פרמקולוגיה רשת משולבת, מטאבולומיקס, ואימות ב-vivo של ליאנשואה דיהואנג דקוקציה בעכברי קוליטיס כיבית שנגרמו על ידי DSS

סיכום

פרוטוקול זה מתאר תהליך עבודה שניתן לשחזור המשלב פרמקולוגיה רשתית, מטבולומיקה לא ממוקדת ואימות in vivo כדי להבהיר את המנגנונים הרב-רכיביים של דקוקטון Liangxue Dihuang במודל עכבר שנתרן מושרה על ידי דקסטרן סולפט לקוליטיס כיבית.

תקציר

קוליטיס כיבית (UC) היא מחלת מעי דלקתית כרונית המתאפיינת בדלקת מעיים מתמשכת ובחוסר ויסות מטבולית. נוסחאות רפואה סינית מסורתית (TCM) בשימוש נרחב בפרקטיקה קלינית לטיפול בהפרעות דלקתיות; עם זאת, גישות ניסיוניות שיטתיות להבהרת המנגנונים הרב-רכיביים והרב-מטריים שלהן נותרות מוגבלות. מאמר זה מציג פרוטוקול ניסויי שכפול המשלב פרמקולוגיה ברשת, מטבולומיקה לא ממוקדת, ואימות in vivo כדי לחקור את ההשפעות האנטי-דלקתיות של דקוקטון Liangxue Dihuang (LXDHD) במודל עכברים מושרה על ידי DSS של UC. תהליך העבודה כולל הכנת תרמיל צמחי, מידול קוליטיס מושרה על ידי DSS, הערכת פעילות מחלה, הערכה היסטופתולוגית והמטולוגית, מדידת ציטוקינים בסרום, פרופיל מטבולומי מבוסס LC–MS, וניתוח רשתות חישובית. באמצעות גישה משולבת זו, הוכח בהצלחה קוליטיס שנגרם מ-DSS, וטיפול ב-LXDHD הביא לשיפורים מדידים במדד פעילות המחלה, אורך המעי הגס, הנזק ההיסטופתולוגי, רמות הציטוקינים הדלקתיים והפרופילים המטבוליים. ניתוחי פרמקולוגיה ומטבולומיקה ברשתות הראו כי פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מטרות, מסלולים ומטבוליטים מרכזיים הקשורים להתערבות טיפולית. תהליך עבודה מוצג וסטנדרטי זה מספק מסגרת מתודולוגית מעשית לחקר המנגנונים הפרמקולוגיים של נוסחאות רפואה סינית רב-רכיביות במחלות מעי דלקתיות, וניתן להתאים אותו למרשמים צמחיים ומודלים של מחלות אחרות.

מבוא

קוליטיס כיבית (UC) היא מחלת מעי דלקתית כרונית המתאפיינת בדלקת רירית מתמשכת במעי הגס¹, הגורמת לתסמינים כמו כאבי בטן, שלשולים, דימום רקטלי וירידת משקל². שכיחות ה-UC הולכת וגדלה ברחבי העולם, מה שמטיל נטל כבד על מערכות הבריאות ופוגע משמעותית באיכות החיים של המטופלים³. למרות שהאטיולוגיה של ה-UC עדיין לא מובנת במלואה, מצטברות ראיות מצביעות על כך שתגובות חיסוניות לא מאוזנות, ייצור יתר של ציטוקינים דלקתיים, לחץ חמצוני והפרעות מטבוליות ממלאים תפקידים מרכזיים בפתוגנזה של המחלה ^4,5.

האסטרטגיות הטיפוליות הנוכחיות ל-UC כוללות בעיקר אמינוסליצילטים, קורטיקוסטרואידים, תרופות מדכאות חיסון ותרופות ביולוגיות המיוקדות לציטוקינים דלקתיים⁶. בעוד שטיפולים אלו יכולים להקל על התסמינים ולהביא להפוגה, השימוש ארוך הטווח בהם קשור לעיתים קרובות לתופעות לוואי, עלויות גבוהות ותגובות טיפוליות משתנות ^7,8,9. יתרה מזאת, חלק ניכר מהמטופלים אינם מצליחים להשיג הפוגה מתמשכת, מה שמדגיש את הצורך בגישות טיפוליות חלופיות או משלימות עם בטיחות משופרת ויעילות מרובת מטרות.

הרפואה הסינית המסורתית (TCM) משמשת רבות לטיפול בהפרעות מערכת העיכול במשך מאות שנים ומוכרת יותר ויותר בזכות היתרונות הפוטנציאליים שלה במחלות דלקתיות מורכבות כמו UC¹⁰. בניגוד לטיפולים חד-מטרה בלבד, נוסחאות הרפואה הסינית בדרך כלל מפעילות השפעות טיפוליות באמצעות רכיבים מרובים הפועלים על מטרות ונתיבים שונים, מה שעשוי להתמודד טוב יותר עם האופי הרב-גורמי של UC¹¹. מחקרים קליניים וניסויים הציעו כי מרשמים מסוימים לרפואה הסינית הסינית יכולים לווסת תגובות חיסוניות, לדכא דלקת, להגן על שלמות מחסום המעי ולווסת הומאוסטזיס מטבולי 12,13,14,15.

ליאנשואה דיהואנג דקוקציה (LXDHD) היא נוסחה קלאסית ל-TCM המשמשת באופן מסורתי ל"קירור הדם ולניקוי החום" והיא יושמה קלינית לטיפול בהפרעות דלקתיות ודימומיות¹⁶. המרשם כולל מספר עשבים, כולל Scutellaria baicalensis, Phellodendron chinense, Rehmannia glutinosa, Paeonia suffruticosa, Paeonia lactiflora, Sanguisorba officinalis, Platycladus orientalis, Saposhnikovia divaricata, Citrus aurantium, Angelica sinensis ו-Glycyryriza uralensis. מחקרים פרמקולוגיים מודרניים הראו כי מספר צמחי מרפא המרכיבים והתרכובות הפעילות שלהם מחזיקים בתכונות אנטי-דלקתיות, נוגדי חמצון ומודולטוריות חיסוניות 17,18,19. עם זאת, ההשפעות הטיפוליות הכוללות והמנגנונים הבסיסיים של LXDHD ב-UC טרם הוברו באופן שיטתי.

פרמקולוגיה רשתית הפכה לגישה יעילה לחקר האינטראקציות המורכבות בין נוסחאות צמחיות רב-רכיביות לבין יעדים מולקולריים הקשורים למחלות²⁰. על ידי שילוב מידע ממספר מסדי נתונים, פרמקולוגיית רשת יכולה לחזות תרכובות פעילות פוטנציאליות, מטרות טיפוליות ונתיבי איתות, ולספק הבנה ברמת מערכת של מנגנוני הרפואה הסינית^{הסינית 21}. עם זאת, פרמקולוגיה רשתית מתבססת בעיקר על תחזיות מסדי נתונים ואינה משקפת ישירות שינויים מטבוליים בתוך החיים .

מטאבולומיקה, ככלי עוצמתי לפרופיל שינויים מטבוליים גלובליים, מציע תובנות משלימות על פתופיזיולוגיה של מחלות ותגובות טיפוליות²². ב-UC, ניתוחים מטבולומיים חשפו הפרעות משמעותיות במטבוליזם של שומנים וחומצות אמינו, וכן מסלולים הקשורים ללחץ חמצוני 23,24,25. שילוב מטבולומיקה עם פרמקולוגיה רשת יכול לסייע בגישור בין מטרות מולקולריות צפויות לפנוטיפים מטבוליים אמיתיים, ובכך לשפר את אמינות הפרשנויות המכניסטיות.

במחקר הנוכחי, שימשה אסטרטגיה משולבת המשלבת פרמקולוגיה רשתית, מטבולומיקה לא ממוקדת ואימות ניסויי כדי לחקור את ההשפעות האנטי-דלקתיות והמנגנונים הפוטנציאליים של LXDHD במודל עכבר שנגרם על ידי דקסטרן סולפט נתרן (DSS) של UC (איור 1A). העיצוב המתודולוגי הכולל הזה, המשלב תחזיות סיליקו עם אימות מטבולומי ופנוטיפי בתוך החיים , תואם את מסגרות המחקר הקפדניות²⁶. ניתוח פרמקולוגיה ברשת שימש לזיהוי תרכובות פעילות, מטרות טיפוליות פוטנציאליות ונתיבי איתות מועשרים על ידי טיפול ב-LXDHD. מטבולומיקה לא ממוקדת בוצעה כדי לאפיין שינויים מטבוליים הנגרמים על ידי UC ומודולציה שלהם על ידי LXDHD. יתרה מזאת, ממצאים מרכזיים אושרו באמצעות ניסויים ב-in vivo , כולל הערכות פעילות מחלה, שינויים היסטופתולוגיים, פרמטרים המטולוגיים ורמות ציטוקינים דלקתיים.

באמצעות שילוב תחזיות חישוביות, פרופיל מטבולי ואימות ביולוגי, מחקר זה שואף לספק הבנה מקיפה של המנגנונים הרב-רכיבים, היעדים הרב-מסלולים העומדים בבסיס ההשפעות הטיפוליות של LXDHD ב-UC. עבודה זו לא רק מספקת ראיות ניסיוניות התומכות בשימוש ב-LXDHD כטיפול משלים פוטנציאלי ל-UC, אלא גם מספקת מסגרת מתודולוגית לחקירת המנגנונים של נוסחאות TCM מורכבות אחרות.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה ואושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של בית החולים המשויך של אוניברסיטת נאנג'ינג לרפואה סינית (אישור מס' #2025DW-034-01; תאריך אישור: 24 במרץ 2025). הכנת דקוקציה של ליאנגשו דיהואנג בוצעה בהתאם להליכים המתוארים בפרמקופיאה^{הסינית 27}. המגיבים, הכימיקלים והתוכנה המשמשים בפרוטוקול מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת דקוקטון ליאנגשו דיהואנג (LXDHD)

1. הכינו את החומרים הצמחיים המיובשים לפי הנוסחה הסטנדרטית של LXDHD. הרכב הצמחים המדויק, השמות הצמחיים והמינונים המדויקים של אחד עשר העשבים המרכיבים מפורטים בטבלה 1.
   הערה: אימות כל החומרים הצמחיים על ידי פרמקוגנוזיס מוסמך לפני השימוש כדי להבטיח זהות בוטנית ועקביות איכות. שמור רשומות אימות לצורך שחזור.
2. הכנת אבקה
   1. ייבשו באוויר את כל החומרים הצמחיים בטמפרטורת החדר בסביבה נקייה ואוורורית היטב.
   2. טחנו כל עשב בנפרד באמצעות מטחנה מכנית עד שמתקבל אבקה דקה.
   3. שלב את האבקות לפי היחסים שנקבעו.
   4. העבר את האבקה המעורבת דרך מסננת של 80 רשתות (קוטר פנימי 180 מיקרון ± 7.6 מיקרון) כדי להבטיח גודל חלקיקים אחיד.
   5. הומוגניזציה יסודית של האבקה המסננת.
      הערה: גודל חלקיקים אחיד חיוני ליעילות חילוץ עקבית. טחינה לא שלמה או ערבוב לא אחיד עלולים לגרום לשונות בהרכב הכימי.
3. הכנת תמצית מימית LXDHD
   1. שקלו במדויק את אבקת הצמחים המעורבת והוסיפו מים מזוקקים ביחס של 1:10 (w/v).
   2. חממו את התערובת לרתיחה וערבבו ל-20 דקות.
   3. סנן את התמצית ואסף את הסינון.
   4. הוסיפו מים מזוקקים טריים לשאריות וחזרו על הבישול למשך 20 דקות נוספות.
   5. משלבים את שני הסינון כדי לקבל את תמצית המים הסופית של LXDHD.
      הערה: דאבל דקוקציה חיונית להבטחת הפקה יעילה של רכיבים מסיסים במים ושל רכיבים מסיסים במידה בינונית.
4. ריכוז ואחסון
   1. ריכזו את המרקם המשולב בלחץ מופחת או בחימום עדין עד להשגת הריכוז הרצוי.
   2. תן לתמצית להתקרר לטמפרטורת החדר.
   3. אחסן את תמצית ה-LXDHD המוכנה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשתמש בטווח של 48 שעות.
      הערה: הימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים, שכן הם עלולים לפגוע בתרכובות ביואקטיביות ולהפחית את השחזור הניסוי.
5. מינהל
   1. הביאו את התמצית לטמפרטורת החדר לפני ההזנה.
   2. נתנו את המרקם המימי המרוכז של LXDHD לעכברים באמצעות גאווג דרך הפה במינונים המיועדים לפי קבוצות ניסויים.

2. עיצוב ניסויי בעלי חיים

1. בעלי חיים ותנאי מגורים
   1. רכש עכברים זכרים מסוג C57BL/6 (בגיל 6–8 שבועות, 20–25 גרם) מספק בעלי חיים מוסמך למעבדה.
   2. עכברי בית בתנאי מעבדה סטנדרטיים עם מחזור אור/חושך של 12 שעות, טמפרטורה מבוקרת (22–25 מעלות צלזיוס) ולחות יחסית (50%–60%).
   3. ספק לעכברים גישה חופשית לאוכל ומים סטנדרטיים לאורך כל הניסוי.
   4. אפשר לעכברים להסתגל לפחות 7 ימים לפני הניסוי.
      הערה: כלול רק עכברים בריאים עם פעילות תקינה ומשקל גוף תקינים בניסויים הבאים.
2. קיבוץ וחישוב מינון
   1. חשב את מינון LXDHD בעכבר לפי עקרון המרת מינון אדם-בעל חיים המתואר ב-Methodology of Pharmacological Experiments, בהתבסס על משקל גוף מבוגר סטנדרטי של 70 ק"ג ומינון קליני יומי של 8.4 גרם²⁸.
   2. חלק את העכברים באקראי לקבוצות הבאות (n = 6 לכל קבוצה): קבוצת ביקורת תקינה, קבוצת מודל UC מושרה על ידי DSS, קבוצת LXDHD במינון נמוך (1.09 גרם/ק"ג), קבוצת LXDHD במינון גבוה (2.18 גרם/ק"ג), וקבוצת ביקורת חיובית 5ASA (100 מ"ג/ק"ג)²⁹.
      הערה: בצע אקראיות באמצעות טבלת מספרים אקראית כדי למזער הטיית בחירה.
   3. הכנסת UC ומתן תרופות
      1. הכינו תמיסת DSS של 2.5% (ללא יחס למים) במי שתייה.
      2. מתן פתרון DSS אד ליביטום לעכברים במודל, מטופלים ב-LXDHD, ו-5ASA במשך 7 ימים רצופים^{במשך 30} ימים רצופים.
      3. ספק מים מטוהרים לשתייה לעכברים בקבוצת הביקורת התקינה.
      4. מתן LXDHD ו-5ASA לקבוצות הטיפול פעם ביום באמצעות גאווג' אורלי במינונים המתאימים לאורך תקופת הניסוי.
      5. הנח נפח שווה של פתרון רכב לקבוצות מודל הבקרה וה-DSS הרגילות.
         הערה: הכינו את פתרון ה-DSS טרי והחליפו אותו כל יומיים. קבוצות DSS עשויות להשתנות בעוצמת הגורם לקוליטיס; בצע בדיקות פיילוט בעת שימוש באצווה חדשה. הקמה מוצלחת של מודל ה-UC המושרה על ידי DSS מאופיינת בירידה הדרגתית במשקל גוף, שלשולים מדממים, ציוני DAI גבוהים וקיצור בולט במעי הגס. קריטריונים אלה והעיצוב המתודולוגי של ניסויי העכברים תואמים לתקני ייחוס³¹ שנקבעו.
3. הכנת סרום ריק ומכיל תרופות למטבולומיה חיצונית
   1. השתמש בקבוצה נפרדת של עכברים בריאים C57BL/6.
   2. חלק את העכברים באקראי לשתי קבוצות: הקבוצה הריקה וקבוצת ה-LXDHD.
   3. מתן LXDHD לקבוצת ה-LXDHD באמצעות קידוח אוראלי של 2.18 גרם לק"ג פעם ביום במשך 7 ימים רצופים.
   4. הזרקו כמות שווה של מים מזוקקים לקבוצת המים הריקים.
   5. אספו דגימות דם שעה לאחר המתן הסופי.
   6. עבד דגימות דם לקבלת סרום כפי שמתואר קודם בסעיף 3.5.

3. הערכת פעילות המחלה

1. יש לעקוב אחרי משקל הגוף, עקביות הצואה ודימום הצואה מדי יום במהלך הניסוי.
2. חשב את מדד פעילות המחלה (DAI) בהתבסס על ירידה במשקל, עקביות צואה ודימום צואה. מסגרת הניקוד הספציפית מפורטת בטבלה 3. חשב את
   ציון ה-DAI הסופי הוא ממוצע (או סכום) שלושת הפרמטרים הללו³².
3. בסוף היום השמיני, הרדימו עכברים מכל קבוצה עם 1% נתרן פנטוברביטל (30 מ"ג/ק"ג). אסוף כ-400 מיקרוליטר דם מהמקלעה הוורידית הרטרו-אורביטלית של כל עכבר. לאחר מכן, יש להמתים את בעלי החיים באמצעות הפרקת צוואר הרחם כדי להבטיח מוות, בהתאם בקפדנות להנחיות האגודה הווטרינרית האמריקאית (AVMA) להמתת חסד של בעלי חיים (איור 1B).
   הערה: לאשר הרדמה מספקת על ידי צביטה עדינה על האצבעות ומשטח כף הרגליים האחוריות; היעדר תגובת גמילה מעיד על עומק מספק של הרדמה.
4. לאסוף רקמות מעי הגס ולמדוד את אורך המעי הגס כמדד לחומרת המחלה.
   הערה: קיצור אורך המעי הגס נחשב לסימן היכר של חומרת הקוליטיס הנגרמת על ידי DSS³³.
5. השגת סרום דם
   1. אפשר לחלק מדגימות הדם שנאספו להיקרש בטמפרטורת החדר למשך שעה.
   2. דגימות צנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לקבלת סרום.
   3. כמת את רמות הסרום של אינטרלוקין (IL)-1β, IL-6, IL-17, פקטור נמק גידול-אלפא (TNF-α) ו-IL-10.
   4. לאסוף דגימות רקמת המעי הגס לניתוח היסטופתולוגי.
   5. השתמשו בדגימות דם שנותרו לניתוח דם היקפי.
   6. שמרו דגימות סרום נוספות לניתוח מטבולומי.

4. צביעת המטוקסילין–אאוסין (H&E)

1. תקבע רקמות המעי הגס ב-4% פאראפורמלדהיד למשך לפחות 24 שעות.
2. ייבוש רקמות באמצעות סדרת אתנול מדורגת.
3. רקמות שקופות עם קסילן והטמעו בפרפין.
4. חתכו חתכי רקמה (בעובי 3–5 מיקרון) באמצעות מיקרוטום.
5. דה-פרפין לחלקים עם קסילן.
6. החזיר מים לחלקים באמצעות אתנול מדורג.
7. צבעי חתכים עם המטוקסילין לצורך ויזואליזציה גרעינית.
8. חתכי נגד עם אאוזין לצביעה ציטופלזמתית.
9. התבוננו בשינויים היסטופתולוגיים תחת מיקרוסקופ אור וצילמו תמונות מייצגות באמצעות תוכנת ההדמיה הנלווית.
10. העריכו ציונים היסטולוגיים (HCS) בהתבסס על חומרת הדלקת, עומק הפציעה ונזק לקריפטה.
11. עיין בטבלה 4 לקריטריוני ניקוד היסטולוגיים מפורטים.
    הערה: ללכוד תמונות מייצגות של הטמעה, חתך וצביעה של רקמות כדי לשפר את הדמיית הפרוטוקול.

5. ניתוח דם היקפי

1. איסוף דגימות דם פריפריאליות לצינורות נוגדי קרישה EDTA-K2 (1.5 מ"ג EDTA למ"ל דם).
2. הפוך בעדינות את הצינורות 8–10 פעמים כדי להבטיח ערבוב נכון.
3. נתח ספירות תאי דם באמצעות אנליז המטולוגיה וטרינרי תלת-חלקי (Mindray BC-2600vet) עם כיול ספציפי למין.
4. העברו דגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
5. נתח דגימות תוך 4 שעות לאחר האיסוף.
   הערה: יש להוציא דגימות המראות המוליזה או קרישה מהניתוח.

6. בדיקת אימונוסורבנט מקושרת באנזימים (ELISA)

הערה: IL-6, IL-17, IL-1β ו-TNF-α הם ציטוקינים פרו-דלקתיים מרכזיים, בעוד ש-IL-10 הוא ציטוקין אנטי-דלקתי מרכזי. ציטוקינים אלו משקפים את נוכחות וחומרת התגובות הדלקתיות³⁴.
מדידת הציטוקינים הללו חיונית להבנת תהליכים דלקתיים ולהערכת יעילות הטיפולים האנטי-דלקתיים.

1. אסוף דגימות דם מהפלקסוס הוורידי הרטרו-אורביטלי.
2. אפשר לדגימות להיקרש בטמפרטורת החדר למשך שעה.
3. דגימות צנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לקבלת סרום.
4. מדדו את רמות הסרום של IL-1β, IL-6, IL-17, TNF-α ו-IL-10 באמצעות ערכות ELISA מסחריות.
5. מדדו את הספיגה באמצעות קורא מיקרופלט המצויד בתוכנת איסוף נתונים סטנדרטית.
6. חשב את ריכוזי הציטוקינים בהתבסס על עקומות סטנדרטיות.
   הערה: בדוק את כל הדגימות והתקנים הכפולים כדי להפחית שונות טכנית.

7. ניתוח LC–MS של דקוקטון Liangxue Dihuang

1. הכנת דוגמאות
   1. שקלו בדיוק 10 גרם של אבקת צמחים גולמית מעורבבת של LXDHD.
   2. המיס את האבקה ב-30 מ"ל מים חמים.
   3. בצע חילוץ אולטרסוני למשך 30 דקות.
   4. מערבבים 100 מיקרוליטר מהתמצית עם 400 מיקרוליטר מתנול.
   5. מערבולת ל-10 דקות.
   6. צנטריפוגה ב-14,000 × גרם למשך 10 דקות.
   7. אסוף את הסופרנטנט כפתרון הניסוי.
2. תנאי LC–MS
   1. לבצע הפרדה כרומטוגרפית באמצעות מערכת LC בשילוב עם ספקטרומטר מסה Q.
   2. השתמש בעמוד C18 (150 × 2.1 מ"מ, 1.8 מיקרון).
   3. הגדר את הפאזה הניידת כך: ממס A, 0.1% חומצה פורמית במים; ממס B, מתנול.
   4. הגדר את קצב הזרימה ל-0.30 מ"ל לדקה.
   5. הגדר את טמפרטורת העמודה ל-35 מעלות צלזיוס.
   6. כוון את נפח ההזרקה ל-5 מיקרוליטר.
   7. יישם את תוכנית ההעברה הגרדיאנטית הבאה:
      0–2 דקות, 5% B;
      2–15 דקות, 5–95% B;
      15–18 דקות, 95% B;
      18–18.1 דקות, 95–5% B;
      18.1–22 דקות, 5% B.
   8. הגדר את פרמטרי ספקטרומטריית המסה כך: קצב זרימת גז מעטפת, 35 ארב; קצב זרימת גז אוקס, 10 ארב; מתח ריסוס, 3.5 קילווולט (חיובי) ו-2.8 קילווולט (שלילי); טמפרטורת הנימים, 320 מעלות צלזיוס; טמפרטורת מחמם גז אוקס, 350 מעלות צלזיוס.
   9. רכוש נתוני MS הן במצב יוני חיובי והן במצב שלילי עם טווח סריקת MS מלא של m/z 100–1500 (רזולוציה: 70,000).
   10. בצע סריקות MS2 (dd-MS2) התלויות בנתונים ברזולוציה של 17,500.
   11. עבד נתונים גולמיים וזהה תרכובות באמצעות מסד הנתונים של mzCloud.

8. ניתוח מטבולומיקה לא ממוקדת בסרום

1. הכנת דגימות סרום ובקרת איכות (QC)
   1. הפשיר דגימות סרום על קרח.
   2. העבר 50 מיקרוליטר סרום לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
   3. הוסף 200 מיקרוליטר של מתנול/אצטוניטריל קר (1:1, v/v).
   4. מערבולת למשך דקה אחת כדי להשקיע חלבונים.
   5. דגרה על הקרח למשך 15 דקות.
   6. צנטריפוגה ב-14,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   7. העבר את הסופרנטנט לצינור חדש.
   8. ייבשו את התמצית באמצעות ריכוז ואקום.
   9. שיקום ב-100 מיקרוליטר אצטוניטריל/מים (1:1, v/v).
   10. מערבולת ביסודיות.
   11. צנטריפוגה שוב ב-14,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   12. אסוף את הסופרנטנט לניתוח LC-MS.
   13. הכינו דגימות בקרת איכות על ידי איסוף 10 מיקרו-ליטר אליקווטים מכל דגימה.
   14. הזרקו דגימת בקרת איכות אחת לכל 8–10 דגימות ניסוי כדי לעקוב אחר יציבות וחזרתיות המכשיר.
2. הגדרות רכישת LC-MS
   1. לבצע הפרדה כרומטוגרפית באמצעות מערכת LC עם עמודת C18 (150 × 2.1 מ"מ, 1.8 מיקרון).
   2. הגדר את טמפרטורת העמודה ל-35 מעלות צלזיוס.
   3. הגדר את קצב הזרימה ל-0.30 מ"ל לדקה.
   4. הגדר את נפח ההזרקה ל-2 מיקרוליטר (מצב חיובי) או 5 מיקרוליטר (מצב שלילי).
   5. השתמש בממס A (חומצה פורמית 0.1% במים) וממס B (אצטוניטריל עם 0.1% חומצה פורמית).
   6. הפעיל תוכנית שחרור גרדיאנט ליניארי.
   7. הפעל את ספקטרומטר המסה במצבי HESI חיובי ושלילי.
   8. הגדר את טווח סריקת המסה ל-m/z 100–1500.
   9. הגדר את מתח הריסוס ל-3.5 קילווולט (חיובי) ו-2.8 קילווולט (שלילי).
   10. הגדר את טמפרטורת הנימים ל-320 מעלות צלזיוס.
3. עיבוד נתונים וזיהוי מטבוליטים דיפרנציאלי
   1. ייבא נתוני LC-MS גולמיים (קבצי .raw) לתוכנה.
   2. בצע יישור שיא, בחירת שיא ותיקון קו בסיס.
   3. נרמול תכונות שטח שיא שהופקו לעוצמת יונים כוללת.
   4. זיהוי מטבוליטים על ידי התאמת מסה מדויקת (סבילות מסה < 5 ppm) ודפוסי פיצול MS/MS מול מסדי נתונים של mzCloud ו-ChemSpider.
   5. לבצע ניתוח סטטיסטי רב-משתני (PCA ו-OPLS-DA/PLS-DA).
   6. הגדר מטבוליטים דיפרנציאליים בהתבסס על הספים הבאים: VIP > 1.0 ו-p < 0.05 (מבחן t של הסטודנט).

9. ניתוח פרמקולוגיה רשתית

הערה: פרמקולוגיית רשת שימשה לחיזוי רכיבים פעילים ויעדים מרכזיים של LXDHD ב-UC^35,36. המתודולוגיה כוללת כריית מסדי נתונים, עיבוד מידע כימי, רכישת נתוני ביואקטיביות, שליפת יעדי חלבונים, פרופיל ביטוי גנים, בניית רשתות אינטראקציה וניתוח העשרת מסלולים^37,38.

1. סקר תרכובות פעיל
   1. שלפו תרכובות פעילות ממסד הנתונים והניתוח של מערכות פרמקולוגיה מסורתיות ברפואה סינית (TCMSP) (ניגש ב-10 בדצמבר 2025) באמצעות OB ≥ 30% ו-DL ≥ 0.18.
   2. תרכובות נוספות באמצעות חיפושי ספרות ב-PubMed וב-Web of Science (10–15 בדצמבר 2025).
   3. סטנדרטיזציה של מטרות באמצעות מסד הנתונים UniProt (ניגש ב-15 בדצמבר 2025).
2. זיהוי מטרות מחלה
   1. איסוף מטרות הקשורות ל-UC ממאגרי GeneCards, OMIM, TTD ו-DrugBank (ניגש ב-15 בדצמבר 2025).
3. בניית וניתוח רשת
   1. זהה מטרות מצטלבות באמצעות חבילת VennDiagram בתוכנת R.
   2. בנו את הרשת באמצעות תוכנת Cytoscape.
   3. נתח טופולוגיה באמצעות תוסף NetworkAnalyzer ותוסף CytoNCA.
4. רשת PPI וזיהוי מטרות ליבה
   1. ייבא מטרות מצטלבות למסד הנתונים של STRING.
   2. הגבל מינים להומו ספיינס.
   3. הסר את הצמתים המבודדים.
   4. הפעיל סף ציון PPI > 0.9.
   5. יצא נתונים ונתח אותם בתוכנה.
   6. חשב DC, BC, EC, CC, NC ו-LAC.
   7. לבצע סינון מבוסס חציון ליצירת תת-רשתות ולזהות יעדים מרכזיים³⁹.
5. ניתוח העשרה של GO ו-KEGG
   1. לבצע העשרת GO ו-KEGG באמצעות חבילות R וביו-קונדונט.
   2. השתמש בחבילות R כולל ארגון. Hs.eg.db, clusterProfiler, DOSE, enrichplot, stringi ו-ggplot2.
   3. קבע ספי מובהקות ב-p = 0.05 ו-q = 0.05.
   4. בצע ניתוח GO לקטגוריות MF, BP ו-CC.
   5. בצע העשרת וסיווג מסלולי KEGG⁴⁰.
6. עגינה מולקולרית
   1. הורד מבני מורכבות מ-TCMSP בפורמט SDF.
   2. הורד מבני חלבון מ-AlphaFold בפורמט PDB.
   3. בצע עגינה באמצעות שרת האינטרנט CB-DOCK2 (מעבדת CAD, אוניברסיטת סצ'ואן, צ'נגדו, סין).
   4. הגדר קבצי קולטנים וליגנד בהתאם.
   5. רשם את תנוחת הקשירה האופטימלית ואת אנרגיית הקשר.
      הערה: העגינה בוצעה באמצעות אלגוריתם גנטי⁴¹. התוצאות דורגו לפי אנרגיית קשירה.

10. ניתוח סטטיסטי

1. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנת GraphPad Prism.
2. מבטאים נתונים כמותיים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD).
3. בדיקת נורמליות באמצעות מבחן שפירו–וילק.
4. בדוק את הומוגניות השונות באמצעות מבחן בראון–פורסיית'.
5. בצע ANOVA חד-כיווני עם מבחן פוסט-הוק של Tukey לנתונים המפוזרים נורמלית.
6. בצע מבחן קרוסקל–ווליס עם מבחן דאן לנתונים לא-פרמטריים.
7. נתייחס ל-p < 0.05 כמובהק סטטיסטית.
   הערה: ערך p קטן יותר מצביע על הבדל סטטיסטי גדול יותר בין הקבוצות.

תוצאות

ניתוח פרמקולוגיה רשתית של LXDHD באוניברסיטת קליפורניה

פרמקולוגיה רשתית יושמה לחיזוי המטרות הטיפוליות הפוטנציאליות והמנגנונים המולקולריים של LXDHD ב-UC. בסך הכל נבדקו 211 תרכובות עם תכונות פרמקוקינטיות חיוביות במאגר הנתונים של TCMSP, כולל 36 מ-Scutellaria baicalensis, 37 מ-Phellodendron chinense, 10 מ-Rehmannia glutinosa, 11 מ-Paeonia suffruticosa, 29 מ-Paeonia veitchii, 5 מ-Sanguisorba officinal...

דיון

שיטה זו מציגה תהליך ניסוי מוצג וניתן לשחזור, המשלב פרמקולוגיה רשתית, מטבולומיקה לא ממוקדת ואימות in vivo כדי לחקור את ההשפעות האנטי-דלקתיות של נוסחאות TCM במודל עכבר מושרה DSS של UC. בניגוד למחקרים פרמקולוגיים קונבנציונליים המתמקדים בעיקר במסקנות מכניות מבודדות, פרוטוקול זה מדגיש את עמידות המסגרת המתודולוגית עצמה תוך חשיפת תובנות ביולוגיות קריטיות. יתרון מרכזי של זרימת עבודה משולבת זו הוא יכולתה להתגבר על המגבלות הטבועות בשיטות אנליטיות מבודדות. פרמקולוגיה רשתית מסורתית מתבססת ב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
5-חומצה אמינוסליצילית (5-ASA)	סיגמא-אלדריץ'	A3537	תרופת ביקורת חיובית לקוליטיס כיבית; ניתן במינון של 100 מ"ג/ק"ג על ידי שיטפון אוראלי.
אצטוניטריל (דרגת LC-MS)	מרק	100030	משמש להכנת דגימה מטבולומית ולשלב הנייד של LC-MS.
מאגר מבנה חלבונים של AlphaFold	EMBL– המכון הביואינפורמטי האירופי	https://alphafold.ebi.ac.uk/	מסד נתונים המשמש לקבלת מבנים תלת-ממדיים חזויים של חלבוני מטרה.
אנג'ליקה סיננסיס (דאנג גווי)	בית החולים לרפואה סינית של מחוז ג'יאנגסו	באץ': 2409001	עשב המרכיב את LXDHD (מינון: 1.6 גרם).
CB-Dock2	מעבדת CADD	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/	פלטפורמה מבוססת רשת המשמשת לעגינה מולקולרית וחיזוי של ליגנד– מצבי קשירת חלבון.
אורנטיום הדרים (ג'י קה)	בית החולים לרפואה סינית של מחוז ג'יאנגסו	באץ': 2409001	העשב המרכיב את LXDHD (מינון: 0.5 גרם).
תוכנת Compound Discoverer	תרמו פישר סיינטיפיק	גרסה 3.3	משמש לעיבוד נתוני LC–MS ולזיהוי תרכובות.
תוכנת CTAn	ברוקר	גרסה 1.17	משמש לשחזור תמונות תלת-ממדיות Micro-CT ולניתוח סחיפת עצם.
ציטוסקייף	קונסורציום סייטוסקייף	גרסה 3.8.0	תוכנה המשמשת לבניית רשת והדמיה.
דסקסטרן סולפט נתרן (DSS)	ביומדיקל MP	160110	משקל מולקולרי 36,000– 50,000 ד'; משמש לגרימת קוליטיס כיבית בעכברים.
צינורות נוגדי קרישה EDTA-K2	Sinopharm Chemical Regain Co., Ltd.	לא זמין	משמש לאיסוף דם היקפי.
תמיסת צביעת אאוסין	ביושארפ	לא זמין	משמש לצביעה נגדית ציטופלזמית ב-H&, צביעת E.
אתנול	צ'נגדו קלן כימיקלים בע"מ	64-17-5	משמש להתייבשות רקמות.
חומצה פורמית (דרגת LC-MS)	מרק	5.33002	משמש להכנת שלב נייד LC-MS.
גליסיריזה אורלנסיס (גאן קאו)	בית החולים לרפואה סינית של מחוז ג'יאנגסו	באץ': 2409001	העשב המרכיב את LXDHD (מינון: 0.5 גרם).
פריזמת GraphPad	תוכנת GraphPad	גרסה 9.0	משמש לניתוח סטטיסטי והצגה גרפית.
אנלייזר המטולוגיה	מיינדריי	BC-2600vet	אנליז המטולוגיה וטרינרי בעל שלושה חלקים לניתוח שגרת דם.
תמיסת צביעת המטוקסילין	ביושארפ	BL700B	שימש ל-H& צביעת E של חתכי רקמת המעי הגס.
צנטריפוגה מהירה	היטאצ'י	CT15E/CT15RE	משמש להכנת סרום ודגימות.
IL-10 ELISA Kit (עכבר)	מיימיאן	MM-0176M2	משמש להערכת רמות IL-10 בדם.
IL-17 אליסה קיט (עכבר)	אבקלונל	RK00039	משמש למדידת רמות IL-17 בסרום.
IL-1 ובטא; אליסה קיט (עכבר)	אבקלונל	RK00006	משמש לזיהוי IL-1 ובטא בדם; רמות.
ערכת IL-6 ELISA (עכבר)	אבקלונל	RK00008	משמש לכימות רמות IL-6 בסרום.
תוכנת ImageJ (פיג'י)	המכונים הלאומיים לבריאות (NIH)	גרסה 1.53c	תוכנה בקוד פתוח המשמשת לעיבוד תמונה וכימות תמונה.
לייקה Application Suite X (LAS X)	לייקה מיקרוסיסטמס	גרסה 3.7	תוכנת הדמיה המשמשת ללכידת שקופיות היסטופתולוגיות.
מתנול (דרגת LC-MS)	מרק	106035	משמש להכנת דגימה מטבולומית ולשלב הנייד של LC-MS.
עכברים (זכר C57BL/6)	אנוקאנג ביוטכנולוגיה בע"מ.	לא זמין	בעלי חיים ניסיוניים (גיל 6&00; 8 שבועות, 20 ו-ndash; 25 גרם) ששימש למודל UC מושרה על ידי DSS.
מסד הנתונים mzCloud	תרמו פישר סיינטיפיק	https://www.mzcloud.org/	מסד נתונים המשמש להתאמה ספקטרלית בין MS/MS.
מיקרוסקופ אופטי	לייקה	DM500	משמש לתצפית היסטופתולוגית.
Paeonia lactiflora (צ'י שאו)	בית החולים לרפואה סינית של מחוז ג'יאנגסו	באץ': 2409001	הצמח המרכיב את LXDHD (מינון: 0.6 גרם).
פאאוניה סופרוטיקוסה קורטקס (Mu Dan Pi)	בית החולים לרפואה סינית של מחוז ג'יאנגסו	באץ': 2409001	העשב המרכיב את LXDHD (מינון: 0.5 גרם).
פאראפורמלדהיד (4%)	Sinopharm Chemical Regain Co., Ltd.	לא זמין	משמש לקיבוע רקמות המעי הגס.
מיקרוטום פתולוגי	לייקה	RM2016	משמש להכנת חתכי רקמת פרפין.
פלודנדרון צ'יננסה (חואנג בו)	בית החולים לרפואה סינית של מחוז ג'יאנגסו	באץ': 2409001	העשב המרכיב את LXDHD (מינון: 0.5 גרם).
Platycladus orientalis (Ce Bai Ye Tan)	בית החולים לרפואה סינית של מחוז ג'יאנגסו	באץ': 2409001	עשב מרכיב את LXDHD (מינון: 0.7 גרם).
ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה אקסטרטיבי Q	תרמו פישר סיינטיפיק	ש: אקסקטיבי	ספקטרומטר מסה מבוסס Orbitrap לניתוח LC–MS.
R Software	קרן R למחשוב סטטיסטי	גרסה 4.2.1 (https://www.r-project.org/)	תוכנה המשמשת לניתוחי העשרת GO ו-KEGG.
רחמניה גלוטינוזה (שנג די הואנג)	בית החולים לרפואה סינית של מחוז ג'יאנגסו	באץ': 2409001	העשב המרכיב את LXDHD (מינון: 2.1 גרם).
Sanguisorba officinalis (די יו טאן)	בית החולים לרפואה סינית של מחוז ג'יאנגסו	באץ': 2409001	הצמח המרכיב את LXDHD (מינון: 0.6 גרם).
סאפושניקוביה דיווריקאטה (פאנג פנג)	בית החולים לרפואה סינית של מחוז ג'יאנגסו	באץ': 2409001	העשב המרכיב את LXDHD (מינון: 0.3 גרם).
סקוטלריה בייקלנסיס (חואנג צ'ין)	בית החולים לרפואה סינית של מחוז ג'יאנגסו	באץ': 2409001	העשב המרכיב את LXDHD (מינון: 0.5 גרם).
נתרן פנטוברביטל (1%)	סיגמא-אלדריץ'	P3761	שימש להרדמה של בעלי חיים לפני איסוף דגימות.
תוכנת SoftMax Pro	מכשירים מולקולריים	גרסה 7.1	תוכנת רכישת וניתוח נתונים המשמשת עם קורא המיקרופלט עבור ELISA.
מאגר מחרוזות	קונסורציום המיתרים	https://string-db.org/	מאגר נתונים שמשמש לחלבון ו-ndash; ניתוח אינטראקציות חלבון.
מסד הנתונים של TCMSP	פלטפורמת TCMSP	https://tcmsp-e.com/	מאגר מידע המשמש לסינון תרכובות פעילות ולחיזוי מטרות תרופות.
TNF-α אליסה קיט (עכבר)	אבקלונל	RK00027	משמש לקביעת TNF ואלפא בדם; ריכוזים.
מערכת LC אולטימטיבי 3000 RS	תרמו פישר סיינטיפיק	אולטימט 3000 RS	מערכת UHPLC בשילוב עם ספקטרומטריית מסה.
מנקה אולטרסוני	קונשאן אולטרסונייק אינסטרומנטס בע"מ	KQ3200E	משמש להוצאה אולטרסונית של LXDHD.
מסד הנתונים UniProt	קונסורציום UniProt	https://www.uniprot.org/	מאגר נתונים המשמש לסטנדרטיזציה של שמות גנים וחלבונים.
מערבל מערבולת	בייג'ינג פאוורסטאר טכנולוגיה בע"מ	LC-Vortex-P1	משמש לערבוב דגימות.
עמוד Welch AQ-C18 (150 & 2.1 מ"מ, 1.8 & mu; m)	חומרי וולש	AQ-18-15021	עמודה המשמשת להפרדת מטבוליטים ורכיבים צמחיים.
קסילן	צ'נגדו קלן כימיקלים בע"מ	1330-20-7	משמש לניקוי רקמות במהלך עיבוד היסטולוגי.