בניית מודלים יעילים של בלסטוציסט עכברים שמקורם בתאי גזע ללימודי סביבה

Summary

פרוטוקול זה מתאר את היצירה והניתוח של iGATA4-בלסטואידים, מודל מבוסס תאי גזע בקנה מידה שמסכם מאפיינים מרכזיים של הבלסטוציסט בעכבר, כולל ארגון שושלת וקוויטציה, ומאפשר הערכה שחזורית ובעלת תפוקה גבוהה של הפרעות סביבתיות ומולקולריות המשפיעות על התפתחות עוברית מוקדמת.

Abstract

מודלים מבוססי תאי גזע של עוברים מציעים פלטפורמה עוצמתית לחקר התפתחות יונקים מוקדמת ורגישותם להפרעות סביבתיות. כאן מוצג פרוטוקול חזק ונגיש לייצור בלסטואידים של עכבר באיכות גבוהה באמצעות תאי גזע עובריים (ESCs), תאי גזע טרופובלסטים (TSCs) ותאי גזע עובריים המהונדסים לביטוי GATA4 השראה (iGATA4-ESCs). מערכת זו מייצרת iGATA4-בלסטואידים שמסכמים במדויק את המורפולוגיה הטבעית של הבלסטוציסט E4.5, פרופורציות שושלת וחתימות שעתוק, ומספקת מודל מעבדה אמין של מחלקות האנדודרם הפרימיטיבי (PE), האפיבלסט (EPI) והטרופקטודרם (TE). פרוטוקול זה מדגים תחילה כיצד לשמור ולהכין את שלוש אוכלוסיות תאי הגזע הנדרשות להיווצרות בלאסטואידים. ההרכבה שלב אחר שלב של iGATA4-blastoiדים בתנאי תרבית טרום-השתלה מתוארת, תוך הדגשת פרמטרים ניסיוניים קריטיים. כדי לאפשר אפיון קפדני, מסופק תהליך עבודה שנבדק לקיבוע בלאסטואידים, צביעה והדמיה. לבסוף, מוצגת דוגמה המדגימה כיצד ניתן להשתמש ב-iGATA4-blastoiדים לבדיקות בתפוקה גבוהה. על ידי חשיפת קבוצות גדולות של בלסטואידים לגורמים סביבתיים מוגדרים, ניתן לכמת שינויים במורפולוגיה, בהקצאת השושלות ובהתקדמות ההתפתחותית במהירות ובשחזור. ביחד, פרוטוקול זה יוצר פלטפורמה ניתנת להרחבה למידול התפתחות טרום-השתלה, ניתוח החלטות שושלת מוקדמות וביצוע סקרים רב-פרמטריים להערכת השפעות סביבתיות או מולקולריות על היווצרות הבלסטוציסטות.

Introduction

הבנת האופן שבו עוברים יונקים מוקדמים מתאספים מעצמם וכיצד גורמים סביבתיים נפוצים עלולים להשפיע לרעה על היווצרותם דורשת מערכות מודל שניתנות לשחזור, נגישות ניסיונית וניתנות להרחבה. מודלים משולבים דמויי עוברים שנוצרים משילוב תאי גזע עובריים וחוץ-עובריים מספקים פלטפורמה כזו ^1,2. פרוטוקול זה מתאר כיצד תאי גזע עובריים (ESCs), תאי גזע טרופובלסטים (TSCs) ו-ESCs מהונדסים לביטוי GATA4 השראה (iGATA4-ESCs) יכולים להיות מורכבים בתנאי טרום-השתלה כדי לייצר בלסטואידים עם שושלות אנדודרם פרימיטיבי חזק ופרופורציות נכונות (PE), אפיבלסט (EPI) וטרופקטודרם (TE). מחקרים עדכניים הראו שמבנים אלו, הנקראים iGATA4-blastoids³, דומים לבלסטוציסט E4.5 בפרופורציות השושלת, בחתימות שעתוק ובביטוי הסמנים הפונקציונליים. כאשר מגדלים במעבדה, 12.5% מהמבנים הללו עוברים למורפולוגיה לאחר ההשרשה. חשוב לציין, הם מתאימים לטוקסיקולוגיה ולבדיקות סביבתיות.

פיתוח הטכניקה הזו נבע ממגבלות במערכות בלסטואידים קיימות ^2,4,5. למרות שרבים מהפרוטוקולים 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 יוצרים מבנים מקווטים הדומים לבלסטוציסטים מוקדמים, רובם עושים זאת ביעילות יחסית נמוכה או יוצרים מבנים עם היווצרות PE לא שלמה, זהות תאים לא מוגדרת, או פרופורציות שושלת שגויות. אי-התאמות אלו מפחיתות את ההתאמה שלהם למחקרים מכניים ולמסכי הפרעה בעלי תפוקה גבוהה. מכיוון שמפרט PE ב-vivo עוקב אחרי הפעלת GATA6, SOX17, GATA4 ו-SOX7²², ופגמים ב-PE או בנגזרתו, האנדודרם הוויסרלי (VE), פוגעים בהתפתחות סביב ההשתלה 23,24,25,26,27, מה שמחזק את תוכנית השעתוק הזו במבחנה משפר את האיכות של הבלסטואידים. ESCs הנושאים טרנסג'ן GATA4 מותנה עוברים טרנסדיפרנציאציה חזקה ל-VE, וכאשר משולבים עם ESCs ו-TSCs בתנאים לאחר ההשתלה, יוצרים מודלים משולבים של עוברים שמבצעים גסטרולות ומתחילים אורגנוגנזה 28,29,30,31. כאן, עיקרון זה מותאם לתנאי טרום-השתלה, ומדגים כי iGATA4-ESCs מייצרים באופן אמין PE ומניבים בלסטואידים הדומים מאוד לבלסטוציסטים טבעיים³.

שיטה זו מתגברת על מגבלות קודמות במידול בלסטוציסטים באמצעות תאי גזע ומציעה יעילות גבוהה של היווצרות בלאסטואידים (80% מהמבנים שנוצרים הם בלסטואידים, 75% מהם מראים ארגון ופרופורציות שושלת נכונים) ודמויות עובריות גבוהות. יתרה מזאת, ההרכבה המודולרית של iGATA4-בלסטואידים, שבה כל שושלת בלסטוציסטה נגזרת מאוכלוסיית תאי גזע מתורבתת באופן עצמאי, מספקת גישה ניסיונית ישירה לכל תא עובר. תכונות אלו הופכות את המערכת למתאימה במיוחד ליישומי סינון רב-פרמטריים. מכיוון שהוא מניב קבוצות גדולות של מבנים מורפולוגיים עקביים עם שושלות TE, EPI ו-PE בפרופורציות מדויקות, הוא מאפשר הפרעות מקבילות וכימות של תגובות ספציפיות לשושלת עם עוצמה סטטיסטית שאינה ניתנת להשגה באמצעות עוברים טבעיים.

כהוכחה לעיקרון, נמדדו השפעות הגורמים הסביבתיים הנפוצים בטווחים פיזיולוגיים 32,33,34,35,36,37,38 על התפתחות הבלסטואידים. השפעת שינויים בקפאין, ניקוטין, אתנול וחומצות אמינו על קצב הקוויטציה, המורפולוגיה, הכושר ופרופורציות השושלת הוערכה במגוון ריכוזים וחלונות טיפול זמניים. רוב התנאים (קפאין, אתנול, ניקוטין, ואלו המדמים דיאטות דלות חלבון) גרמו להיווצרות בלסטואידים חריגות ולפגיעה באיכות המבנית. לעומת זאת, הגדלת ריכוז חומצות האמינו בעלות שרשרת מסועפת (בדומה לתזונה עתירת חלבון) שיפרה את יעילות ואיכות יצירת הבלאסטואידים. תוצאות אלו שיקפו השפעות שנצפו בבלסטוציסטים טבעיים שעברו תרבית חוברת חוברת ³, ומראות כי מערכת זו לוכדת פנוטיפים עדינים ותלויי מינון ותומכת בצינורות סקר רב-ממדיים בקנה מידה שאינם אפשריים עם עוברים טבעיים.

בהקשר הרחב יותר של מידול עוברים, טכניקה זו מראה כי אותם תאים ששימשו למידול התפתחות משולבת לאחר ההשתלה יכולים גם לשמש כמודלים לפני ההשתלה. שיטה זו מתאימה במיוחד ליישומים הדורשים מידול בקנה מידה של מבנים דמויי בלסטוציסטות עם יצירת PE מדויקת ואינטגרציה שושלת חזקה. עם זאת, כמו במודלים אחרים מבוססי תאי גזע של הבלסטוציסט של העכבר, iGATA4-בלסטואידים אינם משתילים ומתפתחים לאחר העברה לעכבר מארח, ולכן אינם מתאימים למחקרים של אינטראקציות עובריות–אם. בסך הכול, פרוטוקול זה מספק גישה אמינה ונגישה ליצירת בלסטואידים באיכות גבוהה, המדמים החלטות מוקדמות מסוג תא בעובר היונק.

Protocol

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה כוללים קווי תאים מוכרים ובוצעו בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדית במכון הטכנולוגי של קליפורניה. לא בוצעה עבודה על בעלי חיים חיים או נבדקים.

מספר קווי ESC ו-TSC נבדקו ונמצאו תומכים ביצירת iGATA4-בלסטואידים. ESCs, iGATA4-ESCs ו-TSCs ממחקרים קודמים,²⁸ שימשו בהצלחה להשלמת כל השלבים המתוארים בפרוטוקול זה. אותם מחברים מתארים את יצירת iGATA4-ESC מקו עכברי CD1 (ICR) ESC שהוקם בעבר.

TSCs מגודלים מעל פיברובלסטים עובריים של עכבר (MEFs) הזמינים מסחרית. כל הכימיקלים, המגבים, הערכות, הציוד והתוכנה המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. תרבית תאי גזע של עכברים להיווצרות בלאסטואידים

1. הכנת לוחות הזנה של MEF
   1. צפה לוח תרבית תאי 6 בארות ב-1.5 מ"ל של 0.2% ג'לטין במים דה-יוניים (DI) לכל באר. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בנורמוקסיה לפחות 45 דקות.
   2. במהלך הדגירה, יש להכין צינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל עם 4 מ"ל מדיום FC (טבלה 1) מחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס.
   3. הפשרו את בקבוקון ה-MEF באמבט מים בתנועת צורה שמונה עד שנשאר רק כדור קרח קטן. העבר את התכולה לצינור המוכן, ואז פיפט למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. צנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 4 דקות.
   4. שואף את הסופרנטנט ותשהה מחדש את הכדור ב-1 מ"ל של FC בינונית. כוון לנפח מספיק לציפוי ~160,000 תאים לכל באר ב-1.5 מ"ל לבאר.
   5. שואב את הג'לטין והפלטה 1.5 מ"ל MEF לכל באר. דגרו בנורמוקסיה ללילה ללא הפרעה.
   6. החליפו את המדיום ב-1.5 מ"ל טרי לכל מדיום FC באר ביום הבא. שנה את המדיום כל 48 שעות. השתמש ב-MEFs 2–7 ימים אחרי הציפוי. ייתכן ש-MEFs יישארו בריאים זמן רב יותר, אך יכולתם לתמוך בצמיחת TSC עלולה להיפגע.

אזהרה: בצע את כל תרבית תאי העכבר בארונות זרימה למינריים ברמת בטיחות ביולוגית (BSL) 1 באמצעות טכניקת BSL-2.

2. הפשרה ומעבר תאי גזע עובריים בעכבר (WT ESCs ו-iGATA4-ESCs)
   1. הפשרת ESCs WT או iGATA4-ESCs לפי שלבים 1.1.1–1.1.3. לאחר הצנטריפוגה, החזירו את התאים ל-1 מ"ל של מדיום N2B27/2i/LIF (טבלה 1) וזרעו ~50,000 תאים לבאר בלוח 6 בארות מצופה ג'לטין עם ~1.5 מ"ל לבאר. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בנורמוקסיה והחליפו מדיום כל 48 שעות.
   2. ודאו שהמושבות צפופות ועגולות עם בליטות מינימליות לפני העומס. מעבר כל 2–3 ימים.
      הערה: WT ESCs ו-iGATA4-ESCs אינם ניתנים להבחנה מורפולוגית עד לאינדוקציה עם דוקסיציקלין (DOX).
   3. ציפו לוח עם 6 בארות ב-1.5 מ"ל של 0.2% ג'לטין במי DI לכל באר. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפחות 45 דקות.
   4. הוסיפו 500 מיקרולטר של תגובת דיסוציאציה של תאים לכל באר ודגרו במשך 3 דקות. הוסיפו 2 מ"ל של FC medium תוך כדי פיפטינג עדין סביב הקצוות. אשר >90% ניתוק תחת מיקרוסקופ. אם התאים נשארים מחוברים, יש פיפטה עדינה כדי לסייע בהשעיה מחדש.
   5. העבר את מתלה התא לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 4 דקות.
   6. שאוף את הסופרנטנט והחזיר את הגלולה ל-1 מ"ל של N2B27/2i/LIF בינוני. קבעו את ריכוז התאים באמצעות 10 מיקרוליטר על המוסיטומטר. כוון את הנפח לזרע ~50,000 תאים לבאר.
   7. שאפו את הג'לטין וזרעו את התאים. דגירה בנורמוקסיה. שנה את המדיום ביום הבא וכל 48 שעות לאחר מכן.
3. הפשרה ומעבר של תאי גזע טרופובלסטים בעכבר (TSCs)
   1. הפשרת TSCs לפי שלבים 1.1.1–1.1.3. לאחר הצנטריפוגה, החזירו את התאים ל-1 מ"ל של מדיום TSF4H (טבלה 1) וזרעו ~20,000 תאים לכל באר בלוח מצופה MEF עם 6 בארות. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂, 5% O₂ (היפוקסיה) והחליפו מדיום כל 24 שעות.
   2. ודאו שהמושבות גדולות (>75 מיקרון) ושטוחות לפני המעבר למים. הוסף 500 מיקרוליטר של תגובת דיסוציאציה של תאים לכל באר ודוגר במשך 5 דקות. הוסף 2 מ"ל של FC medium תוך כדי פיפטינג עדין. אשר >90% ניתוק.
   3. העבר תאים לצינור צנטריפוגה וסובב ב-500 × גרם למשך 4 דקות.
   4. תלייה מחדש ב-1 מ"ל TSF4H בינונית. קבעו את הריכוז והתאימו ל~20,000 תאים לבאר.
   5. לוחם על MEF ולדגור בהיפוקסיה. החלפת מדיום כל 24 שעות ומעבר כל 2–3 ימים לפני מיזוג המושבה.

2. היווצרות iGATA4-בלסטואידים

1. הכנת לוח אגרגציה של מיקרובאר להצטברות תאים
   1. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה נגד היצמדות לכל באר בלוח הצטברות מיקרובאר. צנטריפוגה ב-2,000 × גרם למשך 5 דקות עם איזון נכון להסרת אוויר כלוא מהמיקרובארות. דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בנורמוקסיה למשך לפחות שעה או לילה.
2. הכנת בלסטואידים, יום 0 — הכנה וציפוי של WT ו-iGATA4-ESC
   1. מדיום N2B27/2i/LIF, FC ו-FCYL לפני חימום (FC + 10 ng/mL LIF רקומביננטי בעכבר (mLIF) + מעכב ROCK של 2 מיקרומום Y27632) עד 37 מעלות צלזיוס. הכינו ג'לטין של 0.2% במי DI והכירו את מגיב התפרקות התאים.
   2. שאפו את תמיסת האנטי-היצמדות מבלי לגעת בתחתית הבאר. שטוף פעמיים עם 1 מ"ל PBS ופעם אחת עם 1 מ"ל FCYL בינונית. פיפט לאורך הקיר כדי להימנע מנזק למיקרובארות.
   3. הכינו צלחת 6 בארות מצופה ג'לטין (≥45 דקות דגירה) לתאים שעוברים.
   4. קציר WT ו-iGATA4-ESCs על ידי שאיבת מדיום והוספת 500 מיקרוליטר תגובת דיסוציאציה של תאים לכל באר. דגרו במשך 3 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הוסיפו 2 מ"ל FC בינוני ופיפטה בעדינות. אשר ניתוק מוחלט תחת מיקרוסקופ. העבר לצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 4 דקות.
   5. החזיר את השעון ב-1 מ"ל FCYL בינונית. קבעו את ריכוז התאים באמצעות 10 מיקרוליטר על המוסיטומטר. התאם ל-500,000–700,000 תאים/מ"ל. חשב את הנפח הנדרש ל-5 ESCs של WT ו-5 iGATA4-ESC לכל מיקרובאר (6,000 תאים לבאר).
      הערה: אופטימיזציה לקווי ESC אחרים במידת הצורך. טווח התחלתי הוא 4–7 ESCs לכל מיקרובאר עם יחס של 1:1 בין ESCs ל-iGATA4-ESCs.
   6. הכינו 500 מיקרוליטר של תליית תא לכל באר. הוסיפו בכיוון הנפילה לפלטת האגרגציה של מיקרווול באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר. צנטריפוגה ב-100 × גרם ל-3 דקות ולוודא התפוצה אחידה. דגרו במשך 6 שעות עד שנוצרו אגרגטים.
   7. מעבר ב-ESCs שנותרו כפי שמתואר בסעיף 1.2.
3. הכנת בלסטואיד, יום 0 — הכנת מדיום TX
   1. הכינו ~20 מ"ל TX בבסיס באמצעות DMEM/F12 (טבלה 2). הכינו טריים לכל ניסוי.
      1. הוסף 200 מיקרוליטר 200 מ"מ L-אלניל-L-גלוטמין (2 מ"מ אחרון). מלאי לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      2. הוסף 200 מיקרוליטר 10,000 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין (100 U/mL אחרונים כל אחד). אחסון בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס.
      3. הוסף 40 מיקרוליטר 32 מ"ג/מ"ל חומצה אסקורבית (64 מיקרוגרם/מ"ל סופית). הכינו במי DI, סיננו ואחזו בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס.
      4. הוסף 20 מיקרוליטר נתרן סלניט (14 ng/mL סופיים). הכינו ואחסנו בטמפרטורה של −20°C.
      5. הוסף 240 מיקרו-ליטר NaHCO₃ (543 מיקרוגרם/מ"ל סופיים). ערבב היטב אחרי ההפשרה.
      6. הוסף 20 מיקרוליטר הולו-טרנספרין (10.7 מיקרוגרם/מ"ל אחרונים). מערבבים אחרי ההפשרה.
      7. הוסף ~37.5 מיקרוליטר אינסולין (19.4 מיקרוגרם/מ"ל; תלוי באצווה). אחסון ב-4 מעלות צלזיוס.
   2. מיד לפני השימוש, מוסיפים Y27632 לריכוז סופי של 20 מיקרומ', CHIR99021 ל-3 מיקרומ', IL-11 עד 30 ננוגרם/מ"ל, FGF4 עד 25 ננוגרם/מ"ל, הפארין ל-1 מיקרוגרם/מ"ל, mLIF ל-10 ננוגרם/מ"ל, TGFβ ל-15 ננוגרם/מיליטר, ו-8Br-cAMP ל-25 מיקרומון.
4. הכנת בלסטואידים, יום 0 — הכנה וציפוי של TSCs
   1. TSF4H, FC (טבלה 1) לפני התחממות, ומדיה TX (סעיף 2.3). הכינו צלחות מצופות ג'לטין (≥45 דקות) לדלדול MEF.
   2. קציר TSCs על ידי הוספת 500 מיקרוליטר ריגונט לדיסוציאציית תאים לכל באר ודגירה למשך 5 דקות בהיפוקסיה. הוסיפו 2 מ"ל FC בינוני ופיפטה בעדינות. אשר את הניתוק. העבר לצינור וצנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 4 דקות.
      הערה: TSCs שנגרמו >4 ימים עשויים לדרוש טיפול של עד 10 דקות בטיפול בהתנתקות תאים.
   3. החזיר את השעון ב-1 מ"ל TSF4H בינוני והתאם לנפח המתאים לציפוי ביחס של 1:2.
   4. לוחות על בארות מצופות ג'לטין לדלדול MEF. הדגרה ~45 דקות בהיפוקסיה. ודא שה-MEF מחוברים בעוד ש-TSCs נשארים ברובם לא מחוברים.
   5. החלף מדיום של 900 מיקרוליטר מבארות לוחות הצטברות מיקרווול במדיה של 500 מיקרו ליטר TX. חזרה להיפוקסיה.
   6. העבר את הסופרנטנט המכיל TSC לצינור מבלי להפריע ל-MEFים מחוברים. קבעו ריכוז (יעד 500,000–700,000 תאים/מ"ל).
   7. חשב נפח עבור 12 TSCs לכל מיקרובאר (14,400 תאים לבאר). צנטריפוגה אם נדרש ריכוז נוסף.
      הערה: אופטימיזציה לקווי TSC אחרים (מומלץ 10–15 תאים לכל מיקרובאר).
   8. הוסף 500 מיקרוליטר מתלה תא לכל באר מצד הדרופ. צנטריפוגה ב-100 × גרם למשך 3 דקות. אשר את ההתפלגות ודגרה בהיפוקסיה למשך 24 שעות.
   9. מעבר עם TSCs שנותרו לפי הצורך (סעיף 1.3).
5. הכנת בלסטואידים, יום 1 — השראה
   1. כ-24 שעות לאחר הוספת TSC, יש להוסיף 20 מיקרוליטר של 5 מילימטר 8Br-cAMP ו-1 מיקרוליטר של 1 מיקרוגרם/מ"ל DOX לכל באר. דגרו במשך 48–72 שעות בהיפוקסיה.
6. הכנת בלסטואיד, יום 3 — קיבוע
   1. החזר את האגרגטים באמצעות קצה פיפטה חתוך בנפח 1000 מיקרוליטר. העבר לצינורות של 2 מ"ל ואפשר לשקע במשך 5 דקות.
   2. הסר סופרנטנט והוסף 250 מיקרו-ליטר של 4% פאראפורמלדהיד (PFA). תשעה בעדינות.
      אזהרה: לטפל ב-PFA עם מכסה אדים עם ציוד מגן מתאים.
   3. דגירה 15 דקות, תוך הקפצה כל 5 דקות.
   4. הסר PFA והוסף 300 מיקרוליטר PBST (PBS + 0.1% Tween-20). ערבב בעדינות. שמרו ב-4 מעלות צלזיוס למשך <שבוע לפני הכתמה.
7. אימונופלואורסצנציה של בלסטואידים
   1. העבר 150 מיקרוליטר לכל דגימה ללוח U-תחתית עם 96 בארים.
   2. הוסיפו 100 מיקרוליטר בופר חדירה ודגרו 20 דקות. החלף בתמיסת נוגדנים ראשונית ודוגר ללילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   3. שטוף 3× עם PBST (5 דקות כל אחד). הוסיפו נוגדנים משניים.
   4. דגרו 2 שעות בטמפרטורת החדר בחושך.
   5. שטוף 3× והעבר לצלחת ההדמיה.
   6. תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (≥25× אובייקטיבי, NA ≥0.8).

3. מסכים בעלי תפוקה גבוהה במודל iGATA4-blastoid

1. הכנת iGATA4-בלסטואידים ובדיקת גורמים סביבתיים
   1. הכינו לוח אגרגציה של מיקרובאר כפי שמתואר בסעיף 2.1 ויצרו iGATA4-blastoiדים בהתאם לסעיפים 2.2–2.4. הכינו מספיק בארות, כולל בקרות מתאימות. כלול בקרה ריקה (בלסטואידים שהוכנו לפי הפרוטוקול הסטנדרטי), בקרת נשא ותנאי ניסוי אחד או יותר.
   2. דגור בלסטואידים במהלך הלילה בהיפוקסיה. כ-24 שעות לאחר זריעת TSC, יש להכין מדיום TX בתוספת 8Br-cAMP, דוקסיציקלין (DOX) והתרכובת המעניינת (או בקרת נשאי). התנאים הבאים נבדקו:
      1. קפאין: 3.5 מ"ג/ליטר, מדולל ממאגרי מים אולטרה-טהורים.
      2. ניקוטין: 330 ng/L, מדולל ממלאי 100% אתנול (EtOH).
      3. אתנול: 17 מילימטר, מדולל מ-EtOH מוחלט.
      4. חומצות אמינו בעלות שרשרת מסועפת גבוהה (BCAA): +5%, +25%, +50% יחסית לריכוזים בסיסיים (0.45 מ"מ L-לאוצין, 0.45 מ"מ L-ולין, 0.42 מ"מ L-איזולאוצין), שהוכנו ממאגרים מרוכזים במים אולטרה-טהורים.
      5. מתיונין ולואצין נמוכים: −5%, −25%, −50%, −100% יחסית לריכוזי בסיס (0.12 mM L-מתיונין, 0.45 mM L-לאוצין), שהוכן באמצעות DMEM/F12 ללא Met-/Leu. DMEM (LM-DMEM) ללא מט/לאו מתוסף עם תערובת תזונה F-12 של Ham's 1 לפני השימוש.
         אזהרה: הכינו וטפלו במלאי קפאין וניקוטין מרוכזים במכסה אדים באמצעות ציוד מגן אישי מתאים (ציוד מגן אישי; כפפות, חלוק מעבדה, מגן עיניים). אתנול דליק ויש להרחיק אותו ממקורות חום.
   3. שאבו את המדיום מכל באר והוסיפו 1 מ"ל של מדיום TX המכיל תרכובות. עבד היטב אחד בכל פעם כדי למנוע ייבוש. החזר את הצלחת לדוגמת ההיפוקסיה ולתרבית עד היום השלישי.
   4. לצלם תמונות מייצגות של שדה בהיר ביום השלישי באמצעות מיקרוסקופ אור משודר. תקבע את המבנים ובצע אימונופלואורסצנציה כפי שמתואר בסעיפים 2.6 ו-2.7.
      הערה: כוון את חלונות הטיפול בהתאם למטרה הניסויית. ניתן ליישם טיפולים במהלך הצטברות מוקדמת (יום 1) או שלבים מאוחרים יותר (למשל, התרחבות חלל). חלונות לדוגמה כוללים את הימים 1–3, ימים 1–2 (ואחריו החלפת מדיה), וימים 2–3.
2. ניתוח iGATA4-בלסטואידים רב-פרמטריים
   1. השתמשו בתמונות שדה בהיר כדי לכמת את אחוז הבארות המכילים מבנים מקווטים (כלומר, מבנים עם חלל מרכזי מוגדר בבירור) ולמדוד את קוטר הבלסטואידים.
      1. תמונות פתוחות בתוכנת ניתוח התמונה.
      2. השתמש בכלי הקו הישר כדי לצייר קו על פני כל מבנה.
      3. מדדו את הקוטר באמצעות ניתוח > מדידה.
   2. בחרו דגימות ייצוגיות עם צביעת חיסון (20–40 מבנים לכל שכפול ביולוגי, עם לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים לכל מצב) ותמונה כפי שמתואר בסעיף 2.7.
   3. כמת את מספר התאים הכולל והרכב השושלת באמצעות סמני אימונופלואורסצנציה: TE (חיובי ל-CDX2), "EPI" (חיובי ל-SOX2 ו-SOX17-שלילי), ו-PE (חיובי-SOX17).
   4. הערכת ארגון מבני ומורפולוגיה על ידי קביעת האם תאי PE מופרדים מרחבית מתאי EPI בתוך מסת התא הפנימית (ICM) (סיווג בינארי: כן/לא).
   5. סווג את המורפולוגיה כטובה (מבנה דמוי בלסטוציסט ברור עם חלל מוגדר ומחלקות TE, EPI ו-PE מאורגנים היטב), בינונית (חריגות קלות כמו צורה לא סדירה או חלל חלקי), או רעה (חריגות משמעותיות כמו היעדר חלל או שושלות לא מסודרות/לא מסודרות).
   6. לכמת פרמטרים נוספים, כולל גודל או נפח החלל, כאשר רלוונטי. השתמש בכלים ביואינפורמטיים או כלים אחרים לגרפיה וניתוח סטטיסטי, ובתוכנות ניתוח תמונות תלת-ממדיות לספירת תאים ו/או הכנת תמונה לתצוגה.

Results

שמירה על ESCs ו-iGATA4-ESCs (נורמוקסיה) ו-TSCs (היפוקסיה) בתנאי תרבית מתאימים חיונית ליצירת בלסטואידים מוצלחת. כאשר מגדלים אותם כפי שמתואר, ESCs ו-iGATA4-ESC אמורים להיות כמעט בלתי ניתנים להבחנה, וליצור מושבות בגודל בינוני, עגולות ומוגדרות היטב לאחר 3 ימים. הופעת מושבות שטוחות או קצוות בולטים מעידה על התמיינות ראשונית, ותרביות כאלה אינן צריכות לשמש ליצירת בלסטוידים. TSCs צריכים ליצור מושבות אפיתל שטוחות עם קצוות מעט מוגבהים ומרכזים שטוחים יותר. מושבות TSC שגדלו יתר על המידה או מתמזגות (בדרך כלל לאחר >3 ימים בתרבית) לעיתים קרובות מובילות לתוצאות בלסטואידים גרועות (איור 1).

במהלך הרכבת iGATA4-בלסטואיד, מספר סימנים מוקדמים מצביעים על הצלחת הפרוטוקול (איור 2A, B). כ-6 שעות לאחר הצטברות ESC ו-iGATA4-ESC, יש לראות אגרגטים של תאים צפופים בתחתית המיקרובארות. אגרגטים רופפים מצביעים על חשיפה מופרזת לתגובת דיסוציאציה של תאים, מה שמפחית הידבקות בין תאים. התקדמות לשלב הבא (הוספת TSC; סעיף 2.4) אמור להתרחש רק כאשר נצפים אגרגטים צפופים (איור 2B, נקודת זמן D0.5). צביעת חיסון בשלב זה אמורה להראות אגרגטים הומוגניים של SOX2⁺ ו-GATA4⁻ (איור 2B, נקודת זמן D0.5).

לאחר הוספת TSC והדגירה הלילית, אמור להיות ברור אגרגט קוהזיבי יחיד מוקף בתאי CDX2⁺ (איור 2B). נוכחות תאים גדולים ולא מצטברים על פני השטח של אגרגטים מצביעה לעיתים קרובות על שאריית MEFs. זיהום MEF יכול להפחית את יעילות יצירת הבלסטואידים; לכן, דלדול מספק של MEF הוא קריטי לקבלת אוכלוסיית TSC ברובה לפני ההצטברות. מסננת תאים בנפח 40 מיקרון עשויה לשמש להסרת שאריות MEF, אם כי הדבר עשוי להפחית את תפוקת TSC. כיסוי CDX2⁺ לא שלם או מופרז ניתן לתיקון על ידי התאמת מספר ה-TSCs שנוספו לכל מיקרובאר (טווח מומלץ: 10–15).

לאחר הוספת DOX ו-8Br-cAMP, נחשפים לעששת בדרך כלל עד היום השני ועלולים להימשך עד היום השלישי. במיקרוסקופיית ברייטשילד, חללים נראים כחללים שקופים וריקים בתוך בלסטואידים (איור 2B, C; קו מקווקו לבן). תאי GATA4⁺ מופיעים זמן קצר לאחר השראת DOX וממיינים בהדרגה לפני השטח של המחלקה הדמוית ICM (איור 2B). היווצרות בלאסטואידים מוצלחת מאופיינת ביעילות קוויטציה גבוהה (בדרך כלל ~80% מהמבנים בכל לוח אגרגציה מיקרובאר; איור 2D), אפיתל חיצוני חד-שכבתי בדומה ל-CDX2⁺ דמוי TE, חלל דמוי בלסטוקואל, ותא מעוגל דמוי ICM המכיל תאי SOX2⁺ דמויי EPI שמכוסה בתאי GATA4⁺ דמויי PE (איור 2C–E).

תוצאות לא אופטימליות נפוצות כוללות מבנים ללא קוויט, בלסטואידים בעלי צורה לא סדירה עם מספר חללים או מחלקות דמויי ICM, ובארות המכילות מעט מבנים או פסולת תאית. בעוד שצפויים כ-20% מבנים חריגים (איור 2C), שיעורים גבוהים יותר עשויים להעיד על בעיות כמו הכנה לא נכונה של מדיום TX, איכות תאי התחלה ירודה, כישלון בהוספת DOX או 8Br-cAMP ביום הראשון, או הזזת מבנים במהלך שינויים במדיום.

ליישומי סינון בעלי תפוקה גבוהה, בארות בקרה לא מטופלות ובקרת רכב אמורות להניב בלסטואידים דומים לתנאי בקרה חיובית (איור 3A,B). טיפולים ניסיוניים עשויים להשפיע על מדדי איכות שונים, כולל גודל הבלסטואידים (איור 3C), יעילות הקוויטציה, מספר תאים כולל וספציפי לשושלת (איור 3D), מיון PE ומורפולוגיה כללית (איור 3E). לדוגמה, טיפול בקפאין, ניקוטין או אתנול במהלך היווצרות בלאסטואידים הוביל למבנים קטנים יותר עם יעילות קוויטציה מופחתת, מספר תאים כולל או ICM נמוך יותר, פגיעה במיון PE ומורפולוגיה ירודה יותר. לעומת זאת, ריכוזים הולכים וגדלים של חומצות אמינו בשרשרת מסועפת יצרו בלסטואידים גדולים יותר, בעלי קוויטציה גבוהה יותר, עם מספר תאים מוגבר ומורפולוגיה משופרת (איור 3C–E). צפויה שונות ביולוגית בין הניסויים, מה שמדגיש את החשיבות של שילוב בקרות ריקות ונשאיות בכל ניסוי.

איור 1: דוגמאות ל-ESCs איכותיים וירודים, iGATA4-ESC ו-TSC. מיקרוגרפיות Brightfield של WT ESCs, iGATA4-ESCs ו-TSCs המראות מורפולוגיות מושבות צפויות לאחר 2–3 ימים של תרבית ב-N2B27/2i/LIF (ESCs) או TSF4H (TSCs). הפאנל שכותרתו "WT ESCs – איכות ירודה" מציג תאים עם מורפולוגיה לא מיטבית, כולל מושבות שטוחות עם קצוות בולטים (ראשי חץ אדומים). הפאנל "TSC overgrown" מציג מושבות TSC מאוחדות ומורחבות לאחר 4 ימי תרבות. פס סולם: 100 מיקרון לכל הפאנלים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: מורפולוגיה סכמטית וצפויה של iGATA4-בלסטואידים. הודפס מחדש מתוך Developmental Cell, כרך 61, Jorgensen V, Bao M, Junyent S ואחרים, מודלים יעילים של עוברים עכבריים שמקורם בתאי גזע למחקרים סביבתיים, עמ' 193–207.e6, זכויות יוצרים (2025)³, באישור Elsevier. (א) ייצוג סכמטי של התפתחות בלסטוציסטים טבעיים בעכברים (למעלה) ומודלים מבוססי תאי גזע באמצעות WT ESCs, iGATA4-ESCs ו-TSCs.
(B) מיקרוגרפים המציגים מורפולוגיה צפויה וביטוי סימנים בשלבים שונים של הפרוטוקול. הקרנת עוצמה מרבית (MIP); קווים מקווקו מסמנים את החלל. פס קנה מידה: 20 מיקרון. (C) תמונת שדה בהיר של iGATA4-בלסטואידים ביום השלישי. פס קנה מידה: 100 מיקרון.
(D) קצבי הקוויטציה של iGATA4-blastoiדים שנוצרו באמצעות TSCs שגודלו מראש בנורמוקסיה או היפוקסיה; אגרגטים גודלו בתנאים היפוקסיים. n ≥ 4; פסי שגיאה מייצגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. (ה) צביעת חיסון של בלסטוציסטים E4.5 ובלסטואידים iGATA4 ביום 3 עבור סימני שושלת (CDX2, ציאן; OCT4, אדום; GATA4, ירוק). הקרנת עוצמה מרבית (MIP); מישור Z יחיד מוצג במקום שבו מצוין. פס קנה מידה: 25 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 3. השפעות של גורמים סביבתיים על היווצרות ואיכות הבלאסטואידים. (א) תמונות תלת-ממד מייצגות של אימונופלואורסצנציה (למעלה) ושחזורי פני השטח של IMARIS (למטה) של iGATA4-בלסטואידים שטופלו בגורמים סביבתיים (קפאין, ניקוטין, אתנול, ותנאים המדמים דיאטות עשירות וחלבון נמוך). פסי קנה מידה: 25 מיקרון לכל התמונות. (ב) סכמטי של זרימת העבודה הניסיונית. (C) קוטר בלסטואיד בתנאי טיפול שונים. הטווח מייצג את האחוזון העשירי–ה-90; הקופסאות מציינות את טווח הרוחות הבין-רבעוניות; הקו מציין את החציון. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA חד-כיווני עם השוואות מרובות. (D) כימות מספר התאים הכולל (אפור), טרופקטודרם (ציאן), אפיבלסט (אדום) ואנדודרם פרימיטיבי (ירוק) בבלסטואידים מבוקרים ומטופלים. הפסים מייצגים את הממוצע; פסי השגיאה מייצגים את סטיית התקן (סטיית תקן). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA חד-כיווני עם השוואות מרובות. (ה) כימות את שיעור הבלסטואידים המסווגים כ"טובים" (מיון שושלת נכונה עם חריגות מורפולוגיות מינימליות), "בינוניות" (מורפולוגיה נכונה ברובה עם חריגות קלות, כולל מיון EPI–PE לא שלם), או "רע" (מורפולוגיה חריגת חמורה עם הפרעה בארגון השושלת) תחת תנאי בקרה וטיפול. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA דו-כיווני ביחס לתנאי ביקורת. לכל הפאנלים, n ≥ 3. המובהקות הסטטיסטית מוצגת כ-*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מדיה	ריאגנט	ריכוז סופי
FC
	DMEM	נ.א.
	FBS מושבתת חום (iFBS)	15%
	גלוטמקס	2 מילימטר
	2-מרקפטואנול (2-ME)	0.1 מ"מ
	חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)	1x
	נה פירובה	1x
	פניצילין–סטרפטומיצין	1x
N2B27/2i/LIF
	DMEM/F12	50%
	NeurobasalA	50%
	תוספת B27	1x
	תוספת N2	0.5x
	2-ME	100 מיקרומטר
	פניצילין–סטרפטומיצין	1%
	גלוטמקס	2 מילימטר
	PD0325901	1 מיקרומטר
	CHIR99021	3 מיקרומטר
	LIF רקומביננטי בעכבר	10 ng/mL
TSF4H
	מגסל RPMI-1640 בינוני	נ.א.
	iFBS	20%
	גלוטמקס	2 מילימטר
	נה פירובה	1x
	פניצילין–סטרפטומיצין	1x
	FGF4	25 ng/mL
	הפארין	1 מיקרוגרם/מ"ל

טבלה 1: מתכוני מדיה ל-FC, N2B27/2i/LIF ו-TSF4H. מתכונים להכנת מדיום FC, מדיום N2B27/2i/LIF, ומדיה TSF4H, עם ריכוזים סופיים.

רכיב	ריכוז סופי	ריכוז מלאי	ממס ואחסון	נפח ל~20 מ"ל
8Br-cAMP	25 מיקרומטר	5 מ"מ	PBS, אחסון ב-20- מעלות צלזיוס	100 מיקרוליטר
CHIR99021	3 מיקרומטר	10 מ"מ	DMSO, אחסן ב-20 מעלות צלזיוס	6 מיקרוליטר
DMEM/F12	לא זמין	לא זמין	אחסון ב-4 מעלות צלזיוס	20 מ"ל
FGF4	25 ng/mL	100 מיקרוגרם/מ"ל	0.1% BSA ב-PBS, אחסון ב-20°-	5 מיקרוליטר
תוסף L-אלניל-L-גלוטמין	2 מילימטר	200 מ"מ	אחסון ב-4 מעלות צלזיוס	200 מיקרוליטר
הפארין	1 מיקרוגרם/מ"ל	1 מ"ג/מ"ל	PBS, אחסון ב-20- מעלות צלזיוס	20 מיקרוליטר
הולו-טרנספרין	10.7 מיקרוגרם/מ"ל	10.7 מ"ג/מ"ל	מים ב-DI, אחסנו ב-20- מעלות צלזיוס	20 מיקרוליטר
TGF-β1 אנושי	15 ng/mL	20 מיקרוגרם/מ"ל	4 מ"מ HCl + 0.1% BSA, אחסון ב--20 מעלות צלזיוס	15 מיקרוליטר
IL-11	30 ng/mL	25 מיקרוגרם/מ"ל	0.1% BSA ב-PBS, אחסון ב-20°-	24 מיקרוליטר
אינסולין	19.4 מיקרוגרם/מ"ל	9.5 - 11.5 מ"ג/מ"ל	הריכוז תלוי באצווה, יש לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס	33.7–40.8 מיקרוליטר, כוונן נפח לפי ריכוז המלאי.
L-אסקורבית חומצה-2-פוספט מגנזיום	64 מיקרוגרם/מ"ל	32 מ"ג/מ"ל	מים ב-DI, אחסנו ב-20- מעלות צלזיוס	40 מיקרוליטר
LIF רקומביננטי בעכבר	10 ng/mL	10 מיקרוגרם/מ"ל	PBS + 0.1% BSA, אחסון ב--20 מעלות צלזיוס	20 מיקרוליטר
NaHCO3	543 מיקרוגרם/מ"ל	45.25 מ"ג/מ"ל	מים ב-DI, אחסנו ב-20- מעלות צלזיוס	240 מיקרוליטר
פניצילין/סטרפטומיצין	1x	100x	אחסון בטמפרטורה של -20°C	200 מיקרוליטר
נתרן סלניט	14 ng/mL	14 מיקרוגרם/מ"ל	מים ב-DI, אחסנו ב-20- מעלות צלזיוס	20 מיקרוליטר
Y27632	20 מיקרומולר	20 מ"מ	DMSO, אחסן ב-20 מעלות צלזיוס	20 מיקרוליטר

טבלה 2: מתכון מדיה לטקסס. מתכון להכנת מדיה TX, עם פרטים על איך להכין ולאחסן מולקולות קטנות ותגובות אחרות, וריכוזים סופיים.

Discussion

iGATA4-בלסטואידים מספקים מודל יעיל מאוד, דמוי עוברים, מבוסס תאי גזע של הבלסטוציסט של העכברים, על ידי ארגון עצמי של שלושה סוגי תאים מעבדתיים: ESCs, GATA4-ESCs מושרים (iGATA4-ESCs), ו-TSCs עם תרבית היפוקסיה. מבנים אלו משחזרים תכונות מרכזיות של הבלסטוציסט E4.5, כולל פרופורציות שושלת מתאימות וזהות שעתוק, וניתן להשתמש בהם לסינון סביבתי רב-פרמטרי, המשקף באופן אמין ליקויים התפתחותיים בשלב הבלסטוציסט³. מחקר עדכני מראה עוד כי הצטברות של ESCs, iGATA4-ESCs ו-TSCs במדיה בסיסית בלסטואידים גם מניבה יצירת בלאסטואידים יעילים מאוד, ומדגיש את החוסן והגמישות של גישה זו^{בין מעבדות} ותנאי תרבית. בעבר הוכח ש-iGATA4-ESCs משחזרים את תפקודי תאי VE במודלים מבוססי עוברים מבוססי תאי גזע לאחר ההשתלה 28,29,30,31. יחד, תוצאות אלו ממחישות כיצד iGATA4-ESCs יכולים לשמש כתחליף גמיש ואמין לתאי PE/VE במידול עוברים מבוססי תאי גזע בשלבי התפתחות.

מספר שלבים בפרוטוקול הם קריטיים להשגת בלסטואידים איכותיים. אלה כוללים את איכות אוכלוסיות התאים ההתחלתיים, במיוחד TSCs שעברו תרבות היפוקסיה (איור 1); הכנת ה-TX Medium, שיש להכין טרי ביום 0 (טבלה 2; סעיף 2.3); וטיפול זהיר בלוחות לאחר האגרגציה. קריאות מפתח להצלחת הפרוטוקול כוללות יעילות קוויטציה (בדרך כלל ~80%), מורפולוגיה מתאימה (מבנים בקוטר ~100 מיקרון עם חלל דמוי בלסטוקואל, שכבה חיצונית דמוית CDX2⁺ TE, ומסה פנימית של SOX2⁺ ו-GATA4⁺ ממוינות עם יחס PE של כ-3 TE:1 EPI:1), ונוכחות שכבה דמוית PE מסוג GATA4⁺ ממוינת כראוי. אלו מדדים הנפוצים בתחום 1,2,4,5. מבין הבלסטואידים המעוצבים, כ-75% מהמבנים מציגים את כל התכונות הללו. מדדים אלו יכולים לשמש כמדדים ראשוניים לאיתור תקלות. איכות התאים הלא אופטימלית משתקפת בדרך כלל במורפולוגיה לא תקינה של מושבה, מה שמוביל למבנים שאינם מאוגדים היטב או לא מקובטים. הכנה לא נכונה של מדיום עלולה להוביל לאגרגציה לא שלמה או ליקויים בקו שושלת, בעוד שטיפול גס עלול לגרום למספר אגרגטים בכל מיקרובאר או בארות ריקות.

אופטימיזציה נוספת עשויה לכלול התאמת מספר התאים הזרעים (טווחי התחלה מומלצים: 4–7 ESCs ו-iGATA4-ESCs, ו-10–15 TSCs לכל מיקרו-באר), שיפור שיטות דלדול MEF (למשל, סינון דרך מסננת תאים של 40 מיקרון), ושינוי הרכב המדיה של TX. לדוגמה, הסרת FGF4 והפארין עדיין יכולה לתמוך ביצירת בלסטואידים יעילה תוך קידום זהות דמוית TE קיר. iGATA4-blastoiדים יכולים להישמר בתרבית עד 6 ימים; עם זאת, מבנים מהימים 4–6 לעיתים גדלים בגודלם תוך שמירה על פרופורציות דמויי בלסטוציסטות של השושלת. הפרוטוקול מניב תוצאות עקביות בין שכפולים ביולוגיים, אך יש לכלול בקרות מתאימות בכל ניסוי.

בהשוואה למערכות בלסטואיד עכבריות אחרות, שמשתנות באוכלוסיות התאים ההתחלתיות ובתנאי התרבית 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 , iGATA4-בלסטואידים משיגים יעילות גבוהה של תצורה וייצוג שושלת מדויק. בעוד שפרוטוקולים רבים קיימים יוצרים מבנים מקוויטיים והם בעלי ערך ליישומים ביולוגיים מסוימים, הם לעיתים מציגים היווצרות PE לא שלמה, זהויות תאים הטרוגניות או לא מוגדרות, או פרופורציות שושלת שגויות. על ידי שילוב שלוש אוכלוסיות תאי גזע מכוונות שושלת באופן שלבי, iGATA4-blastoiדים מתגברים על מגבלות אלו ומספקים מערכת ניתנת לשחזור, מודולרית ונגישה ניסיונית.

למרות היתרונות הללו, נותרו מספר מגבלות. תרבית ממושכת במבחנה במדיון טקסס מעבר ל-4–6 ימים גורמת לצמיחת יתר, גם אם פרופורציות השושלת נשארות דמויי בלסטוציסט. כ-12.5% מהבלסטואידים של iGATA4 עוברים למורפולוגיות דמויות פרי-השתלה במבחנה, המאופיינות באפיבלסט בצורת ופסאודוסטרטיפיקציה סביב חלל פרו-שפיר, תא אקטודרם חיצוני מורחב הסמוך לאפיבלסט הפרוקסימלי, ושכבה חיצונית דמוית אנדודרם ויסרלי. עם זאת, iGATA4-בלסטואידים אינם משתילים ומתפתחים לאחר העברה לעכבר המארח. לכן, iGATA4-בלסטואידים, ובלסטואידים בכלל, אינם מתאימים לחקר השתלות או אינטראקציות בין עובר לאם.

הבסיס המולקולרי לכישלון ההשתלה של הבלסטואידים נותר לא ברור, אם כי הראיות הנוכחיות מצביעות על כך שמודל טרופקטודרם לא שלם עשוי להיות גורם תורם. תאים דמויי TE בבלסטואידים iGATA4 מציגים זהות מולקולרית קוטבית מדי. מאמצים עתידיים להנדס TSCs הדומים יותר לתאי TE מורליים, או להכניס קווי תאים חלופיים שמסכמים טוב יותר TE בעלי יכולת השתלה, מהווים כיוונים מבטיחים להתגברות על מגבלות אלו. האופי המודולרי של iGATA4-בלסטואידים, שבהם ניתן ליישם שינויים ספציפיים ל-TE באופן עצמאי מהיווצרות EPI ו-PE, הופך מערכת זו למתאימה במיוחד לפיתוחים כאלה.

ביחד, פרוטוקול iGATA4-blastoid מספק פלטפורמה איתנה וניתנת להרחבה לחקר מפרט שושלת ותהליכי התפתחות מוקדמים בעובר היונק. השחזוריות והגמישות שלו הופכות אותו למתאים במיוחד ליישומים סביבתיים, פרמקולוגיים וגנטיים בעלי תפוקה גבוהה. לפיכך, iGATA4-בלאסטואידים מהווים מערכת עוצמתית לחקר מנגנוני התפתחות מוקדמים ולהערכת האופן שבו הפרעות מגוונות משפיעות על התפתחות טרום-השתלה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	משמש להכנת מדיה כללית
8-Bromo-cAMP	STEMCELL Technologies	73602	משמש להכנת מדיה TX וחלל חלל
AggreWell400	STEMCELL Technologies	34415	צלחת צבירה מיקרוולית; משמש להכנת blastoid
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies	7010	משמש להכנת blastoid
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	2079GPK	טיפים לפיפטה עם פתח רחב לתנועת blastoid במהלך אימונו-צביעה.
B27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	משמש להכנת מדיה
Caffeine	Sigma	58-08-2	משמש כגורם סביבתי לבדיקה ב-iGATA4-blastoids
CDX2 antibody, mouse	Biogenex	MU392A5UC	לאימונו-פלואורסנט, משמש ב-1:200
CellXpert (normoxia incubator)	Eppendorf	6731010015	מותגים/דגמים אחרים עשויים לעבוד גם כן.
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	משמש להכנת מדיה
Countess Cell Counting Chamber slides	Invitrogen	C10228	משמש למטרות כלליות של תרבות רקמות
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	משמש לאימונו-פלואורסנט, משמש ב-1:500-1:1,000
DMEM	Gibco	11995040	משמש להכנת מדיה FC
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	משמש להכנת N2B27 ומדיה TX
DMEM-LM	Thermo Fisher Scientific	30030	יש להוסיף ל-DMEM-LM תערובת תזונה של Ham's F-12 נוזלית לאבקה כדי להשיג ריכוז סופי של 1x לקבלת DMEM/F12 ללא Met ו-Leu
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055	משמש לאימונו-פלואורסנט, משמש ב-1:500-1:1,000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 647	Invitrogen	A-31571	משמש לאימונו-פלואורסנט, משמש ב-1:500-1:1,000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 568	Invitrogen	A10042	משמש לאימונו-פלואורסנט, משמש ב-1:500-1:1,000
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A78947	משמש לאימונו-פלואורסנט, משמש ב-1:500-1:1,000
Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	משמש לאימונו-פלואורסנט. מפשירים ב-4°C;, ומאחסנים ב--20°C;
Doxycycline	Sigma	D9891-5G	לגירוי iGATA4 במהלך הכנת blastoid
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf	5702	משמש במעבדה שלנו, אחרים יעבדו. דורשים מתאמים לצינורות וצלחות.
Falcon 96-well Clear Round Bottom Not Treated Microplate, with Lid, Individually Wrapped	Corning	351177	משמש לאימונו-פלואורסנט
FGF4	R&D Systems	5846-F4	משמש להכנת מדיה
Fiji	Schindelin et al., 2012	https://imagej.net/Fiji	משמש לניתוח תמונות
GATA4 antibody, rabbit	Cell Signalling	36966S	משמש לאימונו-פלואורסנט, משמש ב-1:500
Gelatin solution, 2%	Sigma	G1393	משמש למטרות כלליות של תרבות רקמות
Glass Bottom Dish 35 mm	Ibidi	81218-200	לאימונו-פלואורסנט והדמיה
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061	תוסף L-alanyl-L-glutamine; משמש להכנת מדיה
Ham's F-12 Nutrient Mix powder	Thermo Fisher Scientific	21700075	משמש כתוסף ל-DMEM-LM, לתנאי תזונה דלי חלבון.
Heparin	Sigma	H3149	משמש להכנת מדיה
Heracell VIOS 160i (hypoxia incubator)	Thermo Fisher Scientific	51030400	מותגים/דגמים אחרים עשויים לעבוד גם כן.
Holo-transferrin	Sigma	T4132	משמש להכנת מדיה TX.
Human recombinant TGF-ß1	PeproTech	100-21	משמש להכנת מדיה TX.
IL-11	PeproTech	200-11	משמש להכנת מדיה TX.
Imaris	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/	משמש לניתוח תמונות והכנת תמונות.
Inactivated Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	משמש להכנת מדיה
Inducible GATA4 ESCs (tetO-GATA4-ESCs)	Amadei et al., 2021	NA	קו תאים זמין ממעבדת Zernicka-Goetz על פי בקשה
Insulin	Sigma	I9278	משמש להכנת מדיה TX.
Irradiated C57bl/6 Mouse