי. הגבלות מיקום הוטלו על הליגנד עם קבוע כוח של 1000 kJ·mol⁻¹·nm^⁻2 במהלך שלב שיווי המשקל. לאחר מזעור האנרגיה, המערכת התאזנה עם סימולציות של 2 ns NVT ו-2 ns NPT, ואחריהן סימולציה של דינמיקת מולקולות ייצור של 100 ננו-נשנושן עם צעד זמן של 2-fs. קואורדינטות אטומיות נרשמו כל 10 פס לניתוח מסלול נוסף.

אימות ניסיוני במודל עכבר SONFH
Animals והקמת דגם SONFH
עשרים עכבר נקבות C57BL/6J, בגיל 10 שבועות ומשקל 20 עד 22 גרם, נאספו ממרכז בעלי החיים של האוניברסיטה הרפואית הסינית בז'ג'יאנג. העכברים עברו תקופת הסתגלות של 7 ימים בסביבה מבוקרת וקיבלו גישה חופשית למזון ולמים. כל העכברים חולקו באקראי לקבוצות (n = 5 לקבוצה): קבוצת הביקורת, קבוצת SONFH, קבוצת SONFH + CC במינון נמוך (CC-נמוך, 7.5 גרם/ק"ג/יום), וקבוצת SONFH + CC במינון גבוה (CC-גבוה, 15 גרם/ק"ג/יום). מודל SONFH הוקם כפי שתואר קודם. בקצרה, עכברים בקבוצות SONFH, SONFH + CC-Low ו-SONFH + CC-High קיבלו שתי זריקות תוך-ורידיות של ליפופוליסכריד (LPS; 20 מיקרוגרם/ק"ג) ביום האפס. לאחר מכן, ניתנו שלוש זריקות תוך-שריריות של מתילפרדניזולון (MPS; 40 מ"ג/ק"ג) במרווחים של 24 שעות, החל מ-24 שעות לאחר הזרקות ה-LPS. העכברים בקבוצות הטיפול קיבלו תמצית CC באמצעות תמצית אוראלית יומית במשך 6 שבועות, החל מיום ההזרקה האחרונה של ה-MPS. עכברי קבוצת הביקורת קיבלו כמויות דומות של מלח בנקודות זמן מתאימות.

איסוף והכנת דגימות
בסיום תקופת הטיפול בת 6 השבועות, העכברים הושמעו. ראשי הירך הדו-צדדיים נקטעו ונקטפו בקפידה. לכל בעל חיים, ראש הירך השמאלי נקבע ל-48 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לצורך דה-קלציפיקציה והטמעת פרפינים. ראש הירך הימני קבוע ואז שימש ישירות לסריקת Micro-CT ללא דה-קלציפיקציה.

ניתוח היסטולוגי (צביעת ABH)
לאחר דה-קלציפיקציה והטמעת פרפין, קטעי ראש הירך צוברו באמצעות פרוטוקול Alcian Blue/Hematoxylin (ABH) להערכת שינויים באוסטאונקרוזיס. לזמן קצר, קטעים צוברו בכחול אלציאני 1% (pH 2.5) למשך 30 דקות, שטפו, ואז צובעו בצבע נגד עם המטוקסילין האריס. לאחר הייבוש וההתקנה, צולמו שקופיות תחת מיקרוסקופ אור. כימות האוסטאונקרוזיס בוצע על ידי שני צופים עיוורים באמצעות תוכנת ImageJ. יחס הלקונות הריקות חושב כ-(מספר הפערים הריקים למספר הפערים הכולל) × 100% בשלושה שדות בעלי הספק גבוה שנבחרו באקראי לכל דגימה באזור התת-כונדרלי. היחס בין גרעיני הפיקנוטים נקבע באופן דומה.

ניתוח טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (Micro-CT)
המיקרו-מבנה התלת-ממדי של העצם של ראש הירך נותח באמצעות סורק מיקרו-CT ברזולוציה גבוהה. דגימות קבועות נסרקו ברזולוציה של 10 מיקרון (70 קילו-וולט, 114 מיקרואמפר). נפח כדורי סטנדרטי (VOI) הכולל את אזור המשקל הראשי שוחזר ונותח באמצעות תוכנת CTAn. הפרמטרים המורפומטריים הבאים נמדדו: נפח עצם/נפח כולל (BV/TV), עובי טרבקולרי (Tb.Th), והפרדה טרבקולרית (Tb.Sp).

צביעת אימונופלואורסצנציה (IF)
להערכת מיקרו-סביבת העצם, בוצעה צביעת אימונופלואורסצנציה על חתכי פרפין. לאחר שליפת אנטיגנים וחסימה, החתכים דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם הנוגדנים העיקריים הבאים: אנטי-HIF-1α של ארנב (1:200), אנטי-ALP של ארנב (1:300), ואנטי-VEGF של ארנב (1:150). לאחר השטיפה, הקטעים הוגברו בתערובת של נוגדנים משניים מצומדים בפלואורופור: IgG אנטי-ארנב עם סימון Alexa Fluor 488, IgG אנטי-ארנב לעזים עם סימון Alexa Fluor 555. הגרעינים צובעו נגד DAPI. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה בתנאי חשיפה עקביים. עוצמת הפלואורסצנציה היחסית לכל סמן נמדדה באמצעות תוכנת ImageJ בשלושה שדות בכל דגימה.

ניתוח סטטיסטי
כל הנתונים הכמותיים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי בוצע באמצעות תוכנת GraphPad Prism (גרסה 9.0) לקביעת מובהקות סטטיסטית בין קבוצות. ערך P של פחות מ-0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

תוצאות

זיהוי רכיבים פעילים ויעדים חזויים של CC ופיתוח רשת "H-C-T".
כדי לחקור את המנגנונים של רכיבים מרכזיים ומטרות של CC בשיפור SONFH, המחברים השתמשו במאגר HERB 2.0 כדי לזהות את כל רכיבי CC שנבדקו. נמצאו 85 תרכובות ביואקטיביות סבירות מתוך 209 מרכיבים פעילים מועמדים של CC (טבלה משלימה 1). באמצעות פלטפורמת חיזוי מטרות שוויצרית והסרת רשומות כפולות ולא תקפות, הושגו 563 יעדים פוטנציאליים התואמים לרכיבי CC אלו (טבלה משלימה 2). המחברים זיהו את הרכיבים הפעילים והיעדים של CC.

לחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים בהופעת והתקדמות SONFH ולזהות מטרות ביומרקרים פוטנציאליות. ניתוח מאגר הנתונים של GSE123568 במאגר GEO זיהה DEGs הקשורים ל-SONFH, כולל 207 גנים שעברו ו-216 גנים שהועברו לוויסות פחות. גרף הר געש של 425 ה-DEGs מוצג באיור 2A, בעוד דפוסי הביטוי של 60 ה-DEGs המובילים המדורגים לפי רמת הביטוי מוצגים כמפת חום באיור 2B, כאשר עוצמת הצבע משקפת את ערכי הביטוי המועברים בלוגריתם. מסדי הנתונים DisGeNET, OMIM ו-GeneCards סיפקו 711 מטרות המקושרות ל-SONFH. בשילוב 425 ה-DEGs ממסד הנתונים GEO, סך הכל 1136 מטרות מקושרות ל-SONFH. לאחר הסרת כפילויות, אושרו 1115 יעדים הקשורים ל-SONFH, כפי שמודגם באיור 2C. המחברים הקימו באופן ראשוני ספריית מיקוד למחלות עבור SONFH.

כדי לזהות מטרות ורכיבים עיקריים, ניתוח חיתוך בין 563 היעדים של CC לבין 1115 מטרות הקשורות ל-SONFH זיהה 61 יעדים נפוצים (איור 3A וטבלה משלימה 3), שהובאו ל-Cytoscape 3.10.3 כדי לבנות את רשת "H-C-T" (איור 3B). רשת זו כללה 147 צמתים ו-413 קצוות. ניתוח טופולוגי הראה כי (s)-4-נונונוליד (דרגה:16), איזוהומוגנול (דרגה:15), נריל אצטט (דרגה:14), מלילוטוקרפן A (דרגה:14), 3-מתוקסינמאלדהיד (דרגה:13) הראו את הקישוריות הגבוהה ביותר למטרות חלבון.

פיתוח והערכה טופולוגית של רשת PPI.
לבחון לעומק את מטרות CC לשיפור SONFH. Cytoscape 3.10.3 שימש לצפייה ברשת ה-PPI לאחר ש-61 יעדים זהים הוכנסו למסד הנתונים של STRING. היו 463 קצוות ו-60 צמתים ברשת. באיור 4A, הצמתים עוברים בצבע ובגודל מבהיר וקטן יותר לכהה וגדול, מה שמעיד על עלייה בדרגה מנמוכה לגבוהה. תוסף MCODE הקל על קיבוץ המטרות הללו לשני מודולים פונקציונליים (איור 4A), מתוכם אשכול 1 כלל 23 צמתים ו-216 קצוות, עם ציון של 19.636. כדי לאפיין את ארכיטקטורת הרשת, נעשה שימוש ב-DC, BC ו-CC כמדדים טופולוגיים. כאשר ערכי החציון של פרמטרים אלו נקבעו כנקודות חיתוך, המחברים זיהו 8 מטרות פעילות (איור 4B). תוסף CytoHubba השתמש באלגוריתם MCC כדי לדרג צמתים ולזהות את עשרת הגנים המובילים. (איור 4C).

ניתוח העשרת GO
כדי לחקור לעומק את מנגנוני CC בשיפור ONFH, בוצע ניתוח העשרת GO על 61 מטרות פוטנציאליות, תוך שימוש ב-BP, CC ו-MF. סך הכל 435 מונחי GO הועשרו, כולל 293 מושבי BP, 41 תקופות CC ו-101 מונחי MF. ממצאים אלו מוצגים בטבלאות המשלימות 4, 5 ו-6. איור 5A מציג ויזואלית את עשרת מונחי BP, CC ו-MF המועשרים ביותר באמצעות תרשים בועות. הממצאים הצביעו על כך שמונחי BP היו קשורים בעיקר להעברת אותות, ויסות חיובי של שעתוק על ידי RNA פולימראז II, ויסות שלילי של תהליך אפופטוטי, ויסות חיובי של שעתוק בתבנית DNA, וויסות שלילי של שעתוק באמצעות RNA פולימראז II. הניתוח חשף כי מונחי MF מעורבים בעיקר בקישור חלבונים, קישורי יוני מתכת וקשירת חלבונים זהים. תוצאות ה-CC הראו שרוב המטרות היו ממוקמות בעיקר בציטופלזמה, בממברנה ובממברנת הפלזמה.

ניתוח KEGG
כדי להעלות מידע על המנגנונים הביוכימיים הפוטנציאליים שבאמצעותם CC עשוי לשפר את SONFH, נערך ניתוח העשרת מסלולי KEGG כדי להבהיר את המנגנונים הביוכימיים שבאמצעותם CC עשוי לשפר את SONFH. באמצעות קריטריון סינון של P < 0.05 ו-FDR < 0.05, זוהו 48 ערכי העשרת KEGG (טבלה משלימה 7). 20 המסלולים המועשרים באופן משמעותי המובילים, שנקבעו על ידי העשרת קיפול וספירה, הוצגו באמצעות תרשימי בועה ובר (טבלה 1, איור 5B ו-5C). באמצעות Cytoscape 3.10.3, נבנתה רשת C-T-P עם 167 צמתים ו-589 קשתות (איור 5D). ההשפעות של CC על SONFH קשורות בעיקר לזיהום בהרפסווירוס הקשור לסרקומה של קפוסי, מסלול איתות HIF-1, ולליפידים וטרשת עורקים, כפי שמצוין בניתוחי העשרת מסלול תפקודי GO ו-KEGG.

אימות MD
כדי להעריך את האינטראקציות הפוטנציאליות בין תרכובות פעילות למטרות מרכזיות, 10 התרכובות מרשת C-T-P, כולל אנתול, מלילוטוקרפן A, נריל אצטט, חומצה קפרילית, איזוהומוגנול, 3-מתוקסינמאלדהיד, (s)-4-נונואנוליד, מיריסטיצין, בורנואול וקינמיל אצטט, חוברו למטרות המרכזיות AKT1, HIF-1α, STAT3, ESR1, CASP3, SRC ו-EGFR. תוצאות העגינה המלאות לכל זוגות התרכובת–מטרה מסוכמות בטבלה משלימה 8, ומידע מפורט על התרכובות, המטרות ופרמטרי העגינה מסופק בטבלה משלימה 9. איור 6 מציג מפת חום של התפלגות אנרגיית הקשירה.

בסך הכל, מספר זוגות מורכבות-מטרה הראו זיקות קשירה יחסית חיוביות, כאשר ערכי אנרגיית קישור נמוכים יותר מעידים על אינטראקציות צפויות ויציבות יותר. ראוי לציין כי תוצאות העגינה הראו הטרוגניות ברורה בזיקות הקשירה בין תרכובות ומטרות. תרכובות מסוימות, כמו מלילוטוקרפן A, הראו בעקביות זיקות קשירה חזקות יחסית בין מספר מטרות, בעוד אחרות הראו אינטראקציות מתונות או חלשות יותר, מה שמרמז כי תרכובות שונות עשויות לתרום באופן לא שווה להשפעות הפרמקולוגיות החזויות.

בנוסף, נצפתה שונות בין מטרות. לדוגמה, מטרות מסוימות כמו STAT3 ו-EGFR הראו זיקות קשירה מתונות או חלשות יחסית עם תרכובות מרובות, כאשר ערכים מסוימים התקרבו ל-5.0- קקלורי/מול, בהשוואה למטרות כמו AKT1 או SRC. דפוס זה מצביע על כך שלא כל היעדים המרכזיים בהכרח פועלים כשותפים ישירים בעלי זיקה גבוהה של התרכובות שזוהו, וייתכן שהן ממלאות תפקידים רגולטוריים עקיפים בתוך רשת האינטראקציה. הבדלים אלו עשויים להיות קשורים לשונות בתאימות מבנית בין ליגנדים לאתרי קישור חלבונים, וכן לתכונות הטבועות במטרות.

מבין הזוגות שנבדקו, AKT1 הציג את אנרגיית הקישור הנמוכה ביותר עם מלילוטוקרפן A (-9.6 קקלורי/מול), מה שמרמז על אינטראקציה פוטנציאלית חיובית. איור 7 ממחיש את מצב הקישור הצפוי של קומפלקס זה. באופן ספציפי, SER205 של AKT1 יוצר קשרי מימן עם מלילוטוקרפן A, אנטהול ומיריסטיסין. בנוסף, חזה שמלילוטוקרפן A ייצור קשרי מימן עם GLY309 של HIF-1α, LEU438 ו-THR440 של STAT3, SER433 ו-ARG412 של ESR1, ו-ARG500 ו-GLU510 של SRC.

כדי לזהות תרכובות מועמדות מייצגות, נעשה שימוש באנרגיית הקישור הנמוכה ביותר לכל מטרה, וסף אנרגיית קישור של ≤-5.0 קקלוריות/מול נקבע כדי להצביע על אינטראקציות יציבות יחסית. בהתבסס על קריטריונים אלו, זוהו מלילוטוקרפן A, אנתול ומיריסטיצין כתרכובות מפתח פוטנציאליות. בסך הכל, רוב הרכיבים הפעילים של CC הראו אינטראקציות פוטנציאליות עם היעדים הטיפוליים הנבחרים, כאשר חלק מהתרכובות הראו מגמות קשירה חזקות יחסית בין מספר מטרות. עם זאת, יש לציין כי MD היא גישה חישובית פשוטה שמספקת תחזיות ראשוניות של אינטראקציות פוטנציאליות וייתכן שאינה מתייחסת במלואה לגמישות חלבונים ולסביבות ביולוגיות מורכבות. לכן, יש לפרש תוצאות אלו בזהירות, והאינטראקציות שנצפו אינן מהוות ראיה חד-משמעית לקישור ישיר.

סימולציית דינמיקה מולקולרית
כדי להעריך את יציבות הקומפלקסים, בחרו המחברים בקומפלקסים AKT1-melilotocarpan A, HIF-1α-melilotocarpan A ו-STAT3-melilotocarpan A לסימולציות דינמיקה מולקולרית. מבין היעדים החזויים, STAT3 ו-HIF-1α נבחרו לסימולציות MD בהתבסס על תפקידם המרכזי ברשת PPI ורלוונטיותם הביולוגית לפתולוגיית SONFH. STAT3 הציג אחת מדרגות הקישוריות הגבוהות ביותר ברשת ה-PPI, מה שמעיד על תפקיד רגולטורי פוטנציאלי במסלולי איתות מרובים. HIF-1α נבחר משום שניתוח העשרת KEGG זיהה את מסלול האיתות HIF-1 כאחד המסלולים הרלוונטיים ביותר הקשורים לאנגיוגנזה והתאמת היפוקסיה באוסטאונקרוזיס.

במקביל, המחברים התמקדו ב-AKT1 כמטרה מייצגת בשל ציוני העגינה החזקים שלו והרלוונטיות הישירה לתכונות הפתולוגיות של SONFH, במיוחד אנגיוגנזה הנגרמת מהיפוקסיה והתחדשות עצם. עקב מגבלות משאבים חישוביים, נבחרו שלושה קומפלקסים מייצגים לסימולציות MD מפורטות, אסטרטגיה נפוצה במחקרי סימולציה מולקולרית מבוססת פרמקולוגיה רשתית. סטיית שורש ממוצעת ריבוע (RMSD) מעריכה ביעילות את היציבות הקונפורמציה של קומפלקסי חלבון-ליגנדים, כאשר ערכים נמוכים יותר מצביעים על יציבות מבנית גבוהה יותר. כפי שמוצג באיור 8A, קומפלקס AKT1-מלילוטוקרפן A השלים את ההרפיה בתוך 12 ננו-נוניות הראשונים ובהמשך הגיע לרמה יציבה, כאשר נצפה רק תנודה חולפת סביב 50-55 ננו-נשנציות לפני שחזרה במהירות לשיווי משקל. ה-RMSD הכולל לאורך הסימולציה היה כ-0.369 ננומטר. איור 8B ממחיש כי קומפלקס HIF1A-מלילוטוקרפן A עבר הרפיה בתוך 16 ה-ננו-שניות הראשונים, ולאחר מכן שמירה על רמה יציבה. תנודה קצרה התרחשה בין 38 ל-42 ננו-שניות, ולאחר מכן נצפתה ייצוב מהיר. ה-RMSD הכולל למתחם זה היה 0.25 מייל ימי. באיור 8C, קומפלקס STAT3-מלילוטוקרפן A עבר הרפיה בתוך 0.3 ננו-שניות, ואז הגיע לרמה יציבה. התנודה הקצרה התרחשה בין 5 ל-80 ננו. הסימולציה הכוללת הייתה כ-0.21 ננומטר. כפי שמוצג ב-The AKT1-melilotocarpan A, HIF-1α-melilotocarpan A ו-STAT3-melilotocarpan שמרו על יציבות ללא שינויים משמעותיים, מה שמעיד על שילוב יציב יחסית.

הגמישות של שאריות חומצות האמינו בחלבונים הוערכה באמצעות תנודות ממוצע ריבועי שורש (RMSF). באיור 9A, התנודה הממוצעת של שאריות גלובלית הייתה כ-0.17 ננומטר, מה שמרמז שהיציבות נשמרה בעיקר על ידי הליבה המבנית וכיס הקשירה. הגמישות הגבוהה יותר הייתה מוגבלת בעיקר לאזורים ניידים במהותו, כמו מקטעי קצה ואזורי לולאות, ולא לליבת הכיס. ידוע היטב שאזורים אלו גמישים במהותם. איור 9B מראה שכ-94% מהשאריות הציגו ערכי RMSF מתחת ל-0.20 ננומטר, ורק כ-6% עלו על 0.30 ננומטר, מה שמעיד כי השדרה הכללית של החלבון ושאריות הפנימיות השתנו בטווח יציב. איור 9C מראה כי השארית הגלובלית הממוצעת הייתה כ-0.17 ננומטר. לא זוהו תנודות העולות על 0.15 ננומטר בנתונים, מה שמעיד שכיס הקישור שמר על קונפורמציה יציבה לאורך כל הסימולציה. גם הקומפלקסים של AKT1-מלילוטוקרפן A וגם HIF-1α-מלילוטוקרפן A הוכחו כבעלי אינטראקציה חזקה ויציבה.

קשרי מימן הם קריטיים לקידום אינטראקציות חלבון-ליגנטיות. איור 10A מראה כי קומפלקסי AKT1-מלילוטוקרפן A יצרו בדרך כלל קשר מימן אחד, כאשר מספר קשרי המימן נע בין 0 ל-2. בין מלילוטוקרפן A ל-HIF-1α מופרדים בפחות מ-0.35 ננומטר. AKT1 מתקשר לעיתים קרובות בקרבה למלילוטוקרפן A. קומפלקסי HIF-1α-מלילוטוקרפן A יוצרים 0 עד 2 קשרי מימן, בעיקר קשר מימן אחד, כפי שמוצג באיור 10B. באיור 10 C, מספר קשרי המימן של קומפלקס STAT3-melilotocarpan A הוא אפס עד ארבע. ברוב המקרים, אטומי A בין מלילוטוקרפן A ל-HIF-1α מופרדים בפחות מ-0.35 ננומטר. קומפלקסי HIF-1α-מלילוטוקרפן A יוצרים 1-3 זוגות של מגעים קרובים ולעיתים אף 7-9 זוגות. דבר זה מצביע על אינטראקציות יעילות בין המולקולה הקטנה לחלבוני המטרה. לסיכום, גם קומפלקסי AKT1-melilotocarpan A וגם HIF-1α-melilotocarpan A מפגינים יציבות וחוזק.

CC מעכב את התגובה הדלקתית והאפופטוזיס של עכברי SONFH
ניתוח היסטולוגי באמצעות צביעת ABH חשף שינויים אוסטאונקרוטיים בולטים בקבוצת SONFH, שהתאפיינו בפערים ריקים מוגברים, גרעינים פיקנוטיים והפרעה בארכיטקטורה טרבקולרית, בעוד שמאפיינים פתולוגיים אלו הוקטנו באופן ניכר לאחר טיפול ב-CC (איור 11A). ניתוח כמותי אישר כי היחסים בין פערים ריקים לגרעינים פיקנוטיים ירדו משמעותית בקבוצות שטופלו ב-CC לעומת קבוצת SONFH (איור 11B–C). ניתוח מיקרו-CT הראה אובדן חמור של עצם טרבקולר בקבוצת SONFH, שהוחזר חלקית על ידי מתן CC (איור 11D). באופן עקבי, טיפול ב-CC העלה משמעותית את ה-BV/TV והשחפת. תוך הפחתת Tb.Sp ביחס לקבוצת SONFH (איור 11E–G). צביעת אימונופלואורסצנציה הראתה ביטוי HIF-1α מוגבר ורמות ALP מופחתת בקבוצת SONFH, בליווי שינוי בביטוי VEGF. טיפול ב-CC ויתר על ביטוי HIF-1α ו-VEGF ושיפר את אותות ALP, מה שמעיד על שיפור במיקרו-סביבת העצם ובפעילות האוסטאוגנית (איור 11H).

זמינות נתונים:
מערכי הנתונים ששימשו או נותחו במהלך המחקר הנוכחי זמינים בקישור: https://zenodo.org/records/19730455.

איור 1: תרשים זרימה של אסטרטגיית מחקר הפרמקולוגיה ברשת לשיפור SONFH ב-CC. איור 1 מראה שהמחקר מזהה מטרות פוטנציאליות של רכיבים פעילים מ-CC מתוך מסד הנתונים, כאשר SONFH הוא המחלה המרכזית. לאחר חיתוך אלה עם מטרות הקשורות למחלות, נבנו רשת "רכיב–מטרה–מסלול' ומונחי GO, KEGG. עגינה מולקולרית וסימולציה של דינמיקה מולקולרית משמשות להערכת הזיקה הקשירה בין רכיבים מרכזיים למטרות הליבה, כאשר האישור הסופי מתבצע באמצעות אימות ניסיוני. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: סקר מטרות מצטלבות הקשורות ל-SONFH. (A) תרשים הר געש המציג את התפלגות הגנים המובעים באופן שונה בדגימות מחלה. נקודות אדומות מסמלות גנים מופרזים, נקודות כחולות מציינות גנים עם ירידה בוויסות, ונקודות אפור מייצגות גנים חסרי ביטוי שונה משמעותית. (B) מפת חום המציגה את דפוסי הביטוי של 60 הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי, עם עמודות המתאימות לדגימות ושורות המתאימות לגנים. (ג) דיאגרמת ון המציגה את החפיפה של מטרות הקשורות למחלות שהושגו ממאגרי מידע שונים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: סינון מטרות מצטלבות בין CC ל-SONFH. (A) דיאגרמת ון הממחישה את התפלגות 61 המטרות המשותפות המשותפות בין היעדים החזויים של תרכובות פעילות ב-CC (צהוב) ומטרות מחלות הקשורות ל-SONFH (סגול). (ב) רשת תרכובת עשבי מרפא (H-C-T) ממחישה את האינטראקציות בין התרכובות לבין המטרות המתאימות להן. הצומת הריבועי הכחול מייצג את המחלה, צמתים ירוקים ריבועיים מסמנים תרכובות פעילות, ונקודות ריבוע כתומות מציינות מטרות משותפות. קצוות מציינים את האינטראקציות בין תרכובות למטרותיהן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: זיהוי יעד מועמד באמצעות ניתוח PPI. (א) רשת PPI מאבקדת עם תוסף MCODE. (ב) זרימת עבודה סכמטית של סינון טופולוגי בתוך רשת ה-PPI. (ג) גנים מרכזיים שהופקו מרשת ה-PPI על ידי תוסף CytoHubba. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5: תוצאות ניתוח העשרת GO וניתוח העשרת מסלול KEGG עבור 61 היעדים הנפוצים. (א) תרשים בועות המציג את עשרת מונחי ניתוח העשרת GO המובילים עבור BP, CC ו-MF. (ב) ערימת בועה המתארת את 20 מסלולי KEGG העשירים משמעותית. (C) התפלגות 20 המסלולים המועשרים המובילים בהתבסס על סיווג פונקציונלי KEGG. (D) רשת C-T-P להמחשה המתארת את המנגנונים הפוטנציאליים שבאמצעותם CC עשויה לשפר את האוסטאאונקרוזיס של ראש הירך. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 6: מפת חום אנרגיית קישור של האינטראקציות בין התרכובות הפעילות של CC לבין היעדים המרכזיים (kcal/mol). אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של האיור.

איור 7: מצבי קישור של מטרות מפתח עם תרכובות פעילות ספציפיות. AKT1-מלילוטוקרפן A (A1), HIF-1α-מלילוטוקרפן A (B1), STAT3-מלילוטוקרפן A (C1), ESR1-מלילוטוקרפן A (D1), CASP3-מלילוטוקרפן A (E1), SRC-מלילוטוקרפן A (F1), EGFR-מלילוטוקרפן A (G1), AKT1-אנטהול (H1), AKT1-מיריסטיצין (I1). (A2), (B2), (C2), (D2), (E2), (F2), (G2) ו-(H2) ממחישים בהתאמה את מצבי הקישור הדו-ממדיים שלהם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 8: RMSD של MD. (A) ערכי RMSD עבור קומפלקסים AKT1-Melilotocarpan A. (B) ערכי RMSD של קומפלקסים HIF-1α-Melilotocarpan A. (C) ערכי RMSD של קומפלקסים STAT3-Melilotocarpan A. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 9: RMSF של MD. (A) ערכי RMSF של קומפלקסים AKT1-Melilotocarpan A. (B) ערכי RMSF של קומפלקסים HIF-1α-Melilotocarpan A. (C) ערכי RMSF של קומפלקסים STAT3-Melilotocarpan A. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 10: קשרי H של MD. (A) ערכי קשרי H של קומפלקסים AKT1-Melilotocarpan A. (B) ערכי קשר H של קומפלקסים HIF1A-מלילוטוקרפן A. (C) ערכי הקשר H של קומפלקסים AKT1-Melilotocarpan A. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 11: CC מעכב תגובה דלקתית ואפופטוזיס בראש הירך, ובכך משפר את SONFH. (א) חתכי ראש ירך ייצוגיים מוכתמים ב-ABH. פערים ריקים מסומנים על ידי ראשי חץ שחורים, וגרעינים פיקנוטיים מסומנים על ידי חצים. (B–C) ניתוח כמותי של יחס הפערים הריקים (B) למספר גרעיני הפיקנוטים (C). n = 5. (D) שחזורים תלת-ממדיים מיקרו-CT מייצגים של ראשי הירך. (E–G) כימות פרמטרי מיקרו-CT, כולל שבר נפח העצם (BV/TV), הפרדה טרבקולרית (Tb.Sp) ועובי טרבקולר (Tb.Th). (H) צביעת אימונופלואורסצנציה מייצגת של HIF-1α, VEGF ו-ALP בחתכי ראש הירך; הגרעינים צובעו נגד DAPI. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 5). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מונח		העשרת קיפולים	ערך P	רוזן	מזהי משתמש
סרטן שלפוחית השתן		28.44	1.23E-07	7	CREBBP,CXCL8,NOS2,MMP2,STAT3,F2,PTGS2, HIF1A,ESR1,MMP9,EGFR,MTOR,VEGFA,CASP3, ERBB2,EP300,PPARG,NFE2L2,BCL2L1
מסלול איתות HIF-1		16.66	6.56E-10	11	SRC,MMP2,STAT3,HIF1A,ESR1,MMP9,EGFR, MTOR,VEGFA,CASP3,ERBB2,KDR,PDCD4,PTPN6
עמידות למעכבי טירוזין קינאז EGFR		16.66	3.84E-07	8	CCR1,CREBBP,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3 ,EP300,TYK2,PTGS2,HIF1A,MTOR,VEGFA
צומת אדרנס		12.54	1.64E-05	7	CREBBP,ABCB1,CASP3,ERBB2,STAT3,PDCD4, EP300,PTGS2,MMP9,EGFR,MTOR,VEGFA
עמידות אנדוקרינית		11.78	2.35E-05	7	CREBBP,NOS2,NOS3,ERBB2,STAT3, SERPINE1,EP300,HIF1A,EGFR,MTOR,VEGFA
מסלול איתות זעם גילאי בסיבוכי סוכרת		11.55	2.63E-05	7	CCR1,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3,CXCR2,PTGS2,EGFR,MTOR,VEGFA
פרוטאוגליקנים בסרטן		11.43	1.19E-10	14	CXCL8,SRC,NOS3,CASP3,STAT3,PPARG,MMP9,BCL2L1,NFE2L2
נתיב איתות לרקסין		10.25	1.02E-05	8	OXTR,NOS2,NOS3,ERBB2,PTAFR,KDR,NOS1,EGFR,VEGFA
זיהום בהרפס וירוס הקשור לסרקומה של קפוסי		10.20	1.45E-08	12	SRC,ERBB2,STAT3,KDR,EGFR,MTOR,BCL2L1,VEGFA
מסלול איתות הורמון בלוטת התריס		9.56	7.64E-05	7	NOS2,SRC,NOS3,MMP2,NOS1,MMP9,EGFR,VEGFA
מאמץ גזירה נוזלית וטרשת עורקים		8.21	0.000177	7	CREBBP,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3,EP300,TYK2,MMP9
הפטיטיס B		8.18	4.41E-05	8	CREBBP,STAT3,EP300,PTPN6,TYK2,EGFR,MTOR,BCL2L1
מסלול איתות JAK-STAT		7.93	5.35E-05	8	SRC,VDR,STAT3,CYP3A4,ESR1,EGFR,MTOR,VEGFA
זיהום בציטומגאלווירוס האנושי		7.34	6.2E-06	10	CREBBP,CASP3,EP300,TYK2,PTGS2,EGFR,MTOR,VEGFA
ליפידים וטרשת עורקים		6.94	0.000035	9	CXCL8,SRC,MMP2,ERBB2,MMP9,EGFR,VEGFA
מיקרו-RNA בסרטן		6.25	2.06E-06	12	CREBBP,SRC,ERBB2,EP300,PTPN6,PTPRF,EGFR
קרצינוגנזה כימית - הפעלת קולטנים		6.14	0.000265	8	SRC,MMP2,ERBB2,ESR1,MMP9,EGFR,MTOR
מסלולים בסרטן		5.94	6.64E-10	19	CXCL8,NOS3,CASP3,MMP2,STAT3,SERPINE1,VEGFA
מסלול איתות סידן		5.90	0.00011	9	KAT2B,CREBBP,SRC,EP300,HIF1A,ESR1,MTOR
זיהום בנגיף הפפילומה האנושי		4.00	0.00324	8	SRC,NOS3,MMP2,KDR,MMP9,NFE2L2,VEGFA

טבלה 1: תוצאות העשרת KEGG של 20 המסלולים המועשרים המובילים.

טבלה משלימים 1: מידע בסיסי על תרכובות פעילות ב-CC.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 2: היעדים של 85 רכיבים פעילים ב-CC.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 3: מידע על 61 יעדים משותפים CC-SONFH.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 4: תוצאות מונחי קטגוריית תהליכים ביולוגיים מניתוח העשרת GO.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 5: תוצאות מונחי סיווג רכיבי התאים מניתוח העשרת GO.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 6: תוצאות מונחי קטגוריית הפונקציה המולקולרית מניתוח העשרת GO.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 7: תוצאות המסלולים מניתוח העשרת KEGG.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 8: אנרגיות קישור מולקולריות (kcal/mol) של זוגות תרכובת-מטרה.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

טבלה משלימה 9: פרטים על מטרות ורכיבים לעגינה מולקולרית.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

במחקר זה, המחברים קיבלו 85 תרכובות ביואקטיביות מ-CC דרך מספר מאגרי מידע וביצעו סקרים, ביניהם הרכיבים הכימיים העיקריים כוללים אנתול, מלילוטוקרפן A ומיריסטיסין. כדי לזהות מטרות, המחברים חיצו 563 יעדים של CC תרופות עם 1116 יעדים הקשורים ל-SONFH, ובסופו של דבר השיגו 61 יעדים. המחברים ייבאו 61 מטרות נפוצות למאגרי STRING ו-DAVID כדי לבנות רשת PPI ולחקור מסלולים פרמקולוגיים אפשריים. התוצאות חשפו 10 יעדים מרכזיים ברשת ה-PPI, כולל HIF-1α ו-STAT3. איסכמיה והיפוקסיה הן שתיים מהתכונות הפתוגניות המרכזיות של SONFH, לפי מחקרים קודמים³⁵. CC עשוי להשפיע לטובה ב-SONFH באמצעות תהליכים ביולוגיים מרובים, כולל אנגיוגנזה וויסות שעתוק. ניתן להשיג זאת באמצעות מסלול האיתות HIF-1α, מאמץ גזירה נוזלי וטרשת עורקים, ליפידים וטרשת עורקים, מסלול איתות AGE-RAGE בסיבוכי סוכרת, ומסלולי איתות נוספים, לפי ניתוח העשרת KEGG. דבר זה מרמז ש-CC עשויה לפעול לפי SONFH דרך היעדים המרכזיים הללו והמסלולים הנלווים. כדי להבהיר עוד יותר האם רכיבי ה-CC קשורים באופן הדוק ליעדים, בהתבסס על תוצאות מחקר הפרמקולוגיה של הרשת שהוזכרו לעיל, כלומר תוצאות הסינון של הרכיבים הפעילים במרשם התרכובת ותוצאות הסינון של היעדים ברשת PPI, המחברים ערכו סימולציות דינמיקה מולקולרית של המלילוטוקרפן A-AKT1, מלילוטוקרפן A-HIF-1α, ו-STAT3-melilotocarpan קומפלקסים. זה מראה שמלילוטוקרפן A נקשר ל-AKT1, HIF-1α ו-STAT3 באופן יציב, ולכן ייתכן ש-CC אכן ישפיע לטובה על ידי פעולה על מטרות מפתח אלו. בסך הכול, באמצעות מנגנון רב-רכיבי, רב-מטרות ורב-מסלולים, CC עשוי להשפיע על איכות החיים של מטופלי SONFH.

קבוצת המחקר התמקדה בהבהרת המנגנונים שבאמצעותם YGPs מפעילים אפקטים טיפוליים במחלות הקשורות לעצמות. המחקר הקודם הצביע על כך ש-YGPs משפרים את היווצרות העצם ומשפרים את המיקרו-ארכיטקטורה הטרבקולרית בראש הירך על ידי הפעלת β-קטנין לעיכוב אוסטאוקלסטוגנזה ולקידום אוסטאוגנזה במהלך SONFH^{הארנב 36}. יתרה מזאת, החוקרים מצאו כי YGPs מפעילים השפעות טיפוליות על SONFH בעיקר על ידי הקלה על דלקת וקידום אנגיוגנזה¹². YGPs לא רק יכולים לשפר את SONFH אלא גם לשפר את האוסטאופורוזיס. על ידי עיכוב מסלול האיתות של IL-17/NF-κB והפחתת תגובות החיסון ל-Th17, YGPs מצליחים לעצור אובדן עצם שנגרם מכריתת שחלות³⁷. באמצעות ניסויים בבעלי חיים, החוקרים אישרו כי Cornus officinalis, אחד מרכיבי YGPs, משפיע על SONFH על ידי עיכוב הפרשת מתווכים דלקתיים ואפופטוזיס תאי עצם³⁸. CC, שיכול לחמם את היאנג ולהועיל לצ'י ולשחרר את המרידיאנים, הוא הצמח המרכזי ב-YGP, ומשחק תפקיד מרכזי בשיפור SONFH והקלה על סבל המטופלים. לסיכום, מחקרים אלו משקפים את המיקוד המתמשך בהבהרת מנגנוני YGPs באוסטאונקרוזה ובזיהוי CC כעשב עשב מרכזי ששווה מחקר מכני ב-SONFH.

מבין המרכיבים הפעילים החזויים, אנתול, מיריסטיצין ורכיבים נוספים הראו פעילות ביולוגית נגד מחלות הקשורות לעצמות. הוכח כי אנתול מעכב את העלאת סמני ספיגת העצם. אנתול בסופו של דבר מפחית התמיינות אוסטאוקלסטית ותפקוד ספיגה על ידי עיכוב מסלולים במורד הזרם וגורמים רגולטוריים מרכזיים³⁹. מחקרים מראים כי אנתול מציג תכונות אנטי-דלקתיות ומעכב התמיינות אדיפוגנית בתאי גזע מזנכימיים של מח עצם אנושי (hBMSCs^). מיריסטיצין מעכב דלקת ומגן על תאי השריר החלק הווסקולרי על ידי דיכוי מסלולי PI3K/Akt ו-NF-κB⁴¹. פרופטוזיס הוא אחד המנגנונים המרכזיים שמאחורי פתוגנזה של SONFH. פרופטוזיס הוא סוג של מוות תאי מתוכנת הנגרם על ידי פרוקסידציה של שומנים התלויה בברזל. מיריסטיצין מונע פרופטוזיס, ובכך מגן על ההומאוסטזיס של רדוקס של ממברנות תאי האוסטאובלסט⁴². המרכיב הנוסף של בורניאול אושר כמעכב את היווצרות טבעות אקטין, תכונה של אוסטאוקלטים מחזירים המשקפים קיטוב תאים, בתוך 30 דקות^ו-43 דקות. ממצאים אלו מצביעים על כך שרכיבים אלו עשויים להיות חשובים מאוד להשפעה המגנה של CC ב-SONFH, והם ראויים לחקירה נוספת. בתוך כל המרכיבים הללו, מלילוטוקרפן A נבחר כליגנד המייצג משום שהפגין את זיקות הקשירה היציבות ביותר עם מספר מטרות ליבה בניתוח MD. מבין התרכובות המדורגות ביותר, Melilotocarpan A הראה אינטראקציות קשירה חזקות ועקביות עם מספר חלבונים מרכזיים ברשת PPI, מה שמרמז כי ייתכן שהוא מייצג רכיב ביואקטיבי מרכזי ב-CC.

בנוסף, תוצאות רשת ה-PPI חשפו כי במיוחד HIF-1α ו-STAT3 עשויים להיות היעדים המרכזיים. HIF-1α הוא המתווך המרכזי של התגובה התאית להיפוקסיה. בניסויי SONFH, הפעלת HIF-1α משפרת את האנגיוגנזה ותיקון העצם, ובכך מקלה על נמק ראש הירך⁴⁴. בנוסף, מחקרים מצאו כי HIF-1α יכול להפעיל אפקט הגנה על רקמת הסחוס^בתנאי היפוקסיד. ויסות HIF-1α מדכא את הפרופטוזיס ומפעיל את STAT3 כדי להאיץ את התמיינות המונוציטים של מח העצם לאוסטיאוקלסטים⁴⁶. STAT3 הוא מפעיל העברת אותות ושעתוק. HBMSCs מקדמים את ההמרה של STAT3 ל-p-STAT3, ובכך משפרים את התרבות הכונדרוציטים, הנדידה וההשפעות האנטי-אפופטוטיות בתנאים היפוקסיים⁴⁷. STAT3 משפר את ההבדלות האוסטוגנית וההשפעות האנטי-אפופטוטיות של hBMSCs תוך הגברת הפרשת גורם גדילה אנדותליאלי וסקולרי (VEGF) כדי לקדם התחדשות מיקרווסקולרית של עצם⁴⁸. AKT1 הוא קינאז חלבון הפועל כמתווך מרכזי באיתות אנגיוגנזה. AKT1 מעורב בקישור אנגיוגנזה-אוסטאוגנזה בעצם וביצירת עצם טרבקולרית⁴⁹. בסך הכול, מטרות המרכז הללו מתכנסות סביב אנגיוזנזה, הסתגלות להיפוקסיה, דלקת ועיצוב מחדש של עצם, מה שמרמז כי CC עשוי להפעיל אפקטים מגנים נגד SONFH על ידי ויסות מטרות אלו ומסלולי האיתות הנלווים להן.

כדי לחקור את מנגנון ה-CC בשיפור SONFH, ביצעו החוקרים ניתוח GO וניתוח העשרת KEGG. תוצאות GO מראות כי הגנים המטרה מועשרים בעיקר בתפקודים ביולוגיים כגון תגובה להיפוקסיה, תגובה תאית לליפופוליסכריד, וויסות חיובי של אנגיוגנזה. ניתוח העשרת KEGG הצביע על כך שההשפעות הפרמקולוגיות של CC ב-SONFH קשורות בעיקר למסלול איתות AGE-RAGE בסיבוכי סוכרת, מסלול איתות HIF-1α, לליפידים וטרשת עורקים, ולמסלולי איתות נוספים. SONFH מתרחש כאשר זרימת הדם לראש הירך מופרעת, מה שמוביל לחוסר תמיכה תזונתית לראש הירך וגורם לאפופטוזיס תא⁵⁰. HIF-1 מורכב מ-HIF-1α ו-HIF-1β, כאשר HIF-1α ממלא תפקיד מרכזי בתגובה השעתוקית לסביבות היפוקסיות ואיסכמיות⁴⁷. מחקרים קודמים הראו כי, באמצעות מפל האיתות VEGF/AKT/mTOR, HIF-1α מתאם את האוסטאוגנזה והאנגיוגנזה, ובכך משפר באופן קריטי את ההתמיינות האוסטאוגנית של תאי גזע שמקורם בשומן. לאחר שמתרחשת איסכמיה, מתפתחת היפוקסיה ברקמה, מה שמוביל לעלייה ניכרת של HIF-1α בתוך התאים. מה שמגביר את רמות ביטוי ה-VEGF ובכך מקדם תיקון והתחדשות כלי דם⁵¹. היפוקסיה משבשת את ייצור האנרגיה המיטוכונדריאלית ומגבירה את היווצרות מיני חמצן תגובתי (ROS). שינויים אלו מקדמים אוסטאוקלסטוגנזה, מעכבים פעילות אוסטאובלסטים, ולבסוף גורמים לאפופטוזיס של האוסטאוציטים. ביטוי גבוה של HIF-1α משנה את חילוף החומרים של אנרגיה תאית מזרחון חמצוני לגליקוליזה, מפחית את ייצור ROS ובכך מחליש אפופטוזיס באוסטאובלסטים ואוסטאוציטים^52,53. עצם הקוצלית תומכת בתפקוד ההמטופואטי של מח העצם ואוגרת מינרלים כמו סידן. פעילות מוגברת של HIF-1α יכולה להגדיל ישירות את היווצרות העצם המנצלת⁵⁴. בנוסף, HIF-1α שומר על הישרדות כונדרוציטים והומאוסטזיס בתנאים היפוקסיים⁴⁵. כתוצאה מכך, מסלול האיתות HIF-1α הפך למטרה טיפולית ל-ONFH, עם יישום טיפולי פוטנציאלי ל-ONFH.

במסלול האיתות של AGE-RAGE, תוצרי קצה גליקציה מתקדמים (AGEs) נוצרים מקישור צולב קוולנטי לא-אנזימטי של פחמימות עם חלבונים, שומנים או מקרומולקולות^{ביולוגיות אחרות}. AGEs עלולים לפגוע בתאים וברקמות באמצעות נזק דלקתי ומחמצן. דרך ארבעה מסלולים, האותות מועברים על ידי אינטראקציה AGE-RAGE. הם 1) JAK-2-STAT1, (2) PI3K-AKT, (3) MAPK-ERK, ו-(4) NADPH oxidase-ROS⁵⁶. בסופו של דבר, ה-NF-κB המזרחן נכנס לגרעין כדי לתעד את ביטוי הציטוקינים הפרו-דלקתיים, גורמי גדילה, ציטוקינים פרופיברוטיים ולחץ חמצוני. המחקר הראה כי AGE-RAGE מקדם אפופטוזיס אוסטאובלסטים דרך מסלול האיתות של MAPK והפעלת לחץ חמצוני, ומעכב התמיינות אוסטאוגנית על ידי דיכוי רמות חיישני לחץ רשתית אנדופלזמית, וכן באמצעות מתילציה DNA/מסלול Wnt⁵⁷. בנוסף, מחקרים הצביעו על כך ש-AGEs ו-RAGEs משתתפים בהתיידות כלי הדם⁵⁸.

במסלול האיתות של שומנים וטרשת עורקים, ליפידים מחומצנים מפעילים PPARγ. זהו רגולטור ראשי של הדיפוגנזה שמעכב התמיינות אוסטאוגנית⁵⁹. בנוסף, מספר מחקרים הראו כי ליפידים משפיעים על ההבדלה והבשלת האוסטיאוקלסטים והאוסטאובלסטים, ובכך משבשים את ההומאוסטזיס של העצם⁶⁰. מחקרים יסודיים רבים הוכיחו את המעורבות המשמעותית של אפופטוזיס במנגנונים הפיזיולוגיים והפתולוגיים של SONFH. ניסויים מאוחרים יותר בבעלי חיים בחיות חיות אישרו עוד יותר כי החלק הפעיל של ה-CC מדכא אפופטוזיס ודלקת ב-SONFH, ובכך מפחית את התקדמות המחלה.

בהתאם לממצאים אלו, פרמקולוגיה רשתית וניתוחים ניסיוניים מצביעים על כך ש-CC עשוי לשפר את SONFH על ידי תיאום התאמת היפוקסיה, ויסות אנגיוגנזה וויסות תהליכים מטבוליים. ניתוח מיקרו-CT כמותי גילה כי התערבות CC שיקמה משמעותית את שבר נפח העצם (BV/TV), הפחיתה את ההפרדה הטראבקולרית (Tb.Sp, Tb.Th), וקידמה את התאוששות המיקרו-מבנה של העצם. ניתוח העשרת KEGG הדגיש עוד יותר את מסלול האיתות HIF-1α כמנגנון מרכזי מאחורי השפעות אלו. יחד, ניסויים אלו מצביעים על כך ש-CC עשוי להקל על SONFH על ידי ויסות תהליכים ביולוגיים הקשורים להיפוקסיה ולדלקת ולקידום אנגיוגנזה ועיצוב מחדש של עצם, ייתכן באמצעות מסלולים מרכזיים כמו מסלול האיתות HIF-1α.

למרות שהושגו ממצאים ראשוניים חשובים, למחקר זה עדיין יש מגבלות מסוימות. המחברים הסתמכו אך ורק על שיטות ביואינפורמטיקה מודרניות, כולל פרמקולוגיה רשתית ו-MD, וכן על ניסויים בבעלי חיים, כדי לחקור את תפקיד ה-CC ב-SONFH. לכן, יש לאמת עוד יותר את האמינות והדיוק של התחזיות בניסויים in vivo וב-in vitro . מחקר זה מספק רמזים ראשוניים למנגנונים שבאמצעותם CC משפר את SONFH, שדורשים אימות ניסיוני נוסף. על ידי שילוב פרמקולוגיה רשת עם MD, המחברים מיפו באופן שיטתי את הרכיבים הביואקטיביים המועמדים, היעדים המרכזיים והמסלולים המועשרים של CC ב-SONFH. לסיכום, מחקר זה חקר את ההשפעות המגנות האפשריות של CC ב-SONFH באמצעות פרמקולוגיה רשת אינטגרטיבית ואימות in vivo . התוצאות מצביעות על כך שהמנגנונים היו קשורים בעיקר למודולציה של מסלול האיתות HIF-1 ולקידום התחדשות אוסטאוגנית. כפי שמודגם באיור המתאים, שיפור ה-CC ווסת משמעותית את הביטוי של חלבונים מרכזיים, כולל HIF-1α, VEGF ו-ALP, באופן תלוי במינון, ובכך תמך עוד יותר בתפקידו בתיאום התאמת היפוקסיה, אנגיוגנזה ופעילות אוסטאוגנית. ממצאים אלו אושרו בניתוח מיקרו-CT, שהראה כי התערבות CC החזירה ביעילות את שבר נפח העצם ושיפרה את המיקרו-מבנה הטרבקולרי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
4% PFA	ביושארפ	BL539A
אתנול מוחלט	קבוצת סינופארם Co.Ltd	10009218
ערכת הכתם הכחול האלקי	סולרביולוגיה	G1563
ALP	אריגו	ARG57422
אוטודוק וינה	מחקר סקריפס		גרסה 1.2.7
AutoDockTools	מחקר סקריפס		גרסה 1.5.7
פלטפורמת ביואינפורמטיקה מקוונת			https://www.bioinformatics.com.cn
שדה כוח CHARMM36			משמש לפרמטריזציה של MD
CTD			https://ctdbase.org
ציטוסקייף	קונסורציום סייטוסקייף		גרסה 3.10.3; פלאגינים: CytoHubba, CytoNCA
פתרון צביעת DAPI	ביוטיים ביוטק בע"מ	C1006-50mL
דיוויד	NCI		https://david.ncifcrf.gov
Discovery Studio Visualizer	ביוביה		BIOVIA Discovery Studio 2020; ויזואליזציה של עגינה
DisGeNET			https://disgenet.com
דה-קלציפיקציה של EDTA	ביוטיים ביוטק בע"מ	C0167-3L
תמיסת חסימת פרוקסידאז אנדוגנית	ביוטיים ביוטק בע"מ	P0100A
ג'ינקארדס			https://www.genecards.org
GEO (GSE123568)	NCBI		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
עז אנטי-ארנב IgG(H+L)(Alexa Fluor 488)	CST	4409
סרום עזים	ביוטיים ביוטק בע"מ	C0265
פריזמת GraphPad	GraphPad (דוטמטיקס)		גרסה 10; ניתוח סטטיסטי וגרפים
גרומקס	גרומקס		גרסה 2022; שדה כוח CHARMM36
עשב 2.0			http://herb.ac.cn/v2/
HIF-1 ו-alpha;	האנגג'ואו חואן	HA721997
ציוד מיקרו-CT ברזולוציה גבוהה	ברוקר	סקייסקן
מסנן כללי ליפינסקי			Mw & le; 500; miLogP & le; 5; HBD & le; 5; HBA & le; 10
ליפופוליסכריד	סיגמא-אלדריץ'	L4516
מתילפרדניזולון	קבוצת סינופארם Co.Ltd	CATOCCAD302504100MG
בלסם נייטרלי	ביושארפ	BL704A
OMIM			https://www.omim.org
פרפין	קבוצת סינופארם Co.Ltd	C416770020
רשת חלקיקים של Ewald (PME)			אלקטרוסטטיקה לטווח ארוך
PubChem	NIH		https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
PyMOL	Schrö דינגר		הדמיית חלבונים וההכנה
R	קראן		גרסה 4.4.3
RCSB PDB			https://rcsb.org
מיתר			https://string-db.org
SwissADME	המכון השווייצרי		http://www.swissadme.ch
SwissTargetPrediction	המכון השווייצרי		http://www.swisstargetprediction.ch
מודל המים של TIP3P			משמש לפתרון
UniProt			https://www.uniprot.org
VEGF	האנגג'ואו חואן	ET1604-28
ויישנגשין			https://www.bioinformatics.com.cn
Windows 11	מיקרוסופט		משמש לעיבוד נתונים, עגינה מולקולרית וסימולציות MD
קסילן	קבוצת סינופארם Co.Ltd	10023418