הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תרגום mRNA ללא תאים במבחנה בליזטים של דרוזופילה

377 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70844

⸱

12 ביוני 2026

 ,  ,  ,  , 
1mRNA and Cancer Laboratory, Subdirección de Investigación Básica, Instituto Nacional de Cancerología (INCan; National Institute of Cancer), 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnologico de Monterrey, 3Escuela de Ingeniería y Ciencias, Tecnologico de Monterrey

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מספקים פרטים כיצד להכין ליזטים ולבצע תרגום חוץ גופי באמצעות עוברי דרוזופילה .

תקציר

תרגום mRNA ללא תאים במבחנה שיחק תפקיד מרכזי בהבנת תהליך סינתזת החלבונים במהלך ביטוי גנים באיוקריוטים. פיתוח הליזטים ממערכות שונות לתרגום חוץ גופי היה גורם מרכזי בחקר תפקידי רוב מרכיבי מנגנון התרגום ובניתוח שלבים רבים בתהליך סינתזת החלבונים. היבטים שונים של תרגום ושליטה תרגומית נחקרו באמצעות Drosophila melanogaster lysates. מאמר זה מספק פרוטוקולים מפורטים להכנת תבניות mRNA סינתטיות, גידול תרביות זבובים חיים בקנה מידה גדול, הכנת ליזטים בעלי יכולת תרגום מעוברי דרוזופילה, וביצוע תגובות תרגום חוץ-גופיות ללא תאים. פרוטוקול זה מתאים לכל מין בסוג Drosophila — מלנגסטר, ויריליס, פסאודוסקורה, גרימשווי, הידאי ועוד. אנו משווים את הפרוטוקול הזה למערכות תרגום אחרות ודנים במגבלות, צעדים קריטיים ופתרון תקלות. תוצאות מייצגות נכללות כדי לסייע בהערכת ביצועי הפרוטוקול ויכולת השחזור. לבסוף, נדון ביישומים פוטנציאליים בביוטכנולוגיה ובמחקר.

מבוא

למעלה ממאה שנה, דרוזופילה הוכיחה את עצמה כאורגניזם מודל חזק וגנטי ללימוד תופעות ומולקולות ביולוגיות רבות, כולל בקרה תרגומית ומנגנון התרגום 1,2,3,4. תרגום חוץ גופני ללא תאים של דרוזופילה הפך לכלי עוצמתי לחקר סינתזת חלבונים, משום שהוא מסוגל לשחזר אירועים רבים שנצפו בחיים החיים. לכן, דרוזופילה היא מערכת אידיאלית לגילוי פונקציות ומולקולות חדשות המבצעים תרגום ושליטה תרגומית. מחקרים מוקדמים קבעו מערכת במבחנה, בעלת יכולת תרגומית, בפרקי-רגליים הקשור לזבובים Artemia salina5 ובהמשך ב-Drosophila hydei6.

מאוחר יותר, ליזטים המגיבים ל-mRNA חיצוניים פותחו ב-Drosophila melanogaster. רוב המחקרים על תרגום בחוץ-גופית של דרוזופילה בוצעו בעוברים בגילאים שונים, אם כי כמה וריאציות של בופר תגובת התרגום שימשו על ידי קבוצות מחקר שונות. להשוואה, התופעות השונות שנחקרו ותנאי תגובת התרגום מפורטים בטבלה 1. מלבד עוברים, פותחו גם פרוטוקולים לתרגום חוץ גופני ללא תאים באמצעות ביציות דרוזופילה 10,22,23,24,25,26 וליזטים של תאי שניידר או Kc מתורבתים 17,27,28,29,30,31,32. תיאור הרכיבים הנדרשים לתרגום במבחנה והשוואה בין ליזטים ממינים שונים מתוארים בהפניות 33,34.

למרות שתהליך תרגום ה-mRNA נשמר בין האאוקריוטים, הבדלים משמעותיים בין טקסונים נמצאים בעיקר בשלב ההתחלה של התרגום, שבו מולקולות שונות מדכאות או מקדמות תרגום לאורך ההתפתחות באופן ייחודי לטקסון או למין35,36. פרוטוקול זה מתאים מאוד לחקר תרגום mRNA בחרקים לאורך כל ההתפתחות, כאשר לא ניתן להשתמש בליזטים ממטזואן פילוגנטית רחוק, כולל הליזטים המסחריים מחיטה או ארנב. למעשה, פרוטוקול זה יכול לשחזר את אירועי התרגום המתרחשים במהלך העובר, דבר שלא אפשרי בשימוש בליזאטים של ביציות23. עד כה, לא נערכה השוואה בין מערכות דרוזופילה של עוברים, ביציות ותאי תרבת. הוספת שינויים פוסט-תרגומיים לחלבונים מסונתזים במבחנה היא מגבלה של פרוטוקול זה במצבו הנוכחי. יתרה מזאת, שיטה זו אינה מניבה כמויות מוכנות של חלבון בהשוואה לשיטות לייצור חלבונים רקומביננטיים בחיידקים.

כאן, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לגידול שגרתי של כלובים גדולים של זבובי דרוזופילה , להכנת תבניות mRNA סינתטיות, להכנת ליזטים מיומנים לתרגום מעוברים, ולביצוע בדיקות תרגום חוץ-גופיות ללא תאים. טבלת החומרים מציגה את התגובות הנדרשות לאורך כל הפרוטוקול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1) בניית תבנית פלסמיד לשעתוק חוץ גופי

  1. בחר פלסמידים המכילים אזור לא מתורגם (UTR) של 5' (UTR), ציסטרון מדווח, UTR של 3' וזנב poly(A) במורד הזרם של פרומוטר פולימראז RNA מסוג T7, T3 או SP6. ודאו שכל מבנה מכיל אתר הגבלה ייחודי מיד במורד זנב הפוליא(A) לצורך ליניאריזציה של פלסמיד לפני השעתוק (איור 1).
    הערה: אתר האנזים ההגבלה שבו משתמשים צריך להיבחר בקפידה כך שאתר הזיהוי יהיה מחוץ לרצף המתועתק או כזה שמאפשר ל-DNA הלינארי להסתיים ב-A. יתרה מזאת, אנזים ההגבלה אמור להשאיר בליטה קהה או 5' בקצה ה-3' של התבנית. הבליטות של 3' עלולות לגרום לתוצרי שעתוק חריגים. אם משתמשים באנזים עם בליטה של 3 רגל, יש להקהה את השבר לפני השימוש.
  2. אמת את כל המבנים על ידי רצף לפני השימוש בהם כתבניות לתמלול מבחץ .
    הערה: מבני דיווח Firefly luciferase (FLuc) עם זנב poly(A)71 שימשו לתהליך עבודה זה. מבני ה-FLuc נגזרים מקלטת pLUC12. מידע על וקטורים וערכות מופיע בטבלת החומרים.

2) שעתוק חוץ גופי של mRNA עם כיסוי ופוליאדנילטים

  1. ליניאריזציה של כל מבנה פלסמיד באמצעות אתר ההגבלה הייחודי במורד זנב הפוליא(A) (כאן, KpnI).
  2. לפתור את ה-DNA הלינארי באמצעות אלקטרופורזה בג'ל 1% אגרוז ב-100 וולט למשך שעה.
  3. חלצו את ה-DNA בג'ל ובדקו את שלמותו ואת הליניאריזציה הנכונה באמצעות אלקטרופורזה זהה בג'ל אגרוז.
    הערה: אין צורך לטהר ג'ל את ה-DNA הלינארי—אם ה-DNA נחתך לחלוטין, אז טיהור עמודה או הפקת פנול/השקעת ETOH מספיקים.
  4. תמלל את ה-DNA המטוהר והליניארי באמצעות ערכת שעתוק במבחנה בהתאם להוראות היצרן. כלול אנלוג 5' cap בתגובת השעתוק כדי לייצב את ה-RNA ולעורר תרגום.
    הערה: אנלוג קבל פונקציונלי, כמו m7G(5′)ppp(5′)G RNA, תומך בייצוב תמלול וגירוי תרגום. אנלוג לא פונקציונלי של cap, כמו G(5′)ppp(5′)A, תומך בייצוב תמלול אך לא בגירוי תרגום. מעכב תרגום זה משמש כאשר תמלילי ביציסטרון מתורגמים לבדיקת נוכחות אתרי כניסה פנימיים לריבוזום (IRES) שמניעים את התרגום של הציסטרוןהשני 7. כדי לבדוק את התלות בזנב poly(A), ניתן למחוק זאת בפלסמיד התבנית לפני ביצוע התעתוק.
  5. לטפל בכל תגובות השעתוק עם DNase ללא RNase כדי להסיר את תבנית ה-DNA לאחר השעתוק לפי הוראות היצרן. כל ערכות השעתוק במבחנה מספקות את ה-DNase ללא RNase.
  6. לטהר את התמלול באמצעות משקע ליתיום כלוריד או ניקוי RNA מבוסס עמודה לפי הוראות היצרן.
    הערה: כל ערכות השעתוק במבחנה מספקות את תגובות הליתיום כלוריד.
  7. כמת באמצעות ספקטרוסקופיה את התמלול המטוהר והעריך שלמות mRNA באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל 1%-אגרוז הפועל ב-100 וולט למשך שעה.
  8. עליקו את ה-mRNA ואחסנו בטמפרטורה של -70°C עד השימוש.

3) תחזוקה שוטפת של תרבית דרוזופילה בקנה מידה גדול

  1. השתמשו בזן הבר Drosophila melanogaster Oregon-R.
  2. הכינו אוכל לזבובים לפי מתכון מבוסס במרכז ההתייחסות.
    הערה: המחברים השתמשו במתכון Bloomington Drosophila StockCenter מספר 37 כהפניה להכנת מזון. פרטי המתכון הזה מופיעים בטבלה 237. איור 2 מציג את תהליך העבודה הכולל מאיסוף עוברים ועד כימות פעילות הלוציפראז.
  3. הצב כלוב אקרילי קובייתי או גלילי באורך של כ-1 מטר וקוטר 50 ס"מ.
  4. צרו חור בקוטר של כ-30 ס"מ בחלק העליון של הכלוב ואטומו אותו ברשת (איור 3).
  5. הניחו נייר רטוב מעל הרשת כדי לספק מים לזבובים, והחליפו את הנייר הרטוב מדי יום (איור 3).
  6. השאר את החלק הקדמי של הכלוב פתוח ומכוסה בבד כדי לאפשר גישה לתוך הכלוב. מניחים אקריליק בצד האחורי של כלוב הזבובים הפלסטי, אטום לחלוטין.
  7. הגבירו את מאגר הזבובים לפני איסוף העוברים, והניחו ~1,000 זבובים צעירים בתוך הכלוב. שמור על כלוב הזבובים בטמפרטורה של 22–25 מעלות צלזיוס באופן קבוע.
    הערה: ניתן לתחזק מספר כלובי זבובים באותו גודל וצפיפות זבובים בו-זמנית. זבובים מטילים ביצים במשך כ-15 ימים ומתחילים למות בסביבות היום ה-20.
  8. האכילו את הזבובים מדי יום בצלחות מיץ אגר ופירות עם כף שמרי אפייה מיובשים, המכילות 200 מיקרו ליטר חומצה אצטית או חומץ.
  9. כדי להקים את הדור הבא של הזבובים, יש לאסוף מספר צלחות של עוברים בני 0–12 שעות. הניחו את העוברים בקופסאות פלסטיק בגודל 22 ס"מ × 17 ס"מ × 10 ס"מ המכילות מזון זבובים לעומק של 3 ס"מ. ודאו שלארגזים יש חור אטום ברשת, כדי לאפשר זרימת אוויר ולמנוע בריחת זחלים (איור 4). הוסיפו שמרים יבשים פעילים מעל המזון ותנו לעוברים לגדול בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
  10. לאחר 3 ימים, מניחים נייר מקופל בגובה 5 ס"מ בתוך הקופסאות כדי שזחלי השלב השלישי יוכלו לטפס ולהפוך לגולם.
  11. לאחר 10 ימים, הניחו את הקופסאות המכילות זבובים בוגרים שזה עתה בקעו לתוך הכלוב. תן לזבובים לצאת מהארגזים ולהזדווג בכלוב במשך יומיים.
  12. כדי לקבל עוברים בגיל מסוים להכנת ליזאט, פתח את הכלוב בזהירות והניח צלחות מיץ אגר בתוך הכלוב לתקופת הטלת הביצים הנדרשת.
  13. הסירו את הצלחות ואספו את הביצים באמצעות ערימת מסננים.
    הערה: עבור ליזאטות עוברים בני 0–12 שעות, הניחו שתי צלחות מיץ אגר בכלוב בשעה 8:00 בבוקר והוציאו אותן בשעה 20:00 לאיסוף עוברים.
    1. איסוף עוברים להכנת ליזאט בין הימים 3 ל-10 לאחר בקעת הזבובים הבוגרים.
    2. במקביל, איסוף עוברים בימים 2–4 והקים דור חדש של זבובים בקופסאות המכילות מזון כפי שתואר לעיל.

4) הכנת ליזאטים של תרגום מעוברי דרוזופילה בני 0–12 שעות

הערה: פרוטוקול זה אינו כולל טיפול בנוקלאז מיקרוקוקלי. שלב זה הושמט כדי למנוע פגיעה אפשרית ב-mRNA המדווח החיצוני אם השבתה של נוקלאז אינה שלמה. יש לנטר את תרגום הרקע בכל ניסוי באמצעות בקרת ללא mRNA.
הערה: שיטה זו נגזרת מהפרוטוקולים שתוארו קודםלכן 7,12,14,15,16,17,22.

  1. הכינו בופר פירוק עובר כפי שמתואר בטבלה 2 ואחסנו אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס באליקווטים של 1 מ"ל.
    הערה: הפשרה של כל אליקווט עד פי 2 לשימוש מיידי.
  2. לאסוף עוברים באמצעות מסננת.
    הערה: הפרוטוקול הסטנדרטי משתמש בעוברים בני 0–12 שעות, אך גילאים אחרים של עוברים עשויים להתאים גם הם להכנת ליזאט.
  3. שטפו עוברים במי ברז באופן נרחב ואז עם בופר עוברי המכיל 0.9% NaCl + 0.03% טריטון X-100.
    הערה: ניתן לאחסן עוברים בטמפרטורה של 4°C עד 24 שעות לפני העיבוד.
  4. עוברים דקוריונים למשך 5 דקות בבופר עוברי 50% ו-50% אקונומיקה ביתית (היפוכלוריט נתרן [NaOCl] 4–6% ונתרן הידרוקסיד [NaOH] 0.02–0.1%).
    זהירות: השתמש בכפפות ובמשקפי מגן פלסטיק שקופים בעת טיפול באקונומיקה.
  5. שטפו היטב במי ברז. ייבשו עוברים עם נייר ושוקלים אותם.
  6. העבר עוברים ארוזים למטחנת זכוכית על קרח. הוסף 1 מ"ל של בופר לליזיס עובר לכל גרם עוברים. הומוגניזציה של העוברים על הקרח ב-20 משיכות.
  7. העבר את ההומוגנט לצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב-15,900 × גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  8. השחזר את האינטרפאזה ב-50 מיקרוליטר אליקווטים על הקרח. הקפיאו אליקווטים בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של -80°C.
    הערה: האינטרפאזה היא תמיסה נוזלית מעוננת בין הפאזות העליונות והתחתונה. השלב העליון הוא שכבה של ליפידים לבנים אטומים וצמיגים מאוד. השלב התחתון הוא פלט מוצק.
    זהירות: הימנעו מזיהום תמיסת האינטרפאזה מפאזה סמוכה.
    זהירות: השתמש בכפפות ובמשקפי מגן פלסטיק שקופים בעת טיפול בחנקן נוזלי.

5) תגובת תרגום חוץ גופית

  1. הגדר את תגובות התרגום בלוח עם 96 בארות או בצינורות PCR בודדים בנפח 0.2 מ"ל על תרמחזור PCR. הכינו כל תגובת תרגום בנפח סופי של 17 מיקרוליטר, כולל 5 מיקרוליטר של ליזאט עוברי ושאר רכיבי התגובה המתוארים בטבלה 2.
    הערה: ליזאט עובר מייצג 30% נפח לנפח הכולל של התגובה.
  2. אם מוסיפים חלבונים רקומביננטיים לתגובת התרגום, דיאליזציה של החלבון מול pH 7.4 של 20 מ"מ Hepes-KoH. בחר את נפח קלטת הדיאליזה ואת חיתוך המשקל המולקולי בהתאם לנפח הדגימה וגודל החלבון.
    הערה: הוספת חלבונים רקומביננטיים רלוונטית לחקר מדכאי תרגום או בדיקות תלויות מינון עם גורמי התחלה. הימנעו מהוספת PBS לחלבונים רקומביננטיים המשמשים בתגובת התרגום. שמור על גליצרול ב-5% או מתחת לדגימת החלבון או בתגובת התרגום. אם אפשר, הימנע מהוספת גליצרול לתגובה.
  3. דטרנציה של ה-mRNA על ידי חימום ל-65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות וקירור מהיר על הקרח למשך 2 דקות לפני תגובת התרגום במבחנה .
  4. בצע תרגום של כל mRNA בשלושה עותקים. הגדר את התגובה כך: 2.7 מיקרוליטר של קוקטייל תגובה (טבלה 2) + 5 מיקרוליטר ליזאט עובר + mRNA (30 ng) + H2O עד 17 מיקרו-ליטר של נפח סופי. כמיקס בסיס ראשי, עקבו אחרי קוקטייל התגובה לתגובה אחת בטבלה 2 והתאימו למספר התגובות שיש לבצע. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
    הערה: ATP ו-GTP אינם מתווספים בנפרד לתגובה הסטנדרטית המתוארת כאן. בידינו, הוספת ATP/GTP נוספת לתגובה לא שיפרה את תפוקת ה-FLuc והפחתה את התרגום בתנאים שנבדקו. לכן, התגובה מתבצעת באמצעות מערכת מתחדשת אנרגיה המתוארת בטבלה 2 ללא תוספת נוקלאוטידית.
  5. תכנת את התרמחזור עם שלב ראשוני של 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, אחריו 60 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ושלב סופי של 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  6. עצור את התגובה על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של בופר ליזיס קר 1× פסיבי. הנח את התגובה על הקרח לעוד 10 דקות.
  7. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס או המשך לכימות לוסיפראז.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

6) כימות של לוסיפראז מסונתז

  1. הביאו את התגובות לטמפרטורת החדר למשך 20 דקות לפני כימות פעילות FLuc.
  2. הביאו 10 מיקרוליטר מכל תגובת תרגום ו-50 מיקרוליטר מצע לוסיפראז (לפחות שעתיים לפני השימוש) לטמפרטורת החדר.
  3. הוסיפו את תת-הלוסיפראז לתגובת התרגום. רשמו יחידות אור יחסיות באמצעות לומינומטר אוטומטי או ידני. תכנת את הלומינומטר כך שיקבל 10 קריאות במרווח של שניות אחת מהפרש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ביצענו תגובות תרגום לניתוח שונות היעילות בין שישה תכשירי ליזאט עצמאיים (כלומר, חזרות ביולוגיות) באמצעות עוברים בני 0–12 שעות. כל פס מייצג משולש טכני (איור 5). נצפתה יעילות תרגום דומה, אם כי עם שונות מסוימת. השווינו גם את יעילות התרגום בין עוברים בגילאים שונים. לכן, בדקנו ליזטים מעוברים בני 0–2 שעות, 0–12 שעות ועוברים בני 0–18 שעות, תוך ביצוע חזרות ביולוגיות, כלומר באמצעות ליזטים עצמאיים (איור 6). הבחינו שליזטים מעוברים בני 0–2 ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ליזאטים של דרוזופילה לתרגום ללא תאים במבחנה יכולים להניב תוצאות שחזוריות. עוברים בגילאים שונים ובשינויים בהרכב הבופר שימשו לחקר מגוון רחב של תופעות יסודיות בסינתזת חלבונים ובמכונה (טבלה 1). כאן תיארנו שיטה סטנדרטית המתאימה לעוברים בכל גיל לביצוע מחקרים מדויקים וכמותיים (טבלה 1). פרוטוקול זה עשוי להיות שימושי לחקר תפקידו של חלבון או גנוטיפ מסוים בזבובים מוטנטיים כאשר נוצרת תרבית בקנה מידה גדול של אותו מוטנט. יתרה מזאת, שיטה זו י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

N.B-Á ו-G.H. נתמכו על ידי תוכנית המימון הפנימית של המכון הלאומי לסרטן (Instituto Nacional de Cancerología, INCan), מקסיקו; D.E.V. הוא עמית פוסט-דוקטורט בתוכנית Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación (SECIHTI) "Estancias posdoctorales por México para la Formación y Consolidación de las y los Investigadores por México, 2022". אנו מודים לפאניס מיסירליס ובטי אוסוריו (CINVESTAV, מקסיקו) על הזבובים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
רדיד אלומיניוםReynoldsN/Aרדיד אלומיניום ביתי סטנדרטי; כל מותג מסחרי מקביל מקובל.
תערובת חומצות אמינוPromegaL4461N/A
חומץ תפוחיםHeinzN/Aחומץ תפוחים מסחרי (5% חומציות); כל מותג מקביל מקובל.
מיץ תפוחים או ענביםJumexN/Aמיץ ענבים מסחרי; או כל מותג מסחרי מקביל.
אגר בקטריולוגי Merck/Sigma-Aldrich9002-18-0N/A
חומצה בורית (H3BO3)Merck/Sigma-AldrichB6768BioReagent, Molecular Biology grade, ≥99.5%, אבקה; משמש להכנת חיץ TBE.
כובע: כובע נגד היפוך (ARCA): 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G מבנה כובע RNABioLabsS1411SN/A
כובע: מבנה אנלוגי כובע RNA m7G(5')ppp(5')GNew England BiolabsS1404SN/A
כובע: אנלוגי כובע לא פונקציונלי G(5´)ppp(5´)ANew England BiolabsS1406N/A
צנטריפוגה צינורית (15 מ"ל)Corning 430053N/A
תערובת מעכבי פרוטאז מלאה ללא EDTARoche11836170001N/A
קריאטין פוספוקינאז משרירי ארנבMerck/Sigma-AldrichC-3755N/A
חומצה קריאטית פוספורית, מלח דיסודיוםMerck1120A47950N/A
שמרים אפויים מיובשיםFleischmann'sN/Aשמרים פעילים יבשים מסחריים; כל מותג מקביל מקובל.
דיאתיל פירוקרבונט Merck/Sigma-AldrichD575897%(NNR)
DNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchD4004N/A
זן Drosophila melanogaster מסוג Oregon-RBloomington Drosophila Stock Center, Indiana, USAhttps://bdsc.indiana.edu/index.html ; זנים מוטציוניים של Drosophila melanogaster, כמו גם זני עיון מסוג בר של מיני דרוזופילה אחרים, כגון virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei, וכו 'מסופקים גם על ידי מרכז המלאי הזה.
חומצה אתילנדיאמין טטרה-אצטית (EDTA)Merck/Sigma-AldrichE9884ACS reagent, 99.4-100.6%, אבקה; משמש להכנת חיץ TBE.
HEPESSigmaSLBH4583V99.5%(titration)
מימן חמצני (H2O2)EquateN/Aמסחרי (~2.5-3.5% פתרון מימן חמצני; כל מותג מקביל מקובל.
ערכת תמלול in vitro mMessage mMachine T7, T3, או SP6Thermo Fisher ScientificAM1344 ו- AM1348N/A
KOAc, המכונה גם KCH3COOMerck/Sigma-AldrichכמהN/A
נוזל Lb (lennox)Merck/Sigma-AldrichL30221kg 
מערכת בדיקת לוספראזPromega E1501N/A
ערכת תמלול in vitro MAXIscript T7, T3, או SP6InvitrogenAM1316 ו- AM1312N/A
Mg(OAc)2, המכונה גם Mg(CH3COO)2Merck/Sigma-AldrichכמהN/A
NaCl (נתרן כלוריד)J.T Baker B17W53ACS Reagent
אוליגונוקלאוטידיםכל חברהN/Aספציפי לרצף.
מאגר פירוק pasive 5XPromegaE1941N/A
קצות צינוריתAxygenT-200-Yקצות צהובים של 200 מיקרוליטר.
קצות צינוריתAxygenT-1000-Bקצות כחולים של מ"ל 1.
קצות צינורית AxygenT-300קצות שקופים של 0.5-10 מיקרוליטר.
חומצה פרופיוניתMerck/Sigma-Aldrich79-09-04דרגת ACS reagent, ≥99.5%, נוזלי.
מכתש זכוכית 5 מ"ל PYREX®  PYREX®  7724-5N/A
ערכת QIAprep spin plasmid miniprepQiagen27106N/A
ערכת QIAquick למיצוי מגלQiagen28704N/A
תמצית רטיקוליטים מכבש ארנב (RRL)Promega L4960N/A
מערכת בדיקת רנילה לוספראז (RLuc)Promega E2820N/A
מעכב ריבונוקלאז RN

מקורות

  1. Marygold SJ, Attrill H, Lasko P. The translation factors of Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 2017;11(1):65-74.
  2. Hernández G, Vazquez-Pianzola P. eIF4E as a molecular wildcard in metazoans RNA metabolism. Biol Rev Camb Philos Soc. 2023;98(6):2284-306.
  3. Kong J, Lasko P. Translational control in cellular and developmental processes. Nat Rev Genet. 2012;13(6):383-94.
  4. Bayer LV, Milano SN, Bratu DP. The mRNA dynamics underpinning translational control mechanisms of Drosophila melanogaster oogenesis. Biochem Soc Trans. 2024;52(5):2087-99.
  5. Filipowicz W, et al. A protein binding the methylated 5′-terminal sequence, m7GpppN, of eukaryotic messenger RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976;73(5):1559-63.
  6. Sondermeijer PJA, Lubsen NH. Heat-shock peptides in Drosophila hydei and their synthesis in vitro. Eur J Biochem. 1978;88(2):331-9.
  7. Hernández G, Vazquez-Pianzola P, Sierra JM, Rivera-Pomar R. Internal ribosome entry site drives cap-independent translation of reaper and heat shock protein 70 mRNAs in Drosophila embryos. RNA. 2004;10(11):1783-97.
  8. Zapata JM, Martínez MA, Sierra JM. Purification and characterization of eukaryotic polypeptide chain initiation factor 4F from Drosophila melanogaster embryos. J Biol Chem. 1994;269(27):18047-52.
  9. Maroto FG, Sierra JM. Purification and characterization of mRNA cap-binding protein from Drosophila melanogaster embryos. Mol Cell Biol. 1989;9(5):2181-90.
  10. Andrews S, Snowflack DR, Clark IE, Gavis ER. Multiple mechanisms collaborate to repress nanos translation in the Drosophila ovary and embryo. RNA. 2011;17(5):967-77.
  11. Smibert CA, et al. Smaug, a novel and conserved protein, contributes to repression of nanos mRNA translation in vitro. RNA. 1999;5(12):1535-47.
  12. Gebauer F, et al. Translational control of dosage compensation in Drosophila by Sex-lethal: cooperative silencing via the 5′ and 3′ UTRs of msl-2 mRNA is independent of the poly(A) tail. EMBO J. 1999;18(21):6146-54.
  13. Pamudurti NR, et al. Translation of circRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.e7.
  14. Vázquez-Pianzola P, Hernández G, Suter B, Rivera-Pomar R. Different modes of translation for hid, grim and sickle mRNAs in Drosophila. Cell Death Differ. 2007;14(2):286-95.
  15. Hernández G, et al. Two functionally redundant isoforms of Drosophila eIF4B are involved in cap-dependent translation, cell survival and proliferation. Eur J Biochem. 2004;271(14):2923-36.
  16. Hernández G, et al. Functional analysis of the AUG initiator codon context reveals novel conserved sequences that disfavor mRNA translation in eukaryotes. Nucleic Acids Res. 2024;52(3):1064-79.
  17. Tuschl T, et al. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev. 1999;13(24):3191-7.
  18. Scott MP, Storti RV, Pardue ML, Rich A. Cell-free protein synthesis in lysates of Drosophila melanogaster cells. Biochemistry. 1979;18(8):1588-94.
  19. Clark IE, Wyckoff D, Gavis ER. Synthesis of the posterior determinant Nanos is spatially restricted by a novel cotranslational regulatory mechanism. Curr Biol. 2000;10(20):1311-4.
  20. Jeske M, et al. Rapid ATP-dependent deadenylation of nanos mRNA in a cell-free system from Drosophila embryos. J Biol Chem. 2006;281(35):25124-33.
  21. Jeske M, Moritz B, Anders A, Wahle E. Smaug assembles an ATP-dependent stable complex repressing nanos mRNA translation at multiple levels. EMBO J. 2011;30(1):90-103.
  22. Castagnetti S, Hentze MW, Ephrussi A, Gebauer F. Control of oskar mRNA translation by Bruno in a novel cell-free system from Drosophila ovaries. Development. 2000;127(5):1063-8.
  23. Gebauer F, Hentze MW. Studying translational control in Drosophila cell-free systems. Methods Enzymol. 2007;429:23-33.
  24. Hernández G, et al. Mextli is a novel eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein that promotes translation in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 2013;33(15):2854-64.
  25. Lie YS, Macdonald PM. In vitro translation extracts prepared from Drosophila ovaries and embryos. Biochem Biophys Res Commun. 2000;270(2):473-81.
  26. Peng Y, Gavis ER. The Drosophila hnRNP F/H homolog Glorund recruits dFMRP to inhibit nanos translation elongation. Nucleic Acids Res. 2022;50(12):7067-83.
  27. Sanders MM, Triemer DF, Olsen AS. Regulation of protein synthesis in heat-shocked Drosophila cells: soluble factors control translation in vitro. J Biol Chem. 1986;261(5):2189-96.
  28. Storti RV, Scott MP, Rich A, Pardue ML. Translational control of protein synthesis in response to heat shock in Drosophila melanogaster cells. Cell. 1980;22(3):825-34.
  29. Krüger C, Benecke BJ. In vitro translation of Drosophila heat-shock and non-heat-shock mRNAs in heterologous and homologous cell-free systems. Cell. 1981;23(2):595-603.
  30. Zhao F, Yu CH, Liu Y. Codon usage regulates protein structure and function by affecting translation elongation speed in Drosophila cells. Nucleic Acids Res. 2017;45(14):8484-92.
  31. Roy G, et al. The Drosophila poly(A) binding protein-interacting protein, dPaip2, is a novel effector of cell growth. Mol Cell Biol. 2004;24(3):1143-54.
  32. Wakiyama M, Yokoyama S. Posttranscriptional control of protein synthesis in Drosophila S2 cell-free system. Methods Mol Biol. 2014;1118:257-66.
  33. Spirin AS, Swartz JR. Cell-free protein synthesis systems: historical landmarks, classification, and general methods. In: Spirin AS, Swartz JR, editors. Cell-free protein synthesis. Weinheim: Wiley-VCH; 2008. p. 1-34.
  34. Gregorio NE, Levine MZ, Oza JP. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods Protoc. 2019;2(1):24.
  35. Hernández G, Altmann M, Lasko P. Origins and evolution of the mechanisms regulating translation initiation in eukaryotes. Trends Biochem Sci. 2010;35(2):63-73.
  36. Hernández G, Proud C, Preiss T, Parsyan A. On the diversification of the translational apparatus across eukaryotes. Comp Funct Genomics. 2012;2012:256848.
  37. Lakovaara S. Malt as a culture medium for Drosophila species. Drosoph Inf Serv. 1969;44:128.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תרגום נטול תאיםתרגום חוץ-גופי (In Vitro)סינתזה של חלבוניםמנגנון התרגוםתבניות mRNA סינתטיותבקרה תרגומיתעוברים של דרוזופילהפרוטוקול תרגום
תרגום mRNA ללא תאים במבחנה בליזטים של דרוזופילה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.