חקירת הקשר הדו-כיווני בין כאבי גב תחתון, כאבי ירך, כאבי ברך וחריגות בהליכה: מחקר אקראי מנדלי

סיכום

ניתוחי IVW מצביעים על כך שכאבי גב תחתון וירך עשויים להיות קשורים להפרעות בהליכה, בעוד שכאבי ברכיים וקשרים הפוכיים אינם חד-משמעיים.

תקציר

חריגות בהליכה קשורות לשינויים בביומכניקה של הגפיים התחתונות ולפגיעה תפקודית בהפרעות שריר-שלד. למרות שכאבי גב תחתון, כאבי ירך וכאבי ברכיים נקשרו לפגיעה בהליכה במחקרים תצפיתיים, הקשר הסיבתי ביניהם נותר לא ברור. ערכנו מחקר אקראי דו-כיווני (MR) מנדלי כדי להעריך קשרים סיבתיים פוטנציאליים בין כאב ספציפי לבין חריגות הליכה ספציפיות למקום. פולימורפיזמים עצמאיים של נוקלאוטידים בודדים ממחקרי אסוציאציה גנומיים רחבי היקף שימשו ככלים גנטיים לכאבי גב תחתון, כאבי ירך וכאבי ברכיים. חריגות הליכה, שהוגדרו במקור GWAS כקושי בהליכה שדווח על עצמו, שימשו כתוצאה בניתוחי MR קדמיים וכחשיפה בניתוחי MR הפוכים. שיטת ה-IVW המשקללת בהיפוך (IVW) הייתה הניתוח העיקרי, הנתמך בניתוחי רגישות להטרוגניות, פליאוטרופיה אופקית ועמידות. בניתוחים קדמיים, כאבי גב תחתון חזויים גנטית (OR = 1.53, רווח בר-סמך 95% = 1.058–2.219, P = 0.024) וכאבי ירך (OR = 1.55, רווח בר-סמך 95% = 1.067–2.252, P = 0.021) היו קשורים לסיכון מוגבר לחריגות בהליכה בניתוחי IVW. עם זאת, ארבע שיטות MR הנוספות לא היו מובהקות סטטיסטית, אם כי ההערכות היו בדרך כלל עקביות מבחינה כיוונית. כאב ברך שחזה גנטית לא הראה קשר מובהק (OR = 2.15, רווח בר-סמך 95% = 0.234–19.789, P = 0.498), עם אי-ודאות משמעותית המשתקפת ברווח האמון הרחב. ניתוחי MRI הפוכים לא מצאו ראיות לכך שרגישות גנטית לחריגות בהליכה העלתה את הסיכון לכאבי גב תחתון, ירך או ברך, אם כי רק ארבעה SNPs היו זמינים. לא זוהתה הטרוגניות משמעותית או פליאוטרופיה אופקית. בסך הכול, מחקר זה מספק ראיות גנטיות מוגבלות מבוססות IVW לכך שכאבי גב תחתון וכאבי ירך עשויים להיות קשורים להפרעות בהליכה. יש לפרש את הממצאים בזהירות ולאמת באמצעות מאגרי GWAS גדולים יותר עם פנוטיפים מעודנים.

מבוא

חריגות בהליכה יכולות לנבוע מליקויים מוטוריים או חושיים, והתכונות הקליניות שלהן תלויות במיקום ובאופי הפתולוגיה הבסיסית. דפוסי הליכה חריגים מסוימים עשויים לספק רמזים אבחנתיים חשובים למחלות מסוימות. ראוי לציין שבהפרעות שריר-שלד, הפרעות בהליכה מופיעות לעיתים עם תכונות ביומכניות מובחנות, וקשורות קשר הדוק לכאב, תפקוד לקוי במפרקים וירידה בניידות ^1,2,3. מחקרים הראו כי חריגות הליכה ארוכות טווח עלולות להחמיר את מצבם של חולים עם אוסטיאוארתריטיס⁴. יתרה מזאת, הליכה לא תקינה מתמשכת עלולה להגדיל את חוסר היציבות של מפרקי התנועה ולשנות את עומס המפרק; פעילויות מפרקים חוזרות תחת מכניקה חריגה עלולות להחמיר עוד יותר את פגיעות המפרק, ובכך לגרום לכאב, לקדם ניוון שרירי הדרגתי ולגרום לאובדן כוח שרירים בולט יותר. גורמים אלו עשויים ליצור מעגל קסמים, התורם להחמרה הדרגתית של הכאב ולפגיעה תפקודית אצל מטופלים עם הפרעות שריר-שלד⁵. לכן, הבהרת כיוון וסיבתיות אפשרית לקשרים בין כאב שריר-שלד ספציפי לבין חריגות בצעידה עשויה לסייע בפרש קשרי כאב והליכה תצפיתיים ולהנחות מחקרים עתידיים על תפקוד לקוי ושיקום.

עם זאת, למרות הצטברות ראיות תצפיתיות המקשרות כאב ספציפי למקום — כמו כאבי גב תחתון, כאבי ירך וכאבי ברך — לפגיעה בביצועי ההליכה, מחקרים תצפיתיים קונבנציונליים פגיעים לבלבול, טעות מדידה וסיבתיות הפוכה, מה שמקשה לקבוע את הכיוון והסיבתיות של הקשרים הללו. בנוסף, הקשר בין כאב להליכה עשוי לכלול הסתגלות של מערכת העצבים המרכזית ומודולציה של מידע נוציספטיבי המתקבל מהפריפריה, מה שמסבך עוד יותר את פירוש הקשרים בין כאב להליכה שנצפה. רנדומיזציה מנדלית (MR) היא גישה אפידמיולוגית שנועדה להתגבר על מגבלות מרכזיות של מחקרים תצפיתיים ויושמה רבות במחקר הסקה סיבתית. MR משתמש בפולימורפיזמים חד-נוקלאוטידיים (SNPs) עצמאיים כמשתנים אינסטרומנטליים כדי להסיק קשרים סיבתיים פוטנציאליים בין חשיפות לתוצאות⁶. לדוגמה, במקום להקצות אנשים לפתח כאבי גב תחתון, MR יכול לבדוק האם האחריות הגנטית לכאבי גב תחתון קשורה לתוצאות הקשורות להליכה במאגרי נתונים של מחקר אסוציאציה גנומי רחב (GWAS). מכיוון שהווריאנטים הגנטיים מוקצים באקראי בעת ההפריה, כלומר ביצירת העובר, MR יכול להפחית הטיה מגורמים מבלבלים כמו גיל, מדד מסת גוף, פעילות גופנית ומצבים נלווים במערכת השרירים והשלד. גישה זו מתאימה לחקר קשרים סיבתיים ברמת האוכלוסייה כאשר נתוני GWAS חזקים וכלים גנטיים תקפים זמינים. עם זאת, הפנוטיפים ששימשו במחקר זה היו תכונות GWAS רחבות שדווחו בעצמן, וייתכן שלא לוכדות במלואן את חומרת הכאב, משך התסמינים, אבחנות שאושרו על ידי הרופא או פרמטרי הליכה אובייקטיביים. על ידי ניצול ההקצאה האקראית של וריאנטים גנטיים בעת ההפריה, MR יכול ביעילות להפחית הטיה מגורמים מבלבלים ולהפוך סיבתיות, ובכך לספק ראיות סיבתיות סבירות יותר.

מטרת המחקר הייתה לבצע ניתוח MR דו-כיווני באמצעות נתוני סיכום GWAS על כאבי גב תחתון, כאבי ירך וכאבי ברכיים שדווחו בעצמם, יחד עם נתוני GWAS על חריגות בהליכה ממאגר IEU Open GWAS. במחקר זה, פנוטיפים של הכאב ייצגו תכונות כאב רחבות שדווחו על עצמם ספציפיות למקום, וחריגות בהליכה ייצגו קושי בהליכה שדווחו על עצמם במקום אבחנות מאושרות על ידי רופא, פרמטרי הליכה שנמדדו במעבדה, או ציונים פונקציונליים סטנדרטיים. עיצוב דו-כיווני זה נועד להעריך את כיוון הקשרים הסיבתיים הפוטנציאליים בין כאב שריר-שלד ספציפי לבין חריגות בהליכה באמצעות סטטיסטיקות סיכום GWAS⁷.

פרוטוקול

מחקר זה השתמש בנתוני סיכום ברמת מחקר אסוציאציה גנומי רחב (GWAS) זמינים לציבור ממאגר IEU OpenGWAS ומקטלוג GWAS. לא ניגשו לנתוני משתתפים ברמת הפרט, ולא גויסו משתתפים אנושיים חדשים. אישור אתי והסכמה מדעת בכתב התקבלו במחקרי GWAS שתרמו במקור. לכן, לא נדרשה אישור נוסף של ועדת הביקורת המוסדית לניתוח המשני הנוכחי של סטטיסטיקות סיכום זמינות לציבור.

עקרון הלימוד והעיצוב

השלבים הבסיסיים במחקר MR כוללים השגת נתוני סיכום GWAS, סינון והערכת SNPs, ביצוע ניתוח סטטיסטי ויישום מדדי בקרת איכות. כפי שמוצג באיור 1, דיוק ניתוח ה-MR מבוסס על מימוש שלוש הנחות קריטיות: (1) הנחת הרלוונטיות: עירויים צריכים להיות רלוונטיים לפנוטיפים של החשיפה, כלומר כאבי גב תחתון, כאבי ירך וכאבי ברכיים⁸; (2) הנחת העצמאות: IVs אינם רלוונטיים לגורמים מבלבלים המשפיעים על "חשיפה-תוצאה"; (3) הנחת הבלעדיות: IVs משפיעים על התוצאה רק דרך חשיפה ולא דרך מסלולים אחרים⁹. גורמי חשיפה ומשתני תוצאה יוחלפו בכל ניתוח כדי לקבוע אם קיימת סיבתיות הפוכה בין השניים.

לשיפור השחזוריות, זרימת העבודה החישובית המלאה המשמשת לייבוא סטטיסטיקה סיכום מקומית של GWAS, חילוץ SNP, הצטברות LD, חילוץ SNP לתוצאות, הרמוניזציה של אללים, ניתוח MR, ניתוח רגישות, גרף אבחוני וחיסכון בתפוקה מסופק כקוד משלים 1. הטקסט הראשי מתאר את שלבי הפרוטוקול המרכזיים, בעוד שקובץ משלים 1 מספק את מימוש R ברמת הפקודה ורמת הפונקציה המתאימים.

מקורות נתונים

נתונים הקשורים לכאבי גב תחתון, כאבי ירך וכאבי ברכיים מתקבלים ממאגר הנתונים של IEU openGWAS, והאתר הוא: https://gwas.mrcieu.ac.uk/. שאלות ספציפיות המשמשות להגדרת תנאים אלו ניתן למצוא בתיק המשלים 2. כאבי גב תחתון, כאבי ירך וכאבי ברכיים הוגדרו על פי פריטי כאב ספציפיים לאתר שדווחו בעצמם במאגרי הנתונים המקוריים של GWAS. מספר הזיהוי של מאגר GWAS לכאבי גב תחתון הוא: ebi-a-GCST90018797, עם גודל מדגם של 468269, הכולל 22,413 מטופלים עם כאבי גב תחתון, ו-445,856 קבוצת ביקורת באוכלוסייה, עם מספר SNP כולל של 24174741. מספר הזיהוי של כאב הירך ב-GWAS הוא: ebi-a-GCST90013968, עם גודל מדגם של 407746 וספירת SNP כוללת של 11039206. מספר הנתונים של מכאבי הברך ב-GWAS הוא: ukb-b-16254, עם גודל מדגם של 461857, הכולל 98704 מטופלים עם כאבי ברכיים, וכן אוכלוסיית ביקורת של 363153, עם מספר כולל של SNPs של 9851867. נתוני GWAS עבור חריגות הליכה מתקבלים גם ממאגר הנתונים openGWAS של IEU, מספר זהות GWAS הוא: finn-b-R18 _ABNORMALITI_GAIT_MOBIL, עם גודל מדגם של 210717, כולל 1348 מקרים של חריגות בהליכה ואוכלוסיות ביקורת 209369, וסך הכל זוהו 1638044 לוקוסי SNPs. הפרטים מוצגים בטבלה 1.

לרכישת נתונים שניתן לשכפול, חוקרים צריכים לחפש כל מזהה GWAS שמופיע לעיל במאגר IEU OpenGWAS, להוריד את קובץ הסיכום הסטטיסטי של GWAS המתאים כאשר זמין, ולשמור את הקובץ כטקסט מקומי או כקובץ מופרד בפסיקים לפני ייבואו ל-R. בזרימת העבודה החישובית ששימשה במחקר זה, קבצי סיכום סטטיסטיים מקומיים של GWAS יובאו ל-R באמצעות read.table() או read.csv(), בהתאם לפורמט קובץ המקור. תהליך העבודה המבוסס על קבצים מקומיים אומץ כדי להבטיח שניתן יהיה לעבד שוב ושוב את אותם קבצי סיכום סטטיסטיים GWAS שהורדו באמצעות מיפוי עמודות קבועים ופקודות ניתוח זהות. הפקודות המדויקות R לייבוא ועיבוד הקבצים המקומיים מסופקות בקובץ המשלים 1.

סינון וכניסת SNPs

SNPs הקשורים באופן מובהק לכל פנוטיפ חשיפה הופקו מתוך מאגרי הנתונים הסיכומים של GWAS באמצעות סף מובהקות כלל-גנומי של P < 5 × 10⁻⁸. אם פחות משלושה SNPים עצמאיים היו זמינים בסף זה, הסף הוקל ל-P < 5 × 10⁻⁶ כדי לקבל מספיק כלים גנטיים לניתוח MR. אי-שוויון הקישור הוערך באמצעות r² < 0.001 בתוך חלון של 10,000 קילו-בייט כדי להבטיח את עצמאות המשתנים האינסטרומנטליים.

ברמת הסקריפטים, סטטיסטיקות סיכום של GWAS בחשיפה יובאו תחילה ל-R וסוננו לפי סף ערך P שנקבע מראש. ה-SNPs שנבחרו נשמרו כקובץ חשיפה ועוצבו בהתאם לדרישות חבילת TwoSampleMR. מיפוי עמודות נדרש כלל את מזהה SNP, הערכת אפקט, שגיאת תקן, אלל אפקט, אלל אחר וערך P. בתהליך העבודה R הניתן לשחזור, נתוני החשיפה יובאו באמצעות read_exposure_data(), ו-LD clumping בוצע על ידי הגדרת clump = TRUE. מבנה הפקודות R המתאים היה: read_exposure_data(שם קובץ = "exposure.csv", sep = ",", snp_col = "rsids", beta_col = "beta", se_col = "sebeta", effect_allele_col = "alt", other_allele_col = "ref", pval_col = "pval", clump = TRUE). שמות העמודות הותאמו בהתאם לקבצי ה-GWAS שהורדו בפועל.

חוזק הכלי הוערך באמצעות סטטיסטיקת F:

F = [(N − k − 1)/k] × [R²/(1 − R²)],

כאשר N מייצג את גודל המדגם, k מייצג את מספר המשתנים האינסטרומנטליים, ו-R² מייצג את החלק של שונות החשיפה המוסברת על ידי SNPs. R² חושב כך

Σ[2 × MAF × (1 − MAF) × β²/(SE² × N)],

כאשר MAF הוא תדירות האללים המינורית, β הוא הערכת אפקט האלל, ו-SE הוא השגיאה הסטנדרטית.

SNPs עם סטטיסטיקות F > 10 נשמרו. SNPs הקשורים לגורמים פוטנציאליים לבלבלים, כולל חריגות אנטומיות מולדות ומדד מסת גוף, זוהו באמצעות PhenoScanner V2 והוסרו.

SNPs התוצאה הופקו על ידי מיזוג SNPs שנחשפו עם קובץ הסיכום המקומי של GWAS לפי מזהה SNP. אם התוצאה GWAS דיווחה −log10(P), ערך ה-P הומר באמצעות P = 10^(−LP). SNPs שהופקו יובאו לאחר מכן באמצעות read_outcome_data(). מערכי הנתונים של חשיפה ותוצאה אוחדו באמצעות harmonise_data() ליישור אללים של אפקט ולהסיר SNPים שאינם מתאימים לניתוח MR. SNPs פלינדרומיים עם אוריינטציה אללית עמומה הוצאו, ו-SNPs עם mr_keep = TRUE נשמרו לניתוחי MR מאוחרים^{יותר 11}. הסקריפט המפורט להפקת SNP בתוצאה, המרת ערך P והרמוניזציה מסופק בקובץ המשלים 1.

ניתוח סטטיסטי

ההשפעות הסיבתיות בין החשיפה למשתני התוצאה הוערכו במחקר זה באמצעות חמש שיטות: שיטת IVW, שיטת הרגרסיה MR-Egger, שיטת החציון המשוקלל, שיטת המצב המשוקלל, ושיטת המצב הפשוט¹². שיטת IVW נחשבת לשיטה הסטנדרטית לניתוח MR, המניחה שכל המשתנים האינסטרומנטליים תקפים, ומבוססת על עקרון שילוב הערכות יחס וולד, ומודל אפקטים אקראיים משמש אם יש הטרוגניות, ומודל אפקטים קבועים משמש אם אין הטרוגניות. שיטת הרגרסיה MR-Egger מזהה פוטנציאל רב-קוליניאריות ומתחשב בנוכחות איבר יירוט ברגרסיה¹³. שיטת החציון המשוקלל דורשת שיותר מ-50% מהמשתנים האינסטרומנטליים יהיו SNPs תקפים. שיטת המצב המשוקלל דורשת גודל מדגם קטן יותר משיטות אחרות ומבטיחה פחות הטיה ושיעורי שגיאה מסוג I נמוכים יותר. שיטת המצב הפשוט מאפשרת לקבץ SNPs עם השפעות דומות לפי האם ההשפעות הסיבתיות המוערכות דומות או לא¹⁴.

ברמת הפונקציה, בוצעו ניתוחי MR באמצעות פונקציית MR() בחבילת TwoSampleMR. רשימת השיטות ששימשה בניתוח צוינה כ-c("mr_ivw", "mr_egger_regression", "mr_weighted_median", "mr_simple_mode", "mr_weighted_mode"). יחסי סיכויים ורווחי ביטחון של 95% נוצרו באמצעות generate_odds_ratios(). המימוש המלא של R, כולל רשימת המתודות המדויקת ופקודות שמירת הפלט, מסופק בקובץ המשלים 1.

בקרת איכות וניתוח רגישות

כדי לבדוק את היציבות והאמינות של תוצאות ה-MR, תחילה נעשה שימוש במבחן קוקרן Q להערכת ההטרוגניות של SNPs, ואם מבחן קוקרן Q היה מובהק סטטיסטית, הוא הצביע על הטרוגניות מובהקת בתוצאות המנותחות¹⁵. שנית, מבחן היירוט MR-Egger שימש להערכת פליאוטרופיה אופקית פוטנציאלית. יירוט MR-Egger מובהק סטטיסטית מצביע על נוכחות פליאוטרופיה אופקית כיוונית בניתוח ה-MR. שלישית, MR-PRESSO (MR-PRESSO) יושמה לחיפוש נוכחות של SNPים חריגים בתוצאות, ואם היו קיימים, הם הוסרו ונותחו מחדש¹⁶. רביעית, שיטת "השארת אחד החוצה" יושמה לבחינת עמידות התוצאות, וההשפעה המשולבת של שאר SNPs חושבה על ידי החרגת SNPs אחד אחד כדי להעריך את השפעת SNPs בודדים על הקשר בין חשיפה למשתני תוצאה¹⁷.

ברמת הפונקציה, הוערכה הטרוגניות באמצעות mr_heterogeneity(), פליאוטרופיה כיוונית הוערכה באמצעות mr_pleiotropy_test(), השפעות SNP בודדות הוערכו באמצעות mr_singlesnp(), וניתוח השאר-אחד-אאוט בוצע באמצעות mr_leaveoneout(). גרפים אבחנתיים נוצרו באמצעות mr_scatter_plot(), mr_funnel_plot() ו-mr_leaveoneout_plot(). MR-PRESSO בוצע כאשר מספר המשתנים האינסטרומנטליים הזמינים היה מספיק; אם MR-PRESSO לא ניתן היה להתבצע בגלל חוסר מספיק של SNPs, הדבר נרשם ודווח. ניתוח MR ונהלי בקרת האיכות בוצעו באמצעות גרסה R 4.3.2 וחבילת TwoSampleMR גרסה 0.5.8, עם רמת מובהקות של α = 0.05. הפקודות המלאות מסופקות בקובץ המשלים 1.

שמירת פלט, בדיקת איכות ודיווח

כל הפלטים הביניים והסופיים נשמרו לשחזור. אלה כללו SNPs שנבחרו לחשיפה, מכשירי חשיפה מרוכזים, SNPs שהופצו, מערכי נתונים מאוזנים, רשימות SNP ששמרו, הערכות MR, יחסי סיכויים, תוצאות הטרוגניות, תוצאות יירוט MR-Egger, תוצאות MR-PRESSO, תוצאות SNP בודד, תוצאות השאר-אחד-בחוץ, גרפים אבחנתיים, ומידע על מפגש R. לפני הדיווח, נבדקו SNPים שנשמרו למשמעות גנומית רחבה, עצמאות LD, מצב הרמוניזציה של אללים, וריאנטים פלינדרומיים עמומים, עוצמת מכשיר, הטרוגניות, פליאוטרופיה אופקית כיוונית ו-SNPs חריגים. תוצאות ה-MR הראשוניות דווחו כיחס סיכויים עם רווחי ביטחון של 95% וערכי P. תוצאות ניתוח רגישות וגרפים אבחנתיים דווחו בטבלאות ובאיורים המשלימים הונחו. פקודות שמירת הפלט ובדיקת הקבצים מסופקות בקובץ המשלים 1.

תוצאות

נתוני GWAS עבור שלושה פנוטיפים ספציפיים של כאב שריר-שלד, כולל כאבי גב תחתון, כאבי ירך וכאבי ברכיים, ופנוטיפ אחד של חריגות הליכה, נותחו במחקר זה. מידע מפורט על עירויים לכל גורם חשיפה ניתן למצוא בקובץ המשלים 3.

ניתוח MR של כאב שריר-שלד ספציפי לאתר על חריגות בהליכה

במחקר זה, SNPs עם חוסר שוויון קישור ומבנה פלינדרומי הוצאו וה-SNPs הקשורים למבלבלים הוסרו, וה-SNPs הסופיים שנכללו ינותחו כמשתנים אינסטרומנטל...

דיון

חריגות בהליכה עלולות לשנות את אסטרטגיות העומס והתנועה של מפרקי הגפיים התחתונות, להאיץ תהליכי 821+_osteoarthritic ולתרום למגבלות תפקודיות שפוגעות משמעותית באיכות החיים. רלוונטיות קלינית זו משכה תשומת לב גוברת לאינטראקציה בין דיספונקציה לקויה בהליכה לכאב שריר-שלד. מחקרים תצפיתיים מצביעים על כך שכאב שריר-שלד ספציפי לאתר עשוי להיות קשור לפגיעה בהליכה; לדוגמה, מחקר חתך על מבוגרים בקהילה בגיל 65 ומעלה דיווח כי כאב רב-אתרי היה קשור למהירות הליכה איטית (n = 176)¹⁸. עם זאת...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מסד הנתונים של IEU OpenGWAS	יחידת האפידמיולוגיה האינטגרטיבית של MRC, אוניברסיטת בריסטול	לא זמין	מקור סטטיסטיקות סיכום של GWAS עבור חשיפה ופנוטיפים לתוצאה.
חבילת MR-PRESSO R	מארי ורבנק / חבילת R	לא זמין	משמש לזיהוי חריגים והערכה של פליאוטרופיה אופקית.
PhenoScanner V2	אוניברסיטת קיימברידג'	V2	משאב אינטרנט המשמש לזיהוי SNPs הקשורים למבלבלים פוטנציאליים.
R	קרן R למחשוב סטטיסטי	גרסה 4.3.2	סביבת מחשוב סטטיסטית המשמשת לניתוח MR ובקרת איכות.
חבילת TwoSampleMR R	יחידת האפידמיולוגיה האינטגרטיבית של MRC, אוניברסיטת בריסטול	גרסה 0.5.8	שימש לניתוחי IVW, MR-Egger, חציון משוקלל, מצב משוקלל ו-MR במצב פשוט.