מאמר שיטה

מדידת דינמיקה תרגומית של mRNA בתאים חיים באמצעות תיוג לומנסנטי מפוצל בתאי HEK293

DOI:

10.3791/70840

⸱

14 באוגוסט 2026

 ,  ,  , 
1Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Pharmacology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים שיטה גמישה, התואמת תפוקה גבוהה (high-throughput), למדידת דינמיקת תרגום של mRNA חי בתוך תאי HEK293s, באמצעות תיוג לומניסצנטי מפוצל (split luminescent tagging). בדיקה רב-גונית זו מבדילה בין השפעות מבניות, תומכת באופטימיזציה של שעתוק in vitro, ומייעלת את הפיתוח של תרופות מבוססות mRNA.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפיתוח המהיר של החיסונים למאבק ב-COVID-19 הדגים את הפוטנציאל של טיפולים המבוססים על RNA שליח (mRNA) לשנות את פיתוח התרופות. בדומה ל-mRNA בוגר, mRNA שתועתק in vitro כולל את אותם רכיבים, ביניהם כובע 5', אזורים שאינם מתורגמים (UTRs), רצף מקודד וזנב poly(A). עבודות קודמות שבחנו את ההשפעות של רכיבים אלו על תרגום ה-mRNA השתמשו בעיקר בחלבונים דגל (reporter proteins) שעברו הנדסה רבה ומראים תרגום יעיל ויציבות חלבונית. מאחר שרכיבי המבנה של כל mRNA משפיעים באופן שונה על התרגום שלהם, הכרחי לזהות את התכנון האופטימלי הרלוונטי לחלבון העניין (POI) הטיפולי. כדי לאפשר אפיון של תרגום ה-POI, נעשה שימוש במערכת השלמה של לוציפראז מפוצלת (split luciferase complementation system). תג פפטיד קצר (HiBiT), שניתן להחבירו לכל אחד מקצות ה-POI, נקשר להטרודימר המשלים שלו (LgBiT) כדי לשחזר פעילות אנזימטית בנוכחות מצע חודר-תאים. עד כה, סימון לומניסצנטי מפוצל שימש בעיקר למחקרי תחלופת חלבונים בסריקה רחבה. בעבר הדגמנו כיצד ניתן להשתמש בסימון לומניסצנטי מפוצל כדי לאפשר כימות של תרגום mRNA במישור הזמני in cellulo בתאי HEK293 המבטאים באופן קונסטיטוטיבי את ההטרודימר המשלים. כאן, אנו מדגימים עוד יותר את רב-גוניות הבדיקה ומפרטים כיצד ניתן להשתמש בבדיקה זו לאופטימיזציה של תעתוק in vitro במטרה להפחית עלויות. מערכת הבדיקה יכולה להבחין באופן ייחודי בשינויים ברכיבי המבנה תוך הדגשת ההשפעות של אופטימיזציית הרצף המקודד תוך שימוש בגנים לא-מהונדסים. בנוסף, אנו מדגימים כי הפחתה של פי 4 בריכוז כובע 5' עבור תעתוק in vitro מביאה לתרגום שווה in cellulo. ממצאים אלו ממחישים כיצד ניתן לשלב בקלות סימון לומניסצנטי מפוצל בתהליך העבודה של תרופות mRNA, מה שמאפשר ניטור של דינמיקת ביטוי חלבונים המונעת על ידי mRNA בזמן אמת in cellulo, ובכך מציע שיטה רב-גונית לקידום טיפולים מבוססי mRNA.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפולים ומחקרי mRNA (Messenger RNA) התרחבו במהירות בשנים האחרונות, בהובלת הצלחתם של חיסוני mRNA1,2 וההכרה הגוברת ברב-גוניות של ה-RNA כביומולקולה הניתנת לתכנות. אתגר מרכזי בתחום זה הוא היכולת להעריך באופן כמותי ודינמי את יעילות התרגום של mRNA בהקשרים מגוונים. השיטה המתוארת כאן – המשתמשת במערכת תיוג לומנסנטית מפוצלת (split luminescent tagging system) – מספקת פלטפורמה גמישה וניתנת להרחבה לחקר תרגום mRNA בחיים in cellulo3. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לאפשר לחוקרים למדוד כיצד מאפייני רצף, מודיפיקציות כימיות ואלמנטים מבניים משפיעים על קינטיקת התרגום ועל תחלופת החלבון העוקבת, ובכך להציע כלי רב עוצמה לאופטימיזציה של מבני mRNA ליישומים טיפוליים ולמחקר בסיסי.

In vitro transcribed mRNA משקף את הארכיטקטורה החיונית של תסכיפים בוגרים, הכוללת 5′ cap, אזורים לא מתורגמים (UTRs), רצף מקודד וזנב poly(A), ולעיתים קרובות כולל נוקלאוטידים שעברו מודיפיקציה כדי להפחית אימונוגניות4,5. עבודות נרחבות הראו כי כל אחד מהאלמנטים הללו – לבדו או בשילוב – יכול להיות מהונדס כדי להשפיע באופן משמעותי על יעילות התרגום ועל תנובת החלבון6,7. עם זאת, מרבית המחקרים הקודמים הסתמכו על חלבוני דגמי (reporter proteins) שעברו אופטימיזציה גבוהה, כגון Green Fluorescent Protein (GFP)7, NanoLuc8, או חלבון ה-spike של SARS-CoV-28,9, אשר הונדסו כדי להתרגם ביעילות גבוהה ולהפיק חלבונים יציבים מאוד, ולכן אינם משקפים את האתגרים הניצבים בהקשרים טיפוליים. מכיוון ש-mRNAs טיפוליים מקודדים חלבונים מגוונים בעלי עניין (POIs), שכל אחד מהם כפוף למגבלות מבניות ייחודיות ולרגולציה ספציפית לסוג התא, עקרונות התכנון הממקסמים את התרגום עבור מבנה אחד עשויים שלא להכלל למבנה אחר, כפי שדווח בעבר3. לכן, זיהוי התצורה האופטימלית עבור POI טיפולי נתון הוא חיוני ומצריך שיטות שיכולות להעריך באופן רגיש וסיסטמטי כיצד מאפיינים בודדים של התסכיף תורמים לתפוקת החלבון.

שיטות המתמקדות בריבוזום, כגון פרופיל פוליזומים (polysome profiling), מבדילות בין פראקציות תרגום באמצעות סנטריפוגציה במעבר גרדיאנט10, בעוד שפרופיל ריבוזומים (Ribo-seq) מספק רזולוציה ברמה של נוקלאוטידים לגבי תפוסת ריבוזומים, אתרי התחלה ועצירות (pausing)11. בדומה ל-Ribo-seq, גישות אחרות המבוססות על ריצוף, כגון High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Crosslinking Immunoprecipitation (HITS-CLIP) ו-Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP), מאפיינות עוד יותר את התרגום של RNA הקשור לחלבונים קושרים של RNA או RNA הקשור לריבוזומים12. למרות עוצמתן, טכניקות אלו דורשות הכנה מורכבת, ציוד ייעודי ומומחיות חישובית, מה שהופך אותן לבלתי מתאימות לפיתוח mRNA טיפולי בתפוקה גבוהה. שיטת immunoprecipitation של שרשראות נבנות (Nascent chain immunoprecipitation)13 מודדת יעילות תרגום באמצעות חלבונים מתויגים ב-FLAG ששוקעו אימונולוגית מריבוזומים וכומתה באמצעות Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR). למרות שניתן להתאימה ל-mRNA טיפולי, הבדיקה דורשת עבודה מאומצת, חסרה רזולוציה זמנית ואינה מתאימה ליישומים בתפוקה גבוהה. מערכת ה-SunTag14 מאפשרת מדידות בתאי חיים של תפוקת סינתזת חלבונים ובקרה תרגומית ממולקולות mRNA בודדות, והיא פועלת באמצעות אינטראקציה של פרגמנט משתנה של שרשרת אחת (scFv) המהוכה ל-GFP עם חזרות טנדמיות של האפיטופ הפפטידי. מערכת זו מאפשרת מדידות דינמיות של תרגום ומיקום ברזולוציה של mRNA בודד, ולכן היא נוצלה לפיתוח מערכות רבות למעקב אחר שרשראות נבנות15,16. עם זאת, גישה זו היא בעלת תפוקה נמוכה ודורשת שימוש במיקרוסקופים בעלי עוצמה גבוהה.

בעוד שסימון של החלבון הנבנה הוא בלתי נמנע, זוהה שימוש פוטנציאלי בתג פפטיד קטן, שנגזר מ-NanoLuc luciferase, כדי לדווח על תרגום mRNA בתאים חיים. ה-NanoLuciferase הונדס כך שיחולק לתת-יחידה קטנה של 11 חומצות אמינו (HiBiT) ותת-יחידה גדולה יותר של 158 חומצות אמינו (LgBiT), שיכולות להיווצר במהירות כדימר ו,בנוכחות סובסטרט, לשחזר לוקיפראז תפקודי17,18. ישנם מספר יתרונות מרכזיים למערכת הסימון הלומניסצנטית המפוצלת למחקרים של דינמיקת mRNA. ראשית, הגודל המינימלי של תת-היחידה הקטנה המחוברת ל-POI מאפשר למבנה המקודד להישאר קרוב ככל האפשר לחלבון העניין המקורי. מכיוון שאורך רצף הקידוד יכול להשפיע ישירות על יחסי התרגום19, מזעור אורך התג משפר את יכולת הניבוי שלנו לגבי דינמיקת התרגום של mRNAs סינתטיים. באופן מכריע, אסטרטגיית סימון מינימלית זו מאפשרת זיהוי של הבדלים בתרגום המונעים על ידי וריאציה ברצף קידוד סינונימי, ובכך מאפשרת לבחון את יעילות התרגום באופן בלתי תלוי ברצף החלבון או ביציבותו3. מסיבה זו, שימוש בתגים גדולים יותר, כגון חלבונים פלואורסצנטיים או לוקיפראזים מלאים, אינו אופטימלי. שנית, מערכת הסימון הלומניסצנטית המפוצלת המשמשת כאן מאפשרת יצירת אות מיידית. תגובת ההשלמה המהירה והיעילה שלה in cellulo היא בעלת זיקה גבוהה מדווחת (KD = 700 pM) והיא שימשה למדידת מודולציה של תחלופת חלבונים עם קריאות קצרות של עד כל 30 s18. בעוד שמערכת הסימון הלומניסצנטית המפוצלת המקורית נמדדה בעיקר אל מול מערכות לוקיפראז מפוצלות אחרות17,18, היתרון המרכזי בהקשר זה הוא שיצירת האות אינה מוגבלת על ידי הבשלה של החלבון. לעומת זאת, חלבונים פלואורסצנטיים דורשים הבשלה של הכרומופור, שעלולה להתרחש בטווח של דקות עד שעות20, ובכך להגביל את הרזולוציה הזמנית. לבסוף, מערכת הסימון הלומניסצנטית המפוצלת המבוססת המשמשת כאן מתגברת על מגבלות של מערכות חלבון פלואורסצנטי מפוצל, אשר בדרך כלל דורשות היווצרות של כרומופור לאחר ההשלמה21, מה שיוצר עיכוב נוסף ומגביל את התאמתן ללכידה של תהליכים דינמיים ומהירים. מחקרים קודמים הדגימו את התועלת של סימון לומניסצנטי מפוצל במבחני תחלופת חלבונים ובמחקרי דגרדציה22,23,24. הרחבת טכנולוגיה מבוססת זו לקינטיקה של תרגום מהווה התקדמות מתודולוגית משמעותית. לדוגמה, בעוד שפרופיל ריבוזומים יכול לחשוף צפיפות ריבוזומים לאורך תמלילים, הוא אינו יכול ללכוד בקלות שינויים דינמיים בשיעורי התחלת התרגום או ההארכה תחת תנאים שונים. כפי שהודגם בעבר3, מערכת סימון לומניסצנטית מפוצלת זו יכולה לזהות הבדלים בעת שינוי מבנה ה-cap, הרכב ה-5′ untranslated region (UTR), אופטימיזציה של קודונים, מודיפיקציות של נוקלאוטידים ואורך זנב ה-poly(A), שכולם מהווים גורמים קריטיים ליעילות התרגום. רוחב יישומים זה הופך את השיטה לעוצמתית באופן ייחודי לפירוק התרומות של מאפייני mRNA בודדים לתפוקת החלבון הכוללת. ראוי לציין כי, תלוי במכשיר שבו משתמשים, ניתן ללכוד בטכנולוגיה זו נתונים הן ברמת התא הבודד והן ברמת הבאר השלמה. פלטפורמות דימוי המסוגלות לרכוש תמונות מבוססות לומניסצנציה יכולות לאפשר שימוש בטכנולוגיה זו לחקר דינמיקת תרגום בתא בודד. כאן, אנו מתמקדים ביישום מבוסס בארות באמצעות קורא פלטות, בשל אופיו של תפוקה בינונית עד גבוהה ודרישות מינימליות לניתוח נתונים.

חוקרים השוקלים להשתמש בשיטה זו צריכים להעריך את התאמתה לאור מטרותיהם הניסיוניות הספציפיות. הבדיקה בעלת ערך רב במיוחד בהקשרים הדורשים סריקה בספיקה גבוהה (high-throughput screening) של מבני mRNA סינתטיים, כגון בתהליכי תכנון של תרופות מבוססות mRNA. היא מתאימה מאוד לאנליזות השוואתיות של מאפייני רצף של mRNA סינתטי – כולל אזורים לא מתורגמים (UTRs), שימוש בקודונים או מודיפיקציות של נוקלאוטידים – שבהן ניתן לזהות הבדלים דקים ביעילות התרגום3. מכיוון שהמערכת תואמת לפלטפורמות תרגום נטולות תאים (cell-free), לבדיקות בתאים חיים ולבדיקה ליטית תלויית נקודת זמן, היא מציעה גמישות לחוקרים המעוניינים להתאים את התכנון הניסיוני שלהם למחקרים מכניסטיים או למחקר יישומי. יחד עם זאת, חשוב להכיר במגבלות הטכניקה. באופן קריטי, בדיקת התיוג הלומניסצנטי המפוצל (split luminescent tagging assay) אינה מספקת רזולוציה של תפוסת ריבוזומים (ribosome occupancy), יכולת שנותרה ייחודית לגישות של ribosome footprinting, ואינה מודדת באופן ישיר יציבות או פירוק של RNA, אשר עשויים לדרוש הערכה באמצעות שיטות משלימות. עם זאת, בשל המגבלות של טכניקות ריבוא-צנטריות קיימות, חוקרים נשענים על בדיקות מבוססות תיוג, כמו מערכת הלומניסצנציה המפוצלת, כדי לחקור ביטוי חלבון מונע mRNA ברזולוציה של זמן כמדד (proxy) לדינמיקה תרגומית. לפיכך, בעוד שמערכת זו היא כלי רב עוצמה לניטור ביטוי חלבון מונע mRNA סינתטי, התאמתה תלויה בשאלה אם שאלת המחקר מתמקדת בתפוקת חלבון דינמית ולא במיקום מדויק של ריבוזומים או בפירוק RNA.

לסיכום, מערכת התיוג הלומנסנטית המפוצלת מהווה שיטה עוצמתית ורב-גונית לחקר תרגום mRNA. מטרתה הכוללת היא לספק לחוקרים כלי גמיש, הניתן להרחבה (scalable), בעל תפוקה גבוהה ומסוגל לזהות הבדלים בתפוקת החלבון הנובעים מ-mRNA סינתטי בעל אלמנטים מבניים ורצפיים משתנים3. הרציונל לפיתוחה טמון בהתגברות על מגבלותיהן של טכניקות קיימות, תוך הצעת יתרונות ברגישות, ביכולת ההרחבה ובברזולוציה הזמנית. כחלק מהספרות הרחבה יותר על ביולוגיה של RNA וטיפולים תרופתיים, שיטה זו מהווה תוספת בעלת ערך למאגר הכלים הניסוייים, ומאפשרת הן תובנות בסיסיות והן התקדמויות תרגומיות. באמצעות בחינה קפדנית של נקודות החוזק והמגבלות של הבדיקה, יוכלו חוקרים לקבוע את התאמתה ליישומים הספציפיים שלהם, ובכך למקסם את השפעתה בתחום מדעי ה-RNA המתפתח במהירות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיאור גרפי של הפרוטוקול המלא מוצג ב-איור 1.

1. הכנת תבנית לתעתוק in vitro (IVT)

הערה: כדי להכין את תבנית ה-DNA עבור IVT, ודאו שה-plasmid DNA מכיל פרומוטור של RNA polymerase (בדרך כלל T7 או SP6), מקטעי 5’ ו-3’ UTR, ואת מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של ה-POI (איור 1).

  1. בצע ליניאריזציה של DNA פלסמידי באמצעות אנזים הגבלה בעל אתר חיתוך יחיד הממוקם לאחר ה-3’ UTR, והרכב את התגובה בהתאם להוראות היצרן. לאחר הדגירה, נקה את תגובת עיכול אנזימי ההגבלה באמצעות ערכה לטיהור DNA המבוססת על עמודת ספינ (spin column). כמת את ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
  2. כדי לאשר את הליניאריזציה, הכן ג'ל אגרוז TAE בריכוז 1% המכיל את צבע ה-DNA אתידיום ברומיד (Ethidium Bromide) בריכוז 0.1 µg/mL. ערבב 150 ng של DNA שעבר עיכול עם מים וצבע טעינה. טען את ג'ל האגרוז עם הדגימה, פלסמיד לא חתוך וסולם DNA, והרץ את ג'ל האגרוז במתח של 100 V למשך 40 דקות בבופר Tris-acetic acid-EDTA (TAE) בריכוז 1×. הדמיין את התוצאות באמצעות מכשיר להדמיית ג'לים.
    זהירות: תמיסת אתידיום ברומיד היא מוטגן חזק ומצריכה טיפול זהיר תוך שימוש בציוד מגן אישי (PPE) מתאים.
  3. אם ל-DNA הפלסמידי אין זנב poly(A) מיד לאחר ה-3’ UTR, הוסף אותו באמצעות PCR. בצע את ה-PCR בהתאם להוראות היצרן תוך שימוש בפולימראז בעל נאמנות גבוהה (high-fidelity polymerase) עם פריימרים שתוכננו בהתאם. ודא שהאמפליקון כולל את מקדם T7, את מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) ואת זנב ה-poly(A).
    הערה: לטכנולוגיות כובע (Capping) עשויות להיות דרישות רצף ספציפיות במקדם T7; לכן, ניתן לספק דרישות אלה באמצעות תכנון מתאים של הפריימר הקדמי (forward primer). הפריימר האחורי נקשר לקצה של ה-3’ UTR ומכניס זנב poly(A) (אורך מומלץ של לפחות 80 T). עבור מבנים בעלי תכולת GC גבוהה, מומלץ לבצע step-up PCR ו/או להוסיף 3% DMSO.
  4. כדי לאשר PCR מוצלח, הכן ג'ל אגרוז TAE המכיל אתידיום ברומיד (ראה שלב 1.2). אם אורך המבנה הוא ≥1 kb או <1 kb, הכן ג'ל של 1% או 2%, בהתאמה. ערבב 5 µL מתגובת ה-PCR עם מים וצבע טעינה. טען את ג'ל האגרוז הן עם הדגימה והן עם סולם DNA, והרץ אותו במתח של 100 V למשך 40 דקות בבופר TAE. הדמיין את התוצאות באמצעות מכשיר להדמיית ג'לים.
  5. לאחר אישור גודל ה-PCR, נקה את תגובת ה-PCR באמצעות ערכה לטיהור DNA המבוססת על עמודת ספינ. בצע אלוציה לתוך 15–20 µL של בופר אלוציה (המסופק לרוב עם ערכת טיהור ה-DNA) או מים נקיים מנוקלאז (nuclease-free water) כדי לרכז את תבנית ה-DNA לשימוש ב-IVT. כמת את ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר.

2. תמלול In vitro

  1. לפני התחלת העבודה, רססו ונגבו את משטח העבודה, הכפפות והפיפטות עם תמיסה לדה-קונטמינציה של RNase. כדי לשפר את התנובה והאיכות, בצעו הליך זה בסביבת מנדף סטרילית.
  2. הפשיתו והרכיבו את רכיבי ערכה לטרנסקריפציה במבחנה (IVT) מבוססת T7 בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: חלק מהיצרנים ממליצים על שימוש ב-dithiothreitol (DTT, 0.1 M) כדי להגביל את חמצון התגובה ולשפר את היעילות. שלב זה מומלץ כאשר הוא תואם לערכה. במידה ומשתמשים ב-dNTPs שעברו מודיפיקציה, החליפו את הנוקלאוטיד המקביל ללא המודיפיקציה בכמות שווה של הנוקלאוטיד המומודפיקאי. העריכו את התנובה מחצי תגובה, שכן לא נצפתה תנובה משמעותית יותר בתגובה מלאה. כאשר מסנתזים יותר מ-mRNA אחד, מומלץ להכין master mix כדי להפחית טעויות פיפטור ושונות.
  3. בצעו פיפטור וערבוב קצר ויסודי, ולאחר מכן דגרו ב-37 °C למשך 5 h עם מכסה מחומם למניעת עיבוי. ניתן להאריך את הדגירה ללילה אם יש בכך צורך, שכן לדבר זה השפעה מינימלית על תנובת ה-mRNA או על שלמותו.
  4. הוסיפו 1 µL של DNase I ובצעו פיפטור יסודי. דגרו ב-37 °C למשך 30 min.
  5. טיהור של RNA שטרנסקריב ב-in vitro (IVT)
    1. נקו את תגובת ה-IVT באמצעות ערכת RNA Cleanup מבוססת עמודה בהתאם להוראות היצרן (ערכות שונות עשויות להוביל לרמות שונות של התאוששות ובעלות קיבולי קישור משתנים). לצורך אלוציה, הוסיפו 60 µL של מים נקיים מנוקלאז (nuclease-free water) ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 5 min לפני הצנטריפוגה.
    2. לחלופין, השתמשו בהשקעה באמצעות ליתיום כלוריד כגישה זולה וגמישה יותר.
      1. הוסיפו נפח שווה של ליתיום כלוריד 7.5 M לתגובה, ערבבו ודגרו ב-20 °C- למשך לילה.
      2. צנטריפוגו ב-18,300 × g למשך 20 min ב-4 °C, ולאחר מכן הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע ה-RNA.
      3. שטפו עם 950 µL של ethanol 70% וצנטריפוגו ב-18,300 × g למשך 5 min ב-4 °C. הסירו את הנוזל העליון, הניחו למשקע להתייבש למשך כ-5 min בטמפרטורת החדר, והמיסו מחדש במים נקיים מנוקלאז (60 µL הוא הנפח הסטנדרטי; הפחיתו את הנפח בהתאם לגודל המשקע כדי להעלות את הריכוז).
        זהירות: ליתיום כלוריד עלול לגרום לגירוי בעור או בעיניים אם לא נעשה שימוש בציוד מגן אישי (PPE) מתאים. הרכיבו כפפות והגנה על העיניים בעת הטיפול. כמו כן, ethanol הוא נוזל דליק מאוד ועלול לגרום לגירוי בעיניים. הרחיקו מאש גלויה והשתמשו בציוד מגן אישי מתאים, כולל הגנה על העיניים.
  6. כמתו את ה-mRNA באמצעות ספקטרופוטומטר. ודאו שיחס ה-A260/A280 עבור ה-mRNA הוא ~2.0, ואשרו שיחס ה-A260/A230 נע בין 1.8 ל-2.2.
  7. כדי לאשר IVT מוצלח, הכינו ג'ל אגרוז 1% TAE (לא דנטורנטי) המכיל Ethidium Bromide. ערבבו 500 ng של mRNA עם מים וצבע טעינה (loading dye), ופעלו לפי הוראות היצרן להכנת סולם RNA (RNA ladder) והוראות לדנטורציה. טענו את ג'ל האגרוז והריצו אותו ב-80 V למשך 40 min בבופר TAE. הדמיזו באמצעות מדמיין ג'לים (gel imager).
  8. לאישור נוסף של גודל ה-mRNA הנכון, הריצו את הדגימות ב-Bioanalyser.
  9. כדי למנוע הפשרה והקפאה חוזרות (freeze-thawing), חלקו את ה-mRNA לאליקוטים בנפח הנדרש לניסוי. לדוגמה, השתמשו ב-1.2 pmol של mRNA לכל באר בלוח של 96 בארות. לכן, חלקו לנפח המתאים עבור 1.2 pmol × n חזרות, ואז אחסנו ב-80 °C-.

3. טרנספקציה הפוכה של תאי HEK293

הערה: כדי להשיג מדידות זמניות, נדרש קו תאים המבטא באופן קבוע את מקטע הלוציפראז המשלים. ניתן להשיג זאת על ידי יצירת קו תאים יציב באמצעות טרנספקציה של פלסמיד המבטא את מקטע הלוציפראז הנדרש ובחירה קלוונלית לאחר מכן. דבר זה מאפשר למשתמש למדוד דינמיקה תרגומית של mRNA ברזולוצית זמנית בכל רקע תאי לבחירתו. לחלופין, ניתן לרכוש קווי תאים המבטאים את מקטע הלוציפראז הנדרש. ניסויים אלו בוצעו באמצעות תאי HEK293 המבטאים באופן קבוע את ההטרודימר המשלים.

  1. לפני התחלת העבודה, הפשירו את ה-mRNA על קרח כדי למנוע דגרדציה.
  2. הכינו קומפלקסים לטרנספקציה. עבור פלטה של 96 בארות, נדרשים 1.2 pmol של mRNA לכל בארה. אם העבודה מבוצעת בכפילויות, הכינו כמות המספיקה ל-2.5 כפילויות כדי לפצות על שגיאות פיפטינג. לכן, ערבבו 3 pmol של mRNA עם Opti-MEM Reduced Serum Medium לנפח סופי של 50 µL (20 µL לבארה).
  3. הוסיפו 0.5 µL של ריאגנט טרנספקציה מבוסס ליפידים קטיוניים (0.2 µL לבארה), ערבבו על ידי פיפטינג מעלה ומטה, והדגירו בטמפרטורת החדר. לאחר דגירה של 5 דקות, ערבבו שוב על ידי פיפטינג מעלה ומטה, ולאחר מכן הוסיפו 20 µL לבארה למיקרופלטה לבנה בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות. מומלץ למקם את בארות הטרנספקציה במרכז הפלטה ולהשאיר את בארות השוליים ריקות.
  4. הכינו תאי HEK293 על ידי הסרת המדיום ושטיפה עם 2 mL של phosphate-buffered saline (PBS) ללא Ca2+ ו-Mg2+. הסירו את השטיפה והוסיפו 500 µL של Trypsin-EDTA, ולאחר מכן הדגירו ב-37 °C למשך 3 דקות.
  5. במהלך דיסוציאציית התאים, מלאו את בארות השוליים של פלטת 96 הבארות ב-PBS כדי להפחית התאיידות של המדיום במהלך תרבית התאים. אם נדרש להשתמש בכל הבארות, ניתן למלא את הרווחים שבין הבארות ב-PBS.
  6. הוסיפו 4.5 mL של Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) מועשר ב-1× L-glutamine וב-10% fetal bovine serum (FBS) לאיסוף התאים. בצעו ספירת תאים באמצעות המוציטומטר או סופר תאים אוטומטי.
  7. העבירו את כמות התאים הנדרשת (כמות המספיקה לזריעה של 1 x 105 תאים לבארה) בתוספת 3 בארות נוספות (לפיצוי על שגיאות פיפטינג) למבחנה נקייה וסבבו בצנטריפוגה ב-500 × g למשך 2 דקות.
  8. הסירו את העלייה ותלו את התאים שוב בנפח הנדרש של מדיום Leibovitz’s L-15 (ללא פנול) מועשר ב-10% FBS וב-Endurazine Live Cell Substrate (ביחס של 1:200) כדי להבטיח ריכוז סופי של 1 × 106 תאים/mL. ערבבו באמצעות פיפטה סרולוגית כדי להבטיח ערבוב יסודי של ה-Endurazine. העבירו בפיפטה 100 µL (1 × 105 תאים) של התאים התלוים לכל בארה.
    הערה: אם מבצעים ניסויי סדרת זמנים הנמשכים 72 שעות, הגדילו את הנפח ל-200 µL כדי למנוע התאיידות.
  9. מיד לאחר הטרנספקציה, הניחו את התאים בקורא פלטות (לומינומטר) המכוון ל-37 °C. בצעו מדידות במרווחי זמן קבועים עם זמן אינטגרציה של 1 s. בשל יעילות הקומפלימנטציה של המערכת, האות ניתן לזיהוי תוך דקות ספורות. לכן, כדי לקבל קריאת בסיס מדויקת, יש לבצע שלב זה במהירות. מרווחי זמן אלו תלויים בניסוי ובמכשיר; עם זאת, בניסויים אלו נמצא כי אופטימלי לבצע מדידה כל 12 דקות עבור ניסויי סדרת זמנים של 18 שעות, וכל 48 דקות עבור ניסויי 72 שעות. מדידת לומינסנציה אינה דורשת פילטר; יחס אות לרעש טוב יותר נצפה בעת שימוש בפילטר של 530–540 nm.
    הערה: אות Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) נוצר מ-eGFP המסומן ב-split-luciferase, לכן פילטר ב-530–540 nm יקלוט הן אות לומינסנציה והן אות פלואורסנציה. כדי למנוע קליטה של BRET, השתמשו בפילטר של 460–480 nm או לחלופין, השתמשו בחלבון שאינו פלואורסצנטי כגון MYL3 כנקודת ייחוס.

4. ניתוח נתונים

  1. חשבו את שינויי הקיפול (fold changes) ביחידות לומינסנציה יחסיות (RLUs), על ידי נרמול האות של כל תנאי לנקודת הזמן הראשונה שלו (t0, מנורמל לממוצע של החזרות הטכניות), כיוון שהאות בתחילת הבדיקה מהווה את רמת הרקע.
  2. הפחיתו את השונות בין החזרות הביולוגיות על ידי נרמול לתנאי בקרה.
  3. בחרו את הניתוח הסטטיסטי עבור הבדיקה, בין אם עבור נקודת זמן בודדת או עבור השטח תחת העקומה (AUC)—בהתאם לשאלה הנחקרת.
    1. עבור נקודת זמן בודדת, השתמשו בנקודות הזמן שבהן מתרחש ביטוי השיא (התלוי ב-POI) יחד עם נקודת הזמן הסופית. שרטטו את ה-RLU שחושב בשלב 4.1 בנקודת הזמן הספציפית (למשל, 240 min) ונתחו אותו באמצעות מבחן סטטיסטי מתאים.
    2. מדדו את הדינמיקה של תרגום ופירוק חלבונים על ידי חישוב ה-AUC עבור מסגרת זמן ספציפית (כלומר, מ-t0 עד 240 min) או לאורך כל הבדיקה (כלומר, מ-t0 עד לנקודה הסופית). נרמלו את ערך ה-AUC עבור כל חזרה ביולוגית לממוצע של mRNA הייחוס, ובכך השגיחו מדד של שינוי קיפול ב-AUC שניתן לניתוח באמצעות מבחנים סטטיסטיים מתאימים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קיימות מספר דרכים שבהן ניתן למקסם את יעילות העלות של פרוטוקול זה. לדוגמה, תגובת ה-IVT הוקטנה למחצית מהנפח המומלץ על ידי היצרן, ונמצא כי התוצר שהתקבל סיפק את הכמות הנדרשת לניסויי in cellulo. יש לציין כי אורך הרצף ומורכבותו משפיעים על תוצרי ה-IVT, ולכן אופטימיזציה מוצלחת של הפרוטוקול צריכה להניב לפחות 50 µg של mRNA לכל תגובת IVT. בדומה לערכות תגובת IVT, גם ריאגנטים לכapping (הוספת כיפה) הם לרוב יקרים מאוד. בהתחשב בכך שדרוש רק cap אחד לכל מולקולת mRNA, אנו משערים כי תגובת ה-IVT מכילה עודף של מולקולות cap ביחס למספר מולקולות ה-mRNA המתקבלות. לפיכך, נבדק האם ניתן לייעל את הפרוטוקול עוד יותר על ידי תיחור (titrating) של כמות ריאגנט ה-capping המתווסף לתגובת ה-IVT, והתוצאות מוצגות ב-איור 2. 100% (10 mM cap סופי), 50%, 25% או 0% (ללא cap) מריאגנט ה-capping הוספו לתגובות IVT בנפח של 10 µL, ו-eGFP mRNA שהתקבל הותמר לתאי HEK293 המבטאים באופן קבוע את ההטרודימר המשלים. כביקרת נרמול, הותמר גם MYL3 (עם 100% capping), שכן גן אנדוגני זה, המקודד לחלבון מבני המועשר בשרירים, מראה דינמיקת תרגום דומה לזו של eGFP, אך עם אות קרוב יותר לזה של גנים אנדוגניים אחרים3. בהתאם לנתונים קודמים3, eGFP mRNA ללא capping הוביל להיעדר תרגום בדומה לביקרת ה-mock (איור 2A). eGFP mRNA שסונתת עם 25% או 50% מריאגנט ה-capping המומלץ הראה רמות ביטוי דומות לאלו של 100% (איור 2A), מה שהוביל להיעדר הבדלים בערכי השטח תחת העקומה (AUC) לאורך מסלול זמן של 18 שעות (איור 2B). תוצאות אלו מעידות כי, תחת תנאים אלו, ריאגנט ה-capping נמצא בעודף וכי הפחתת ריכוזו אינה פוגעת בתוצר התרגומי, דבר התואם שילוב מספיק של cap. הממצאים המוצגים ב-איור 2 ספציפיים למותג ריאגנט ה-capping שנעשה בו שימוש, ויש לבצע אופטימיזציה עבור ריאגנטים שונים.

בעוד שההתקדמות בטכנולוגיית ה-cap ושילוב של נוקלאוטידים שעברו שינוי שיפרו את ביטוי ה-mRNA, פיתוחם של אלגוריתמים לעיצוב mRNA שיפר את הביטוי עוד יותר. אלגוריתמים אלו מתמקדים באופטימיזציה של יציבות ה-mRNA ושימוש בקודונים על ידי שיפור האנרגיה החופשית המינימלית (MFE) ומדד ההסתגלות של הקודונים (CAI), בהתאמה. כדי לבחון את השפעת האופטימיזציה על ביטוי mRNA, נעשה שימוש ב-LinearDesign9. אלגוריתם זה מתבסס על הזנת ערך lambda, שהוא פרמטר קביעה המשמש בנוסחאות אופטימיזציה וקובע עד כמה האלגוריתם מעדיף MFE או CAI. אותן הגדרות אופטימיזציה הוחלו (כלומר, אותו ערך lambda) על ארבעה גורמי שחלוף – HAND2, GATA4, MEF2C ו-TBX5. איור 3 בוחן את השפעות האופטימיזציה על שיעורי התרגום. האופטימיזציה שיפרה את הערכים הן עבור MFE והן עבור CAI בכל גורמי השחלוף, כאשר MEF2C הראה את השינויים הגדולים ביותר בשני הפרמטרים (איור 3A). תג לומניסנציה מפוצל חובב לקצה ה-C של כל מבנה, כשקדמה לו מקשר GS, ו-mRNA סונתז עבור כל ארבעת גורמי השחלוף עבור התצורות הבלתי-אופטימליות והאופטימליות כאחד. כדי להבטיח שכל mRNA ניתן לתרגום ויכול להפיק חלבון במשקל המולקולרי הצפוי, נעשה שימוש במערכת תרגום ללא תאים המבוססת על ליסאט רטיקולוציטים של ארנב3. החלבונים שהתקבלו הופרדו ב-western blot באמצעות תת-היחידה האנזימטית של חלבון הלוסיפראז המפוצל ומצע מתאים לזיהוי התג הלומניסנציה המפוצל. ה-Western blotting הראה כי האופטימיזציה עדיין הפיקה חלבונים התואמים למשקל המולקולרי הצפוי שלהם (איור 3B). תאי HEK293 עברו טרנספקציה עם התצורות הבלתי-אופטימליות או האופטימליות של כל גורם שחלוף, ונלקחו הקלטות של תאים חיים למשך 18 h. עבור כל ניסויי ה-18 h, נלקחו מדידות משלוש חזרות ביולוגיות, ושלוש חזרות טכניות לדגימה נעשה בהן שימוש בכל ניסוי חוזר. לאופטימיזציה של HAND2 (איור 3C) ו-GATA4 (איור 3D) לא הייתה השפעה על הביטוי (כפי שנקבע במבחן t לשני מדגמים בלתי זוגיים), עם עלייה של 1.07-fold וירידה של 1.25-fold, בהתאמה, בהשוואה למקביליהם הבלתי-אופטימליים. בינתיים, אופטימיזציה של MEF2C (איור 3E) ו-TBX5 (איור 3F) הובילה לעלייה מובהקת סטטיסטית בביטוי, עם עלייה של 2.25 (P = 0.0486, n = 3, מבחן t לשני מדגמים בלתי זוגיים) ו-1.72-fold (P = 0.0379, n = 3, מבחן t לשני מדגמים בלתי זוגיים) ב-AUC לעומת הגרסאות הבלתי-אופטימליות שלהם. בדומה לכך, הבדלים נצפו לא רק בביטוי בנקודת הסוף אלא גם בצורה ובקצב של עקומות הביטוי, מה שמעיד על כך שהבדיקה מזהה שינויים בדינמיקה של התרגום לאורך זמן. כדי לקבוע האם עלייה זו בביטוי נשמרת לאורך תקופה ארוכה יותר, תאי HEK293 עברו טרנספקציה עם mRNA של MEF2C, והקלטות נלקחו למשך 72 h (איור 3G). בדומה לניסויי ה-18 h, נלקחו מדידות משלוש חזרות ביולוגיות, ושלוש חזרות טכניות לדגימה נעשה בהן שימוש בכל ניסוי חוזר. באופן דומה למה שנצפה לאחר 18 h, MEF2C אופטימלי הגביר משמעותית את הביטוי עם שיפור של 2.5-fold (P = 0.0061, n = 3, מבחן t לשני מדגמים בלתי זוגיים) ב-AUC בהשוואה לגרסה הבלתי-אופטימלית. למרות שישנה עלייה משמעותית בביטוי עם אופטימיזציה, תוצאות אלו מוכיחות כי אופטימיזציה אינה מונעת, במקרה זה, דעיכה לאורך 72 h, כאשר שתי תצורות ה-MEF2C הראו שיפועים דומים החל מ-24 h והלאה. דעיכה זו נובעת ככל הנראה מפירוק ליניארי של mRNA ו/או מחלוקת תאים. יחד, תוצאות אלו מדגימות את הפוטנציאל של אלגוריתמים לעיצוב mRNA לשיפור ביטוי mRNA; עם זאת, הן מדגישות כי יש לבצע אופטימיזציה באופן התלוי ב-POI.

figure-results-1
איור 1: זרימת עבודה עבור סינתזת mRNA ובדיקת תג לומנסנטי מפוצל בתאי HEK293. לצורך ביצוע IVT עבור בדיקת התג הלומנסנטי המפוצל, יש לוודא שהפלסמיד מכיל מקדם של RNA polymerase (T7 או SP6), אזורי UTR 5' ו-3', ורצפי קידוד עבור החלבון המבוקש המחובר לתת-יחידת לוסיפראז קצרה HB (HiBiT). הפלסמיד מולינארי באמצעות אנזים הגבלה בעל אתר חיתוך יחיד, ובכך מספק את התבנית עבור Poly T PCR, המשמשת לאחר מכן כתבנית ל-IVT. ה-mRNA מסנתז, מקישור לליפוזומים, ומוחדר בתרגום הפוך לתאי HEK293 המבטאים באופן קבוע את תת-יחידת הלוסיפראז הגדולה יותר (LB), שניתן להניחם מיד בתוך קורא לוחות למדידת הקלטות של תאים חיים. לאחר השלמת הניסוי, מבוצע ניתוח נתונים לצורך נרמול וניתוח סטטיסטי לאחר מכן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הפחתה של פי ארבעה בריכוז של סוכן ה-capping מניבה ביטוי של eGFP דומה לזה המתקבל בריכוז מלא. (A) בדיקה קינטית של תאים חיים בתאי HEK293 שעברו טרנספקציה של mRNA של eGFP עם ריכוזים שונים של סוכן capping, MYL3, או Mock, נתונים מנורמלים ל-t0; הנקודות מייצגות את הממוצע של לפחות שלושה שיכbolים ביולוגיים לכל נקודת זמן. (B) שינוי במכפלה (Fold change) של AUC של עקומות עבור מהלך זמן של 18 שעות של לפחות שלושה שיכbolים ביולוגיים, שהתקבל על ידי נרמול לדגימת הייחוס MYL3 והושווה באמצעות one-way ANOVA עם מבחן השוואות מרובות של Tukey. הנתונים מוצגים כממוצע ± טעות תקנית של הממוצע (SEM), כאשר כל נקודה מייצגת ממוצע של שיכbol ביולוגי אחד. ***P < 0.001. (eGFP – enhanced green fluorescent protein; AUC – שטח תחת העקומה; RLU – יחידות לומינסנציה יחסיות) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: אופטימיזציה של הרצף משפרת את תרגום ה-mRNA באופן התלוי ב-POI. (A) אופטימיזציה של רצף ה-mRNA באמצעות LinearDesign הובילה להפחתה בערכי האנרגיה החופשית המינימלית (MFE) ולעלייה במדד ההסתגלות של הקודונים (CAI), בהתאמה, עבור כל גורם שחירה. (B) תגובות RRL בוצעו למשך 120 min עם mRNA המקודד עבור HAND2, GATA4, MEF2C, TBX5 שאינם אופטימליים או אופטימליים, או ללא RNA. החלבונים שהתקבלו עובדו עבור western blotting וזוהו באמצעות כימילומניסנציה על ידי דגירה של הממברנה עם תת-היחידה האנזימטית במערכת הלוסיפראז המפוצלת (split luciferase system) ותסבסב מתאים. בדיקה קינטית של תאים חיים בתאי HEK293 שטרנספקטו עם HAND2 (C), GATA4 (D), MEF2C (E), או TBX5 (F) שאינם אופטימליים או אופטימליים, יחד עם MYL3 ו-Mock. הנתונים נורמלו ל-t0, והנקודות מייצגות את הממוצע של שלושה שיכפולים ביולוגיים לנקודת זמן. שינוי הקיפול (Fold change) ב-AUC של העקומות עבור מהלך זמן של 18 h של שלושה שיכפולים ביולוגיים התקבל על ידי נרמול לדגימת הייחוס MYL3 והושווה באמצעות unpaired t-test עם תיקון של Welch. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM, כאשר כל נקודה מייצגת את הממוצע של שיכפול ביולוגי אחד. *P < 0.05. (G) בדיקה קינטית של תאים חיים בתאי HEK293 שטרנספקטו עם MEF2C שאינו אופטימלי או אופטימלי, MYL3 ונתוני Mock נורמלו ל-t0, נקודות מייצגות את הממוצע של שלושה שיכפולים ביולוגיים לנקודת זמן. שינוי הקיפול ב-AUC של העקומות עבור מהלך זמן של 72 h של שלושה שיכפולים ביולוגיים התקבל על ידי נרמול לדגימת הייחוס MYL3 והושווה באמצעות unpaired t-test עם תיקון של Welch. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM כאשר כל נקודה מייצגת את הממוצע של שיכפול ביולוגי אחד. **P < 0.01. (MFE – אנרגיה חופשית מינימלית; CAI – מדד הסתגלות קודונים; RRL – ליזאט רטיקולוציטים של ארנב; AUC – שטח תחת העקומה, RLU – יחידות לומינסנס יחסיות) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תחום הטיפולים ב-mRNA התרחב במהירות בשנים האחרונות, דבר המדגיש את חשיבותם של עיצוב ואופטימיזציה של הרצף כשלב קריטי בתהליך הפיתוח. מאמצים משמעותיים הופנו לבניית כלים חישוביים לניבוי מבני והרכבי ה-RNA היעילים ביותר, כאשר אופטימיזציית רצפים קיבלה תשומת לב מיוחדת8,9. למרות שכלים אלו הם עוצמתיים, תיקוף ניסיוני של עיצובים אלו הוא עדיין חלק חיוני בתהליך. עם זאת, תיקוף זה התבסס במידה רבה על חלבוני דגינה (reporter proteins), כולל GFP7, NanoLuc8 וחלבון ה-spike של SARS-CoV-29 שהם כבר חלבונים יציבים ביותר בעלי יכולת תרגום גבוהה. כדי להתגבר על מגבלה זו, מערכת לוציפראז מפוצלת (split luciferase system) שולבה בתהליך לבחינת דינמיקת התרגום של mRNA שעבר שעתוק in vitro בתאי HEK293, מה שאיפשר רזולוציה זמנית3, והדגים את המגבלות שבשימוש בחלבוני דגינה לזיהוי שינויים בתרגום בעקבות הנדסת mRNA. המאמר של שיטה זו מדגים את השלבים הנדרשים לביצוע בדיקה זו, ממחיש כי ניתן למזער את תגובת ה-IVT, ולהפחית את ריכוז ה-5’ cap ללא השלכות על התרגום, ובכך להפחית עלויות. בהתבסס על תצפיותינו הקודמות, אנו מדגישים כי נדרשת גישה התלויה ב-POI לאופטימיזציית רצף mRNA כדי להשיג ביטוי מוגבר.

כפי שמתואר כאן, בדיקת תגית הלומינסנציה המפוצלת (split luminescent tag assay) היא תהליך פשוט יחסית המאפשר מדידה של תרגום mRNA בבסביבת תפוקה בינונית, ובכך מאפשר למשתמשים לחקור את הביטוי הזמני של חלבון העניין (POI) שלהם בזמן אמת. עם זאת, קיימים מספר שלבים ושיקולים קריטיים הנדרשים להשגת תוצאות עקביות. ראשית, כל התוצאות הבאות תלויות באיכות ה-mRNA, אשר מתחילה בתהליך ה-IVT ובחיטוי הציוד המשמש לכך. לאחר הסינתזה, אחסון ה-mRNA הוא מרכזי, כאשר הוא נשמר על קרח לאחר האלוציה, ואחרי אישור גודל ה-mRNA, הוא מחולק לאליקוטים של נפחי עבודה כדי למנוע הקפאה והפשרה חוזרת, וה-mRNA נשמר בטמפרטורה של -80°C. שנית, ללוחית ה-96 בארות המשמשת לבדיקה יש חשיבות עליונה ויש לשמור על עקביות בבחירתה בין ניסויים. עבור פרוטוקול זה, יש לוודא שנעשה שימוש בלוחית 96 בארות לבנה לחלוטין. ניתן להשתמש בלוחיות בעלות תחתית שקופה ודפנות לבנות אם נדרש ניטור של מורפולוגיית התאים; אלו מניבות אות נמוך בהרבה, ולכן לא ניתן להשתמש בשני סוגי הלוחיות באופן חלופי. נצפה כי בעת מדידת תרגום של אותם mRNA בלוחית בעלת תחתית שקופה ודפנות לבנות, אות הלומינסנציה שהתקבל היה נמוך פי 5 מזה של לוחית מקבילה בעלת דפנות לבנות לחלוטין. הערה טכנית זו עשויה להיות משמעותית בעת הערכת גנים עם דינמיקה תרגומית לא יעילה. מעבר להחדרת חוסר עקביות לנתונים, הירידה באות עלולה למנוע זיהוי של הבדלים עדינים הנגרמים על ידי רצף ה-mRNA או שינויים מבניים. שלישית, השימוש במצע L-15 הוא מרכזי לבדיקה זו שכן הוא מאפשר חיוניות של תאים בסביבה ללא תוספת CO225, דבר המעניק גמישות לגבי הלומינומטר שבו משתמשים. בנוסף, שימוש ב-L-15 נטול פנול מפחית את אות הרקע בעת מדידת הלומינסנציה. לבסוף, יש לבצע את תרבית התאים ומדידת הלומינסנציה ב-37°C (או בתנאי התרבית של סוג התא הרלוונטי). ביצוע ניסוי זה בטמפרטורת החדר ישנה את התוצאות באופן משמעותי, שכן קצב הארכת התרגום יפחת26, מה שאומר שקינטיקה רגילה לא תצפה.

את הרב-גוניות של תכנון mRNA המגולש in vitro ניתן להעביר לתהליך הסינתזה, המאפשר שינויים רבים. כפי שנצפה, ניתן להפחית את ריכוז ה-5’ cap פי 4, ועדיין להשיג ביטוי דומה, מה שמאפשר לחוקרים להפחית עלויות. למרות שיעילות ה-capping לא נמדדה ישירות לאחר ה-IVT, שיעול גובר של mRNA ללא cap בתוך מאגר ה-IVT היה מוביל לירידה באות, כפי שהודגם על ידי mRNA ללא cap; דבר זה לא נצפה. בנוסף, בהתחשב בכך ש-eGFP הוא חלבון קטן יחסית במשקל של 27 kDa בלבד, ויסות זה של ריכוז ה-cap אמור להתרגם בקלות לגנים גדולים יותר, שכן יהיו פחות תמלילים להוספת cap לאחר ה-IVT. קיימים אנלוגים למבנה ה-cap בעלי מודיפיקציות מתילציה שונות, המשפיעות על האימונוגניות3 ועל ביטוי החלבון27. בנוסף, ניתן לבצע את תהליך ה-capping באופן קו-טרנסקריפציונלי (כפי שהודגם כאן) או באופן פוסט-טרנסקריפציונלי באמצעות נגיף Vaccinia, מה שמוביל ליעילות capping של 100%28 אך דורש שלבי טיהור נוספים. לייצור mRNA בקנה מידה מעבדתי, נהוג להשתמש בעמודי טיהור כיוון שהם מהירים ויעילים, אך יקרים. גישה זולה ורב-גונית יותר היא שיקוע באמצעות ליתיום כלוריד, אשר למרות שהיא גוזלת זמן רב יותר, מאפשרת למשתמש לרכז את ה-mRNA ואינה מגבילה את התפוקה לקיבולת הקישור של העמוד; לכן, היא מתאימה להרחבת קנה המידה (scale-up). בדומה לעמודי הטיהור, גישה זו אינה מסירה לחלוטין RNA דו-גדילי ומקטעי RNA קטועים, הגורמים לאימונוגניות29. בדומה ל-5’ cap, ניתן להשיג שילוב של זנב poly(A) בדרכים חלופיות לאלו שתוארו כאן. בדומה להחדרת הזנב באמצעות PCR, ניתן להנדס DNA פלסמי כך שיכיל זנב poly(A); עם זאת, מקטעים ארוכים אלו עלולים לעבור רקומבינציה, מה שמוביל לרצפי poly(A) הטרוגניים ומקוצרים. עם זאת, סגמנטציה של poly(A) – הכנסת מפרידי הטרו-נוקלאוטידים – צמצמה את השפעות אלו30,31. לחלופין, ניתן לייצר את זנב ה-poly(A) באמצעות poly(A) polymerase שאינו תלוי תבנית, מה שמאפשר יצירת זנבות poly(A) ארוכים יותר32 אך על חשבון סיכון להטרוגניות המשפיעה על דרישות רגולטוריות33.

בעוד שבדיקת התג הלומנסנטי המפוצל המתוארת יעילה ביותר במדידת ביטוי חלבוני של mRNA שהחדר חיצונית, ישנן מספר מגבלות שיש לקחת בחשבון בהתאם לשאלת המחקר. ראשית, קיים צורך ביצירת קו תאים המבטא באופן קוסטטיטיבי מחצית אחת של הלוציפראז המפוצל. למרות שניתן לרכוש קו כזה מוכן, כעת הוא מוגבל לתאי HEK293 בלבד. אם יצירת קו יציב בסוג התאים המבוקש היא מאתגרת, קיימת בדיקה ליטית שמצאנו כי מדגימה את אותה תוצאה בין תאי HEK293, תאי גזע עובריים אנושיים ותאי קרדיומיוציטים מובהלים3. עם זאת, נקודת הזמן שנבחרה עבור הבדיקה הליטית במחקר זה שפורסם בעבר3 הונחתה על ידי נתוני תאים חיים של HEK293. שנית, הבדיקה מספקת רזולוציה זמנית בתאים חיים אך אינה מסוגלת להציע רזולוציה מרחבית בתאים חיים, דבר שעשוי לעניין חוקרים מסוימים. עם זאת, קיים נוגדן ראשוני הזמין ופועל היטב עבור אימונוציטוכימיה פלואורסצנטית נגד תג הפפטיד הקצר של הלוציפראז המשמש בניסויים אלו, מה שמאפשר בחינה מרחבית של ה-POI המתורגם. בנוסף, מיקרוסקופ המסוגל לבצע דימות לומנסנטי עשוי לספק נתוני רזולוציה של תא בודד. גישה המציעה מידע ספציו-טמפורלית היא SunTag, המודדת תרגום פעיל ומיקום באמצעות דימות תאים חיים דרך אינטראקציות בין scFv מתויג ב-GFP הנקשר לאפיטופים פפטידיים14,34. עם זאת, נדרשים 24 חזרות טנדם של אפיטופים אלה, ובכך עלולה להיגרם עיוות בתרגום, בעוד שזרימת העבודה היא בעלת תפוקה נמוכה יחסית. שלישית, התג הלומנסנטי המפוצל מאפשר מדידה של שפע mRNA, אך לא בתאים חיים. בעבודתנו הקודמת3, בוצע qRT-PCR על RNA שהופק באמצעות פריימרים ספציפיים לטרנסקריפט שהחדר חיצונית, מה שאישש את רמות ה-mRNA עבור יעילות הטרנספקציה בין קונסטרוקטים ודעיכה בין נקודות זמן. גישה אחרת ראתה שימוש ב-Northern blotting למדידת יציבות mRNA35. עם זאת, שתי הגישות הן עתירות עבודה ואינן מסוגלות לספק מדידות רציפות. נכון להיום, לא קיימת שיטה המאפשרת מדידות סימולטניות של תרגום ושפע mRNA בתאים חיים, מה שמהווה נתיב פוטנציאלי לקידום פיתוח בדיקות בתחום זה.

מערכת הלוקיפראז המפוצלת יושמה בתחילה כדי לחקור דינמיקה של חלבונים, אך ניכר כאן כי לבדיקה זו השלכות משמעותיות בתחומי מחקר אחרים. עם הטיפולים ב-mRNA שנמצאים בחזית גישות חדשות לתרפיה גנית, בדיקה זו מתאימה באופן מושלם לאפשר לחוקרים לאפיין את הביטוי של התרפויטי הפוטנציאלי שלהם ולבצע לו אופטימיזציה לביטוי מוגבר. כפי שהוזכר קודם לכן, אופטימיזציה של קודונים הפכה לכלי חדש ועוצמתי בעיצוב mRNA עם פיתוחם של כלים מרובים8,9,36. כאשר גישה אחידה לאופטימיזציה של רצפים יושמה על ארבעה גורמי שעתוק, היא שיפרה הן את ה-MFE והן את ה-CAI עבור כל הגנים, אך רק MEF2C ו-TBX5 הראו ביטוי מוגבר. באופן בולט, על ידי מתן אפשרות לגילוי הבדלי ביטוי הנובעים אך ורק מווריאציות ברצף המקודד הסינונימי, גישה זו מספקת פלטפורמה ייחודית לבחינת יעילות התרגום בתאים חיים ברזולוציה זמנית גבוהה. ממצאים אלו מדגישים כי אופטימיזציה של רצפים חייבת להתחשב בתוכן ה-GC ההתחלתי, בשימוש בקודונים ובמבנה שניוני של RNA באופן התלוי ב-POI כדי להשיג ביטוי מוגבר. בעוד שייתכן שיהיה צורך לבחון קונסטרוקטים נוספים, לבדיקה של תג לומינסנציה מפוצל יש פוטנציאל לניתוח בסריקה רחבה (high-throughput) כדי לזהות את המועמד האופטימלי עבור ה-POI. בנוסף, כפי שהודגם בעבר3, בדיקה זו יכולה למדוד את ההשפעות של הפרעה בכל רכיב רצפי או מבני של mRNA, מה שמרחיב עוד יותר את יישומיה. מעבר לבחינת שינויים ב-mRNA, ניתן להשתמש בבדיקת התג הלומינסנטי המפוצל גם במחקרי הובלה ופורמולציה. גם עם שיפורים ב-5’ caps ושימוש בניוקלאוטידים שעברו מודיפיקציה, mRNA המועבר באופן אקסוגני דורש מערכת אריזה כדי למנוע פירוק ולאפשר ספיגה תאית37. בעוד שננו-חלקיקים ליפידיים38, שלפוחיות חוץ-תאיות39 וביומימטיקה40 נמצאים בחזית הובלת mRNA, עדיין נדרש פיתוח נוסף. אנקפסולציה של mRNA עם תג לומינסנציה מפוצל בכל אחד מהנשאים הללו תאפשר אפיון של יעילות ההובלה שלהם ותאפשר לחוקרים לבחון נשאי מודיפיקציה בגישה של סריקה בינונית עד גבוהה. מעבר למחקרים המתמקדים בתרגום, בדיקת התג הלומינסנטי המפוצל ניתנת לשימוש קל בביולוגיה בסיסית. בין אם מדובר בהערכת ההשפעות של הפרעות ברצפים ובאלמנטים מבניים על תרגום mRNA, הפרעה לתפקוד של מכונת התרגום, או בחינת הפרוטאוזום, מערכת התיוג הלומינסנטית המפוצלת מספקת אפשרות אטרקטיבית.

באופן כללי, מערכת תגי הלומינסנציה המפוצלת המתוארת כאן מציעה בדיקה גמישה וחזקה לניטור זמני של ביטוי חלבונים המונע על ידי mRNA סינתטי, כקריאה של דינמיקת התרגום. יישום של בדיקה בתאי חיים עוקף מגבלות רבות שהיו קיימות בעבר בתחום תרגום ה-mRNA, וחושף מידע מכריע על הדינמיקה של סינתזת חלבונים ופירוק של ה-POI. כיוון שתסכירים בעלי פרופילים רגולטוריים ופרופילי ביטוי שונים, חיוני לאפיין את ה-POI הטיפולי, דבר שיאפשר לטיפולים מבוססי mRNA להמשיך להתפתח ולעבור ליישום קליני.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עיניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים ללורה יצחקי על קו תאי ה-HEK293 LgBiT. עבודה זו נתמכה על ידי מענק פרויקט ופרס תרגומי של ה-British Heart Foundation (מספרי מענקים G114642 ו-G919651 עבור CHW) ומענק מחקר של GenScript Life Science Research (CAPB).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אצטית (Acetic Acid)Sigma-AldrichA6283מרכיב של באפר TAE
אגרוז (Agarose)Sigma-AldrichA9539אלקטרופורזה של ג'ל
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939Bביואנלייזר המשמש לבקרת איכות של mRNA
CLARIOstar Plus LuminometerBMG Labtech430-501S-Fקורא פלטות/לומינומטר המשמש למדידת לומינצנציה
CleanCap AGTrilink BiotechnologiesN-7113קאפ ' 5 המשמש ל-IVT
DMEM, high glucose, pyruvateThermo Fisher Scientific41966029מדיום המשמש לתרבית של תאי HEK293-LgBiT
DNase INew England BiolabsM0303מפרק את תבנית ה-DNA לאחר תגובת IVT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537לשטיפת תאים ולהוספה לפלטה למניעת התאיידות
EDTA, pH 8.0, RNase-freeThermo Fisher ScientificAM9260מרכיב של באפר TAE
אתידיום ברומיד (Ethidium Bromide)Sigma-AldrichE1510צבע לאלקטרופורזה של ג'ל
סרום עגל עוברי (FBS)Sigma-AldrichF7524תוסף המומס ל-DMEM
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BiolabsE2040ערכה לתעתוק חוץ תאי (IVT)
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol redThermo Fisher Scientific21083027מדיום המשמש לתרבית HEK293-LgBiT במהלך מדידות לומינצנציה
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030-024תוסף המומס ל-DMEM
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150ריאגנט טרנספקציה מבוסס ליפידים
Lithium Chloride Precipitation SolutionThermo Fisher ScientificAM9480גישה חלופית לטיהור mRNA לאחר IVT
Monarch Spin PCR & DNA Cleanup KitNew England BiolabsT1130ערכת טיהור לאחר לינאריזציה של פלסמיד
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-Wספקטרופוטומטר המשמש לכימות ריכוזי DNA ו-mRNA
Nano-Glo Endurazine Live Cell SubstratePromegaN2570סובסטרט נדרש ללומינצנציה המומס למדיום L-15 
NucleoSpin RNA Cleanup KitMacherey-Nagel12708612מטהר mRNA לאחר תגובת IVT
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom MicroplateThermo Fisher Scientific136101פלטה המשמשת לזריעת HEK293-LgBiT ולמדידות עוקבות
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985062מדיום המשמש לתגובת טרנספקציה
Phusion High-Fidelity PCR KitNew England BiolabsE0553ערכת PCR
RiboRuler High Range RNA LadderThermo Fisher Scientific11883993סולם RNA לאלקטרופורזה של ג'ל
RNaseZapThermo Fisher ScientificR2020ספריי לדקונטמינציה של RNase
TRIZMA BaseSigma-AldrichT6066מרכיב של באפר TAE
Trypsin-EDTA SolutionSigma-AldrichT4174ריאגנט לפירוק תאים
UltraPure DNase/RNase free Distilled WaterThermo Fisher Scientific10977035משמש להכנת תבנית ול-IVT

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA COVID-19 vaccine. N Engl J Med. 2020;383(27):2603-2615.
  2. Baden LR et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. N Engl J Med. 2021;384(5):403-416.
  3. Ascanelli C, Lawrence E, Batho CAP, Wilson CH. A flexible, high-throughput system for studying live mRNA translation with HiBiT technology. Nucleic Acids Res. 2025;53(11).
  4. Qin S et al. mRNA-based therapeutics: Powerful and versatile tools to combat diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):166.
  5. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
  6. Sample PJ et al. Human 5' UTR design and variant effect prediction from a massively parallel translation assay. Nat Biotechnol. 2019;37(7):803-809.
  7. Leppek K et al. Combinatorial optimization of mRNA structure, stability, and translation for RNA-based therapeutics. Nat Commun. 2022;13(1):1536.
  8. Vostrosablin N et al. mRNAid, an open-source platform for therapeutic mRNA design and optimization strategies. NAR Genom Bioinform. 2024;6(1):lqae028.
  9. Zhang H et al. Algorithm for optimized mRNA design improves stability and immunogenicity. Nature. 2023;621(7978):396-403.
  10. Chasse H, Boulben S, Costache V, Cormier P, Morales J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Res. 2017;45(3):e15.
  11. Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 2009;324(5924):218-223.
  12. Choe HK, Cho J. Comprehensive genome-wide approaches to activity-dependent translational control in neurons. Int J Mol Sci. 2020;21(5):1592.
  13. Cacioppo R, Lindon C. Immunoprecipitation of reporter nascent chains from active ribosomes to study translation efficiency. Bio Protoc. 2023;13(18):e4821.
  14. Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, Vale RD. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 2014;159(3):635-646.
  15. Pichon X et al. Visualization of single endogenous polysomes reveals the dynamics of translation in live human cells. J Cell Biol. 2016;214(6):769-781.
  16. Wu B, Eliscovich C, Yoon YJ, Singer RH. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 2016;352(6292):1430-1435.
  17. Dixon AS et al. Nanoluc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chem Biol. 2016;11(2):400-408.
  18. Schwinn MK et al. CRISPR-mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chem Biol. 2018;13(2):467-474.
  19. Wang T et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Res. 2013;41(9):4743-4754.
  20. Balleza E, Kim JM, Cluzel P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nat Methods. 2018;15(1):47-51.
  21. Koker T, Fernandez A, Pinaud F. Characterization of split fluorescent protein variants and quantitative analyses of their self-assembly process. Sci Rep. 2018;8(1):5344.
  22. Hoare BL, Kocan M, Bruell S, Scott DJ, Bathgate RAD. Using the novel HiBiT tag to label cell surface relaxin receptors for BRET proximity analysis. Pharmacol Res Perspect. 2019;7(4):e00513.
  23. Boursier ME et al. The luminescent HiBiT peptide enables selective quantitation of G protein-coupled receptor ligand engagement and internalization in living cells. J Biol Chem. 2020;295(15):5124-5135.
  24. Winter GE et al. Drug development: Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 2015;348(6241):1376-1381.
  25. Leibovitz A. The growth and maintenance of tissue-cell cultures in free gas exchange with the atmosphere. Am J Hyg. 1963;78:173-180.
  26. Farewell A, Neidhardt FC. Effect of temperature on in vivo protein synthetic capacity in Escherichia coli. J Bacteriol. 1998;180(17):4704-4710.
  27. Mandell ZF et al. CleanCap M6 inhibits decapping of exogenously delivered IVT mRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 2025;36(1):102456.
  28. Ensinger MJ, Martin SA, Paoletti E, Moss B. Modification of the 5'-terminus of mRNA by soluble guanylyl and methyl transferases from vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1975;72(7):2525-2529.
  29. Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin CT. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive, and diverse in character RNA-seq analyses. Nucleic Acids Res. 2018;46(18):9253-9263.
  30. Trepotec Z, Geiger J, Plank C, Aneja MK, Rudolph C. Segmented poly(A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half-life. RNA. 2019;25(4):507-518.
  31. Spiewla T et al. Poly(A) tail segmentation improves the stability of the template DNA and increases the translatability of &lt;em&gt;in vitro.&lt;/em&gt; transcribed mRNA. bioRxiv. 2025:2025.10.21.683660.
  32. Martin G, Keller W. Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 1998;4(2):226-230.
  33. Weissman D. mRNA transcript therapy. Expert Rev Vaccines. 2015;14(2):265-281.
  34. Mateju D et al. Single-molecule imaging reveals translation of mRNAs localized to stress granules. Cell. 2020;183(7):1801-1812.e1813.
  35. Schwaller N, Karousis ED. Protocol for monitoring mRNA translation and degradation in human cell-free lysates. STAR Protoc. 2025;6(3):104073.
  36. Li Y et al. Deep generative optimization of mRNA codon sequences for enhanced mRNA translation and therapeutic efficacy. Nat Commun. 2025;16(1):9957.
  37. Pardi N et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. J Control Release. 2015;217:345-351.
  38. Hou X, Zaks T, Langer R, Dong Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 2021;6(12):1078-1094.
  39. Kalluri R, LeBleu VS. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 2020;367(6478).
  40. Yin M et al. Delivery of mRNA using biomimetic vectors: Progress and challenges. Small. 2024;20(43):e2402715.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

mRNAIn Vitro5mRNA

מאמרים קשורים