הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

P. gingivalis/F. nucleatum בדלקת פריודונטיטיס אפיקלית כרונית קשורים לקיצור הריוני דרך מסלול TLR4/MyD88/NF-κB

161 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70793

⸱

15 במאי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cariology and Endodontics, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, The Affiliated Stomatology Hospital of Xinjiang Medical University, 2Development and Related Diseases of Women and Children Key Laboratory of Sichuan Province, 3Stomatology Disease Institute of Xinjiang Uyghur Autonomous Region, Xinjiang Medical University, 4Department of Endodontics, Urumqi Stomatological Hospital, 5Department of Obstetrics and Gynecology, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University

במאמר זה

סיכום

פתוגנים אוראליים כרוניים הקשורים לדלקת פריודונטיטיס אפיקלית (P. gingivalis, F. nucleatum) מוערכים באמצעות מודלים של CAP בעכברים ובדיקות זיהום טרופובלסטים אנושיים. קיצור הריון נצפה לצד הפעלה דלקתית של השליה, התואם איתות TLR4/MyD88/NF-κB. DNA חיידקי ניתן לזיהוי ברקמות שליה/כלי דם, ותומך בקשר המטוגני ובמטרות התערבות פוטנציאליות.

תקציר

לידה מוקדמת ספונטנית (sPTB; לידה לפני שבוע 37) נשארת סיבה מובילה לתמותת יילודים, וזיהום תוך-רחמי מעורב בחלק משמעותי מהמקרים. ראיות מתפתחות מקשרות פתוגנים אוראליים כמו Porphyromonas gingivalis ו-Fusobacterium nucleatum לתוצאות היריון שליליות; עם זאת, המסלולים המכניסטיים המקשרים בין פריודונטיטיס אפיקלית כרונית (CAP) לסיכון הריוני נותרו לא מוגדרים במלואם. בעכברי C57BL/6J בהריון, CAP הוכחה באמצעות חיסון בטיפול שורש והושלמה במודל אתגר וריד זנב המשתמש בתלסיסים חיידקיים (1 × 108 CFU/mL). אורך ההריון, היסטופתולוגיה של השליה, סמנים דלקתיים ואותות DNA חיידקי הוערכו באמצעות qPCR. במקביל, טרופובלסטים אנושיים נחשפו ל-P. gingivalis או F. nucleatum (MOI = 50, 24 שעות) כדי לבדוק אותות דלקתיים התואמים את הפעלת ציר TLR4/MyD88/NF-κB. בהשוואה לביקורת, קבוצות הקשורות ל-CAP הראו קיצור הריוני (חציון 19.5 לעומת 20.5 ימים), מלווה בקריאות דלקתיות שלייתיות מוגברות (כולל IL-1β ו-TNF-α גבוהים) ותכונות היסטופתולוגיות התואמות לפגיעה דלקתית. qPCR הצביע בנוסף על נוכחות אותות DNA חיידקיים ברקמות שליה וכלי דם. בבדיקות טרופובלסט, F. nucleatum עורר תגובות פרודלקתיות חזקות יותר מאשר P. gingivalis, בשילוב עם עלייה בזרחון NF-κB. ביחד, ממצאים אלו מצביעים על כך שפתוגנים אוראליים הקשורים ל-CAP עשויים לתרום לקיצור ההריון על ידי הנעת דלקת השליה באמצעות איתות TLR4/MyD88/NF-κB, התומכים בציר המיקרוביאלי הפה-שליה כמטרה פוטנציאלית להפחתת סיכון הריוני הקשור לזיהום.

מבוא

לידה מוקדמת ספונטנית (sPTB) מוגדרת כלידה המתרחשת בין שבועות 20–37 להריון ללא התערבות רפואית1. כדאגה קריטית לבריאות הציבור העולמית, שכיחות sPTB נעה בין כ-5%–9% במדינות מפותחות ל-12%–18% באזורים עם משאבים מוגבלים 2,3. לידה מוקדמת וסיבוכיה ממשיכים להיות גורם מוביל לתמותה בילדים מתחת לגיל 5, ומהווים כמיליון מקרי מוות של יילודים בשנה4. ניצולים חווים לעיתים קרובות סיבוכים מיידיים, כגון תסמונת מצוקה נשימתית, ותוצאות ארוכות טווח, כולל שיתוק מוחין ועיכובים התפתחותיים 5,6, ובכך מטיל עומס כלכלי משמעותי על משפחות וחברה 7,8.

האטיולוגיה של sPTB היא רב-גורמית, ומשקפת אינטראקציות בין גורמים אם, עובריים וסביבתיים, כולל תפקוד לקוי של התכווצות הרחם, אי ספיקת צוואר הרחם, הפרעות אנדוקריניות, הפרעות שליה וזיהום תוך-רחמי. זיהום תוך-רחמי מוכר כגורם מרכזי ומוערך כי הוא מהווה כ-30%–40% ממקרי הלידה המוקדמת10,11. פתוגנים עשויים לגשת לחלל מי השפיר דרך דרכים עולות (למשל, צוואר הרחם) או המטוגן, להפעיל את תגובות החיסון של המאכסן ולקדם שחרור ציטוקינים פרו-דלקתיים (למשל, IL-6, TNF-α) ופרוסטגלנדינים שיכולים לגרום ללידה12. טרופובלסטים, כרכיבים תאיים מרכזיים בממשק האם-עובר, תורמים לסבילות החיסונית וכן להגנה אנטימיקרוביאלית13.

מיקרואורגניזמים אוראליים, כולל Porphyromonas gingivalis ו-Fusobacterium nucleatum, היו מעורבים בתהליכים דלקתיים הקשורים ל-sPTB, ייתכן דרך בקטרמיה ו/או הפצת מתווכים דלקתיים14. מינים אלו הם פתוגנים חניכיים מבוססים, ודווחו קשרים בין פריודונטיטיס ל-sPTB במחקרים אפידמיולוגייםוקליניים 15,16,17. ראוי לציין כי P. gingivalis ו-F. nucleatum מאומצים לעיתים קרובות גם בדלקת פריודונטיטיס אפיקלית כרונית (CAP)18,19, אך הקשר בין CAP לתוצאות היריון שליליות נותר לא נחקר באופן חלקי, והמסלולים הביולוגיים הרלוונטיים אינם מוגדרים במלואם20. Harjunmaa ואח' דיווחו לראשונה על קשר בין דלקת פריודונטיטיס אפיקלית לבין ירידה לאורך ההריון ומשקל לידה נמוך בשנת 2015,2021. מחקר מעקב באותה קבוצה לא תמך בהעברה ישירה של חיידקים לשליה, מה שמרמז כי דלקת מערכתית עשויה להוות קשר סביר בין פריודונטיטיס אפיקלילתוצאות ההריון. בהתאם לפרשנות זו, פריודונטיטיס אפיקלי שאושרה ברדיוגרפיה נקשרה לסיכון מוגבר ללידות מוקדמות במשקל נמוך23. כזיהום אוקולטי מתמשך, CAP עשוי לתרום לסיכון להריון באמצעות דלקת מערכתית כרונית בדרגה נמוכה ו/או חשיפה המטוגנית לרכיבים מיקרוביאליים24,25. לכן נדרש הבהרה נוספת של הקשר בין CAP להריון כדי לחדד את ההבנה של מסלולי דלקת אוראליים בין השליה ולייעץ אסטרטגיות מניעה לסיכון הריוני הקשור לזיהום.

מחקרים עדכניים הדגישו את הרלוונטיות של ציר האיתות TLR4/MyD88/NF-κB בלידות מוקדמות הקשורות לדלקת. רוברטסון ואחרים זיהו את TLR4 כמטרה טיפולית פוטנציאלית בלידה מוקדמת הנגרמת מדלקת ודיווחו על השפעות מניעה במודלים של בעלי חיים26. פנג ואחרים הראו בנוסף כי miR-199a-3p מחליש את דלקת אפיתל צוואר הרחם באמצעות דיכוי מסלול HMGB1/TLR4/NF-κB27. בנוסף, שן ואח' תיארו השפעות אנטי-חמצוניות ואנטי-דלקתיות של סירינגין בעכברים בהריון סוכרתיים, כאשר מודולציה של מסלול TLR4/MyD88/NF-κB הייתה מעורבת בשיפורים שנצפו28. יחד, ממצאים אלו תומכים במסגרת מכנית שבה איתות דלקתי המקושר ל-TLR4/MyD88/NF-κB תורם למסלולים הקשורים לזיהום המשפיעים על לידה, תוך הכרה בכך שמספר קולטני חיסון מולדים עשויים לפעול במקביל בהתאם להקשר הפתוגן.

המחקר הנוכחי מעריך השפעות הריון הקשורות ל-CAP באמצעות בדיקות טרופובלסטיות משלימות במבחנה ומודלים של עכברים בחיים (in vivo ). מודל הטרופובלסט מאפשר חקירה מבוקרת של איתות דלקתי המושר על ידי פתוגנים, בעוד שמודל CAP של עכברים בהריון מקשר בין תגובות תאיות לפנוטיפים של הריון ברמת האורגניזם בתנאים גיסיולוגיים הריוניים. מודל אתגר זנב-וריד נכלל כדי לספק מסלול חשיפה המטוגני משלים ולהעריך האם דפוסי הפעלה דלקתיים שנצפו בסביבה של זיהום הפה חוזרים כאשר רכיבים חיידקיים מגיעים למחזור הדם האם. באופן ספציפי, חשיפה לטרופובלסטים ל-P. gingivalis ו-F. nucleatum משמשת לפרופיל תגובות ציטוקינים והפעלה של ציר TLR4/MyD88/NF-κB, בעוד שניסויים בבעלי חיים מעריכים את אורך ההריון, דלקת השליה וזיהוי מבוסס qPCR של אותות DNA חיידקיים בהתפצלות הקרוטיד וברקמות השליה. מכיוון ש-qPCR מצביע על נוכחות DNA חיידקי ולא על חיוניות או מיקום תאי, הפרשנויות לגבי נוכחות מיקרוביאלית בממשק האם-עובר נשארות זהירות. בנוסף, הבדלים בין מינים וחשיפה מבוקרת לניסוי עשויים להגביל את התרגום הקליני הישיר, מה שמדגיש את הצורך באימות עתידי בסביבות הרלוונטיות לבני אדם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם באופן קפדני להנחיות האתיות שנקבעו על ידי ועדת האתיקה למחקר בעלי חיים של בית החולים הראשון המסונף של אוניברסיטת שינג'יאנג לרפואה (מס' אישור: IACUC-20231121-13) ובהתאם למדריך המכון הלאומי לבריאות (NIH) לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה (מהדורת 2011). יתרה מזאת, מחקר זה בוצע בהתאם להנחיות ARRIVE. כל האספקה (תגובות, צרכנים, ציוד ותוכנה) ומידע היצרן ומספרי הקטלוג המתאימים להם מסופקים בטבלת החומרים כדי להקל על שחזוריות.

1. תרבית חיידקים

זני ייחוס של Porphyromonas gingivalis ו-Fusobacterium nucleatum (מזהי זן המופיעים בטבלת החומרים) טופלו בתנאים אנאירוביים. התרביות הראשוניות הוקמו על לוחות אגר דם קולומביה מופחת מראש ודגרו אנאירובית (85% N₂, 10% H₂, ו-5% CO₂) בטמפרטורה של 37°C במשך 48 שעות. לתכשירים ניסיוניים, מושבה מבודדת היטב הוזרקה לתוך מרק עירוי לב של 40 מ"ל למוח ודגרה בתנאים אנאירוביים זהים עד לשלב הגדילה באמצע הלוגריתם (OD660 = 0.6–0.8). כדי למזער חשיפה לחמצן, בוצעו שלבי חיסון והעברה בתוך תחנת עבודה אנאירובית באמצעות מדיה וכלים מופחתים מראש. ריכוזי החיידקים תוקנו ל-1 ×10 8 CFU/mL לחשיפה לבעלי חיים באמצעות כימות מבוסס OD660 עם עקומת תקן OD–CFU ייחודית לזן שנוצרה באותם תנאי תרבית; עקומת הכיול נקבעה באמצעות דילול סדרתי וספירת מושבות על לוחות אגר אנאירוביים עם לפחות שלוש כיולים עצמאיים. למחקרי זיהום טרופובלסטים, תסמיני חיידקים נמדדו באמצעות שיטת ספירה מאומתת ודיללו במדיום תרבית מלאה ללא אנטיביוטיקה כדי להשיג את ריבוי הזיהום (MOI) שנקבע מיד לפני הקולטורציה המשותפת.

2. מגורי בעלי חיים וקיבוץ

עכברים ספציפיים ללא פתוגנים C57BL/6J (n = 90; 60 נקבות, 30 זכרים) בגילאי 6–7 שבועות שוחזקו בתנאים מבוקרים (22 °C ± 2 °C, 60% ± 10% לחות, מחזור אור של 12 שעות) עם גישה חופשית למזון ולמים. לאחר שבוע של הסתגלות, חולקו העכברים באקראי לשש קבוצות ניסוי (n = 15 לקבוצה): קבוצת ביקורת תקינה (NC), CAP עם P. gingivalis (AP), CAP עם F . nucleatum (AF), הזרקת וריד זנב מלוח תקינה (VN), הזרקת וריד זנב P. gingivalis (VP), והזרקת וריד זנב F. nucleatum (VF). נרשמו אקראיות והקצאת כלובים כדי למזער הטיית הקצאה והשפעות אפשריות בכלוב.

3. הקמת מודל ה-CAP

כל ההליכים הכירורגיים בוצעו בתנאים אספטיים. הרדמה נגרמה על ידי מתן תוך-פריטוניאלי של פנטוברביטל נתרן (1.62 מ"ג/30 גרם משקל גוף) בשילוב עם אטרופין סולפט (12.5 מיקרוגרם/30 גרם משקל גוף), ועומק ההרדמה המתאים אושר בהיעדר רפלקס גמילה מהפדל. העכברים הונחו בשכיבה על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף, והפה נפתח בעדינות כדי לאפשר ראייה יציבה של הטוחנות הראשונות של המקסילריה הדו-צדדית. בהגדלה, פתחו את תאי המוך של הטוחנות הראשונות הדו-צדדיות של המקסילריה באמצעות בור עגול סטרילי, ולאחר מכן הוסר רקמת מוך קורונלית באמצעות מיקרו-מכשירים סטריליים. פתחי טיפול שורש זוהו באמצעות פצירה אנדודונטית קטנה (גודל 06–10), והתעלות עברו בעדינות כדי להגיע לפטנסיות תוך הימנעות מכוח מופרז כדי לצמצם את הסיכון לחור. התא נשטף במלח סטרילי (או PBS סטרילי) ויובש עם נקודות נייר סטריליות לפני החיסון.

החיסון החיידקי בוצע באמצעות תלייה סטנדרטית ב-1 × 108 CFU/mL. כדי להפוך את המינון לשחזור, הנפח שנמסר היה קבוע תפעולית ב-2 מיקרוליטר לשן (כ-2 ×10 5 CFU לשן), שסופק באמצעות קצה מיקרופיפטה מכויל הממוקם בכניסה לתא. נקודת נייר סופגת סטרילית שהושרה מראש באותו תלייה הוכנסה לתא העיסה לשמירה על חשיפה מקומית. המסירה המוצלחת אושרה על ידי הרטבה נראית לעין של נקודת הנייר והיעדר דליפה לחלל הפה. לאחר החיסון, התא יובש באוויר עד שלא נותר נוזל נראה לעין, ואז נאטם בדבק דנטלי מתקשה באור (20 שניות), ולאחר מכן שיקום באמצעות חומר קומפוזיט שרף זורם (20 שניות). שלמות האטם אושרה באמצעות בדיקה ויזואלית ובדיקה עדינה; שיפוצים שהראו פערים או אובדן מוקדם נאטמו מחדש מיד. ניתנו הקלה ומעקב לאחר הפרוצדורה, בהתאם להנחיות מוסדיות לטיפול בבעלי חיים.

שבועיים לאחר מכן הושגו צילומי רנטגן פריאפיאליים כדי לאשר את הקמת ה-CAP. ההקמה המוצלחת הוגדרה על ידי רדיולוצנטיות פריאפיקלית ברורה עם שינויים סביב העצם התואמים דלקת פריאפיקלית כרונית והרס עצם. ההזדווגות החלה שבועיים לאחר ההדבקה/היווצרות הדגם.

4. הקמת מודל הזרקת וריד הזנב

תסלים חיידקיים הוכנו בריכוז של 1 × 108 CFU/mL במי מלח סטריליים. העכברים היו מוגבלים, והזנב חומם למשך 1–2 דקות כדי להרחיב את הוורידים הצדדיים של הזנב. ההזרקות בוצעו באמצעות מחט דקה-רוחב (בדרך כלל 29–30 גרם) שהוחדרה בזווית רדודה (כ-10–15°). מיקום תוך-ורידי נכון אושר על ידי הבזק דם במרכז והזרקה חלקה עם התנגדות נמוכה; מיקום לא מוצלח הצביע על ידי התנגדות מוגברת ו/או היווצרות גוש תת-עורי, שבו ההזרמה הופסקה וחזרה על עצמה באתר קרוב יותר לאחר חימום קצר מחדש. העכברים קיבלו הזרקות יומיות במשך שלושה ימים רצופים (100 מיקרוליטר לעכבר בכל פעם). לאחר שלושה ימים, הנשים שוכנו יחד עם גברים, ובבוקר למחרת נבדקו פקקי הנרתיק. לאחר אישור הפקקים הנרתקיים (GD 0.5), הזרקות ניתנו כל שלושה ימים (100 מיקרוליטר לעכבר בכל פעם) עד ליום ההריון ה-15.

5. הקמת מודל עכברים בהריון

עכברים נקבות וזכרים אוחסנו יחד ביחס של 2:1 (נקבה/זכר) במהלך הלילה, החל מ-20:00 בכל יום. נוכחות פקק נרתיקי או מריחת זרע חיובית לזרע בשעה 08:00 בבוקר למחרת סווגה כיום הריון (GD) 0.5. לכל עכבר נרשמו משקל גוף ראשוני, משקל לפני הלידה, משקל לאחר הלידה, אורך הריון, משקל לידה יילודה, גודל המלטה ומספר הלידות המתות. בהתבסס על מחקרים קודמים29,30, הלידה שהתרחשה לפני סוכרת הריון 18.5 הוגדרה תפעולית כלידה מוקדמת בעכברים. מכיוון שקיצור הריוני עשוי להתרחש בטווח הזמן, תוצאות ההריון פורשו תוך התחשבות בהבחנה בין לידה מוקדמת אמיתית לפנוטיפים של קיצור הריון.

6. איסוף ועיבוד דגימות

ביום ההריון ה-15, שלוש עכברים בהריון מכל קבוצה נבחרו באקראי לדגימה שלייתית וכלי דם (NC/AP/AF ו-VN/VP/VF). לאחר הרדמה שנגרמה על ידי הזרקה תוך-פריטונלית של פנטוברביטל נתרן (1.62 מ"ג ל-30 גרם משקל גוף) ואטרופין סולפט (12.5 מיקרוגרם ל-30 גרם משקל גוף), נאספו דגימות דם באמצעות דימום רטרו-אורביטלי. עכברים הושמתו בתא פחמן דו-חמצני עד שאושר המוות בהיעדר נשימה, דופק ורפלקס קרנית; אספקת פחמן דו-חמצני התבצעה בגישה של מילוי הדרגתי בהתאם להנחיות רווחת בעלי החיים המוסדיות. פיצול עורק הקרוטיד ורקמות השליה נאספו במהירות באמצעות כלים סטריליים להפחתת זיהום בדגימות. רקמת השליה חולקה לשני חלקים: חלק אחד נשמר בטמפרטורה של −80°C, והחלק השני היה מקובע בפורמלין ניטרלי 10% למשך 24 שעות, ואחריו ייבוש אתנול מדורג והטמעת פרפין. העכברים הנותרים נבדקו לפי משקל גוף יומי, אורך הריון, גודל המלטה ומשקל הלידה של יילודים.

7. תרבית תאים וטיפול

קו התאים הטרופובלסטים האנושי HTR-8/SVneo תורתח במדיום RPMI 1640 שהושלף עם 10% סרום בקר עוברי מנותק בחום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂. לניסויי זיהום, תאי HTR-8/SVneo (1 ×-106 תאים) בשלב הצמיחה הלוגריתמי הוזרעו ללוחות של 6 בארות והותרכו להידבק ללילה. לפני האתגר החיידקי, המדיום הוחלף במדיום מלא ללא אנטיביוטיקה כדי למנוע השפעות אנטיבקטריאליות במהלך הקולטורציה המשותפת. תליות חיידקיות של P. gingivalis או F. nucleatum נוספו ב-MOI = 50, וכל באר הותאמה לנפח סופי של 2.5 מ"ל באמצעות מדיום תרבית מלא. הצלחות הוגדרו במשך 24 שעות. סופרנטנטים נאספו לאחר 24 שעות והוברו באמצעות צנטריפוגה קצרה להסרת פסולת לפני מדידת הציטוקינים. תאים דביקים נשטפו פעמיים עם PBS סטרילי להסרת חיידקים שאינו דבקים, ולאחר מכן עובדו מיד להפקת RNA או חלבון בהתאם לתהליכי העבודה המתוארים להלן.

8. ניתוח היסטולוגי של שליית העכבר

רקמות השליה היו מקובעות בפורמלין בופר ניטרלי של 10% למשך 24 שעות, עם פרפין, ונחתכו בעובי של 4.5 מיקרון. בוצעה צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) שגרתית לבחינת מורפולוגיית השליה. לצביעה אימונוהיסטוכימית, הוצג מיקום אנטיגן באמצעות מצע פרוקסידאז כרומוגני שיצר משקעים חומים באתרים חיוביים, ולאחר מכן צביעת נגד עם המטוקסילין. בקרה שלילית בוצעה על ידי החלפת נוגדנים ראשוניים בסרום לא חיסוני.

כדי לשפר את השחזוריות והשקיפות, הערכה אימונוהיסטוכימית השתמשה בגישה חצי-כמותית מוגדרת מראש. עוצמת הצביעה דורגה כ-0 (אין), 1 (חלש), 2 (בינוני) או 3 (חזק), ואחוז התאים החיוביים נקבע כ-0 (<5%), 1 (5–25%), 2 (26–50%), 3 (51–75%) או 4 (>75%). ציון אימונוריאקטיביות חושב על ידי כפל ציוני העוצמה והאחוזים לכל תחום. לכל שליה נמדדו לפחות חמישה שדות חזקים לא חופפים מאזורים אנטומיים דומים. הניקוד בוצע באופן עצמאי על ידי שני צופים עיוורים להקצאת קבוצות, והמחלוקות נפתרו בסקירה משותפת.

9. זיהוי PCR כמותי בזמן אמת של אותות DNA חיידקי בפיצול התרדמת העכבר ובשליה

DNA רקמתי הופק באמצעות תהליך חילוץ DNA מבוסס עמודת סיליקה. ליזטים רקמתיים הובהרו באמצעות צנטריפוגציה ב-12,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20–25 מעלות צלזיוס, וסופרנטנטים הוחלו על עמודי סיליקה לקשירת DNA באמצעות צנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורה של 20–25 מעלות צלזיוס. שלבי השטיפה בוצעו בהתאם לזרימת העבודה, כאשר כל שטיפה לוותה בצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורה של 20–25 מעלות צלזיוס. סיבוב יבש סופי בוצע ב-12,000 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 20–25 מעלות צלזיוס להסרת שאריות אתנול. ה-DNA נלקח בבופר שחרור של 50 מיקרוליטר לאחר דגירה של 2 דקות בטמפרטורה של 20–25 מעלות צלזיוס ונאסף בצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורה של 20–25 מעלות צלזיוס. DNA גנומי חיידקי הופק באמצעות תהליך חילוץ DNA חיידקי מבוסס עמודת סיליקה תוך שימוש באותם פרמטרים של צנטריפוגציה של קשר/שטיפה/ספין יבש/שחרור, אלא אם כן נדרש אחרת על פי זרימת העבודה.

ריכוז ה-DNA וטוהרו נמדדו באמצעות מדד חומצות גרעין מיקרו-נפח, והשלמות הוערכה באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז. דגימות DNA מאושרות נשמרו בטמפרטורה של –20 מעלות צלזיוס לניתוח הבא. גנים של חיידקים מטרה הוגברו ושוכפלו באמצעות פריימרים המפורטים בטבלה משלימה 1, כאשר תנאי PCR מפורטים בטבלה המשליפה 2 ובטבלה משלימה 3. רצועות מטרה מוגברות טוהקו, שוכפלו לפי מפרטי הטבלה המשלימים 4, והוסבו לתאי Escherichia coli DH5α מיומנים. זנים המכילים פלסמיד רקומביננטי אושרו כדי להבטיח רצפי הכנסת נכונים, ו-DNA הפלסמיד הוצא להכנה סטנדרטית. עקומות סטנדרטיות נוצרו על ידי ביצוע qPCR על תקני פלסמיד מדוללים סדרתית המכילים קטעי גן חיידקי מטרה. אותות ה-DNA החיידקי P. gingivalis 16S ו-F. nucleatum 16S בפיצול עורק הקרוטיד ובדגימות שליה זוהו כמותית באמצעות PCR בזמן אמת, כאשר מספרי עותקי DNA חושבו מערכי Ct באמצעות עקומה סטנדרטית. מערכות ותוכניות תגובה מפורטות בטבלה המשליחה 5 ובטבלה משלימה 6, בהתאמה. מכיוון ש-qPCR מצביע על אותות DNA חיידקי ולא על חיוניות או מיקום תאי, הפרשנויות לגבי נוכחות מיקרוביאלית בממשק האם-עובר נשארות זהירות.

10. זיהוי ELISA של גורמים דלקתיים בדגימות סרום עכברים ובסופרנטנטים של תרביות תאים

כל המגבים והדגימות הותאמו לטמפרטורת החדר לפני הבדיקה. רמות הסרום של TNF-α ו-IL-1β נמדדו באמצעות זרימות עבודה של ELISA לעכברים, ורמות TNF-α ו-IL-1β בסופרנטנטים של תרביות תא נקבעו באמצעות תהליכי ELISA אנושיים, בהתאם להליכי הערכה. תקנים ודגימות נמדדו בבארות כפולות, ונוצרו עקומות סטנדרטיות לכל לוחית. כפילויות טכניות נמדדו בממוצע כדי להניב ערך אחד לכל שכפול ביולוגי.

11. ניתוחים נוספים בביולוגיה מולקולרית

עבור qRT-PCR, כל ה-RNA הופק מתאים מתורבתים באמצעות תהליך חילוץ RNA מבוסס פנול-כלורופורם. לאחר הפרדת פאזה, הפאזה המימית הובהרה באמצעות צנטריפוגציה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, וה-RNA הושקע, נשטף והושהה מחדש בהתאם לזרימת העבודה. ריכוז ה-RNA נמדד באמצעות אנלייזר חומצות גרעין, ושלמות ה-RNA הוערכה באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז. בוצע שעתוק הפוך ליצירת cDNA, ו-PCR כמותי בזמן אמת שימש לכימות רמות TNF-α ו-IL-1β mRNA. רצפי פריימר מפורטים בטבלה משלימה 7, תערובות תגובה בטבלה משלימה 8, ותוכניות תגובה בטבלה משלימה 9.

לבלוט מערבי, ליזאטים חלבונים מרקמות שליה של עכבר או תאי טרופובלסט הובהרו באמצעות צנטריפוגציה ב-12,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, כמותו, והוכחשו ל-SDS-PAGE ולאחר מכן העברת ממברנה וזיהוי מבוסס נוגדנים באמצעות תהליך הדמיה פלואורסצנטי. עומס חלבון שווה נקבע על 30 מיקרוגרם לכל נתיב. תמונות ממברנה מקוריות שלא נחתכו, כולל סמני משקל מולקולרי, נשמרו לכל הכתמים המוצגים באיורים וזמינות DOI: 10.57760/sciencedb.28254. אלא אם צוין אחרת, "n" מתייחס לשכפולים ביולוגיים (בעלי חיים בודדים או תרביות תאים עצמאיות), בעוד שחזרות טכניות משמשות לבקרת איכות ואינן מחליפות שכפול ביולוגי.

12. ניתוח סטטיסטי

ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי, והנתונים נוצרו באמצעות תוכנת גרפים (הרשומה בטבלת החומרים). נתונים רציפים שמפוזרים בדרך כלל הוצגו כסטיית תקן ממוצעת ± ונותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני עם בדיקות פוסט-הוק מתאימים, בעוד שנתונים לא מבוזרים נורמלית הוצגו כחציון (טווח בין-רבעוני) ונותחו באמצעות מבחן Kruskal–Wallis עם השוואות זוגיות מתאימות. ספי המובהקות הסטטיסטית נקבעו ב-P < 0.05, P < 0.01, ו-P < 0.001. אלא אם צוין אחרת, "n" מציין שכפולים ביולוגיים, ושכפולים טכניים (למשל, בארות ELISA כפולות) הוערכו כך שיניבו ערך יחיד לכל שכפול ביולוגי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זיהום ב-P. gingivalis או F. nucleatum קשור לקיצור הריוני ולעלייה בציטוקינים פרודלקתיים בסרום בעכברים
הסטטיסטיקות הבסיסיות של שינויים במשקל של האימהות, תוצאות יילודות ואורך ההריון מסוכמות בטבלה 1 ובאיור 1. מסלולי המשקל של האם ומצבים יילודים לא היו שונים באופן מובהק בין הקבוצות (ANOVA חד-כיווני, P > 0.05; איור 1A–F). אורך ההריון בקבוצת NC היה 20.50 (20.13, 20....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בשנים האחרונות, ראיות מצטברות מצביעות על קשרים קרובים בין בריאות הפה לתוצאות הריון, מה שמוביל לתשומת לב גוברת לקשרים פוטנציאליים בין דלקת פריודונטיטיס אפיקלית כרונית (CAP) לתוצאות שליליות בהריון, כולל פנוטיפים הקשורים ללידה מוקדמת31 . סקירה שיטתית מצביעה על כך שבסיס הראיות הקליני הנוכחי נותר מוגבל והטרוגני, אך בסך הכל תומך בקשר חיובי בין פריודונטיטיס אפיקלי אימהית לתוצאות שליליות בהריון, תוך הדגשת הצורך במחקרים פרוספקטיביים באיכות גבוהה יותר. בהתאם להקשר זה, CAP ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים מנוגדים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מעבדת הקרן לפיתוח ומחלות קשורות של נשים וילדים במחוז סצ'ואן (מענק מס' FYYFEJB2025002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Chromogenic Peroxidase SubstrateAgilent DakoK3468חומר מצע כרומוגני לפרוקסידאז להמטוקסין
Defibrinated sheep blood, sterileThermo Fisher (Remel)R54012דם כבשים דפוס פיברינים, סטרילי
Dental X-ray unit / radiography systemPlanmecaIntra (דגם)צילומי רנטגן פריאפיקליים לאישוש CAP
DNeasy Blood & Tissue KitQIAGEN69504חילוץ DNA מרקמות/חיידקים באמצעות עמודות סיליקה
E. coli DH5α Competent CellsTaKaRa9057טרנספורמציה לבניית תקן פלסמיד
Eosin Y solution, alcoholicSigma-Aldrich (Merck)HT110132צביעת H&E
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, AustraliaGibco (Thermo Fisher Scientific)10099-141תוסף לתווך תרבית מלא
Flowable resin composite3MFiltek Supreme Flowable 6010שיקום לאחר איטום; ריפוי באור
Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum reference strainATCC25586תרבית אנארובית; חשיפה CAP וווריד זנב
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 9 (גרסה)ניתוח סטטיסטי ויצירת גרפים
Hematoxylin solutionSigma-Aldrich (Merck)HHS32צביעת נגד H&E
HTR-8/SVneo human trophoblast cell lineATCCCRL-3271בדיקות זיהום in vitro
Human IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)DLB50מדידת IL-1β בתרכולת תאים
Human TNF-α Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)DTA00Dמדידת TNF-α בתרכולת תאים
Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45 µmMillipore (Merck)IPFL00010העברה למערכת Western blot פלואורסצנטית
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L)LI-COR925-68071נוגדן משני פלואורסצנטי
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H+L)LI-COR926-32211נוגדן משני פלואורסצנטי
IκBα (44D4) Rabbit mAbCell Signaling Technology4812נוגדן ראשוני (WB)
K-File (endodontic file)Dentsply Sirona (Maillefer)A012D015כלי נגרר (גודל דוגמה 15)
LED dental curing light3MElipar DeepCure-S (דגם)20 שניות ריפוי (לפי הפרוטוקול)
Mouse IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)MLB00Cמדידת IL-1β בסרום
Mouse TNF-α Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)MTA00Bמדידת TNF-α בסרום
MyD88 (D80F5) Rabbit mAbCell Signaling Technology4283נוגדן ראשוני (WB)
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-Wכימות DNA/RNA
Near-infrared imaging systemLI-COROdyssey CLx (דגם)הדמיה של Western blot פלואורסצנטי
NF-κB p65 (D14E12) Rabbit mAbCell Signaling Technology8242נוגדן ראשוני (WB)
PBS, pH 7.4, without Ca2+/Mg2+Gibco (Thermo Fisher Scientific)10010-023שטיפת תאים והכנת ריאגנטים
Penicillin-Streptomycin Gibco (Thermo Fisher Scientific)15140-122אנטיביוטיקה
Pentobarbital sodium saltSigma-Aldrich (Merck)P3761השראת הרדמה (מינון לפי פרוטוקול)
Peroxidase blocking solutionAgilent DakoS2023חסימת פרוקסידאז אנדוגני להמטוקסין
Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAbCell Signaling Technology3033נוגדן ראשוני (WB)
Porphyromonas gingivalis reference strainATCC33277תרבית אנארובית; חשיפה CAP וווריד זנב
PrimeScript RT Reagent Kit (Perfect Real Time)TaKaRaRR037Aסינתזת cDNA
Real-time PCR systemApplied BiosystemsQuantStudio 5 (דגם)כימות qPCR של מטרות 16S
Round bur (sterile)Dentsply SironaH1-010פתיחת גישה לתא פולפה של השיניים הטוחנות העליונים הראשונים
RPMI 1640 MediumGibco (Thermo Fisher Scientific)11875-093תווך תרבית בסיסי HTR-8/SVneo
SYBR-safe DNA gel stainInvitrogenS33102ויזואליזציה של DNA
TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0TaKaRa9760מיניפרפ פלסמיד להכנת סטנדרטים
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TaKaRaRR820Aתערובת qPCR מוכנה (מבוססת צבע)
TLR4 (D8L5W) Rabbit mAbCell Signaling Technology14358נוגדן ראשוני (WB)
TRIzol ReagentInvitrogen15596-026חילוץ RNA בפנול-

מקורות

  1. American College of Obstetricians and Gynecologists’ Committee on Practice Bulletins—Obstetrics. Practice bulletin no. 171: Management of preterm labor. Obstet Gynecol. 128, e155-e164 (2016).
  2. Vogel, J. P., Chawanpaiboon, S., Moller, A. B., Watananirun, K., Bonet, M., et al. The global epidemiology of preterm birth. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 52, 3-12 (2018).
  3. Svenvik, M., et al. Early prediction of spontaneous preterm birth before 34 gestational weeks based on a combination of inflammation-associated plasma proteins. Front Immunol. 15, 1415016-1415028 (2024).
  4. Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of under-5 mortality in 2000–15: An updated systematic analysis with implications for the sustainable development goals. Lancet. 388, 3027-3035 (2016).
  5. Saigal, S., Doyle, L. W. An overview of mortality and sequelae of preterm birth from infancy to adulthood. Lancet. 371, 261-269 (2008).
  6. Liang, S., et al. Development of a spontaneous preterm birth predictive model using a panel of serum protein biomarkers for early pregnant women: A nested case-control study. Int J Gynaecol Obstet. 168, 701-708 (2025).
  7. Bradley, E., et al. Born too soon: Global epidemiology of preterm birth and drivers for change. Reprod Health. 22, 105-119 (2025).
  8. Hodek, J. M., von der Schulenburg, J. M., Mittendorf, T. Measuring economic consequences of preterm birth: Methodological recommendations for the evaluation of personal burden on children and their caregivers. Health Econ Rev. 1 (1), 6 (2011).
  9. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: One syndrome, many causes. Science. 345, 760-765 (2014).
  10. Goldenberg, R. L., et al. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371, 75-84 (2008).
  11. Combs, C. A., et al. Amniotic fluid infection, inflammation, and colonization in preterm labor with intact membranes. Am J Obstet Gynecol. 210, 125.e1-125.e15 (2014).
  12. Mendz, G. L., Kaakoush, N. O., Quinlivan, J. A. Bacterial aetiological agents of intra-amniotic infections and preterm birth in pregnant women. Front Cell Infect Microbiol. 3, 58-64 (2013).
  13. Semmes, E. C., Coyne, C. B. Innate immune defenses at the maternal-fetal interface. Curr Opin Immunol. 74, 60-67 (2022).
  14. Han, Y. W., Wang, X. Mobile microbiome: Oral bacteria in extra-oral infections and inflammation. J Dent Res. 92, 485-491 (2013).
  15. Ide, M., Papapanou, P. N. Epidemiology of association between maternal periodontal disease and adverse pregnancy outcomes—systematic review. J Periodontol. 84, S181-S194 (2013).
  16. Offenbacher, S., et al. Periodontal infection as a possible risk factor for preterm low birth weight. J Periodontol. 67, 1103-1113 (1996).
  17. Jeffcoat, M. K., et al. Periodontal infection and preterm birth: Results of a prospective study. J Am Dent Assoc. 132, 875-880 (2001).
  18. Siqueira, J. F., Rôcas, I. N. Microbiology and treatment of acute apical abscesses. Clin Microbiol Rev. 26, 255-273 (2013).
  19. Marchesan, J., et al. TLR4, NOD1 and NOD2 mediate immune recognition of putative newly identified periodontal pathogens. Mol Oral Microbiol. 31, 243-258 (2016).
  20. Georgiou, A. C., Crielaard, W., Armenis, I., de Vries, R., van der Waal, S. V. Apical periodontitis is associated with elevated concentrations of inflammatory mediators in peripheral blood: A systematic review and meta-analysis. J Endod. 45 (11), 1279-1295.e3 (2019).
  21. Harjunmaa, U., et al. Association between maternal dental periapical infections and pregnancy outcomes: Results from a cross-sectional study in Malawi. Trop Med Int Health. 20, 1549-1558 (2015).
  22. Harjunmaa, U., et al. Periapical infection may affect birth outcomes via systemic inflammation. Oral Dis. 24, 847-855 (2018).
  23. Leal, A. S., et al. Association between chronic apical periodontitis and low-birth-weight preterm births. J Endod. 41, 353-357 (2015).
  24. León, R., et al. Detection of Porphyromonas gingivalis in the amniotic fluid in pregnant women with a diagnosis of threatened premature labor. J Periodontol. 78, 1249-1255 (2007).
  25. Sanz, M., et al. Periodontitis and cardiovascular diseases: Consensus report. J Clin Periodontol. 47, 268-288 (2020).
  26. Robertson, S. A., et al. Targeting Toll-like receptor-4 to tackle preterm birth and fetal inflammatory injury. Clin Transl Immunol. 9, e1121-e1139 (2020).
  27. Peng, J., et al. miR-199a-3p suppresses cervical epithelial cell inflammation by inhibiting the HMGB1/TLR4/NF-κB pathway in preterm birth. Mol Med Rep. 22, 926-938 (2020).
  28. Shen, Z., et al. Protective effects of syringin against oxidative stress and inflammation in diabetic pregnant rats via TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Biomed Pharmacother. 131, 110681-110690 (2020).
  29. McCarthy, R., et al. Mouse models of preterm birth: Suggested assessment and reporting guidelines. Biol Reprod. 99, 922-937 (2018).
  30. Ao, M., et al. Dental infection of Porphyromonas gingivalis induces preterm birth in mice. PLoS One. 10 (8), e0137249-e0137265 (2015).
  31. Jakovljevic, A., et al. The association between apical periodontitis and adverse pregnancy outcomes: A systematic review. Int Endod J. 54 (9), 1527-1537 (2021).
  32. Khalighinejad, N., Aminoshariae, A., Kulild, J. C., Mickel, A. Apical periodontitis, a predictor variable for preeclampsia: A case-control study. J Endod. 43 (10), 1611-1614 (2017).
  33. Venugopal, B., Narasimman, H., Mahalingam, A., Naren Kishore, R., Jayavel, K., et al. Systemic health associations of apical periodontitis: A systematic review of observational studies. Cureus. 17 (10), e95273 (2025).
  34. Liang, S., et al. Periodontal infection with Porphyromonas gingivalis induces preterm birth and lower birth weight in rats. Mol Oral Microbiol. 33 (4), 312-321 (2018).
  35. Lin, D., et al. Porphyromonas gingivalis infection in pregnant mice is associated with placental dissemination, an increase in the placental Th1/Th2 cytokine ratio, and fetal growth restriction. Infect Immun. 71 (9), 5163-5168 (2003).
  36. Han, Y. W., et al. Fusobacterium nucleatum induces premature and term stillbirths in pregnant mice: Implication of oral bacteria in preterm birth. Infect Immun. 72 (4), 2272-2279 (2004).
  37. Liu, H., et al. Fusobacterium nucleatum induces fetal death in mice via stimulation of TLR4-mediated placental inflammatory response. J Immunol. 179 (4), 2501-2508 (2007).
  38. Chan, E., et al. Identification of Fusobacterium nucleatum in formalin-fixed, paraffin-embedded placental tissues by 16S rRNA sequencing in a case of extremely preterm birth secondary to amniotic fluid infection. Pathology. 51 (3), 320-322 (2019).
  39. Habelrih, T., Augustin, T. L., Mauffette-Whyte, F., Ferri, B., Sawaya, K., et al. Inflammatory mechanisms of preterm labor and emerging anti-inflammatory interventions. Cytokine Growth Factor Rev. 78, 50-63 (2024).
  40. Gomez-Lopez, N., Romero, R., Plazyo, O., Panaitescu, B., Furcron, A. E., et al. Intra-amniotic administration of HMGB1 induces spontaneous preterm labor and birth. Am J Reprod Immunol. 75 (1), 3-7 (2016).
  41. Wang, S., Ma, L., Ji, J., Huo, R., Dong, S., et al. Protective effect of soy isolate protein against streptozotocin induced gestational diabetes mellitus via TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Biomed Pharmacother. 168, 115688 (2023).
  42. Reyes, L., et al. Porphyromonas gingivalis and adverse pregnancy outcome. J Oral Microbiol. 10 (1), 1374153 (2017).
  43. Aagaard, K., et al. The placenta harbors a unique microbiome. Sci Transl Med. 6 (237), 237ra65 (2014).
  44. Kuperman, A. A., et al. Deep microbial analysis of multiple placentas shows no evidence for a placental microbiome. BJOG. 127 (2), 159-169 (2020).
  45. Einenkel, R., et al. Less is more! Low amount of Fusobacterium nucleatum supports macrophage-mediated trophoblast functions in vitro. Front Immunol. 15, 1447190 (2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Porphyromonas GingivalisFusobacterium NucleatumTLR4MyD88NF KappaB
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.