הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פרוטוקול מבוסס סוראט שניתן לשחזור לניתוח ריצוף RNA חד-תאי תאי CD4+ של תאי T חד-גרעיניים בדם היקפיים במהלך הדבקה חוזרת במלריה

106 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70858

⸱

31 ביולי 2026

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Ilorin

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מבוסס סוראט שניתן לשחזור לניתוח נתוני ריצוף RNA חד-תאים מתאי CD4⁺ של תאי T חד-גרעיניים בדם, במטרה לאפיין הטרוגניות שעתוקית ותוכניות חיסון תפקודיות במהלך הדבקה חוזרת במלריה. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי, השוואה ופרשנות ביולוגית עקבית של מצבי תאי T דינמיים של CD4⁺ ותגובות חיסוניות במצבים שונים.

תקציר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מבוסס סוראט שניתן לשחזור לניתוח נתוני ריצוף RNA חד-תאלי של תאי T של PBMC CD4⁺ לאורך נקודות זמן של הידבקות חוזרת במלריה. פרוטוקול זה מדגים תהליך עבודה מבוסס Seurat שניתן לשחזור לניתוח נתוני scRNA-seq של תאי T של PBMC CD4⁺ בנקודות זמן של הידבקות חוזרת במלריה, תוך שימוש במאגרי נתונים ציבוריים מייצגים להדגמת יישומו: מערך נתונים CD4⁺ T-cell מסוג TCR-טרנסגני ספציפי לפלסמודיום (GSE233703) ומערך תאי T פוליקלונלי CD4⁺ המשווה נקודות זמן הקשורות להדבקה חוזרת (GSE233713; D27₍₃₎ לעומת D30). תהליך העבודה כולל עיבוד מקדים סטנדרטי, אינטגרציה, אשכולות וניתוחים טרנסקריפטומיים במסגרת חישובית מאוחדת. השיטה מאפשרת חישוב שיטתי של ציוני מודול עבור תוכניות חיסון מוגדרות מראש ותוכניות תאי T מסוג CD4⁺, זיהוי גנים של סמנים ספציפיים לאשכול, ניתוח ביטוי דיפרנציאלי לפי נקודת זמן, והעשרת מסלולי אונטולוגיית גנים ו-KEGG. יישום זרימת עבודה זו מזהה מצבים פונקציונליים מובחנים של תאי T מסוג CD4⁺ וחושף שינויים דינמיים בתעתוק בין נקודות זמן של הידבקות חוזרת במלריה. הפרוטוקול מייצר פלטי ויזואליזציה סטנדרטיים ותוצאות טבלאות ומספק הנחיות מעשיות לבחירת פרמטרים ופתרון תקלות, ומקל על ניתוח עקבי וניתן לשחזור של מערכי נתונים scRNA-seq של תאי CD4⁺ במלריה ובהקשרים אימונולוגיים קשורים. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח שכפול וביולוגי של תגובות חיסוניות, וניתן ליישמו על מערכי נתונים דומים של תא יחיד במחקר אימונולוגי.

מבוא

מלריה נותרה נטל בריאותי עולמי משמעותי, כאשר זיהומים חוזרים מעצבים את חסינות המארח בדרכים מורכבות ובלתי מובנותלחלוטין 1. תאי ה-CD4⁺ ממלאים תפקיד מרכזי בתגובות החיסוניות נגד מלריה על ידי תיאום ייצור ציטוקינים אפקטוריים, תמיכה בסיוע תאי B וויסות דלקת 2,3. במהלך הדבקה חוזרת במלריה, תאי ה-CD4⁺ T עוברים תכנות מחדש דינמי של שעתוק, המשקף שינויים בין מצבים אפקטוריים, רגולטוריים, זיכרון, רבייה ומצבים מותשים, המשפיעים הן על שליטה בטפילים והן על אימונופתולוגיה 4,5. פתרון מדויק של ההטרוגניות הזו חיוני להבנת ההגנה החיסונית, תפקוד לקוי החיסוני ועמידות החסינות הנרכשת באופן טבעי או כתוצאה מחיסונים לזיהום פלסמודיום. כאן אנו מציגים פרוטוקול מבוסס סוראט שניתן לשחזור לניתוח נתוני scRNA-seq של תאי T מסוג CD4⁺ לאורך נקודות זמן של הדבקה חוזרת במלריה.

ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) מאפשר אפיון ברזולוציה גבוהה של הטרוגניות חיסונית וזיהה תת-קבוצות תאי CD4⁺ T המגיבים לטפילים, תוכניות התשה ורשתות רגולטוריות במלריה 6,7,8,9. עם זאת, שונות אנליטית בבקרת איכות, נרמליזציה, אשכולות ואינטגרציה עלולה להגביל את השחזוריות ולסבך השוואות בין מחקרים10,11. עם זאת, אין זרימת עבודה סטנדרטית ומונחית ביולוגית המותאמת במיוחד לניתוח דינמיקת תאי T של CD4⁺ במהלך הדבקה חוזרת במלריה.

מסגרות חישוב קיימות לניתוח scRNA-seq, כולל Seurat ו-Scanpy, מספקות מערכי כלים מקיפים לעיבוד מוקדם, אשכולות ופרשנות במורד הזרם של נתוני תא יחיד 12,13,14. Seurat, שמיושם ב-R, מציע תהליכי עבודה משולבים היטב לנרמל, אינטגרציה של נתונים והדמיה, כולל גישות מייצבות שונות כמו SCTransform שמשפרות את זיהוי האותות במערכי נתונים חיסוניים הטרוגניים13. Scanpy, שמיושם בפייתון, מספק פתרונות ניתנים להרחבה המותאמים למאגרי נתונים גדולים ולשימוש יעיל בזיכרון, מה שהופך אותו למתאים במיוחד לניתוחים מבוססי תפוקה גבוההאו ענן 12,14. למרות ההתקדמות הזו, עדיין קיימת צורך בתהליכי עבודה סטנדרטיים וניתנים לשחזור המתמודדים במפורש עם שאלות ביולוגיות בסביבות זיהום, תוך שמירה על שקיפות, הסתגלות ועקביות בין מערכי הנתונים. הפרוטוקול הנוכחי מתמודד עם פער זה על ידי שילוב עמידות של עיבוד מוקדם מבוסס סוראט עם פרשנות ביולוגית מובנית המותאמת לתגובות תאי T של CD4⁺ במהלך הדבקה חוזרת במלריה. בהשוואה לתהליכי עבודה כלליים קיימים, פרוטוקול זה מדגיש שחזוריות, בחירת פרמטרים מבוססת ביולוגית, וניתוח עקבי בין נקודות זמן המותאם למודלים של זיהום.

מאפיין מרכזי של פרוטוקול זה הוא הדגש על שחזוריות ושימושיות מעשית. ספי בקרת איכות אינם קבועים אלא נגזרים באמצעות גישות אדפטיביות לנתונים המבוססות על סטייה מוחלטת חציונית, המאפשרות ספי מורכבות תמלול, עומק ריצוף ותוכן מיטוכונדריאלי להתרחב עם התפלגויות ספציפיות למאגר נתונים. עיצוב זה הופך את זרימת העבודה לרלוונטית על פני מאגרי נתונים בגדלים משתנים, בדרך כלל בין כמה אלפי תאים לעשרות אלפי תאים, ובטווח רחב של עומקי ריצוף הנפוצים בניסויים מבוססי טיפות של scRNA-seq. ההנחיות המוטמעות בזרימת העבודה תומכות בבחירת פרמטרים מתאימה להפחתת ממדיות, פתרון אשכולות ואינטגרציה, ומבטיחה שהניתוחים יישארו בעלי משמעות ביולוגית וחזקים מבחינה טכנית. עם זאת, זרימת העבודה תלויה באיכות הנתונים ובעומק הרצף ועלולה לדרוש התאמה עבור מערכי נתונים עם דלילות קיצונית או אפקטים אצווה.

פרוטוקול זה מיועד למשתמשים בינוניים ומתקדמים עם היכרות בסיסית בניתוח R וניתוח תא יחיד, תוך שמירה על נגישותו למתחילים מוטיבציה באמצעות יישום מובנה, שלבי-שלבי ופלטים שניתן לשחזר במלואם. תהליך העבודה מייצר טבלאות ומספרים סטנדרטיים בכל שלב, כולל סיכומי בקרת איכות, פלטי אשכולות, תוצאות ביטויים דיפרנציאליים וניתוחי העשרה, ובכך מקל על שקיפות, אימות ושימוש חוזר בהקשרים שיתופיים או מרובי מחקרים. פרוטוקול זה מתאים במיוחד למחקרים החוקרים הטרוגניות חיסונית בין נקודות זמן או תנאים במחקר זיהום ואימונולוגיה.

השיטה מספקת זרימת עבודה מבוססת Seurat מקצה לקצה לשכפול עבור ניתוח scRNA-seq של תאי CD4⁺ T לאורך נקודות זמן של זיהום חוזר במלריה. הוא משלב בקרת איכות אדפטיבית, ייצוב שונות, הפחתת ממדים, אשכולות ואינטגרציה של מספר דגימות כאשר מתאים13,15. כדי לשפר את הפירוש הביולוגי, זרימת העבודה משלבת ניקוד מודולי גנים תת-קבוצה של תאי T של מערכת החיסון ו-CD4⁺ כדי לכמת תוכניות פונקציונליות כולל Th1, Tfh, Tr1, Treg, זיכרון מרכזי, זיכרון אפקטור, התפשטות, ציטוטוקסיות ותשישה 16,17,18. זיהוי סמני אשכולות משלים, ניתוח ביטוי שונה בנקודת זמן והעשרת מסלולים באמצעות מסדי נתונים של Gene Ontology ו-KEGG כלולים לתמיכה באנוטציה והשוואה חזקה של מצבי תאי T19,20. למרות שהודגם באמצעות מערכי נתונים זמינים לציבור מסוג Plasmodium scRNA-seq, פרוטוקול זה רלוונטי באופן רחב למודלים אחרים של הדבקה חוזרת במלריה ולהפרעות חיסוניות שבהן נדרש ניתוח חד-תאי שניתן לשחזור ולפרשנות של תאי CD4⁺ T. בסך הכול, פרוטוקול זה מספק מסגרת ניתנת לשחזור וניתנת לפרשנות ביולוגית לניתוח תא יחיד של תגובות תאי T של CD4⁺, ותומכת בחקירה מעמיקה של דינמיקת מערכת החיסון במלריה ובמערכות קשורות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה:

כל הנתונים ששימשו במחקר זה התקבלו ממאגרי נתונים זמינים לציבור (GSE233703 ו-GSE233713). המחקרים המקוריים עמדו בהנחיות מוסדיות ואתיות לניסויים בבעלי חיים. מחקר זה כלל ניתוח ביואינפורמטיקה משני של מאגרי נתוני ריצוף RNA חד-תאיים זמינים לציבור ושלא זוהו, שהושגו ממאגר Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE233703 ו-GSE233713). לא היו מעורבים משתתפים אנושיים חדשים, דגימות קליניות או מידע מזוהה על מטופלים במחקר זה. על פי ההנחיות המוסדיות והלאומיות למחקר הכולל מאגרי נתונים אנונימיים זמינים לציבור, לא נדרשו אישור אתי נוסף והסכמה מדעת לניתוח ביואינפורמטיקה זה. המחקרים המקוריים הקשורים למאגרי נתונים אלו נערכו בהתאם לסטנדרטים אתיים מוסדיים רלוונטיים ולהנחיות רלוונטיות למחקר ביו-רפואי.

1. תהליך ניתוח CRNA-seq מבוסס CD4⁺ T-cell מבוסס Seurat לשחזור עבור GSE233703 ו-GSE233713

הערה: תהליך עבודה זה מסופק כקובץ משלים S1. כמו כן, יש לעיין בסכמטיקה שמציגה סקירה של כל תהליך העבודה (איור 1).

  1. הגדירו את ההיקף והמשתמשים המיועדים לפני תחילת הפרוטוקול
  2. הגדר את המשתמשים המיועדים
    1. השתמשו בפרוטוקול זה אם המשתמש מכיר את הניתוח של R וניתוח ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq).
    2. יישם תהליך עבודה זה על מערכי נתוני תאי T של עכברים CD4⁺ שנוצרים בפורמט מטריצה בסגנון 10x. השתמשו במבנה השלבי ובפלטים הצפויים כדי לאמת כל שלב לפני ההתקדמות.
      הערה: ודאו נהלי טיפול נכונים בנתונים ואחסון מאובטח בעת עבודה עם מערכי ריצוף גדולים.
  3. הגדר scRNA-seq
    1. לטפל בריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) כשיטה טרנסקריפטומית²¹ שמכמת את ביטוי הגנים בתאים בודדים.
    2. השתמש ב-scRNA-seq לזיהוי מצבי תאים בדידים, אוכלוסיות מעבר ותוכניות חיסון הטרוגניות בתוך רקמות מורכבות.
  4. הכינו דרישות תוכנה וחבילה
  5. התקנת תוכנת ליבה
    1. התקן את R 4.2 או מאוחר יותר.
    2. פתח את ממשק RStudio. הגדר את התיקייה העובדת באמצעות setwd().
    3. הרץ סקריפטים ברצף באמצעות פונקציית source(). רשם את הגרסאות המדויקות של R, RStudio ומערכת ההפעלה בהערות הפרויקט.
  6. התקנת חבילות R
    1. התקן את חבילות ה-CRAN הנדרשות: Seurat, Matrix, tidyverse, patchwork, pheatmap, RColorBrewer, cluster, glmGamPoi ו-ggplot2.
    2. התקן את חבילות Bioconductor הנדרשות: clusterProfiler, org. Mm.eg.db, enrichplot ו-DESeq2.
    3. התקן חבילות אופציונליות רק במידת הצורך: DoubletFinder להסרת doublet ו-monocle3 לניתוח מסלול. טען את כל החבילות הנדרשות בתחילת סשן הניתוח.
  7. גרסאות תקליטים
    1. שמור את פרטי החבילה והסשן בסוף תהליך העבודה באמצעות sessionInfo() או פונקציה מקבילה.
    2. דווח על רכיבי ניתוח מרכזיים במפורש בכתב היד, כולל גרסת R, גרסת Seurat, גרסת DESeq2 וגרסת clusterProfiler.
  8. הרץ פקודות התקנה לדוגמה שהוזכרו בקובץ המשלים 2
  9. אשר דרישות חומרה ואחסון
  10. אשר משאבים מינימליים
    1. השתמש בתחנת עבודה עם לפחות 16GB RAM, 4 ליבות CPU ו-20GB שטח דיסק פנוי לניתוח שגרתי של מערכי נתונים המכילים כמה אלפי עד עשרות אלפי תאים.
  11. אשר משאבים מומלצים
    1. השתמש ב-32GB RAM או יותר לניתוחים משולבים, גרפים חוזרים או זיהוי כפול אופציונלי.
    2. הגדילו את future.globals.maxSize אם אובייקטים גדולים או מערכי נתונים משולבים גורמים לשגיאות הקשורות לזיכרון.
    3. יישום הגדרת זיכרון לדוגמה
  12. הרץ את הפקודות הבאות כדי להגדיר את אפשרויות הזיכרון המוזכרות בקובץ המשלים 2

2. ליצור את מבנה הפרויקט

  1. צור את תיקיית פרויקט השורש
    1. צור תיקיית פרויקטים לניתוח.
    2. צור תתי-תיקיות בשם data/, scripts/, ו-results_spleen_cd4/.
  2. השתמש במבנה פלט סטנדרטי
    1. ודא שזרימת העבודה כותבת פלט לתיקיות הבאות:
      results_spleen_cd4/GSE233703/fig/
      results_spleen_cd4/GSE233703/טבלאות/
      results_spleen_cd4/GSE233703/rds/
      results_spleen_cd4/GSE233713/fig/
      results_spleen_cd4/GSE233713/שולחנות/
      results_spleen_cd4/GSE233713/rds/
      results_spleen_cd4/post_markers/
  3. השתמש בשמות קבצים עקבי
    1. שנה את שם קבצי הקלט של GEO כך שיתאימו לנתיבים שסקריפט מצפה להם.
    2. השתמש בשמות הקבצים המדויקים הבאים:
      נתונים/GSE233703_matrix.mtx.gz
      נתונים/GSE233703_genes.tsv.gz
      נתונים/GSE233703_barcodes.tsv.gz
      נתונים/GSE233713_d27_3_matrix.mtx.gz
      נתונים/GSE233713_d27_3_features.tsv.gz
      נתונים/GSE233713_d27_3_barcodes.tsv.gz
      נתונים/GSE233713_d30_matrix.mtx.gz
      נתונים/GSE233713_d30_features.tsv.gz
      נתונים/GSE233713_d30_barcodes.tsv.gz
    3. שמות קבצי מטא-דאטה אופציונליים כך:
      נתונים/GSE233703_cell_metadata.csv
      נתונים/GSE233713_cell_metadata.csv
  4. אישור דרישות מטא-דאטה
    1. אשר שכל קובץ מטא-דאטה מכיל עמודת ברקוד. הוסף עמודות אופציונליות כמו דגימה, נקודת זמן, ושכפל כאשר זמינה.
    2. השתמש בהתאמות ברקוד מדויקות בין מטריצות מטא-דאטה וספירה.
      אזהרה: ודא שטריפלטים של מטריצה וקבצי מטא-דאטה קיימים במסלולים הצפויים לפני תחילת הייבוא.


3. ייבוא מטריצות ספירת ואימות שלמות קלט




    
	
  1. קרא מטריצות בסגנון 10x
      
		
    1. קרא כל קובץ matrix.mtx.gz כמטריצה דלילה.
      2. 
		
    2. קרא את קובץ התכונות (או הגנים) המתאימים ואת קובץ הברקוד כטבלאות המוגדרות בלשוניות.
      3. 
		
    3. הקצו סמלי גנים לשורות מטריצה באמצעות העמודה השנייה של קובץ התכונות כאשר זה זמין. אכיפת סמלי גנים ייחודיים באמצעות make.unique().
      4. 
		
    4. הקצה מזהי ברקוד לעמודות מטריצה.'
      5. 
	
    
	
    2. 
	
  2. הרצת פונקציית ייבוא לדוגמה
      
		
    1. הריצו את הקוד המוזכר בקובץ המשלים 2, כדי לייבא את המטריצה ולהקצות מזהים.
      2. 
	
    
	
    3. 
	
  3. אימות שלמות מטריצה
      
		
    1. ודאו שמספר שורות המטריצות שווה למספר התכונות. ודאו שמספר עמודות המטריצה שווה למספר הברקודים.
      2. 
		
    2. עצור את זרימת העבודה אם מתגלה אי התאמה.
      הערה: אם מתגלים אי-התאמות, בדוק את שלמות הקובץ וודא יישור נכון של קבצי הפיצ'ר והברקוד לפני הרצת השלב מחדש.
      נקודת ביקורת: המשך רק אם ספירת השורות תואמת תכונות וספירת העמודות תואמת לברקודים.
      3. 
	
    
	
    4. 





4. הגדרת לוחות סימון ומודול




    
	
  1. הגדר פאנלים של תאי T מסוג CD4⁺ הרלוונטיים למלריה
      
		
    1. הגדר פאנלים גנטיים עם שם עבור: Th1, Tfh, Tr1, Treg, Tcm, Tem, Exhaustion, Propleration, Cytotoxic, Activation_early, Interferon_response, Immune_regulation
      2. 
		
    2. אחסן את הפאנלים הללו ברשימת R בשם לצורך ניקוד מודולים במורד הזרם.
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. הרץ את קוד ה-R שהוזכר בקובץ המשלים 2 כדי להגדיר פאנלים גנטיים.
    3. 
	
  3. הגדר גנים לאימות סמנים
      
		
    1. הגדר פאנל אימות נפרד המכיל גנים של סמנים קנוניים כגון Foxp3, Bcl6, Cxcr5, Il21, Ifng, Ctla4, Pdcd1, Lag3, Tbx21, Tcf7 ו-Lef1.
      2. 
	
    
	
    4. 



5. יצירת אובייקטים ב-Seurat וחישוב מדדי בקרת איכות




    
	
  1. אתחול אובייקטים של Seurat
      
		
    1. צור אובייקט Seurat לכל מערך נתונים באמצעות min.cells = 3 ו-min.features = 0. אל תטילו סגירת תכונות שרירותיות בייבוא.
      2. 
		
    2. הוסף מטא-דאטה של מערך נתונים, דגימה ונקודת זמן. למזג מטא-דאטה אופציונלית באמצעות התאמת ברקוד.
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. הרץ דוגמה לאתחול אובייקטים של Seurat
      
		
    1. הרץ את קוד R שמוזכר בקובץ המשלים 2 כדי ליצור אובייקט Seurat ולהקצות מטא-דאטה.
      2. 
	
    
	
    3. 
	
  3. מדדי בקרת איכות חישוב
      
		
    1. חשב את שבר העתק המיטוכונדריאלי באמצעות הקידומת העכברית ^mt-.
      2. 
		
    2. כמת את המדדים הבאים
      nFeature_RNA
      nCount_RNA
      percent.mt
      3. 
	
    
	
    4. 
	
  4. הרץ את קוד הדוגמה שהוזכר בקובץ המשלים 2.
    5. 
	
  5. המחשת בקרת איכות לפני הסינון
      
		
    1. יצר גרפים לכינור עבור nFeature_RNA, nCount_RNA ו-percent.mt. יצר גרפים של פיזור תכונות עבור nCount_RNA מול nFeature_RNA ועבור nCount_RNA מול percent.mt.
      2. 
		
    2. שמור דמויות עם סינון מוקדם באמצעות שמות סטנדרטיים כמו QC_pre_filter_AllCells_vln.png ו-QC_pre_filter_AllCells_scatter.png.
      זהירות: צפו להתפלגויות רחבות של סינון מוקדם עם זנבות באיכות נמוכה ואולי חריגים עם מספר גבוה.
      3. 
	
    
	
    6. 



6. לגזור ספי בקרת איכות אדפטיביים ולסנן תאים באיכות נמוכה


    
	
  1. הסקת ספים ספציפיים למאגר נתונים
      
		
    1. טרנספורמציה לוגיתמית nFeature_RNA + 1 ו-nCount_RNA + 1. חשב את הסטייה המוחלטת החציונית והחציונית (MAD) עבור שני המשתנים המומרים.
      2. 
		
    2. הגדירו את הספים הבאים:
      min_features = 10^(חציון - 3 × MAD) - 1
      max_features = 10^(חציון + 3 × MAD) - 1
      min_counts = 10^(חציון - 3 × MAD) - 1
      max_counts = 10^(חציון + 3 × MAD) – 1
      3. 
		
    3. הגדר את סף המיטוכונדריה כאחוזון ה-95 של percent.mt ועוד 3 × MAD, מוגבל בין 5% ל-20%.
      4. 
		
    4. ודא ש-dataset_id, sample_id ו-out_dir מוגדרים נכון לפני הרצת הפונקציה.
      qc_thr <- derive_qc_thresholds(seu, dataset_id = "GSE233703", sample_id = "AllCells", out_dir = "results_spleen_cd4/GSE233703")
      5. 
	
    
	
    2. 
	
  2. החלת סינון
      
		
    1. לשמור תאים העומדים בכל הקריטריונים האדפטיביים:
      nFeature_RNA >= min_features
      nFeature_RNA <= max_features
      nCount_RNA >= min_counts
      nCount_RNA <= max_counts
      percent.mt <= max_percent_mt
      2. 
		
    2. הרץ את קוד הדוגמה שהוזכר בקובץ המשלים 2.
      3. 
	
    
	
    3. 
	
  3. שמירת פלטי סינון
      
		
    1. שמור QC_thresholds_*.csv ו-cell_counts_summary_*.csv.
      נקודת עצירה: שמור פלטים ביניים והמשך ניתוח מהשלב הזה במידת הצורך.
      2. 
		
    2. יצר ושמור גרפים של כינור ופיזור בקרת איכות לאחר סינון.
      נקודת ביקורת: צפו להתפלגות הדוקה יותר לאחר הסינון, הסרת תאים בעלי מורכבות נמוכה והפחתת חריגים קיצוניים.
      3. 
	
    
	
    4. 



7. נרמול נתונים וביצוע PCA


    
	
  1. נרמול ומייצב שונות
      
		
    1. נרמל את מבחן ה-RNA לפני ניקוד מחזור התאים. הרץ ניקוד במחזור תאים אם זה מופעל. השתמש ב-SCTransform() לייצוב שונות.
      2. 
		
    2. החזרת תוכן מיטוכונדריאלי רק אם הוא מוצדק ביולוגית ומופעל במפורש.
      3. 
		
    3. נגרר ציוני מחזור תאים רק אם נדרש לעיצוב המחקר.
      4. 
	
    
	
    2. 
	
  2. הרץ דוגמה לנרמול כפי שמוזכר בקובץ המשלים 2.
    3. 
	
  3. הגדרת ערכי פרמטרים
      
		
    1. השתמש n_variable_features = 3000.
      2. 
		
    2. השתמש dims_max_for_pca = 50.
      3. 
		
    3. ציין ערכים אלה במפורש בכתב היד.
      4. 
	
    
	
    4. 
	
  4. הרץ PCA ובחר רכיבים עיקריים
      
		
    1. הרץ PCA על הבדיקה המנורמלית. אשר ביצוע מוצלח של PCA על ידי בדיקת שונות, מוסברת ועומסי רכיבים עיקריים.
      2. 
		
    2. שונות חישובית מוסברת על ידי כל רכיב ראשי.
      3. 
	
    
	
    5. 
	
  5. בחרו מחשבים לפי שלושת הקריטריונים:
      
		
    1. לשמור על שחקני שחקן שמסבירים שונות של לפחות 1%,
      2. 
		
    2. להבטיח שהשונות המצטברת מגיעה לכ-80%,
      3. 
		
    3. להגביל את הבחירה הסופית בין 10 ל-40 שחקנים.
      4. 
		
    4. שמור PCA_variance_table_*.csv, PCA_selection_rationale_*.csv, ו-PCA_Elbow_*.png.
      5. 
	
    
	
    6. 
	
  6. הרצת דוגמה ל-PCA
      
		
    1. דוגמה כפי שצוין בתיק המשלים 2.
      נקודת ביקורת: צפו לגרף מרפק עם ירידה נראית לעין ברווח השונות השולית לאחר נקודת החיתוך שנבחרה.
      2. 
	
    
	
    7. 

















8. בניית שכונות, בחירת רזולוציה ותאי אשכול


    
	
  1. בניית מבנה גרף
      
		
    1. בנה גרף משותף של השכן הקרוב ביותר באמצעות ה-PCs שנבחרו.
      2. 
		
    2. הרץ אשכול ראשוני ברזולוציה נמוכה אם זיהוי כפול דורש תוויות אשכולות.
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. אפשרות להסיר את הדאבלטים
      
		
    1. הרץ את DoubletFinder רק אם מותקן ותואם.
      הערה: יש לבצע זיהוי כפול רק עבור מערכי נתונים עם מספר תאים גבוה שבהם צפויים ארטיפקטים מרובים.
      2. 
		
    2. חישוב מחדש של נרמול ו-PCA לאחר הסרת הדאבלט.
      3. 
	
    
	
    3. 
	
  3. בחירת רזולוציית אשכולות
      
		
    1. הערכת החלטות 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ו-1.2.8.3.2
      2. 
		
    2. חשב את רוחב הסילואט הממוצע עבור כל רזולוציה שנבדקה. בחר את הרזולוציה עם ציון הסילואט הגבוה ביותר בין פתרונות עם לפחות שני אשכולות.
      3. 
		
    3. שמור resolution_sweep_*.csv, resolution_selection_rationale_*.csv, ו-resolution_sweep_*.png.
      4. 
	
    
	
    4. 
	
  4. הרץ בחירת פתרון לדוגמה על ידי הרצת הקוד המוזכר בקובץ המשלים 2
    5. 
	
  5. הרץ את UMAP ואת האשכולות הסופיים.
      
		
    1. הרץ את UMAP עם המחשבים שנבחרו.
      2. 
		
    2. בנה מחדש את גרף השכן הקרוב ביותר. תאים באשכול באמצעות הרזולוציה שנבחרה.
      3. 
		
    3. שמור גרפים של UMAP מסומנים לפי אשכול ומקובצים לפי מדגם או נקודת זמן. בצע את הקוד הבא המוזכר בקובץ המשלים 2.
      אזהרה: צפו להפרדה יציבה של אשכולות ולמבנה UMAP שניתן לפרש בהתאם למצבים חיסוניים עיקריים.
      4. 
	
    
	
    6. 



9. ביצוע אינטגרציה מבוססת SCT עבור GSE233713


    
	
  1. הכנת חפצים נפרדים
      
		
    1. צור אובייקטים נפרדים של Seurat עבור D27_3 ו-D30.
      2. 
		
    2. יש להחיל בקרת איכות וסינון באופן עצמאי על כל דגימה. נרמל כל דגימה בנפרד עם SCTransform().
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. Justify integration
      
		
    1. השתמש באינטגרציה מבוססת SCT כדי להפחית הבדלים טכניים בין נקודות זמן תוך שמירה על מבנה ביולוגי משותף.
      2. 
		
    2. אל תניח שאינטגרציה היא אוטומטית מועילה. תאשר את זה במפורש.
      3. 
	
    
	
    3. 
	
  3. אינטגרציה של דגימות
      
		
    1. בחר תכונות אינטגרציה באמצעות SelectIntegrationFeatures(). הכין אובייקטים עם PrepSCTIntegration().
      2. 
		
    2. מצא עוגנים באמצעות FindIntegrationAnchors (normalization.method = "SCT"). אינטגרציה של מערכי נתונים עם IntegrateData(normalization.method = "SCT").
      3. 
	
    
	
    4. 
	
  4. הרץ אינטגרציה לדוגמה שהוזכרה בקובץ המשלים 2
    5. 
	
  5. אימות אינטגרציה
      
		
    1. יצר גרפים של UMAP לפני ואינטגרציה ואחרי האינטגרציה המקובצים לפי נקודת זמן. פרש שיפור בערבוב תאים בין נקודות זמן כהוכחה לאינטגרציה מוצלחת.
      2. 
		
    2. חישב ערבוב שכנים לפני ואחרי האינטגרציה. חשב את הרכב האשכול לפי נקודת זמן ויצר גרפים של הרכבים מוערמים.
      3. 
		
    3. שמור את הפלטים הבאים:
      UMAP_preintegration_*
      UMAP_postintegration_*
      integration_diagnostics_*
      cluster_timepoint_composition_*
      זהירות: צפו להפחתת הפרדה בנקודות זמן לאחר האינטגרציה, להגברת ערבוב השכנים ולתרומה מרובת נקודות זמן לרוב האשכולות מבלי לאבד לחלוטין את המבנה הביולוגי המשמעותי.
      4. 
	
    
	
    6. 



10. להוסיף הערות לאשכולות ולאמת את מבנה הסמנים




    
	
  1. ציון מודולים רלוונטיים למלריה
      
		
    1. הרץ AddModuleScore() עבור פאנלי תאי ה-T של המלריה CD4⁺ שהוגדרו מראש.
      2. 
		
    2. שמור ממוצעים ברמת אשכול ודירוג מודולים.
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. הרץ דוגמה לניקוד מודולים שהוזכר בקובץ המשלים 2
    3. 
	
  3. הקצאת תוויות אשכולות צפויות
      
		
    1. הקצה את המודול המדורג העליון לכל אשכול בתווית החזויה.
      2. 
		
    2. שמירה:
      cluster_module_score_means_*
      cluster_module_score_rankings_*
      cluster_predicted_labels_*
      3. 
	
    
	
    4. 
	
  4. אימות אשכולות עם סימנים קנוניים
      
		
    1. הרץ אימות סימני DotPlots ו-FeaturePlots באמצעות לוח הסימנים הקנוני.
      2. 
		
    2. שמירה:
      DotPlot_marker_validation_*
      FeaturePlot_marker_validation_*
      זהירות: צפו לביטוי תואם של גנים קנוניים מרובים במצב פונקציונלי, ולא לאותות חד-גנים מבודדים.
      3. 
	
    
	
    5. 



11. זיהוי סימנים וביצוע ביטויים דיפרנציאליים.




    
	
  1. מצא סימני אשכול
      
		
    1. הרץ את FindAllMarkers() רק באמצעות סמנים חיוביים.
      2. 
		
    2. שמור markers_all_clusters_*.csv.
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. הרץ את הקוד המוזכר בקובץ המשלים כדי להריץ את זיהוי הסמן לדוגמה
    3. 
	
  3. השתמש בביטוי דיפרנציאלי מודע לשכפול כאשר הוא זמין
      
		
    1. בדוק אם קיימים מטא-דאטה משוכפלים תקפים. אם קיימים שכפולים, יש לספור לפי שכפול ותנאי ולהריץ DE פסאודו-bulk עם DESeq2.
      2. 
		
    2. שמור DE_pseudobulk_*.
      3. 
	
    
	
    4. 
	
  4. השתמש בביטוי דיפרנציאלי חקרני ברמת התא כאשר חסרים שכפולים
      
		
    1. אם חסרים או חסרים מטא-דאטה משוכפלים, הרץ DE תא יחיד כניתוח חקר.
      2. 
		
    2. שמור את DE_WARNING_* כדי לתעד את הסטטוס החקר. שמור תוצאות חקר כ-DE_exploratory_celllevel_*.
      3. 
	
    
	
    5. 
	
  5. יצירת פלטי ביטויים דיפרנציאליים גלובליים
      
		
    1. צור גרפים של הרי געש לתוצאות DE ושמור Volcano_*.
      2. 
		
    2. שמור תוצאות DE משמעותיות בטבלאות מסוננות.
      3. 
	
    
	
    6. 
	
  6. יצירת פלטי העשרה פונקציונלית
      
		
    1. הרץ העשרת תהליך ביולוגי של GO ושמור GO_BP_*. הרץ את העשרת KEGG ושמור KEGG_*.
      2. 
		
    2. הרץ את GSEA באמצעות שינויי Ranked log2 ושמור GSEA_GO_*. שמור את המארפטים והנקודות המתאימים.
      3. 
	
    
	
    7. 
	
  7. יצירת פלטי ביטויים דיפרנציאליים ספציפיים לאשכול
      
		
    1. הרץ DE בתוך כל אשכול בין נקודות זמן.
      2. 
		
    2. שמור DE_cluster_* ו-DE_cluster_specific_combined_*.
      3. 
	
    
	
    8. 
	
  8. יצירת פלטי ביטוי דיפרנציאליים ממוקדי חיסון
      
		
    1. תוצאת תוצאות DE עבור גנים חיסוניים נבחרים כגון Ifng, Cxcl10, Ctla4, Il10, Foxp3, Bcl6, Cxcr5, Pdcd1, Lag3, Havcr2, Il21 ו-Tbx21.
      2. 
		
    2. שמור DE_immune_focus_*.
      3. 
		
    3. יצר ושמור את הפלטים הבאים:
      DotPlot_selected_genes_by_timepoint_*
      Heatmap_immune_focus_*
      זהירות: צפו לקוהרנטיות בין DE גלובליים, פלטי ההעשרה, DE ספציפי לאשכול וחתימות ממוקדות חיסון.
      4. 
	
    
	
    9. 









12. שמירת התוצרים הסופיים וארכיון הסשן


    
	
  1. שמירת אובייקטים של סורה
      
		
    1. שמור אובייקטים סופיים של Seurat בפורמט .rds עבור כל מערך נתונים.
      2. 
	
    
	
    2. 
	
  2. שמירת מידע על מושב
      
		
    1. כתוב sessionInfo() לקובץ טקסט בתיקיית הפלט.
      2. 
	
    
	
    3. 
	
  3. הרץ את הקוד המוזכר בקובץ המשלים 2 כדי להריץ ייצוא סשן לדוגמה
    4. 
	
  4. אימות שלמות הפלט
      
		
    1. אשר ש-fig/, tables/, ו-rds/תיקיות צפויות מכילות את הקבצים המתאימים.
      2. 
		
    2. ארכיון סקריפטים, מידע על סשן ופלטים יחד.
      זהירות: אל תמשיכו לכתיבת דוחות עד שסיכומי בקרת איכות, פלטי PCA, פלטי בחירת רזולוציה, אבחון אינטגרציה, קבצי אנוטציה של מודולים, פלטי DE וקבצי העשרה כולם נוכחים ועקביים פנימית.
      3. 
	
    
	
    5. 











הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איכות ריצוף ובקרת איכות ברמת התאים (תאי T ספציפיים לאנטיגן (PcAS) תאי CD4⁺ טרנסגניים TCR (GSE233703))


התפלגויות QC לפני סינון (איור 2A) הראו מורכבות תמלול הטרוגנית, כאשר רוב התאים הציגו ספירות גנים ו-UMI בינוניות ותת-קבוצה קטנה יותר הציגה פרופילים חריגים עם ספירה גבוהה התואמים למולטיפלטים פוטנציאליים. גרפי פיזור (איור 2B) הראו קשר חיובי חזק בין nCount_RNA ל-nFeature_RNA, בעוד percent....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקר זה מציג תהליך עבודה סטנדרטי וניתן לשחזור מבוסס Seurat לניתוח דינמיקת שעתוק תאי T של CD4⁺ במהלך הדבקה חוזרת במלריה. הפרוטוקול משלב בקרת איכות אדפטיבית, נרמול, הפחתת ממדים, אשכולות, אינטגרציה של מערכי נתונים, אימות סימנים, ניקוד מודולים וניתוח ביטויים דיפרנציאליים במסגרת חישובית מאוחדת. יחד, צעדים אנליטיים אלו אפשרו זיהוי ופרשנות שכפול של מצבי תאי T ביולוגיים בעלי משמעות ביולוגית בין מערכי נתונים ספציפיים לאנטיגן ופוליקלונליים 13,14,15.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
חומרים
רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם החומר / הציודחברה / מקורמספר קטלוגהערות / תיאור
מטריצות ספירה בפורמט 10x Genomics–NCBI GEON/Aקבצי מטריצה (matrix.mtx, features.tsv, barcodes.tsv)
clusterProfiler (חבילת R)BioconductorN/ARRID:SCR_016884; ניתוח העשרה פונקציונלי (GO, KEGG)
enrichplot (חבילת R)BioconductorN/ARRID:SCR_017030; הדמיה של תוצאות ניתוח העשרה
מטלון GEO GSE233703NCBI Gene Expression OmnibusGSE233703מטלון תאים T CD4+ סינטגני TCR-טרנסגני ל-PcAS מבוסס על scRNA-seq
מטלון GEO GSE233713NCBI Gene Expression OmnibusGSE233713מטלון תאים T CD4+ פוליקלונלי מבוסס על scRNA-seq (D273 לעומת D30)
GitHub (אופציונלי)GitHub Inc.N/ARRID:SCR_002630; בקרת גרסאות ושחזור (אופציונלי)
glmGamPoi (חבילת R)BioconductorN/ARRID:SCR_021001; התאמת מודל SCTransform מואצת
Matrix (חבילת R)CRANN/ARRID:SCR_008389; טיפול במטריצות דלילות לנתוני scRNA-seq
מערכת הפעלהMicrosoft / Apple / LinuxN/Aנתמכים Windows 10+, macOS או Linux
org.Mm.eg.db (חבילת R)BioconductorN/ARRID:SCR_002643; מסד נתונים לסימון גנים בעכבר
patchwork (חבילת R)CRANN/ARRID:SCR_018787; הרכבת דמויות רבות לוחות
מציג PDFכלN/Aצפייה בגרפי QC, UMAPs וחימומים
מחשב אישי או תחנת עבודהכלN/Aמומלץ זיכרון RAM של 16–32 GB לפחות לשילוב
pheatmap (חבילת R)CRANN/ARRID:SCR_016418; הדמיה של חימום להבעת גנים
תוכנת R לסטטיסטיקה (גרסה ≥ 4.2)R Foundation for Statistical ComputingN/ARRID:SCR_001905; סביבת מחשוב מרכזית
RStudio DesktopPosit SoftwareN/ARRID:SCR_000432; סביבת פיתוח משולבת ל-R
Seurat (חבילת R, g4 או מאוחר יותר)Satija LabN/ARRID:SCR_016341; ניתוח scRNA-seq
tidyverse (חבילת R)CRANN/ARRID:SCR_019186; מניפולציה והדמיה של נתונים
מקורות
    
	
  1. World Health Organization. WHO malaria policy advisory group (MPAG) meeting report, 18–20 April 2023. Geneva: World Health Organization; 2023.
    2. 
	
  2. Stevenson MM, Riley EM. Innate immunity to malaria. Nat Rev Immunol. 2004;4(3):169-80.
    3. 
	
  3. Langhorne J, Ndungu FM, Sponaas AM, Marsh K. Immunity to malaria: more questions than answers. Nat Immunol. 2008;9(7):725-32.
    4. 
	
  4. Perez-Mazliah D, Langhorne J. CD4 T-cell subsets in malaria: TH1/TH2 revisited. Front Immunol. 2015;5:671.
    5. 
	
  5. Illingworth J, et al. Chronic exposure to Plasmodium falciparum is associated with phenotypic evidence of B and T cell exhaustion. J Immunol. 2013;190(3):1038-47.
    6. 
	
  6. Tang F, et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods. 2009;6(5):377-82.
    7. 
	
  7. Lönnberg T, et al. Single-cell RNA-seq and computational analysis using temporal mixture modeling resolves TH1/TFH fate bifurcation in malaria. Sci Immunol. 2017;2(9):eaal2192.
    8. 
	
  8. Butler NS, et al. Therapeutic blockade of PD-L1 and LAG-3 rapidly clears established blood-stage Plasmodium infection. Nat Immunol. 2012;13(2):188-95.
    9. 
	
  9. Soon MS, Haque A. Recent insights into CD4+ Th cell differentiation in malaria. J Immunol. 2018;200(6):1965-75.
    10. 
	
  10. Slovin S, et al. Single-cell RNA sequencing analysis: a step-by-step overview. RNA Bioinformatics. 2021:343-65.
    11. 
	
  11. Vieth B, Parekh S, Ziegenhain C, Enard W, Hellmann I. A systematic evaluation of single cell RNA-seq analysis pipelines. Nat Commun. 2019;10(1):4667.
    12. 
	
  12. Wolf FA, Angerer P, Theis FJ. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 2018;19(1):15.
    13. 
	
  13. Hafemeister C, Satija R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biol. 2019;20(1):296.
    14. 
	
  14. Stuart T, et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 2019;177(7):1888-902.
    15. 
	
  15. Satija R, Farrell JA, Gennert D, Schier AF, Regev A. Spatial reconstruction of single-cell gene expression data. Nat Biotechnol. 2015;33(5):495-502.
    16. 
	
  16. Crotty S. T follicular helper cell differentiation, function, and roles in disease. Immunity. 2014;41(4):529-42.
    17. 
	
  17. Wherry EJ, Kurachi M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 2015;15(8):486-99.
    18. 
	
  18. Belkaid Y, Rouse BT. Natural regulatory T cells in infectious disease. Nat Immunol. 2005;6(4):353-60.
    19. 
	
  19. Ashburner M, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 2000;25(1):25-9.
    20. 
	
  20. Kanehisa M, Goto S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 2000;28(1):27-30.
    21. 
	
  21. Gulati GS, et al. Profiling cell identity and tissue architecture with single-cell and spatial transcriptomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025;26(1):11-31.
    22. 
	
  22. Schofield L, Grau GE. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 2005;5(9):722-35.
    23. 
	
  23. Plebanski M, Hill AV. The immunology of malaria infection. Curr Opin Immunol. 2000;12(4):437-41.
    24. 
	
  24. Crotty S. T follicular helper cell biology: a decade of discovery and diseases. Immunity. 2019;50(5):1132-48.
    25. 
	
  25. Vinuesa CG, Linterman MA, Yu D, MacLennan IC. Follicular helper T cells. Annu Rev Immunol. 2016;34:335-68.
    26. 
	
  26. Wherry EJ. T cell exhaustion. Nat Immunol. 2011;12(6):492-9.
    27. 
	
  27. Maizels RM, Smith KA. Regulatory T cells in infection. Adv Immunol. 2011;112:73-136.
    28. 
	
  28. Choudhary S, Satija R. Comparison and evaluation of statistical error models for scRNA-seq. Genome Biol. 2022;23(1):27.
    29. 
	
  29. Li M, et al. Rediscovering publicly available single-cell data with the DISCO platform. Nucleic Acids Res. 2025;53(D1):D932-8.
    30. 
	
  30. Islam MT, Xing L. Cartography of genomic interactions enables deep analysis of single-cell expression data. Nat Commun. 2023;14(1):679.
    31. 
	
  31. Luecken MD, Theis FJ. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 2019;15(6):e8746.
    32. 

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
אימונולוגיה וזיהומיםגיליון 233גיליון 233ערך ריקגיליוןscRNA-seqPBMCאינטגרציה טרנסקריפטומיתדירוג מודולים חיסוניים
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב
צרו קשר
המליצו לספרייה
פרטיות
תנאי שימוש
מדיניות
זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.