זרימת עבודה זולה ללא סימון מבוססת DeepLabCut לניתוח הליכה ותנועה ספונטנית בעכברים שנעים בחופשיות

סיכום

אנו מציגים תהליך עבודה זול וללא סימנים באמצעות DeepLabCut לכימות צעדים ותנועה ספונטנית בעכברים שנעים בחופשיות. פרוטוקול זה משלב רכישת וידאו במצלמה אחת, מעקב ללא סימנים אחר נקודות ציון אנטומיות וחילוץ פרמטרי תנועה מרחבית-זמנית, ומספק מסגרת לא פולשנית ונגישה לניתוח התנהגות מוטורית ללא ציוד ייעודי.

תקציר

הליכה היא סמן ביולוגי פונקציונלי נפוץ לזיהוי שינויים מוטוריים במגוון מחלות ומצבים, שכן הוא משקף שינויים בקואורדינציה, כוח, שיווי משקל ואינטגרציה סנסורומוטורית. עם זאת, שיטות מסורתיות לניתוח הליכה במודלים של בעלי חיים דורשות לעיתים ציוד יקר, מערכות מורכבות או הליכים פולשניים שיכולים לשנות התנהגות טבעית. כאן אנו מציגים תהליך עבודה זול וללא סימנים המבוסס על DeepLabCut, תוכנת הערכת תנוחה בקוד פתוח, לניתוח כמותי של הליכה ותנועה ספונטנית בעכברים שנעים בחופשיות. השיטה מתבססת על רכישת וידאו במצלמה אחת, מעקב ללא סימנים אחר נקודות ציון אנטומיות, וחילוץ פרמטרי תנועה מרחבית-זמנית, ללא צורך בסמנים פיזיים או חומרה מיוחדת. כדי להדגים את יישום הפרוטוקול, הוא יושם במודל העכבר הטרנסגני המשולש של מחלת האלצהיימר (3xTg-AD) כדוגמה מייצגת ליישום. גישה זו שומרת על תנועה חופשית ומפחיתה לחץ הקשור לטיפול, ומאפשרת הערכה לא פולשנית של התנהגות מוטורית. הפרוטוקול תואם לסביבות בדיקות התנהגות סטנדרטיות. בסך הכול, שיטה זו מספקת מסגרת נגישה ולא פולשנית לניתוח כמותי של הליכה ותנועה במחקר פרה-קליני.

מבוא

הליכה היא תהליך מוטורי מורכב שנוצר מאינטראקציה בזמן אמת בין מערכות מוטוריות, חושיות וקוגניטיביות, ודורש עיבוד מתואם של משוב חושי, שליטה ביציבה, תכנון מוטורי והפעלת שרירים ליצירת תנועה יציבה ואדפטיבית¹. בגלל טבעו האינטגרטיבי הזה, שינויים בהליכה מוכרים יותר ויותר כאינדיקטורים פונקציונליים לתפקוד נוירולוגי לקוי הן בפרקטיקה קלינית והן במחקר ניסוי. במודלים של בני אדם ובעלי חיים, ניתוח הליכה מאפשר זיהוי שינויים בתנועה, סיכון לנפילה, חולשה ויכולת תפקודית, והוצע כסמן ביולוגי להתקדמות מחלה ויעילות התערבות במגוון מצבים ^2,3,4.

במחקר בסיסי, במיוחד במודלים של עכברים, הערכת הליכה ספונטנית ופעילות מוטורית מהווה אסטרטגיה נפוצה לאפיון פנוטיפים מוטוריים ולהערכת השפעת הפרעות פיזיולוגיות והתערבויות טיפוליות. כימות אובייקטיבי של פרמטרי התנועה מאפשר זיהוי שינויים מוטוריים עדינים שאינם נתפסים באופן אמין באמצעות בדיקה ויזואלית בלבד, מגבלה שרלוונטית במיוחד במחקרים פרה-קליניים המתמקדים בפנוטיפים מוקדמים או קלים⁵. בהקשר זה, ניתוח הליכה הפך לכלי חשוב לחקר שינויים בהתנהגות מוטורית ולזיהוי שינויים תפקודיים הקשורים למצבים ניסיוניים שונים,^{כגון מחלות} נוירולוגיות וניווניות נוירודגנרטיביות.

הניתוח של התנהגות מוטורית והליכה במודלים של עכברים התבסס באופן מסורתי על פלטפורמות טכנולוגיות ייעודיות שנועדו לכמת משתנים קינמטיים מרחביים וזמניים. מערכות כמו מסלולי הליכה מוארים, פלטפורמות מצוידות במכשירים ותוכנות מסחריות למעקב תנועה הן בשימוש נפוץ; עם זאת, התלות שלהם בחומרה יקרה ותשתית ייעודית מגבילה משמעותית את הנגישות של מעבדות^רבות 7,8,9,10. מעבר לשיקולים כלכליים, גישות אלו מציגות מגבלות ניסיוניות נוספות. מספר מערכות דורשות מבעלי חיים לעבור מסדרונות צרים או נתיבים מוארים מאוד, מה שמטיל דפוסי תנועה כפויים שמפחיתים התנהגות ספונטנית, בעוד שאחרות תלויות בסמנים פיזיים, כתמי צבע או תגי דבק שמחוברים לגפיים. התערבויות כאלה עלולות לגרום לחץ, לשנות את מכניקת ההליכה ולבלבל את הפרשנות הפיזיולוגית של תוצאות מוטוריות 11,12,13,14. יחד, מגבלות אלו מדגישות את הצורך במתודולוגיות המסוגלות ללכוד הליכה בתנאים טבעיים וחופשיים ללא הסתמכות על פרוצדורות פולשניות או תשתיות יקרות.

הערכת ההליכה במהלך תנועה בלתי מוגבלת מאפשרת תצפית על דפוסי תנועה טבעיים יותר, תוך הימנעות ממגבלות חיצוניות שמווסתות באופן מלאכותי מהירות, מסלול או יציבה. גישה זו מקלה על אפיון התנהגות מוטורית בתנאים מינימליים מוגבלים. DeepLabCut היא מסגרת הערכת פוזה בקוד פתוח, מבוססת למידה עמוקה, המשתמשת ברשתות עצביות קונבולוציוניות כדי לעקוב אחר נקודות ציון אנטומיות שהוגדרו על ידי המשתמש ללא צורך בסמנים פיזיים. על ידי הפעלת מעקב אנטומי אחר נקודות מהקלטות וידאו סטנדרטיות, DeepLabCut מאפשר חילוץ פרמטרים קינמטיים תוך הפחתת עלויות ומורכבות ניסויית^{משמעותית} 15,16,17,18. חשוב לציין שמעקב ללא סימנים ממזער הפרעות ניסיוניות, מה שהופך אותו למתאים למחקרים של התנהגות ספונטנית. גישה זו ללא סימן מצלמה אחת מתאימה במיוחד למחקרים הדורשים כימות נגיש ולא פולשני של פעילות תנועה ספונטנית ותכונות דו-ממדיות הקשורות להליכה בתנאים חופשיים. עם זאת, נדרשות פלטפורמות הליכה או מערכות לכידת תנועה תלת-ממדיות כאשר נדרשים משתנים ביומכניים ישירים, כגון כוחות תגובה לקרקע, לחץ כף הרגל, זוויות מפרקים, או קינמטיקה תלת-ממדית מלאה של הגפיים.

מטרת מאמר זה היא להציג זרימת עבודה זולה וללא סימנים המבוססת על DeepLabCut לכימות לא פולשני של הליכה ותנועה ספונטנית בעכברים הנעים בחופשיות, תוך שילוב רכישת וידאו במצלמה אחת, מעקב אנטומי אחר נקודות ציון וחילוץ פרמטרים של תנועת מרחב-זמן בתוך זרימת עבודה נגישה שאינה דורשת חומרה מיוחדת או מניפולציה פולשנית. פרוטוקול זה מתמקד ביישום המתודולוגי ובפלטים המייצגים של תהליך העבודה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה ואושרו על ידי ועדת האתיקה הביולוגית של המכון לנוירוביולוגיה, האוניברסיטה הלאומית האוטונומית של מקסיקו, תחת פרוטוקול מספר 117.

1. הקשר לימוד

1. השתמש בעכברים בתנאים הניסיוניים הנדרשים למחקר. במאמר הפרוטוקול הזה, אנו משתמשים במודל העכבר הטרנסגני המשולש של מחלת האלצהיימר (3xTg-AD), תוך שמירה על הטרנסגנים APPSwe ו-tauP301L על רקע PS1M146V knock-in, יחד עם עכברים לא טרנסגניים כבקרה, כדוגמה מייצגת ליישום זרימת עבודה.
2. גנוטיפ של כל בעלי החיים לפני תחילת המחקר.
3. לשמור על עכברים עם אוכל ומים לפי החופשיות בתנאים מבוקרים הכוללים מחזור בהיר-חושך של 12:12 שעות, טמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ± 2 מעלות צלזיוס, ולחות יחסית של 60% ± 5%, תחת פיקוח וטרינרי.
4. בצע הקלטות במהלך שלב האור לאחר תקופת הרגל של 60 דקות, תוך שימוש במפגש שדה פתוח יחיד לכל בעל חיים כדי לשמור על התנהגות חקר ספונטנית ולמנוע ירידה בפעילות הקשורה לחשיפה חוזרת לזירה.
   הערה: במאמר פרוטוקול זה, אנו מציגים הקלטות מייצגות שמטרתן אך ורק להמחיש את זרימת העבודה ואת סוג תוצאות התנועה וההליכה שנוצרות על ידי השיטה, ולא כדי לתמוך בהשוואות ביולוגיות בין קבוצות.

2. חומרים

1. אנואנו את החומרים והציוד הרשומים בטבלת החומרים והציוד להקלטה וניתוח תנועה והליכה ספונטנית. ראו איור 1 להרכבה הכוללת של מערכת הניסוי.

3. הרגל והקלטת תנועה ספונטנית

1. הכנה והרגל בעלי חיים
   1. העבר בזהירות את העכבר מחדר המגורים שלו לחדר הבדיקות ההתנהגותיות לפחות 60 דקות לפני הניסוי כדי לאפשר הסתגלות סביבתית.
   2. לשמור על חדר הבדיקות ההתנהגותיות בתנאי סביבה מבוקרים, כולל טמפרטורה קבועה של 20°C–22°C, עוצמת תאורה סטנדרטית (120–150 לוקס נמדדת ברמת הזירה), ורעש לבן רציף כדי למזער גירויים שמיעתיים חיצוניים.
   3. במהלך תקופת ההתרגלות, יש להשאיר את החיה בכלוב הבית מבלי להכניס גירויים או העשרה נוספים. לטפל בבעלי חיים בהתאם להנחיות רווחת בעלי החיים המוסדיות כדי למזער שונות התנהגותית הנגרמת מלחץ.
   4. לטפל בבעל החיים עם כפפות נקיות ותנועות איטיות ומחושבות. הרימו את החיה בעדינות בבסיס הזנב ותמכו בגוף ביד הנגדית לפני שמניחים אותו בזירת השדה הפתוח.
      הערה: שלב קריטי: טיפול לא עקבי או זמן התרגלות לא מספק עלולים להגדיל התנהגויות הקשורות לחרדה ולהכניס שונות בפרמטרים המוטוריים. ודא שיהיו תהליכי הרגל זהים לכל בעלי החיים והמפגשים.
2. זירת שדה פתוח והכנת מצלמה
   1. לפני כל סשן הקלטה, נקו היטב את זירת השדה הפתוח האקרילי עם 70% אתנול (v/v) כדי להסיר ריחות שנותרו וסימני ריח קודמים. תן למשטח להתייבש לגמרי לפני השימוש.
   2. יש לטפל ב-70% אתנול באזור מאוורר היטב, להרחיק אותו מחום או מקורות הצתה, ולתת לאולם להתייבש לחלוטין לפני השימוש.
   3. הניחו את זירת השדה הפתוח היטב על פלטפורמת העץ, כדי להבטיח שהמבנה יציב וללא רעידות.
   4. בדקו את הקירות האקריליים השקופים ואת משטח הרצפה המט כדי לוודא שהם נקיים מאבק, לחות או שאריות מחזירות אור שעלולות להפריע למעקב וידאו.
   5. מקמו מנורות אור לבנות חיצוניות משני צידי הזירה בזווית משוערת של 30–45° יחסית למישור הזירה, כדי לספק תאורה אחידה באזור ההקלטה ולמזער צללים, השתקפויות או בהירות מופרזת. התאם את מיקום הפנס לפני כל סשן וודא שהאור ברמת הזירה נשאר בטווח היעד של 120-150 לוקס.
   6. מקם את המצלמה מתחת לזירה בתצורת תצוגה תחתונה במרחק קבוע של כ-80 ס"מ ממישור הזירה, כדי להבטיח נראות מלאה של אזור ההקלטה. יש לשים לב שמרחק אופטימלי זה עשוי להידרש לכוונון בהתאם לצמצם העדשה ולשדה הראייה (FOV) של המצלמה הספציפית כדי לשמור על כיסוי מלא של הזירה.
   7. חבר את המצלמה למערכת המחשב והפעל את תוכנת הקלטת הווידאו לפני הצגת החיה.
   8. כוונו את פוקוס המצלמה ושדה הראייה כדי להבטיח שכל משטח הזירה יהיה נראה וברור בצורה חדה.
   9. השגת תמונת ייחוס לכיול מרחבי על ידי מיקום רשת השחמט או דפוס הכיול במידות ידועות על מישור הזירה.
      הערה: שלב קריטי: יישור מצלמה מדויק, מרחק קבוע ותאורה עקבית הם חיוניים להערכת תנוחה אמינה ללא סימנים. סטיות בגיאומטריה או בתנאי התאורה עלולות להפחית את דיוק המעקב ולפגוע בהשוואת נתונים בין סשנים.
      הערה: חומרים חלופיים, כולל נירוסטה, עשויים לשמש למבנה התמיכה החיצוני, בתנאי שההתקנה נשארת יציבה ויישור ההקלטה נשמר.
      הערה: ניתן להשתמש גם בזירה אטומה או בחומרים חלופיים לקירות, במיוחד כאשר נדרשים שליטה נוספת בקלט חזותי חיצוני, בתנאי שההקלטת המצלמה נשארת יציבה והפרעות חיצוניות מצטמצמות.
      הערה: ממדי הזירה המשמשים בפרוטוקול זה תואמים לתצורה המשמשת להקליט עכברים הנעים בחופשיות. מידות אלו ניתנות להתאמה בהתאם למרסם בו משתמשים ולפרוטוקול השטח הפתוח שאומץ, בתנאי שנראות בעלי חיים מלאה, כיול מרחבי ותנאי רכישה עקביים נשמרים.
3. תיעוד התנהגות תנועה ספונטנית
   1. לפני שמניחים את העכבר בזירה, הצג בקצרה את מזהה החיה במסגרת הווידאו כדי להבטיח קשר ויזואלי ישיר בין ההקלטה לבין המפגש הניסיוני המתאים.
   2. התחל בהקלטת וידאו לפני שמניחים את העכבר במרכז זירת השדה הפתוח כדי להבטיח לכידת ההתנהגות החקרנית הראשונית מתחילת המפגש.
   3. הנח בעדינות את העכבר במרכז זירת השדה הפתוח.
   4. הקלט תנועה ספונטנית ברציפות במשך 3 דקות מבלי לגרום להפרעות חזותיות, שמיעתיות או מישושיות. בפרוטוקול הנוכחי, בוצעה רק סשן הקלטה אחד לכל עכבר.
   5. עקוב אחרי שידור הווידאו החי על מסך המחשב כדי לאשר הקלטה רציפה ותיעוד תקין של תנועות החיה.
   6. בדוק מדי פעם את יישור המצלמה ואחידות התאורה בין המפגשים כדי להבטיח תנאי הקלטה עקביים בין בעלי חיים.
   7. בסיום תקופת ההקלטה, יש להפסיק את איסוף הווידאו ולהוציא בזהירות את החיה מהזירה תוך שימוש באותו הליך טיפול שתואר לעיל.
   8. החזירו את החיה לכלוב הבית שלה ואפשרו לה לנוח לפני כל הליך נוסף.
      הערה: הימנעו מהזיזת מיקום החיה במהלך ההקלטה, שכן הפרעות חיצוניות עלולות לשנות דפוסי הליכה ספונטניים ולהשפיע על ניתוח במורד הזרם.
4. ניקוי, אחסון נתונים והשלמת סשן
   1. נקה שוב את זירת השדה הפתוח עם 70% אתנול (v/v) אחרי כל סשן ותן לו להתייבש לגמרי לפני הכנסת החיה הבאה.
   2. ודאו שאין שאריות של אתנול או ריח על פני השטח לפני הכנסת החיה הבאה.
   3. תעד את מזהה החיה, תאריך ושעת הפגישה, מצב הניסוי ושם המפעיל מיד לאחר כל הקלטה.
   4. אם נבדקים בעלי חיים נוספים, יש לחזור על ההליך החל משלב 3.1.1 בתנאים סביבתיים וניסויים זהים.
   5. שמור כל קובץ וידאו בתיקייה ייעודית באמצעות שיטת שמות סטנדרטית (למשל, AnimalID_SessionDate_Trial1.mp4).
   6. בסוף יום הניסוי, כיבו את מערכת המצלמות וציוד התאורה כדי למנוע סטייה בהגדרות התאורה בין הסשנים.
      הערה: למרות שבפרוטוקול הנוכחי נעשה שימוש ב-70% אתנול כיוון שהוא חומר חיטוי נפוץ בפרוצדורה מסוג זה, ניתן להשתמש גם בחומרי חיטוי תואמי אקריליק כדי למנוע התדרדרות מתקדמת של פני השטח, בתנאי שהזירה יבשה לחלוטין וללא ריח שאריתי לפני ההקלטה הבאה.
      הערה: כאשר זה אפשרי, ניתן להכין מספר זירות שיאפשרו מעבר מיידי בין המפגשים ויאפשרו התקדמות רציפה של הניסוי בין בעלי החיים.
      ראו איור 1 לחומרים ולהרכבה של ההתקנה הניסיונית, כולל פלטפורמת העץ (איור 1A), זירת האקריליק (איור 1B), מערכת התאורה הצדדית (איור 1C), מיקום המצלמה בתצוגה התחתונה (איור 1D), וההתקנה הניסיונית המלאה (איור 1E).

איור 1: הכנה ניסיונית להקלטת וידאו של תנועה בזירה הפתוחה. (א) מבנה תמיכה לזירה; (ב) זירת שדה פתוח אקרילית הממוקמת על הרציף; (ג) תאורה רוחבית להבטחת תאורה אחידה; (ד) מיקום מצלמה להקלטת תנועה מלמטה; (ה) הכנה מלאה. ראשי חץ לבנים מציינים את כיוון מקור האור באיור 1C ושל המצלמה באיור 1D. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

4. עיבוד וידאו וניתוח קינמטי

1. הכנת וידאו ובקרת איכות
   1. רכוש סרטונים גולמיים ב-. פורמט MOV והמיר אותם לפורמט .avi כדי להתאים ל-DeepLabCut תוך שמירה על קצב פריימים ורזולוציה קבועים.
   2. Bמפעיל את כל קבצי הווידאו הגולמיים מיד לאחר הרכישה לתיקייה ייעודית במחשב הניתוח ומיישם קונבנציה סטנדרטית של שמות (למשל, AnimalID_Session_Date).
   3. בדוק כל סרטון במלואו כדי לוודא שההקלטה שלמה וללא הפרעות, פריימים שנפלו או פגומות. יש להוציא סרטונים עם שגיאות רכישה מהניתוח.
   4. המרו את הסרטונים לפורמט MP4 (H.264) או לפורמט AVI לא דחוס אם הפורמט המקורי אינו תואם ל-DeepLabCut.
   5. באופן אופציונלי, לבצע חיתוך זמני של קטעי הווידאו כדי לבטל מרווחים לא ניסיוניים בתחילת ובסוף המפגש (למשל, במהלך הכנסת או הסרה של בעל החיים מזירת הניסוי).
   6. ודאו שהרזולוציה וקצב הפריימים תואמים את פרמטרי הרכישה במהלך ההקלטה ונשארים עקביים בכל הסשנים.
   7. ודאו שכל משטח הזירה גלוי בתוך פריים הווידאו ושאין חלקי גוף חסומים באופן עקבי במהלך התנועה.
   8. Pאסוף את כל הסרטונים המאומתים והמעובדים לתיקיית פרויקטים ייעודית לניתוח DeepLabCut.
      הערה: שלב קריטי: קצב פריימים לא עקבי, נראות חלקית בזירה או טשטוש תנועה יפחיתו ישירות את דיוק המעקב. סרטונים שאינם עומדים בקריטריוני איכות לא צריכים להיכלל בהכשרה או בהסקה.
2. יצירת הפרויקט ותצורתו
   1. הקצה ספריית וידאו לפרויקט, תוך שימוש באותם סרטונים המיועדים לניתוח או בתת-קבוצה מייצגת להדרכת רשת.
   2. הפעל את סביבת Python וייבא את חבילת DeepLabCut.
   3. צור פרויקט DeepLabCut חדש באמצעות הפקודה:
   4. deeplabcut.create_new_project('שם הפרויקט', 'המחבר', 'נתיב הווידאו').
   5. הגדר את נקודות הציון האנטומיות (חלקי גוף) המעניינים בקובץ config.yaml, תוך הבטחת הגדרות ברורות ועקביות אנטומית.
   6. הגדרות חלקי הגוף צריכות להיות מותאמות לשאלה הניסויית ולהישאר זהות בכל בעלי החיים והמפגשים.
3. חילוץ שלדה ותיוג חלקי גוף
   1. ציין התחלה, עצירה, numframes2extract ו-cropping_parameters בקובץ config.yaml בהתאם לאורך הווידאו ולפריסה מרחבית.
   2. חלץ מסגרות מייצגות באמצעות: deeplabcut.extract_frames(config_path, 'אוטומטי', 'kmeans'/'uniform').
   3. בדוק את המסגרות שהוצאו כדי לאשר הכללת שונות ביציבת הגוף, בכיוון הגוף, במיקום הגפיים ובכיסוי שלב ההליכה לאורך ההקלטה. אם תנוחות מסוימות, תצורות גפיים או שלבי תנועה מיוצגים פחות מדי, יש להוציא מסגרות נוספות כדי לייצג טוב יותר את התנאים הללו.
   4. כאשר נדרשים שלבים מסוימים של מחזורי הליכה, יש להוציא מסגרות ידנית באמצעות: deeplabcut.extract_frames(config_path, 'ידני').
   5. הפעל את ממשק התיוג הגרפי באמצעות: deeplabcut.label_frames(config_path).
   6. יש לתייג את כל נקודות הציון האנטומיות המוגדרות מראש המוצגות באיור 2, כולל פריים הווידאו המייצג במהלך הרכישה (איור 2A), זיהוי נקודות גוף אוטומטי שמונח על המסגרת המקורית (איור 2B), והייצוג הסכמטי של סימני הגוף המוגדרים ונקודות ייחוס בזירה המשמשים לניתוח (איור 2C). יש לעקוב אחרי קריטריונים אנטומיים עקביים (למשל, אף: קצה קדמי של החוטם; בסיס הזנב: מפגש בין עמוד השדרה לזנב)
   7. סמנו את כל ארבעת הגפיים בעקביות על ידי מיקום כל נקודת ציון במרכז כף הרגל מעל כריות כף הרגל במגע עם הקרקע.
   8. שמור ובדוק את התוויות באמצעות: deeplabcut.check_labels(config_path), ותקן הערות שגויות במידת הצורך.
   9. כאשר זה אפשרי, בקש מעריך נוסף מיומן לסמן תת-קבוצה של פריימים כדי להעריך עקביות בין המדרגים.
      הערה: שלב קריטי: תיוג לא עקבי או אנטומי לא מדויק הוא מקור מרכזי לטעויות מעקב במורד הזרם. ודא עמידה קפדנית בהגדרות של נקודות ציון דרך בכל המסגרות.
4. אימון רשתות עצביות
   1. לאמן את מודל הערכת התנוחה ל-200 אפוקלים ולקבל שגיאת אימון ממוצעת סופית (RMSE) של 3.27 פיקסלים ושגיאת בדיקה ממוצעת של 3.59 פיקסלים, התואמים לביצועי מעקב יציבים בתנאי הרכישה המתוארים.
   2. צור את מערכי הנתונים להדרכה והערכה באמצעות: deeplabcut.create_training_dataset(config_path).
   3. כוון את פרמטר Training Fraction ב-config.yaml כדי להגדיר את אחוז התמונות המשמש באימון.
   4. אמת זמינות כרטיס מסך על ידי הרצה: nvidia-smi.
   5. התחל אימון רשת באמצעות: deeplabcut.train_network(config_path, save_epochs=5, epochs=200).
   6. עקוב אחרי אובדן האימון והפסיקו את האימון כאשר ערכי הירידה מתייצבים וללא שיפור נוסף.
   7. אם האימון מופרע, תמשיך מהנקודת הביקורת האחרונה שנשמרה.
   8. הערך את המודל המאומן שמשתמש ב: deeplabcut.evaluate_network(config_path) ורשם את שגיאת הפיקסל הממוצעת.
   9. אם השגיאה חורגת מהסף המקובל להגדרת הניסוי, הוסף מסגרות מסומנות נוספות או שפר הערות וחזר על אימון נוסף.
      הערה: ספי שגיאת פיקסלים מקובלים עשויים להשתנות בהתאם לרזולוציית המצלמה ולגודל הזירה, אך צריכים להישאר עקביים בין ניסויים.
5. ניתוח וידאו וכימות הליכה
   1. התייחס לנקודות עם ערך הסתברות מתחת ל-0.3 כחסרות.
   2. אינטרפולציה לינארית של נקודות חסרות רק כאשר הפערים הם ≤3 פריימים רצופים; לשלול פערים ארוכים יותר בניתוח.
   3. הגדר קפיצות מנוע באמצעות סף מהירות במרכז הגוף של 10 ס"מ/שנייה.
   4. החריגו תנועות מתחת לסף זה ואירועים חולפים הקצרים מ-3 פריימים.
   5. הרץ הסקה על סרטונים ניסיוניים באמצעות: deeplabcut.analyze_videos(config_path, [video_path], save_as_csv=נכון).
   6. יצר סרטונים מתויגים באמצעות: deeplabcut.create_labeled_video(config_path, [video_path]) כדי לאשר ויזואלית את איכות המעקב (איור 2).
   7. הגדר את פרמטר pcutoff ב-config.yaml ל-0.6 כדי להחיל סף ביטחון במהלך המעקב אחרי ויזואליזציה והערכה.
   8. ייבא את קבצי ה-CSV של הפלט לסביבת המחשוב הסטטיסטית המופיעה בטבלת החומרים, יחד עם חבילת הניתוח המתאימה והסקריפטים המותאמים המסופקים בחומר משלים 1 לצורך כימות התנהגותי.
   9. המרו את מדדי הפריימים לזמן באמצעות קצב הדגימה המקורי של הווידאו.
   10. כיול ממדים מרחביים על ידי הפיכת קואורדינטות פיקסלים ליחידות פיזיות באמצעות ממדי הזירה הידועים ונקודות ציון בפינות הזירה המעקבות.
   11. בצע בקרת איכות על הקואורדינטות המעקבות לפני חילוץ מטריות.
   12. התייחס לנקודות עם ערך הסתברות מתחת ל-0.3 כחסרות ולהחליפן באינטרפולציה ליניארית כאשר זה מתאים.
   13. זהה מסלולים יוצאי דופן במהלך בדיקה ויזואלית ותקן או החריג אותם בעת הצורך.
   14. הגדר קטעי הליכה באמצעות קריטריונים קינמטיים מסונכרנים המבוססים על הזזת מרכז הגוף ותנועת הגפה האחורית.
   15. להחריג התנהגויות לא ניידות כמו התרוממות, סיבוב וטיפוח.
   16. כיול וחדד ידנית את ספי ההגדרה בהתאם לתנאי הניסוי ולמודל החי כדי לשמור רק על קטעי תנועה חזקים ורציפים לניתוח.
   17. חשב מדדי הליכה שמקורם בקשרים גאומטריים וזמניים בין נקודות ציון שנעקבו באמצעות מקטעי תנועה רציפים מסוננים (טבלה 1). אלה כללו אורך צעד, אורך צעד, רוחב צעד, קצב, משך צעד, משך צעד, זמן עמידה, זמן נדנוד, משרעת במקביל, ומדידות תזוזה ספציפיות לגפה.
   18. חלץ מדדים של שדה פתוח מההקלטה המלאה באמצעות אותם נתוני מעקב (טבלה 1). אלה כללו את המרחק הכולל שנעבר, מהירות ממוצעת, זמן תנועה, אחוז הזמן בתנועה, מספר ומשך ההליכה, ומרחק מצטבר שנכסה במרכז, בשוליים ובפניות.
   19. לאסוף את כל הפלטים לקובץ מאסטר מובנה לניתוח סטטיסטי במורד הזרם.
   20. יצר ייצוגים ויזואליים (למשל, מסלולים, מפות חום, הזזה מבוססת זמן, דפוסי הליכה, וגרפים של תיאום בין גפיים) באמצעות הסביבות החישוביות המפורטות בטבלת החומרים ובסקריפטים שתוארו לעיל.
   21. ויזואליזציות מסונכרנות מייצגות של ביטחון נקודתי, זיהוי קצב הליכה, סיווג אזורי חקר ותיאום בין גפיים מסופקים בסרטון משלים 1 וסרטון משלים 2 כדי להקל על פרשנות זרימת העבודה האנליטית.
6. בקרת איכות וגיבוי נתונים
   1. בדוק ויזואלית תת-קבוצה אקראית של סרטונים מתויגים כדי לוודא עקביות אנטומית בין פריימים וסשנים.
   2. השווה מיקומי נקודות ציון חזויים עם תוויות עם הערות כדי לאמת יציבות והכללה של המודל.
   3. שמור עותק מלא של הפרויקט, כולל config.yaml, תוויות מקוריות, משקלי רשת מאומנים וקבצי פלט.
   4. תעד את גרסאות התוכנה המשמשות בזרימת העבודה, כולל DeepLabCut, Python, PyTorch, CUDA וסביבת המחשוב הסטטיסטית, יחד עם מפרטי ה-GPU ותאריך הניתוח.
   5. יצר דוח סיכום של טעויות ממוצעות וזמני עיבוד מ-evaluation-results.csv.
   6. גבה את כל הפרויקט לארכיון מקומי ולשרת מוסדי או לאחסון ענן מאובטח.
7. סביבה חישובית ומשאבים לשחזור
   1. ללכוד הקלטות וידאו מקוריות ב-. פורמט MOV ברזולוציה של 1080 × 1920 פיקסלים וכ-60 FPS.
   2. תעבד מראש ותמיר את הסרטונים לפורמט .avi.
   3. במהלך שלב ההמרה הזה, חתכו את אזור העניין, שנו את גודלו לרזולוציה ריבועית של 720 × 720 פיקסלים, וסטנדרטים את קצב הפריימים ל-60 FPS קבוע כדי להבטיח כימות זמני מדויק במהלך ניתוח קינמטי מאוחר.
   4. מימוש תהליך המעקב ללא סימנים באמצעות DeepLabCut גרסה 3.0.0rc13 בסביבת פייתון המוגדרת עם Python 3.12.12, PyTorch 2.5.1 ו-CUDA 11.8.
   5. לאמן את מודל הערכת התנוחה ל-200 אפוקלים ולקבל שגיאת אימון ממוצעת סופית (RMSE) של 3.27 פיקסלים ושגיאת בדיקה ממוצעת של 3.59 פיקסלים.
   6. בצע ניתוח לאחר מעקב באמצעות סביבת המחשוב הסטטיסטית והסקריפטים המותאמים המסופקים בחומר משלים 1 לכימות הליכה ושדה פתוח.
   7. השתמש בסף מהירות במרכז הגוף של 10 ס"מ/ש כדי לזהות התקפי הליכה. מלא פערים של עד 3 פריימים בין תקופות מנוע ומונע תנועות חולפות קצרות מ-3 פריימים כדי לשמור על קטעי הליכה רציפים לניתוח.
   8. ספק את הגדרות config.yaml הרלוונטיות, סקריפטים לניתוח מייצגים, דוגמאות לקבצי וידאו ומעקב, ומשקלי מודלים בחומר משלים 1.
   9. ספק פרטים נוספים על מימוש, מדדי הערכת מודלים, מפרטי חומרה ופרמטרי ניתוח ספציפיים למקרה בחומר משלים 1, כאשר רלוונטי.
      הערה: התאימו פרמטרים אלו בהתאם לתנאי הרכישה ששימשו בכל ניסוי.

איור 2: זרימת עבודה מייצגת למעקב נקודות גוף ללא סימנים וניתוח הליכה מהקלטות וידאו. (א) מסגרת וידאו מייצגת של עכבר הנע בחופשיות בזירה הפתוחה במהלך הרכישה. (ב) דוגמה לזיהוי אוטומטי של נקודת גוף המונח על פריים הווידאו המקורי לאחר הערכת תנוחה, הממחיש את סימני האנטומיה המשמשים לניתוח. (ג) ייצוג סכמטי של סימני הגוף המוגדרים ונקודות ייחוס בזירה המשמשים לשחזור הליכה, כיול מרחבי וניתוח תנועה כמותי. נקודות ציון ונקודות ייחוס בזירה: חוטם, גרון, מרכז גוף, מרכז גוף שמאלי (bcl), מרכז הגוף ימין (bcr), ירך שמאל (ירך), ירך ימין (ירך), בסיס זנב, מרכז זנב, קצה זנב, כף רגל שמאלית קדמית שמאלית (LFP), כף רגל שמאלית שמאלית (LHP), כף רגל קדמית ימין (RF), כף רגל אחורית ימין (RHP), שמאל עליון (tl), ימין עליון (tr), שמאל תחתון (bl), ותחתון ימין (br). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

תוצאות

לאחר יישום תהליך המעקב והניתוח, עיבוד אוטומטי שיחזר תנועה פתוחה ספונטנית באמצעות סימן מרכז הגוף שהוגדר ויצר פלטים כמותיים המתאימים לניתוח במורד הזרם. תרשימי מסלול מייצגים ממחישים כיצד הפרוטוקול לוכד הזזה מרחבית ברחבי הזירה, תפוסה זמנית ודינמיקת מהירות במהלך חקירה חופשית. משתני השדה הפתוח המוצגים בחלק זה חושבו מההקלטה המלאה, והקלטות מייצגות נכללות כדי להמחיש את זרימת העבודה ואת סוגי תוצרי התנועה וההליכה שנוצרים על ידי הפרוטוקול.

בהקלטה מייצגת שאינה Tg, מסלול מרכז הגוף המשוחזר מראה הזזה רציפה בר...

דיון

מחקר זה מציג גישה זולה וללא סימנים לניתוח תנועה והליכה ספונטנית בעכברים נעים בחופשיות, באמצעות רכישת וידאו סטנדרטית והערכת תנוחה מבוססת DeepLabCut בתוך זרימת עבודה נגישה. תהליך העבודה מאפשר חילוץ של משתנים הקשורים למנועי תנועה והליכה מהקלטות וידאו, תוך שמירה על התנהגות טבעית של תנועת התנועה והפחתת הפרעות ניסויים. במובן זה, הפרוטוקול מציע חלופה מעשית ונגישה למחקרים פרה-קליניים של התנהגות מוטורית.

הפרוטוקול הודגם במודל עכבר טרנסגני של מחלת אלצהיימר, כיישום מייצג...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
70% אתנול	גנרי	N/A	ניקיון הזירה בין הפעלות
מנורות אור לבן מתכווננות	גנרי	N/A	שמירה על תאורה קבועה (100–150 lx)
ווילות שחורות/בקרת סנוור	גנרי	N/A	הפחתת אור חיצוני/השתקפויות
תבנית רשת מרובעת	גנרי	N/A	תמונת התייחסות לכיול מרחבי
DeepLabCut (v3.0.0rc13)	קוד פתוח	N/A	תוכנת אומדן תנוחה
מצלמת וידאו דיגיטלית (HD, 16:9; ≥60 fps)	גנרי	N/A	הגדרות קבועות לאורך הפעלות
תחנת עבודה GPU של Nvidia	בנייה מותאמת אישית	N/A	חומרה לאימון/הסקת מודל
מונה לוקס	גנרי	N/A	אימות תאורה ברמת הזירה
PyTorch	קרן Pytorch	N/A	מסגרת הנדרשת על ידי DeepLabCut
זירת שדה פתוחה אקרילית שקופה (42 × 42 × 42 ס"מ)	תוצרת מיוחדת / תוצרת בית	N/A	זירת שדה פתוחה
תושבת מצלמה מתחת לזירה (90° תצוגה)	תוצרת מיוחדת / תוצרת בית	N/A	תושבת יציבה להקלטה תחתונה
CUDA	תאגיד נווידיה	N/A	עיבוד מקבילי מואץ GPU
שפת תכנות R	קרן R	N/A	שפת תכנות לניתוח נתונים