בידוד, סינתזה ואפיון של ננו-חלקיקים פוליאוריתיים מצופים ממברנת מקרופאג (לקטית-קו-גליקולית) בממברנת CD47 ואינטגרין α4/β1

Summary

פרוטוקול זה מאפשר הכנה ואפיון של ננו-חלקיקי פולי (חומצה לקטית-קו-גליקולית) מצופים ממברנה-מקרופאג' עם ממקרופאגים מתואמים CD47 ואינטגרין α4/β1 ליישומים ממוקדים של אספקת תרופות.

Abstract

טרשת עורקים היא מחלה דלקתית כרונית ותורמת מרכזית לתחלואה ולתמותה קרדיווסקולרית. מתן ממוקד של תרופות נוגדות דלקת לאתרים עם טרשת עורקים נותר אתגר משמעותי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכנת ואפיון ננו-חלקיקי פוליפולי (MMM/COL) מצופים קולכיצין עם ממברנת מקרופאג (MMM/COL) עם ממברנת CD47 ואינטגרין α4/β1. הפרוטוקול כולל שינוי מקרופאגים באמצעות טרנספקציה של פלסמיד וגירוי אנדותלין-1, בידוד ממברנה, ייצור NP וציפוי ממברנה. ה-MMM/COL NPs המתקבלים מוערכים באמצעות אפיון פיזיקוכימי, ניתוח ביטוי חלבונים, ובדיקות במבחנה ובחינות in vivo . אימות תפקודי כולל הערכת הקשר התאים לתאי אנדותל מופעלים, קליטת מקרופאג'ים, השפעות אנטי-דלקתיות בתאי הקצף, וביו-פיזור במודל טרשת עורקים של עכברים. בנוסף, מודגשים פרמטרים ניסיוניים מרכזיים ושלבי בקרת איכות כדי להבטיח שחזוריות ועקביות בין המעבדות. פרוטוקול זה מספק גישה חזקה וניתנת להרחבה ליצירת NPs ביומימטיים ליישומים ממוקדים של אספקת תרופות במחקר טרשת עורקים.

Introduction

טרשת עורקים היא מחלה דלקתית כרונית הגורמת לאירועים קרדיווסקולריים קטלניים ולשבץ דרך היצרות לומן עורקי וקרע לא יציב של רובד, מה שמסביר עומס בריאותי עולמי משמעותי ^1,2,3. הפחתת תגובות דלקתיות באתר הטרשת עורקים ^{היא יעד} טיפולי עיקרי. קולכיצין, תרופה אנטי-דלקתית חזקה, הראתה פוטנציאל בהפחתת אירועים קרדיווסקולריים^{שליליים 6,7}. עם זאת, התועלת הקלינית שלו מוגבלת על ידי חלון זמן טיפולי צר ותופעות לוואי מערכתיות, המחייבות מערכות אספקה ממוקדות לשיפור הצטברות הפלאק ומזעור רעילות⁸.

ננו-חלקיקים מצופים ממברנת תא (NPs) הפכו לפלטפורמה עוצמתית להעברת תרופות ממוקדת, תוך ניצול הפונקציות הביולוגיות הטבעיות של תאי המקור ^9,10,11. מבין סוגי התאים המעורבים בטרשת עורקים, מקרופאג'ים ממלאים תפקיד מרכזי 12,13,14. אינטגרין α4/β1, המובע על מקרופאגים, מתווך גיוס לפלאקים אטרוסקלרוטיים על ידי קישור למולקולת ההידבקות של תאי כלי דם-1 (VCAM-1) המובעת על תאי אנדותל פעילים (ECs). CD47, אות "אל תאכל אותי", מאפשר התחמקות מפגוציטוזה על ידי מערכת הפגוציטים המונו-גרעינית^15,16. על ידי הנדסת ממברנות מקרופאגים לביטוי יתר על המידה של חלבונים אלה לעומת ממברנות מקרופאגים טבעיות, ניתן ליצור NPs עם מיקוד משופר באמצעות אינטראקציה של אינטגרין α4/β1–VCAM-1 ופגוציטוזה מופחתת באמצעות איתות מתווך CD47⁶. אסטרטגיית השינוי הכפול משפרת את NPs מצופים ממברנה טבעיים ומערכות מיקוד מבוססות ליגנדים, על ידי שיפור המיקוד ל-ECs מופעלים והפחתת ניקוי הפגוציטים. בניגוד לממברנות מקרופאגים טבעיות שמבטאות רק רמות בסיסיות של חלבונים אלו, הממברנה המהונדסת שלנו מספקת פונקציונליות משופרת מבלי להכניס ליגנדים סינתטיים שעשויים להפעיל אימונוגניות.

פרוטוקול זה מפרט את ההכנה והאפיון של NPs פוליאקוליים (חומצה לקטית קו-גליקולית) טעונים בקולכיצין (COL) מצופים בממברנות מקרופאג משולבות CD47 ואינטגרין α4/β1, המייצרות NPs מצופים ממברנת מקרופאג מותאמים (MMM/COL NPs). אנו מתארים שיטות לשינוי גנטי ופרמקולוגי של מקרופאג'ים RAW 264.7, בידוד ממברנות מותאמות, הכנה וציפוי של NPs PLGA, ובדיקות פונקציונליות מקיפות במבחנה ובחיי . שיטה זו מספקת מסגרת שכפולה להכנת והערכת NPs ביומימטיים ליישומים ממוקדים של אספקת תרופות במחקר טרשת עורקים.

Protocol

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית של בית החולים נאנג'ינג דראם טאוור ופעל לפי ההנחיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה שנקבעו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות.

1. שינוי של מקרופאג'ים RAW 264.7

1. הכינו תאי RAW 264.7, מדיום Modified Eagle של Dulbecco מלא בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין–סטרפטומיצין, פלסמיד ביטוי יתר CD47, תגובת טרנספקציה ליפופקטמין 3000, אנדותלין-1 (ET-1), סליין בופר-פוספט (PBS) ואספקת תרביות רקמה סטרילית.
2. תרבית תאי RAW 264.7 באינקובטור לחות בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ ושומרים על התאים עד שהם מגיעים לכ-4–5 ×-10^תאים בכל באר בלוח עם 6 בארות.
3. בצע שינוי CD47
   1. הכינו תמיסת DNA לפלסמיד על ידי ערבוב 2.5 מיקרוגרם DNA פלסמיד עם 5 מיקרוליטר של תגובת P3000 בתווך ללא סרום Opti-MEM בנפח 125 מיקרולטר.
   2. הכינו תמיסת תגובת טרנספקציה על ידי דילול 3.75 מיקרוליטר של תגובת טרנספקציה ב-125 מיקרוליטר של מדיום חופשי מסרום.
   3. השתמש בנפחים האלה לפורמט פלטות עם 6 בארים. קנה מידה של כל הרכיבים באופן פרופורציונלי עבור פורמטים אחרים תוך שמירה על יחס DNA:P3000 של 1:2 (μg:μL) ויחס תגובה DNA:transfection של 1:1.5 (μg:μL).
      הערה: לדוגמה, השתמש ב-10 מיקרוגרם DNA, 20 מיקרוליטר של P3000, ו-15 מיקרוליטר של תגובת טרנספקציה לצלחות של 10 ס"מ.
   4. משלבים את תמיסת ה-DNA עם תמיסת הטרנספקציה ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 25°C.
   5. הוסף את קומפלקסי הטרנספקציה לתאים ב-DMEM ללא אנטיביוטיקה בתוספת 10% FBS בכ-2–2.5 ×-10⁶ תאים לכל צלחת 10 ס"מ.
   6. החלף את המדיום במדיום טרי ומלא המכיל אנטיביוטיקה 6 שעות לאחר הטרנספקציה.
4. ביצוע שינוי אינטגרין α4/β1
   1. גירוי תאים שעברו טרנספקט או לא טרנספקט עם 100 ננומטר ET-1 במדיום ללא סרום למשך 24 שעות כדי להעלות את ביטוי האינטגרין α4/β1.
      הערה: אימות יעילות השינוי באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) וניתוח ווסטרן בלוט עבור CD47, אינטגרין α4 ואינטגרין β1.

2. בידוד ממברנת מקרופאגים מותאמת (MMM)

1. קצור את תאי RAW 264.7 המותאמים באמצעות מגרד תאים.
2. צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 900 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4°C.
3. שטוף את כדור התא שלוש פעמים עם 1× PBS קר.
4. החזירו את כדור התא ל-2 מ"ל של בופר ליזיס היפוטוני מקורר מראש (10 מ"ם טריס-HCl, pH 8.0, 1 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ MgCl₂, ו-1 מ"מ פלואוריד פנילמתילסולפוניל) והדגרו את ההשעיה על הקרח למשך 15 דקות.
5. הקפיאו את התעלה בחנקן נוזלי למשך 2 דקות, ואז הפשרו אותה באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. חזור על מחזור ההקפאה-הפשרה חמש פעמים כדי לפרק את התאים במלואם.
   אזהרה: חנקן נוזלי עלול לגרום לכוויות קריוגניות קשות. לטפל בכפפות מבודדות מתאימות והגנה מפני הפנים.
6. צנטריפוגה את הליזאט בטמפרטורה של 850 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי להסיר גרעינים ותאים שלמים.
7. צנטריפוגה את הסופרנטנט שנאסף ב-15,000 × גרם למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C. כדי להשיג טוהר ממברנה גבוה יותר, להעביר את הסופרנטנט שהושג לאחר 15,000 × גרם צנטריפוגה לצינורות אולטרה-צנטריפוגה וצנטריפוגה ב-100,000 × גרם למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4°C באמצעות אולטרה-צנטריפוגה.
   אזהרה: ודאו שצינורות האולטרה-צנטריפוגה מאוזנים כראוי ומדורגים לצנטריפוגה מהירה כדי למנוע חוסר איזון או כשל ברוטור.
   הערה: אולטרה-צנטריפוגציה מניבה ממברנות פלזמה מטוהרות עם הפחתת זיהום אברוני תוך-תאי.
8. אספו את הכדור המכיל קטעי MMM ותשאו מחדש ב-300 מיקרוליטר של 1× PBS או בופר ליזיס כדי לקבל ריכוז חלבון של כ-1–2 מ"ג/מ"ל.
9. קבעו את ריכוז החלבון בממברנה באמצעות ערכת בדיקת כימות חלבון BCA.
   הערה: ממברנות מבודדות יכולות להיאחסן בטמפרטורה של −80°C לשימוש מאוחר יותר.

3. הכנת NPs PLGA טעונים בקולכיצין (COL NPs)

1. המיס 10 מ"ג PLGA (50:50, MW 90,000) ו-1 מ"ג קולכיצין ב-1 מ"ל דימתיל סולפוקסיד (DMSO).
   זהירות: DMSO עלול לחדור לעור ולשפר את הספיגה של חומרים אחרים. לבשו ציוד מגן אישי מתאים (כפפות ניטריל, חלוק מעבדה ומשקפי מגן) בעת הטיפול. אספו תמיסות המכילות DMSO כפסולת אורגנית ממס והיפטרו באמצעות שירותי סילוק פסולת מסוכנת מורשים. קולכיצין הוא רעיל ועלול להיות טרטוגני. לאסוף את כל החומרים המזוהמים בקולכיצין (תמימות, כפפות וצינורות) כפסולת תרופתית מסוכנת ולהיפטר באמצעות שירותי סילוק פסולת מסוכנת מורשים בהתאם לתקנות מוסדיות ומקומיות.
2. ערבבו את התמיסה במהירות 500 סל"ד באמצעות ערבוב מגנטי עם מוט ערבוב מצופה טפלון 10 מ"מ בטמפרטורה של 25°C.
3. הוסף 4 מ"ל מים אולטרה-טהורים בזרם של כ-1 מ"ל לדקה באמצעות משאבת מזרק עם מזרק של 5 מ"ל ומחט 26 גרם ב-25°C.
4. המשיכו לערבב את התערובת במשך 3 שעות כדי לאפשר יצירת NP.
5. העבר את המתלה של NP לתיק דיאליזה (MWCO 3,500 Da).
6. דיאליז נגד 2 ליטר מים מזוקקים ב-4°C תחת ערבוב עדין ב-200 סל"ד.
7. המשך דיאליזה במשך 24 שעות והחלף את בופר הדיאליזה לחלוטין ב-6, 12 ו-24 שעות כדי להסיר קולכיצין חופשי ו-DMSO.
   אזהרה: לאסוף את כל הממסים והריאגנטים האורגניים, כולל אלה מהדיאליזה, כפסולת כימית אורגנית. אל תשליכו אותו לניקוז. פעלו לפי נהלי טיפול מוסדי בפסולת מסוכנת.
8. אסוף את מתלה ה-COL NP עם דיאליזציה ואחסן בטמפרטורה של 4°C.
   הערה: ניתן לאחסן NPs ב-COL בטמפרטורה של 4°C לשימוש קצר טווח (עד 3 ימים). לצורך סימון פלואורסצנטי, יש לשלב 0.1% (w/w) של צבע 1,1′-דיוקטדציל-3,3,3′,3′-טטרמתילינדוקרבוציאנין פרכלוראט (DiI) לתמיסת PLGA במהלך שלב 3.1.
9. אמת את הסרת DMSO וקולכיצין חינם
   1. אספו את הדיאליזט הסופי (הבופר לאחר השינוי האחרון ב-24 שעות) ונתחו אותו באמצעות ספקטרופוטומטריה אולטרה-סגולה-נראית (UV–vis).
   2. סרוק את הדיאליזה מ-200 ל-400 ננומטר והשווה לדגימת בקרה (בופר דיאליזה טרי).
   3. אשר שאין שיא ספיגה בכ-210 ננומטר (אופייני ל-DMSO) או ב-345 ננומטר (אופייני לקולכיצין), מה שמעיד על הסרה מוצלחת של ממס שארתי ותרופה חופשית.
   4. חלופה נוספת היא לקבוע את ריכוז ה-DMSO השארי באמצעות ערכת בדיקת DMSO לפי הוראות היצרן. ודא ששארית ה-DMSO נמוכה מ-0.1% (v/v) כדי למנוע ציטוטוקסיות בבדיקות במורד הזרם.

4. ייצור NPs מצופים ממברנה (MMM/COL NPs)

1. הסאוניק את המתלה המבודד של MMM (משלב 2.7) למשך 20 דקות באמצעות סוניקטור אמבט מים בתדר 40 קילוהרץ ו-110 וואט. שמור על נפח הדגימה ב-1 מ"ל בצינור של 1.5 מ"ל וטמפרטורה מתחת ל-25°C באמצעות אמבטיית קרח לפי הצורך.
2. הוציא את תליית הממברנה הסוניקית דרך מסנן ממברנה פוליקרבונטית בגודל נקבוביות של 400 ננומטר באמצעות אקסטרודר מיני ליצירת וזיקולות ממברנה.
3. מערבבים את NPs של COL (מהשלב 3.5) עם וזיקולות ה-MMM ביחס מסה של חלבון ל-PLGA של הממברנה של 1:1.
   1. השתמשו בתרסיס ממברנה המכיל 10 מ"ג חלבון עבור 10 מ"ג PLGA כפי שנקבע באמצעות בדיקת כימות חלבון.
   2. ערבב בעדינות פיפט את NPs של COL עם וזיקולות MMM למעלה ולמטה 15 פעמים באמצעות פיפטה של 1 מ"ל.
4. אקסטרודה משותפת של התערובת דרך מסנן ממברנת פוליקרבונט עם גודל נקבוביות של 200 ננומטר וחזרו על האקסטרוזיה במשך 15 מעברים.
5. אסוף את המתלים המכילים NPs של MMM/COL ואחסנו אותם בטמפרטורה של 4°C לשימוש מיידי.

5. אפיון של NPs

1. מדדו את הקוטר ההידרודינמי, מדד הפולידיספיזציה (PDI) ופוטנציאל זטה באמצעות פיזור אור דינמי (DLS) בתנאים הבאים: טמפרטורה, 25°C; זווית פיזור אחורה, 173°; זמן שיווי משקל, 2 דקות; ושלוש מדידות שכפול לכל דגימה.
2. דיללו את הדגימות פי 20 במים דה-יוניים (ריכוז סופי, כ-0.1 מ"ג/מ"ל).
   הערה: דילול ממזער השפעות פיזור מרובות.
3. המחשת מבנה הליבה-קליפה של NPs של MMM/COL באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הולכה (TEM).
   1. הניחו 5 מיקרוליטר של מתלים NP (כ-0.1 מ"ג/מ"ל) על רשת נחושת מצופה פחמן (300 רשתות) עם פריקה זוהרת.
   2. תן לדגימה להיספג במשך 2 דקות בטמפרטורה של 25°C.
   3. הסר נוזלים עודפים על ידי נגיעה עדינה בקצה הרשת עם נייר סינון.
   4. מרחו 5 מיקרוליטר של תמיסת אצטט אורניל 1% על הרשת ודגרו במשך דקה אחת בטמפרטורה של 25°C.
   5. הסר את הכתמים העודפים עם נייר פילטר.
   6. תן לרשת להתייבש באוויר לפחות 10 דקות לפני ההדמיה.
      אזהרה: אצטט אורניל הוא רעיל ורדיואקטיבי. לטפל בציוד מגן אישי מתאים (כפפות, חלוק מעבדה והגנה על עיניים), ולהיפטר מהפסולת בהתאם להנחיות מוסדיות לחומרים מסוכנים.
4. יש לסמן את הממברנה בצבע 3,3′-דיוקטאדצילוקסקרבוציאנין פרכלוראט (DiO) במהלך שלב 2 או על ידי סימון תאים שלמים לפני בידוד הממברנה, ולסמן את ליבת ה-PLGA ב-DiI.
5. ניתוח הקו-לוקליזציה של אותות DiO (ירוק) ו-DiI (אדום) באמצעות מיקרוסקופ סורקת לייזר קונפוקלי (CLSM).
   1. הגדר פרמטרים של עירור/פליטה כך: DiO (ירוק), עירור 488 ננומטר, פליטה 550 ננומטר; DiI (אדום), עירור 561 ננומטר, פליטה 620 ננומטר.
   2. השתמש בעדשת אובייקטיבית של 60× טבילה בשמן (צמצם נומרי, 1.4).
   3. כוון את החור ליחידת Airy אחת.
   4. כוון את הגיין של הגלאי כדי להימנע מרוויית פיקסלים.
   5. רכוש תמונות ברזולוציה של 1024 × 1024 פיקסלים עם ממוצע קווים של 2×.
   6. שמור על עוצמת הלייזר מתחת ל-5% כדי למזער הלבנת פוטו.
6. נתח את נוכחות CD47, אינטגרין α4 ואינטגרין β1 על פני השטח של MMM/COL NP באמצעות ניתוח Western blot.
7. קביעת טעינת ושחרור סמים
   1. לעבור נפח של 100 מיקרו-ליטר של NPs ב-DMSO ולמדוד את ספיגת הקולכיצין ב-345 ננומטר כדי לקבוע את יעילות הטעינה והעטיפה של התרופות.
   2. הניחו 1 מ"ל של תליית MMM/COL NP (המכילה כ-100 מיקרוגרם קולכיצין) בשקית דיאליזה (MWCO, 3,500 Da).
   3. אטום את השקית וטבול אותו ב-50 מ"ל PBS (pH 7.4) המכיל 20% FBS בכוס זכוכית של 100 מ"ל.
   4. שמור על מדיום השחרור ב-37°C תחת ערבוב קבוע ב-100 סל"ד באמצעות ערבוב מגנטי עם מוט ערבוב מצופה טפלון בקוטר 20 מ"מ.
   5. שמור על תנאי השקיעה לאורך כל הניסוי.
      הערה: המסיסות של קולכיצין ב-PBS עם 20% FBS היא >1 מ"ג/מ"ל; הריכוז המרבי של קולכיצין בתווך השחרור הוא <10% מהרוויה.
   6. בנקודות זמן קבועות מראש (0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48 ו-62 שעות), משוך 500 מיקרוליטר של מדיום שחרור.
   7. החלף את הנפח שנמשך בנפח שווה של PBS טרי מחומם מראש (37°C) המכיל 20% FBS.
   8. מדוד את ריכוז הקולכיצין בדגימות שנמשכו באמצעות ספקטרופוטומטריית UV–Vis ב-345 ננומטר.
   9. בצע את כל המדידות בשלוש עותקים.

6. בדיקות פונקציונליות במבחנה

1. תאי אנדותל של ורידי הטבור האנושיים (HUVECs) זרעים. גירוי התאים עם פקטור נמק גידולי אלפא (TNF-α) של 10 ng/mL למשך 24 שעות כדי להגביר את ויסות VCAM-1.
2. אסוציאציה תאית של NPs מסוג MMM/DiI עם HUVECs
   1. דגרו את התאים עם NPs MMM/COL מסומנים ב-DiI (MMM/DiI NPs) בריכוז של 50 מיקרוגרם/מ"ל (בהתבסס על מסת ליבת PLGA) למשך 4 שעות בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה של 5% CO₂.
   2. שטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS מקורר מראש. צנטריפוגה את התאים ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לאחר כל שטיפה.
   3. החזירו את התאים השטופים ב-PBS המכילים 0.5% אלבומין סרום בקר (BSA). כוון את ריכוז התאים הסופי ל-1 ×^{10 6} תאים למ"ל.
   4. הגדר את פרמטרי המכשיר לציטומטריית זרימה או CLSM. זיהוי פלואורסצנציה DiI באמצעות עירור ב-549 ננומטר ופליטה ב-565 ננומטר (ערוץ PE).
   5. אסוף נתונים מהדגימות. לרכוש לפחות 10,000 אירועים לכל דגימה עבור ציטומטריית זרימה או לכידת שדות ייצוג עבור CLSM.
   6. בחר חמישה שדות מייצגים לכל דגימה מאזורים נפרדים, ללא קצוות, באמצעות עדשת טבילה בשמן של 60×. ודא שהתאים שלמים ואינם חופפים.
   7. עיוור את הדגימות לפני רכישת התמונה. בחר שדות על ידי הזזת השלב באקראי במקום לבחור אזורים ספציפיים ידנית.
   8. יש להחיל פרמטרי סף וניתוח זהים על כל הדגימות בתנאי עיוורון.
   9. החריגו פסולת תאים באמצעות גיאטינג FSC-A/SSC-A. בחר תאי סינגלט באמצעות גייטינג FSC-A/FSC-H.
   10. בחר תאים חיים באמצעות צביעת צבע חיונית. הוסיפו 7-אמינואקטינומיצין D (7-AAD) ב-1 מיקרוגרם/מ"ל, דגרו במשך 5 דקות בטמפרטורה של 4°C בחושך, והשתמשו בו לאחסון תאים חיים.
   11. נתח את עוצמת הפלואורסצנציה כדי לכמת את האסוציאציה התאית. השתמשו בעוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת כמדד הכמות. בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה FlowJo (v10.8.1).
3. קליטה תאית של NPs MMM/DiI על ידי RAW 264.7 מקרופאגים
   1. דגרו NPs MMM/COL מסומנים ב-DiI (MMM/DiI NPs) עם מקרופאגים RAW 264.7 לא מותאמים בריכוז של 50 מיקרוגרם/מ"ל (מבוסס על מסת ליבת PLGA) למשך 4 שעות בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה של 5% CO₂.
   2. הכינו את התאים לניתוח כפי שמתואר בשלבים 6.2.2–6.2.3.
   3. קבעו פרמטרי מכשיר לזיהוי DiI באמצעות עירור ב-549 ננומטר ופליטה ב-565 ננומטר (ערוץ PE).
   4. אסוף נתונים מהדגימות. רכוש לפחות 10,000 אירועים לכל דגימה.
   5. החריגו פסולת תאים באמצעות גיאטינג FSC-A/SSC-A. בחר תאי סינגלט באמצעות גייטינג FSC-A/FSC-H.
   6. בחר תאים חיים באמצעות צביעת צבע חיונית. הוסיפו 7-AAD ב-1 מיקרוגרם/מ"ל, דגרו 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך, והשתמשו בו לגייטינג של תאים חיים.
   7. נתח את עוצמת הפלואורסצנציה כדי לכמת את קליטת התאים. השתמשו בעוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת כמדד הכמות. בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה.
4. בדיקת תאי קצף
   1. המיין תאי RAW 264.7 לתאי קצף על ידי דגירה עם ליפופרוטאין מחומצן בצפיפות נמוכה (oxLDL) ב-50 מיקרוגרם/מ"ל למשך 48 שעות. אשר את היווצרות תאי הקצף על ידי צביעת שמן אדום O, המסומן על ידי הצטברות שומנים תוך-תאיים.
   2. לטפל בתאי קצף עם קולכיצין חופשי, COL NPs או NPs של MMM/COL בריכוז קולכיצין שווה ערך של 1 מיקרומון. דגרו את התאים במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂.
      הערה: בחר ריכוז זה בהתבסס על ניסויים ראשוניים של מינון-תגובה שהעריכו את חיוניות התאים ויעילות אנטי-דלקתית.
   3. מדדו את רמות הציטוקינים הדלקתיים באמצעות בדיקת אימונוסורבנט (ELISA) המקושרת לאנזים.
      1. איסוף סופרנטנטים של תרבית תאים מיד לאחר הטיפול (24 שעות לאחר הטיפול).
      2. צנטריפוגה את הלוחות ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי להסיר פסולת תאים.
      3. העבר את הסופרנטנטים המובהקים לצינורות נקיים ואחסן בטמפרטורה של −80°C עד לניתוח.
      4. מדדו רמות TNF-α ואינטרלוקין-6 באמצעות ערכות ELISA בהתאם להוראות היצרן.
      5. בצע את כל המדידות בבארות משולשות וחזר על הניסוי שלוש פעמים עצמאיות.
      6. דווח על ריכוזי ציטוקינים כערכים מוחלטים (pg/mL) ללא נרמול נוסף, שכן צפיפות זריעת התאים ותנאי הטיפול עקביים בכל הקבוצות.

7. יישום טיפולי ב-vivo במודל טרשת עורקים

הערה: כל הליכי בעלי החיים חייבים לקבל אישור מוועדת טיפול ושימוש מוסדית רלוונטית.

1. הקמת מודל בעלי החיים
   1. הקמת מודל פלאק אטרוסקלרוטי פגיע בעכברי אפוליפופרוטאין E (ApoE⁻/⁻) בני 8 שבועות (רקע C57BL/6).
   2. האכיל עכברים תזונה עתירת שומן המכילה 15% שומן ו-0.25% כולסטרול חופשי במשך שבוע לפני הניתוח והמשך 4 שבועות לאחר הניתוח.
   3. הרדמו עכברים עם איזופלורן (2%–3% לאינדוקציה ו-1.5%–2% לתחזוקה) ומתן בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג, תת-עורית) להסרת כאבים במהלך ניתוח היצרת עורק הקרוטיד.
   4. התכווצו את עורק הקרוטיד הרגיל השמאלי באמצעות מחט בקוטר 0.3 מ"מ המונחת לצד העורק. קשור רצועת משי 6-0 סביב העורק והמחט, ואז הסר את המחט כדי ליצור התכווצות חלקית.
   5. אשר היווצרות פלאק פגיע בשבוע 4 לאחר הניתוח באמצעות הערכה היסטולוגית.
   6. לבצע המטוקסילין ואאוסין (H&E), צביעת Oil Red O, וצביעת טריכרום של Masson להערכת מורפולוגיית הפלאק, הצטברות שומנים ותכולת הקולגן.
   7. הגדר פלאקים פגיעים לפי שטח הפלאק > 40% משטח חתך כלי הדם, עובי כיסוי סיבי < 120 מיקרון, שטח ליבת הליפידים > 40% מסך שטח הפלאק, וחדירת מקרופאגים חיוביים משמעותית ל-CD68.
2. הזרקו 100 מיקרוליטר של NPs מסומנים ב-DiI MMM/COL בתוך-ורידי דרך וריד הזנב במינון של 2 מ"ג/ק"ג (בהתבסס על מסת הליבה של PLGA).
   1. תמונה של עכברים ביום אחד לאחר ההזרקה באמצעות מערכת הדמיה in vivo להערכת התפלגות ביולוגית של כל הגוף.
      1. הרדמו עכברים באיזופלוראן (3% לאינדוקציה ו-1.5%–2% לתחזוקה, עם קצב זרימת חמצן של 1 ו-0.5 ליטר לדקה, בהתאמה). עוקב עומק ההרדמה לפי קצב הנשימה ורפלקס צביטת האצבעות.
      2. הצבת עכברים על הגב על שלב מחומם של 37°C כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך ההדמיה.
      3. רכוש תמונות פלואורסצנציה באמצעות הגדרות DiI (עירור 549 ננומטר ופליטה 565 ננומטר) עם מסנן CY3 או TRITC. השתמש במצב חשיפה אוטומטית (בדרך כלל 50–200 מילישניות) וברכישת אפיפלואורסצנציה.
      4. ללכוד תמונות בהירות תואמות במקביל להתייחסות אנטומית ברזולוציה של 1024 × 1024 פיקסלים.
   2. קצור איברים עיקריים ועורקי התרדמה להדמיית פלואורסצנציה אקס ויבו.
      1. הרדמו עכברים עם איזופלורן (3% לאינדוקציה ו-2.5%–3% לתחזוקה).
      2. עכברים עם 20 מ"ל של PBS קר (pH 7.4) באמצעות דקירה בחדר שמאל בקצב זרימה של 5 מ"ל לדקה כדי להסיר שאריות דם ו-NPs לא קשורים.
      3. קצור איברים (לב, אאורטה, כבד, טחול, כליה וריאות) מיד לאחר הפרפוזיה ב-24 שעות לאחר ההזרקה.
      4. שטוף איברים שנאספו ב-PBS קר מאוד כדי להסיר דם על פני השטח.
      5. פתח את האאורטה לאורך ומקבע אותה שטוחה (צד אנדותליאלי כלפי מעלה) על פלטת סיליקון שחורה באמצעות פינים מנירוסטה.
      6. שמרו רקמות ב-PBS קרח ובצעו הדמיה פלואורסצנציונית אקס ביבו תוך 30 דקות מהקציר. הסר עודפי PBS ממשטח הרקמה מיד לפני ההדמיה.
3. ביצוע מינון וטיפול
   1. קבעו את מינון הקולכיצין ממחקר ראשוני-תגובת מינון (0.01–0.45 מ"ג/ק"ג, n = 7 לקבוצה). בחרו 0.05 מ"ג/ק"ג קולכיצין כמנה הטיפולית.
   2. ניתן להזריק 100 מיקרוליטר באמצעות הזרקת וריד זנב, התואם מינון NP של 2 מ"ג/ק"ג (מסה ליבת PLGA) ומינון קולכיצין של 0.05 מ"ג/ק"ג. הזרקה פעם ביום במשך 14 ימים רצופים.
   3. לחלק עכברים לקבוצות טיפול (PBS, קולכיצין חופשי ו-MMM/COL NPs) באמצעות מחולל מספרים אקראיים. בצע את כל הכימות על ידי שני צופים עיוורים לקבוצות טיפול.
   4. הפעילו נקודות סיום הומניות, כולל ירידה >20% במשקל גוף, פגיעה בתנועה או סימני מצוקה.
4. בצע ניתוח נקודות קצה
   1. הורד עכברים 24 שעות לאחר ההזרקה הסופית. קצור עורקי הקרוטיד והאאורטה. הערכו את עומס הפלאק על ידי הפנים בשמן אדום או כתמי האאורטה.
   2. כמת את שטח הפלאק
      1. כמת את שטח הפלאק כאחוז שטח O-חיובי של שמן אדום מסך שטח הלומן האאורטלי בחתכי רוחב (חמישה חתכים לעכבר) באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.
      2. פתח את התמונה בתוכנת ניתוח התמונות של ImageJ.
      3. לחץ על תמונה → הקלדה → 8 ביט כדי להמיר את התמונה לגווני אפור.
      4. לחץ על תמונה → כוון → סף. בחרו בשיטת Otsu והחלו את הסף לזיהוי אזורים O-חיוביים בשמן אדום.
      5. החלו את אותם פרמטרי סף על כל תמונות הדגימה ורשמו את הגדרות הסף לאימות.
      6. לחץ על ניתוח → הגדר מידות ובחר שטח.
      7. לחץ על ניתוח → מדידה כדי לכמת את האזורים הנבחרים.
      8. ייצא את הנתונים הכמותיים.
   3. הערכת יציבות הפלאק
      1. הערכת יציבות הפלאק על ידי צביעה היסטולוגית של חתכי קרוטיד באמצעות H&E, Oil Red O, וצביעת תלת-כרום של מסון. כמת את הקולגן כאחוז האזור הכחול החיובי של מסון באזור הפלאק.
      2. הכינו חתכים מוטמעים בפרפין בעובי של 5 מיקרון וחתכים קפואים בטמפרטורת חיתוך אופטימליים בעובי של 8 מיקרון.
      3. בצע צביעת H&E על ידי דה-פרפיניזציה והידרציה מחדש של מקטעים, לאחר מכן צביעת המטוקסילין למשך 5 דקות וצביעת אאוזין למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT; 23°C ± 2°C).
      4. בצע צביעת שמן אדום על חלקים קפואים על ידי דגירה עם תמיסת Oil Red O למשך 15 דקות ב-RT. מבדיל חתכים ב-60% איזופרופנול למשך 2 שניות ושטוף במים מזוקקים.
      5. בצע את צביעת הטריכרום של מסון לפי הוראות הערכה על ידי דגירה עם המטוקסילין הברזל של וייגרט למשך 10 דקות, פוקסין חומצה פונסו ל-5 דקות, חומצה פוספומוליבדית ל-5 דקות, וכחול אנילין ל-5 דקות ב-RT.
      6. תמונות היסטולוגיות פתוחות בתוכנת ניתוח תמונות.
      7. החלו סף צבע לזיהוי אזורים חיוביים לקולגן. בצע סף אוטומטי והחיל את אותם פרמטרים על כל תמונות הדגימה.
      8. הקליטו הגדרות סף לאימות.
      9. הגדר את שטח הפלאק הכולל כסכום כל אזורי הפלאק בתוך האינטימה הווסקולרית.
      10. מדדו את שטח הפלאק על ידי מעקב ידני אחר גבולות הפלאק או באמצעות סגמנטציה אוטומטית של סף לזיהוי כל אזורי הפלאק.
      11. מדוד שטח חיובי לקולגן.
      12. חשב את תכולת הקולגן כשטח חיובי לקולגן חלקי שטח הפלאק הכולל × 100%.
   4. הערכת תכולת המקרופאגים
      1. בצע צביעת אימונופלואורסצנציה CD68 להערכת תכולת המאקרופאג'ים. כמת את תכולת המקרופאגים כאחוז השטח החיובי ל-CD68 בשטח הפלאק.
      2. הכינו חתכי רקמה (עובי 5 מיקרון לחתכים מוטמעים בפרפין). בצע שליפת אנטיגנים באמצעות בופר ציטראט (pH 6.0) בלחץ גבוה למשך 2 דקות.
      3. בלוק קטעים עם 5% BSA ל-30 דקות ב-RT.
      4. דגרו חתכים עם נוגדן ראשוני מונוקלונלי CD68 נגד עכבר ארנב (שיבוט D4B9C, דילול 1:200 ב-1% BSA) במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
      5. דגרו חתכים עם נוגדן משני IgG אנטי-ארנב מסוג Alexa Fluor 488-conjugated עז (דילול 1:500) למשך שעה ב-RT.
      6. גרעיני נגד צבע עם 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) למשך 5 דקות.
      7. תמונות פלואורסצנציה פתוחות בתוכנת ניתוח תמונות.
      8. זהה אזורים חיוביים ל-CD68 באמצעות סף. בצע סף אוטומטי והחיל את אותם פרמטרים על כל תמונות הדגימה.
      9. הקליטו הגדרות סף לאימות.
      10. מדדו שטח חיובי ל-CD68.
      11. חשב את תכולת המקרופאגים כשטח חיובי ל-CD68 חלקי שטח הפלאק הכולל × 100%.

Results

מדידות DLS בוצעו באמצעות מערכת Zetasizer Nano ZS בטמפרטורה של 25°C וזווית פיזור אחורי של 173°. הדגימות דוללו פי 20 במים דה-יוניים (ריכוז סופי של כ-0.1 מ"ג/מ"ל) והתייצבו למשך 2 דקות לפני המדידה. כל דגימה נמדדה בשלושה עותקים, והתוצאות מוצגות כממוצע ± SD. DLS ו-TEM חושפים עלייה בגודל NP לאחר ציפוי הממברנה ומאשרים את היווצרות מבנה ליבה-קליפה (איור 1). NPs של COL מציגים קוטר הידרודינמי של 180.8 ± 5.2 ננומטר, PDI של 0.12 ± 0.03, ופוטנציאל זטה של −17.2 ± 0.67 mV (n...

Discussion

פרוטוקול זה מספק שיטה מקיפה לבנייה ויישום NPs מצופים ממברנה של מקרופאג' עם שינוי משותף של CD47 ואינטגרין α4/β1 לטיפול ממוקד בטרשת עורקים. היתרונות המרכזיים של מערכת זו כוללים מיקוד פעיל באמצעות אינטראקציה בין אינטגרין α4/β1–VCAM-1 והפחתת קליטת המקרופאגים הקשורה לאיתות מתווך CD47, כפי שנתמך בבדיקות קליטה במבחנה (איור 3) ותוצאות ביו-התפלגות בחיים (איור 4). השימוש בממברנות מותאמות, במקום ממברנות טבעיות פשוטות, משפר תכונות ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-אמינואקטינומיצין D (7-AAD)	תרמו פישר סיינטיפיק (ארה"ב)	A1310	צבע היתכנות לציטומטריית זרימה להבחנה בין חיים לחיים ומתים
אלקסה פלואר 488 נגד ארנב לעזים IgG	תרמו פישר סיינטיפיק (ארה"ב)	A-11008	נוגדן משני לצביעת אימונופלואורסצנציה CD68
נוגדן CD47 נגד עכבר	אבקאם (ארה"ב)	AB214453	משמש לניתוח כתם מערבי לאימות ביטוי CD47
אינטגרין אנטי-עכבר ואלפא; 4 נוגדנים (B-2)	ביוטכנולוגיה של סנטה קרוז (ארה"ב)	SC-376334	משמש לניתוח כתם מערבי לאימות אינטגרין ואלפא; 4 ביטוי
אינטגרין אנטי-עכבר ובטא; נוגדן אחד (A-4)	ביוטכנולוגיה של סנטה קרוז (ארה"ב)	SC-374429	משמש לניתוח ווסטרן בלוט לאימות אינטגרין ובטא; 1 ביטוי
עכברים ApoE-/-	מעבדת ג'קסון (ארה"ב)	לא זמין	משמש למודל טרשת עורקים בחיים
ערכת בדיקות BCA	תרמו פישר סיינטיפיק (ארה"ב)	23225	משמש לקביעת ריכוז החלבון
לוח סיליקון שחור	לא זמין	לא זמין	שימש להרכבת אאורטה להדמיה אקס-ויבו
פלסמיד CD47 (pcDNA3.1(+))	Generay Biotech (סין)	G0177361-1	מכיל גן Cd47 של עכבר לביטוי יתר
קולכיצין	סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)	C9754	מטען טיפולי בננו-חלקיקים
מיקרוסקופ סורק לייזר קונפוקלי	לייקה מיקרוסיסטמס	TCS SP8	משמש להדמיה פלואורסצנצית וניתוח קו-לוקליזציה
בופר ציטראט (pH 6.0)	תרמו פישר סיינטיפיק (ארה"ב)	לא זמין	משמש לשחזור אנטיגנים בצביעת אימונופלואורסצנציה
צינורות דיאליזה (MWCO 3,500 Da)	סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)	PURD35030	משמש לטיהור ננו-חלקיקים
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)	D2447	ממס להכנת ננו-חלקיקים
DiI (1,1&פריים;-דיוקטדציל-3,3,3&3&פריים;,3&פריים;-טטרמתילינדוקרבוציאנין פרכלוראט)	ביוטיים (סין)	C1036	תיוג פלואורסצנטי של ליבת ננו-חלקיקים
DiO (3,3′-דיוקטדצילוקסקרבוציאנין פרכלוראט)	ביוטיים (סין)	C1038	תיוג פלואורסצנטי של ממברנת מקרופאגים
DiR	ביוטיים (סין)	Y239280	משמש לדימות פלואורסצנציה בתוך הגוף
DAPI	תרמו פישר סיינטיפיק (ארה"ב)	D3571	נגד גרעיני להדמיית פלואורסצנציה
דולבקו' s Modified Eagle Medium (DMEM)	תרמו פישר סיינטיפיק (ארה"ב)	11965092	מדיום תרבית תאים
מנתח פיזור אור דינמי (Zetasizer Nano ZS)	מלוורן אנליטיקה (בריטניה)	לא זמין	משמש למדידות פיזור אור דינמי (DLS) של גודל ננו-חלקיקים, PDI ופוטנציאל זטה
ערכת ELISA	R& D Systems (ארה"ב)	תלוי בציטוקין המטרה	משמש לכימות ציטוקינים דלקתיים
אנדותלין-1 (ET-1)	סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)	E7764	משמש לגירוי אינטגרין ואלפא; 4/β 1 ביטוי
סרום בקר עוברי (FBS)	גיבקו (תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב)	10091148	תוסף למדיום תרבית תאים
ציטומטר זרימה	BD ביוסיינסס (ארה"ב)	FACSCalibur	משמש לרכישת אותות פלואורסצנציה
תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה (FlowJo v10.8.1)	BD ביוסיינסס (ארה"ב)	לא זמין	משמש לניתוח נתוני ציטומטריית זרימה
תאי אנדותל של ורידי הטבור האנושיים (HUVECs)	פוהנג ביוטכנולוגיות (סין)	FH1122	משמש לבדיקות מיקוד במבחנה
תוכנת ניתוח תמונות (ImageJ)	המכונים הלאומיים לבריאות (ארה"ב)	לא זמין	משמש לניתוח תמונה כמותי
מערכת הדמיה בגוף	פרקיןאלמר (ארה"ב)	IVIS לומינה III	משמש להדמיית פלואורסצנציה של כל הגוף
איזופרופנול (60%)	סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)	34863	משמש להבדלה במהלך צביעת Oil Red O
ליפופקטמין 3000	תרמו פישר סיינטיפיק (ארה"ב)	L3000001	תגובת טרנספקציה
ערבוב מגנטי ומוט ערבוב	לא זמין	לא זמין	משמש להכנת ננו-חלקיקים
מסון' ערכת כתמים טריכרום	אבקאם (ארה"ב)	AB150686	משמש לצביעת קולגן
מיני אקסטרודר	Avanti Polar Lipids (ארה"ב)	610000	משמש לאקסטרוזיה של ממברנה
קו התאים Murine RAW 264.7	פוהנג ביוטכנולוגיות (סין)	FH0328	מקור המקרופאגים
קו תאי השריר החלק של העכברים	פוהנג ביוטכנולוגיות (סין)	FH-Y063	משמש להערכת בטיחות
שמן אדום O	סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)	O0625	משמש לצביעת שומנים
אופטי-MEM	תרמו פישר סיינטיפיק (ארה"ב)	31985062	מדיום סרום מופחת לטרנספקציה
ליפופרוטאין מחומצן בצפיפות נמוכה (Ox-LDL)	יייואן ביוטכנולוגיות (סין)	YB-002	משמש להשראת יצירת תאי קצף
פניצילין– סטרפטומיצין	תרמו פישר סיינטיפיק (ארה"ב)	15140122	תוסף אנטיביוטי לתרבות תאים
פנילמתילסולפוניל פלואוריד (PMSF)	סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)	78830	מעכב פרוטאז
סליין ממוגן בפוספט (PBS)	תרמו פישר סיינטיפיק (ארה"ב)	10010023	בופר שטיפה ודילול
פולי (חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA, 50:50; MW 90,000)	ביוטכנולוגיה מיילון של דאליאן (סין)	MB5649-1	פולימר לייצור ננו-חלקיקים
מסנני ממברנה מפוליקרבונט (200 ננומטר, 400 ננומטר)	ווטמן (בריטניה)	800282	משמש לאקסטרוזיה
כלוריד אשלגן (KCl)	סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)	P9333	רכיב בבופר הליזה
מגיב P3000	תרמו פישר סיינטיפיק (ארה"ב)	L3000001	משפר טרנספקציה
מיקרוטום סיבובי	Leica Biosystems (גרמניה)	RM2235	משמש לחתך פרפינים
משאבת מזרק	מכונות הרווארד (ארה"ב)	70-3007	משמש להיווצרות ננו-חלקיקים מבוקרת
מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת חשמל (TEM)	תרמו פישר סיינטיפיק (ארה"ב)	טאלוס F200S	משמש להדמיית ננו-חלקיקים
טריס-HCl	סיגמא-אולדריץ' (ארה"ב)	T2663	רכיב מאגר
פקטור נמק הגידול אלפא (TNF-α)	R& D Systems (ארה"ב)	410-MT	משמש להפעלת תאי אנדותל
מים אולטרה-טהורים	מילי-קיו (מרק, ארה"ב)	ZMQSV0T01	משמש להכנת ננו-חלקיקים ודיאליזה