מכשיר לחץ אוניברסלי להדמיה של תאים חיים תחת לחץ פיזיולוגי ממושך

Summary

מכשיר הטעינה בלחץ המתואר כאן מאפשר הדמיה אופטית בטווח זמן של תאים מתורבתים ותואם לצלחות תרבית תאים סטנדרטיות ולמיקרוסקופים הפוכים. באמצעות מכשיר זה, מיקרו-סביבת לחץ הידרוסטטי של הגידול מאושרת כמגבירה את העברת אותות הסידן, ומספקת פלטפורמה ישימה לחקר העברת אותות מכנית במיקרו-סביבת הגידול.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר מכשיר טעינה בלחץ הידרוסטטי שמקל על תצפית מיקרוסקופית בזמן אמת על תאים דבקים במהלך גירוי לחץ הידרוסטטי ממושך, והוא תואם לצלחות תרבית תאים מסחריות בקוטר 3.5 ס"מ. המכשיר מורכב מתא תרבית אטום העשוי מבסיס אלומיניום, כיסוי שקוף אופטית מפולי (מתיל מתקרילט), פתחי כניסה/יציאה של גז המשולבים בתוך המכסה, וחלון תצפית אטום. על ידי חיבור למקור גז מוסדר, המכשיר שומר על לחץ הידרוסטטי יציב (0–200 קילופסקל, ניתן לכוונון) תוך אפשרות הדמיית ניגודיות פאזה או פלואורסצנציה רציפה. באמצעות מכשיר עומס לחץ זה, ניתן לתעד השפעות התלויות במינון על פנוטיפ והתנהגויות התא, כגון מורפולוגיה, התרבות ונדידה. יתרה מזאת, ניתן להקליט אותות פלואורסצנטיים בזמן אמת. כאן, נצפו ונמדדו^{על ידי} מיקרוסקופיית פלואורסצנציה הפוכה באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה הפוכה באמצעות היגיון טיים-לאפס. פלטפורמה זו משלבת עומס מכני עם הדמיה של תאים חיים כדי להתגבר על מגבלות של מערכות קצה קונבנציונליות, ומספקת כלי אוניברסלי למחקרים מכנוביולוגיים.

Introduction

תאים, רקמות ואיברים רבים חווים כוחות דחיסה מתמשכים או לסירוגין כחלק מהפיזיולוגיה שלהם¹. לדוגמה, תאי האלוואולר נתונים ללחץ מחזורי במהלך נשימה², בעוד שתאי האפיתל בשלפוחית סובלים מעומסים מכניים במהלך אגירת שתן³. בהקשרים פתולוגיים כמו גידולים מוצקים, תאי סרטן חשופים כל הזמן לכוחות דחיסה שמקורם בכליאה מרחבית ולחץ נוזל בין-תאי מוגבר⁴. באופן דומה, במחלות אחרות כמו ניוון המניסקוס ופיברוזיס ריאתי, תאי המניסקל⁵ ותאי האפיתל^{האלוואולרי 6} עוברים גם הם לחצים מכניים ממושכים הנובעים ממתח ולחץ נוקשות מטריצה.

ישנן עדויות הולכות וגדלות שמאשרות שלחץ מכני פועל כרגולטור עוצמתי של פנוטיפ התא והתנהגותו ^7,8. בתאים לא ממאירים, לחץ דחיסה מגביר את התרבות תאי הגזע החניכיים ומעורר מיזוג אוסטאוקלטים דרך בליטות פולשניות⁹. לעומת זאת, במודלים של סרטן, הדחיסה מציגה אפקטים יאנוסיים: היא מדכאת התרבות והגירה של תאי מלנומה תוך הפעלת תכנות מחדש טרנסקריפטומי שמעודד כימו-עמידות^10,11. יתרה מזאת, דחיסה נפחית הנגרמת מלחץ היפראוסמוטי יכולה לגרום לצפיפות תוך-תאית ולעודד הפצה מחדש של ריכוז החלבונים והחוזק היוני באמצעות הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS), אשר משנה באופן עמוק את התנהגות התאים ואת גורלם. הפרעה פיזית זו מגבירה את התפשטות האורגנידים המעיים באמצעות איתות Wnt/β-catenin מופעל והגברת התחדשות עצמית של תאי גזע במעי¹². בנוסף, בגרעין התא, LLPS המושר על ידי שינויים בנפח מעורב בשליטה על שעתוק גנים באמצעות תיאום של התחלה, הארכה וסיום שעתוק^13,14.

כדי לחקור באופן כמותי את ההשפעות הביולוגיות הנגרמות מהלחץ, מערכות ניסוי המסוגלות ליישם גירויים דחוסים מוגדרים והומוגניים הן חיוניות. עבור תאים שגודלו במבחנה, המוקפים במדיום מימי, לחץ הידרוסטטי משמש כאמצעי ראשוני ופיזיולוגי רלוונטי להפעלת כוחות דחיסה כאלה, אמצעי שאומץ באופן נרחב לחקר מכנוטרנסדוקציה תאית¹⁵. לחץ הידרוסטטי יכול להגדיל את פעילות הפוספטאז הבסיסי ולהאיץ את האוסטאוגנזה של תאי גזע מזנכימיים שמקורם בשומן אנושי ללא תוספת של גורמים אוסטאואינדוקטיביים¹⁶. במחלת כבד שומני שאינה אלכוהולית, כוחות מכניים כמו לחץ הידרוסטטי יכולים לתרום ליתר לחץ דם פורטלי ללא פיברוזיס משמעותי, מה שמדגיש את תפקידו בגיוון הרקמות¹⁷. למרות שלחץ הידרוסטטי ממלא תפקיד חשוב בוויסות פתופיזיולוגי, מחקרים מכניים של לחץ הידרוסטטי ניצבים בפני מגבלה קריטית: תאי לחץ קונבנציונליים מונעים תצפית בזמן אמת על תאים חיים במהלך הגירוי. רוב המערכות הניסיוניות מאפשרות רק ניתוח נקודות קצה, הסתרת דינמיקה מרחבית וזמנית של אירועי מכנוטרנסדוקציה, כגון הפעלה מכנו-מכנית של Piezo1, הטרוגניות זרם Ca²⁺, וארגון מחדש של שלד הציטוסקלטלי. פער זה הגביל את ההבנה כיצד לחץ הידרוסטטי מניע את מגוון הפנוטיפים בגידולים או ברקמות אחרות.

כדי להתמודד עם הפער הטכנולוגי הזה, פותחה פלטפורמה ניסיונית חדשנית המאפשרת תצפית בזמן אמת על תגובות תאיות ללחץ הידרוסטטי מבוקר במדויק באמצעות דימות אופטי. מערכת זו משלבת שלוש יכולות עיקריות: (1) יישום לחץ הידרוסטטי מתמשך בטווח של 0–100 קילופסקל באמצעות בקר לחץ גז מתכוונן (מד הלחץ הוא בטווח של 0–200 קילופסקל, והלחצים המופעלים ניתנים לבחירה לפי פרמטרים פיזיולוגיים). לדוגמה, בהתבסס על מאמצי לחץ מדווחים של סוגי תאים שונים: 8-16 קילופסקל לתאי סטרומל מח עצם^{אנושי 18}, 12–24 קילופסקל לתאי שריר חלק וסקולריים¹⁹, ו-0–15 קילופסקל לתאי אפיתל בשד אנושי²⁰.); (2) הדמיה רציפה של תאים חיים ברזולוציה זמנית גבוהה במהלך יישום לחץ הידרוסטטי; ו-(3) שמירה על תנאי התרביות הפיזיולוגיים לאורך ניסויים ממושכים. גישה זו מאפשרת הדמיה ישירה של תהליכים דינמיים, כולל גיוס והפעלה של ערוץ פיזו1, גלי איתות סידן ועיצוב מחדש של שלד הציטוסקלטי המתרחשים בתגובה לגירוי מכני. בנוסף, מכשיר זה תואם לרוב צלחות התרביות והמיקרוסקופים הפוכים הזמינים מסחרית, מה שהופך אותו לנוח מאוד לשימוש במעבדות. היכולת לנטר את האירועים הביוכימיים התוך-תאיים הללו בזמן אמת מספקת תובנות חסרות תקדים לגבי האופן שבו תאים חשים ומסתגלים ללחץ הידרוסטטי. על ידי לכידת רצף הזמן של אירועי הטרנסדוקציה המכאנית, הכוללים חישה ראשונית של כוח, איתות במורד הזרם ושינויים פנוטיפיים, פלטפורמה זו מספקת כלי עוצמתי לחקירת המנגנונים הבסיסיים שבאמצעותם לחץ הידרוסטטי משפיע על התנהגות התא בהקשרים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

Protocol

1. חומרים

1. מפרטי התקן (ראו איור 1)
   1. הכינו את הרכיבים בהתבסס על המפרטים המפורטים להלן:
      בסיס: אלומיניום (Ø 56 מ"מ, גובה 15 מ"מ), חלון מרכזי Ø 40 מ"מ.
      כיסוי: PMMA (Ø 56 מ"מ) עם: 6 חורים עם הברגה × M3, פתח גז Luer-lock, אטם סיליקון (קוטר פנימי 25 מ"מ, קוטר חיצוני 32 מ"מ, עובי 0.8 מ"מ)
      ווסת לחץ: (טווח 0–200 קילופסקל)
2. תאים ומגבים
   1. השתמשו בתאי MDA-MB-231 ו-HeLa במחקר זה. השתמש במדיום L-15, מדיום RPMI 1640, סרום עגל (NCS), תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית 1%, וגשוש סידן לתרבות תאים ולסימון^Ca2+.

2. הכנת מכשיר

1. ייצור
   1. עיצוב מותאם אישית הוא המרכיב המרכזי של מחקר זה. מכונה מדויקת: בסיס האלומיניום וכיסוי PMMA בהתאם למפרט (ראו איור 1 ואיור משלים 1).
   2. חתוך את אטם הסיליקון, ועבד אותו לגודל הנדרש.
      הערה: ההעברה האופטית של חומר PMMA מספקת להדמיית אור מועברת סטנדרטית. כל הרכיבים היו ניתנים לסטריליזציה וביוקומפטיביים לניסויי תרביות תאים מאוחרים יותר. לא מוטלות דרישות מיוחדות על סבילות הייצור של תא זה (סבילות של ±0.1 מ"מ אומצה במחקר זה).
2. עיקור
   1. כדי לחטא את הבסיס (אלומיניום), יש להשתמש באוטוקלב ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   2. כדי לחטא את המכסה (PMMA), נגב אותו עם 75% אתנול, ואז סטריליזציה ב-UV למשך 30 דקות.
   3. חטא את אטם הסיליקון על ידי אוטוקלבינג ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

3. עיבוד תאים

1. תרבית תאים
   1. תאי זרע בצלחות בגודל 35 מ"מ בחיבור של 30%–70%. תרבית התאים למשך 24 שעות במדיום RPMI-1640 או L15 (בתוספת 10% NCS) באינקובטור CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
   2. למעבר תאים, יש להפריד את התאים עם 0.25% טריפסין ולסיים את העיכול עם מדיום שלם. השתמשו בתאים לזריעה מחדש לאחר שהם מגיעים ל-70%–80% מפגש ביניהם.
2. צביעת Ca²⁺
   1. הסר את המדיום, ואז שטוף את התאים פעמיים עם תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) המחוממת מראש בארון בטיחות ביולוגית.
   2. צבע את Ca²⁺ הבין-תאי עם גלאי הדמיית סידן של 5 מיקרומולר במדיה נטולת סרום. דגרו את התאים למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה מוגנת מאור.
   3. הסר את הצבע, שטוף את התאים שלוש פעמים עם HBSS, ואז דה-אסטריפ למשך 30 דקות במדיום ללא סרום.

4. הרכבת המכשירים (איור 2)

1. העבר את צלחת התרבית לחלון המרכזי של תא הלחץ, ואז הסר את מדיום התרבית.
2. הניחו את האטם המעוקר בצלחת התרבות.
3. יישר את המכסה מעל ערימת אטם הצלחות.
4. הדק את הברגים באלכסון על ידי הידוק ידני עד שמרגישים התנגדות, ואז הוסף 1.5 סיבובים נוספים באמצעות נהג מבוקר מומנט.
5. חבר את צינור הגז הסיליקוני ליציאת Luer-lock והזריק גז מעורב למכשיר כדי לבדוק דליפות.
6. נתק את צינור הגז הסיליקוני והזריק מדיום טרי לצלחת תרבית התאים דרך פתח Luer-lock באמצעות מזרק סטרילי של 5 מ"ל.

5. עומס לחץ והדמיה

1. חבר צינור גז סיליקון (קוטר פנימי 4 מ"מ) מיציאת Luer-lock על אטם הסיליקון למד הלחץ הדיגיטלי ולמיכל הדלק.
2. התקן את המכשיר המורכב על שלב המיקרוסקופ.
3. כוונת את הלחץ.
   1. אימות היציבות של טווח 0–200 קילופסקל באמצעות המד.
      הערה: גז מעורב המכיל 75% חנקן, 20% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני משמש לתרבות תאי HeLa. גז מעורב המכיל 80% חנקן ו-20% חמצן משמש לתרבות תאים MDA-MB-231. סוג הגז המשמש בניסוי העמסה בלחץ יכול להיות מוחלף בהתאם לסוג התא, סוג המדיום או דרישות ניסוי ספציפיות. אין רכיבים ספציפיים למודל, ומידות מודול גילוי הלחץ וצינור הכניסה שלו ניתנים לבחירה לפי הצורך.
4. הגדר את לחץ היעד (למשל, 100 קילופסקל) דרך רגולטור הלחץ הדיגיטלי.
5. התחילו בהדמיה כאשר הלחץ המטרתי הגיע.
6. הדמיה
   1. כוון את הבמה, אשר את אזור ההדמיה, וודא שהתאים בפוקוס.
   2. רכש תמונות פלואורסצנציה של תאים מוצבעים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך המצויד במטרת 20×, עם הפרמטרים הבאים: זמן חשיפה של 400 מילישניות, מרווחי זמן של 5 שניות, ומשך הדמיה כולל של 10 דקות (מסנן FITC: Ex/Em = 490/525 ננומטר, חיתוך = 515 ננומטר).
   3. תמונה בתנאים לא בלחץ למשך 10 דקות כדי להבטיח את פעולת המערכת התקינה ולקבל נתוני אות בסיסיים.
   4. לאחר פתיחת שסתום הגז ללחץ עומס, כוון מחדש את גובה השלב כדי לוודא שהתאים בפוקוס, ואז התחל לצלם אותות סידן דינמיים.
   5. בחר את עדשת האובייקטיב בהתבסס על עובי תחתית צלחת התרבות ומרחק העבודה של האובייקטיבית. בחרו את זמן החשיפה המשמש כדי לאפשר ניטור תנודות אותות סידן תוך הימנעות מהלבנה מופרזת ונזקי אור.
   6. כוון פרמטרים לפי סוג הגשוש ודרישות הניסוי בעת צפייה באותות דינמיים אחרים.

6. פתרון תקלות

1. עיין בטבלה 1 לקבלת עצות לפתרון תקלות.

7. ניתוח סטטיסטי

1. הצג את כל הנתונים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). תוכנת GraphPad Prism (ארה"ב) שימשה להשוואת תוצאות בין שתי קבוצות באמצעות מבחן הסטודנט הלא מזווג. יש לשקול הבדלים כמובהקים סטטיסטית כאשר **p < 0.01, ***p < 0.001, או ****p < 0.0001.

Results

כדי לאמת את פונקציית ההדמיה בזמן אמת של מכשיר הטעינה ההידרוסטטית הזה, נצפו הדינמיקה של אותות הסידן בתאי הגידול לאחר הפעלת לחץ הידרוסטטי. תאי MDA-MB-231, HeLa ו-A549 נזרעו לתוך צלחות תרבית של 35 מ"מ לשימוש מאוחר יותר. לאחר צביעת גלאי הדמיית סידן, התאים שתרבתו ללא סרום היו נתונים ללחץ הידרוסטטי של 40 קילופסקל. לאחר 10 דקות של עומס לחץ הידרוסטטי, רמת הסידן הכוללת בתאי הסרטן עלתה (איורים 3A,B, ואיור משלים 2A,B). כדי להפעיל ת...

Discussion

פרוטוקול זה הציג מכשיר עומס לחץ מותאם באופן אוניברסלי, שאפשר תצפית בזמן אמת על דינמיקת מכנוטרנסדוקציה תחת לחץ הידרוסטטי ניתן לכיוון. על ידי שילוב כיסוי PMMA שקוף אופטית עם בסיס אלומיניום מדויק, המערכת מתגברת על המגבלות הקריטיות של תאים קונבנציונליים, שיכולים לבצע רק ניתוח נקודות קצה. מכשיר הטעינה בלחץ זה, הפועל עם מיקרוסקופ הפוך סטנדרטי, יכול לספק מידע דינמי באמצעות הדמיית טיים-לאפס. התאימות של מכשירים לצלחות תרבית סטנדרטיות בקוטר 35 מ"מ ותהליך ההרכבה הפשוט שלהם מקלה על אימוץ נרחב שלהם.<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (100x)	תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב	15140122	ריכוז 1% במדיום שלם
אוטוקלאב	פנאסוניק, יפן	MLS-3751-PC	לחיטוי בסיס האלומיניום ואטם הסיליקון
ארון בטיחות ביולוגית	תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב	סדרת 1300 A2 Class II, ארונות בטיחות ביולוגית מסוג A2	מספק סביבה סטרילית לטיפול בתאים
Cal-520 AM, אינדיקטור סידן עם תא	AAT ביוקווסט, ארה"ב	21131	לזיהוי דינמי של ריכוז יוני סידן בתאים חיים
צלחת תרבית תאים (35 מ"מ)	ביופיל, סין	TCD010035	צלחת סטנדרטית בקוטר 35 מ"מ המשמשת לזריעת תאים
בסיס תא (אלומיניום)	קואניי, סין	/	עיצוב מותאם אישית ואוסלאש; 56 מ"מ, H 15 מ"מ, חלון מרכזי ואוסלאש; 40 מ"מ
כיסוי תא (PMMA)	Quanyi,  סין	/	עיצוב מותאם אישית ואוסלאש; 56 מ"מ, עם 6&פי; חורים עם הברגת M3, פתח גז Luer-lock
חממת CO2	תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב	HERAcell 3111	שומר על תנאי התרבות ב-37 מעלות; C עם או בלי 5% CO2
HBSS (תמיסת המלח המאוזנת של הנקס)	ביוטיים, סין	C0219	לשטיפת תאים לפני ואחרי צביעה
קו התאים של HeLa	מרכז משאבי התאים, המכון למדעי הרפואה הבסיסיים, CAMS/PUMC, סין	CRM-CCL-2	תאי סרטן צוואר הרחם האנושיים
מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך	ניקון, יפן	אקליפס Ti2	להדמיית פלואורסצנציה
ה-L-15 הבינוני של לייבוביץ'	תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב	41300039	עבור תרבית תאים MDA-MB-231
קו התאים MDA-MB-231	מרכז משאבי התאים, המכון למדעי הרפואה הבסיסיים, CAMS/PUMC, סין	CRM-HTB-26	תאי סרטן השד האנושיים
סרום עגל שזה עתה נולד (NCS)	תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב	16010142	ריכוז של 10% במדיום שלם
רגולטור לחץ	הונגרון, סין	DP20	טווח: 0-200 קילופסקל
RPMI 1640 בינוני	תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב	31800022	עבור תרבית תאים MDA-MB-231
מזרק סטרילי (5 מ"ל)	KDL, סין	1101010198	להזרקת מדיום או מגיבים דרך יציאת Luer-lock
טריפסין (0.25%)	תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב	2520056	להפרדת תאים דבקים למעבר