הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פרוטוקול חישובי לכימות שינויים טרנסקריפטומיים הקשורים לארטסונאטים ברקמת מוח ניסיונית במלריה מוחית באמצעות DESeq2

75 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70870

⸱

31 ביולי 2026

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Ilorin

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מלריה מוחית ניסיונית (ECM) גורמת לדלקת עצבית ולבעיות בתפקוד מחסומי דם-מוח. באמצעות GSE162535, זרימת העבודה RNA-seq המבוססת R הניתנת לשחזור משווה בין מוחות בקרה (CB), ECM (MB) ו-AB, ומבצעת ניתוחי QC, PCA ו-DESeq2. הוא מזהה שינויים שעתוק מונעים על ידי ECM ומעריך ויסות של מסלולים דלקתיים ונוירו-וסקולריים בתיווך ארטסונט.

תקציר

ריצוף RNA (RNA-seq) משמש באופן נרחב להגדרת תוכניות שעתוק הקשורות למחלות, אך נדרשים תהליכי עבודה עקביים מקצה לקצה כדי להבטיח השוואות שחזוריות בין קבוצות ניסוי ולהקל על תוצאות ביולוגיות לפירוש. כאן מוצג פרוטוקול ניתוח RNA-seq מלא להערכת שינויים טרנסקריפטומיים במוח במלריה מוחית ניסיונית (ECM) וטיפול ארטסונאטי באמצעות מאגר הנתונים הציבורי GSE162535. תהליך העבודה מנתח שלוש קבוצות—מוח ביקורתי (CB), מוח ECM (MB), ומוח ECM מטופל בארטזונאט (AB)—החל ממטריצת HTSeq-count. לאחר ייבוא ועיצוב ספירות גולמיות, הפרוטוקול בונה מאגר נתונים DESeq2 עם CB כרמת ייחוס, מסנן גנים בעלי ספירה נמוכה, ומבצע בקרת איכות באמצעות ויזואליזציה בגודל ספרייה, ניתוח רכיבים עיקריים ואשכול מרחקי דגימה. לאחר מכן מחושב ביטוי דיפרנציאלי עבור שלושה ניגודים עיקריים (MB מול CB, AB מול MB, AB מול CB), כאשר התכווצות שינוי קיפול log2 מיושמת להערכת גודל אפקט יציבה. הפרוטוקול מייצא טבלאות ביטוי דיפרנציאליות מלאות ומשמעותיות, מייצר גרפים של הרי געש וגרפים MA, ומפיק מפות חום של הגנים המשתנים ביותר ושל הגנים המדורגים ביותר בהבעה דיפרנציאלית לכל ניגוד. כדי לתמוך בפרשנות מכנית, תהליך העבודה כולל חילוץ ממוקד של סמנים חיסוניים (למשל, ציטוקינים, כימוקינים, סמנים להפעלה מיקרוגליאלית, גנים BBB/אנדותליים) ומבצע ניתוחי אונטולוגיה גנטית והעשרת KEGG עבור קבוצות גנים מוסדרות באופן משמעותי. פרוטוקול זה מספק תבנית ניתנת לשחזור לאפיון תוכניות שעתוק נוירואינפלמטוריות הקשורות ל-ECM ולכימות מודולציה קשורה לארטסונט של חתימות אלו.

מבוא

מלריה מוחית (CM) היא סיבוך נוירולוגי מסכן חיים של זיהום פלסמודיום פאלציפרום ונותרת גורם מרכזי לתמותה ממלריה למרות התקדמות בניהול מקרים. CM מאופיין באנצפלופתיה חריפה, תפקוד מיקרווסקולרי לקוי, הפעלה של אנדותל והפרעה במחסום דם–מוח (BBB), עם דלקת עצבית במורד הזרם העלולה להוביל לתרדמת, ובקרב שורדים, תופעות נוירוקוגניטיביות מתמשכות1. הפתוגנזה של CM היא רב-גורמית וכוללת תגובות דלקתיות של המארח הפועלות עם גורמים שמקורם בטפיל ובמארח בממשק הנוירווסקולרי, מה שמקשה להסיק מנגנונים סיבתיים רק מנקודות קצה קליניות1.

מודלים ניסיוניים למלריה מוחית (ECM), במיוחד זיהום Plasmodium berghei ANKA בעכברי C57BL/6, מספקים פלטפורמה נוחה לחקירת אימונופתולוגיה ספציפית למוח, פגיעות BBB ואיתות נוירואינפלמטורי בסביבה מבוקרת 2,3. מודלים אלו שימשו למיפוי תגובות תאיות ומולקולריות בשלבי מחלה ולבדיקת התערבויות משלימות ב-vivo 2,3. עם זאת, פתוביולוגיה של ECM היא מורכבת ודינמית מאוד, ובדיקות ממוקדות עלולות לפספס שינויים מתואמים ברמת המסלול המתרחשים במספר תוכניות חיסון ונוירווסקולריות.

ארטסונאט הוא טיפול פרנטרלי קו ראשון מומלץ למלריה קשה והראה יתרון הישרדות משמעותי בהשוואה לכינין בבסיסי ראיות מרכזיים4. למרות שניקוי מהיר של טפילים הוא מרכזי ליעילות הארטסונאט, תוצאות נוירולוגיות ככל הנראה משקפות הן הפחתת טפילים והן מודולציה משנית של מסלולי דלקת ונוירווסקולריים 1,4. הבנת האופן שבו טיפול בארטמיסינין משנה את תוכניות השעתוק המוחיות במהלך ECM יכולה לספק תובנות מכניות שמשלימות את נתוני היעילות הקלינית ועשויות לזהות מסלולים מועמדים לאסטרטגיות נוירופרוטקטיביות משלמות.

ריצוף RNA (RNA-seq) מאפשר פרופיל בלתי מוטה, רחב הגנום של תגובות שעתוק במצבי מחלה וטיפול, התומך בניתוח ביטוי שונה ופרשנות פונקציונלית בהמשך הזרם. מאגרים ציבוריים כמו NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) מספקים מערכי נתונים מוקפדים המתאימים לניתוח חוזר שניתן לשחזור, כולל GSE162535, המכיל RNA-seq מוח ממוחות בקרה (CB), מוחות ECM (MB), ומוחות ECM מטופלים בארטסונט (AB)5. כדי לתמוך בגילוי שכפול ממאגרי נתונים כאלה, נדרשות מסגרות סטטיסטיות חזקות לביטוי שונה מבוסס ספירה, וכלים להעשרה נדרשים לפרשנות שינויים ברמת הגנים במונחים של מסלולים ותהליכים ביולוגיים.

מחקר זה מציג תהליך ניתוח RNA-seq מקצה לקצה שניתן לשחזור עבור רקמת מוח בקבוצות ביקורת (CB), מלריה מוחית ניסיונית (MB) וטיפול בארטסונאט (AB). החידוש של מאמר זה טמון בצינור הסטנדרטי המבוסס על DESeq2, הכולל ניגודים ביולוגיים מוגדרים מראש (MB מול CB, AB מול MB, ו-AB מול CB), פלטי בקרת איכות קפדניים (הערכת גודל ספרייה, ניתוח רכיבים עיקריים, ומפות חום למרחקי דגימה), ופרשנות משולבת במורד הזרם באמצעות Gene Ontology (GO) והעשרת מסלולי KEGG באמצעות clusterProfiler 6,7. בנוסף, זרימת העבודה מיישמת פרשנות מובנית מבוססת פאנל חיסוני, המאפשרת אפיון שיטתי של תגובות תעתוק נוירודלקתיות, חיסונית ונוירו-וסקולריות. על ידי שילוב קפדנות סטטיסטית, שקיפות ותוצרים מוכנים לפרסום, פרוטוקול זה מספק מסגרת חזקה וניתנת לשימוש חוזר לניתוח דיסרגולציה טרנסקריפטומית הקשורה ל-ECM ולהערכת מודולציה מונעת טיפול במחקרים פרה-קליניים של מלריה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה השתמש בנתוני RNA-seq זמינים לציבור ולא כלל ניסויים חדשים בבני אדם או בעלי חיים. לכן, לא נדרשו אישור אתי והסכמה מדעת (טבלת חומרים).

1. הכנת סביבת המחשוב ומבנה התיקיות

  1. הגדרת חומרה ומערכת הפעלה
    1. השתמש בתחנת עבודה או מחשב נייד עם לפחות 8GB RAM (מומלץ 16 GB) ו-≥10 GB פנוי בדיסק להורדות ויציאות.
    2. השתמש ב-Windows, macOS או Linux עם הרשאה להתקין חבילות R ולכתוב קבצים לתיקיית העבודה.
  2. התקנת תוכנה נדרשת
    1. התקן את R (גרסה 4.2 או מאוחר יותר). התקן את RStudio Desktop (מומלץ) כדי להריץ את זרימת העבודה באופן אינטראקטיבי ולניהול תיקיית הפרויקט.
  3. צור תיקיית פרויקט ותיקיות פלט
    1. צור תיקייה חדשה לניתוח (למשל, GSE162535_RNAseq_DESeq2). הגדר את התיקייה הזו כתיקיית העבודה R.
    2. צור את תיקיות הפלט בדיוק כך:
      1. ליצור תוצאות/. צור תוצאות/fig/. צור תוצאות/טבלאות/.
  4. התקנת חבילות R נדרשות
    1. התקן חבילות CRAN: tidyverse, pheatmap ו-RColorBrewer. התקן חבילות Bioconductor: DESeq2, apeglm (אופציונלי), clusterProfiler, ו-org. Mm.eg.db.
    2. טען את החבילות הנדרשות בתחילת הסקריפט: DESeq2, tidyverse, pheatmap, RColorBrewer, clusterProfiler, org. Mm.eg.db, ו-ggplot2. הגדר seed לשחזוריות על ידי הרצת set.seed(123).
  5. יישמו שלמות נתונים והגנות פרטיות
    1. אשמור קבצים שהורדו רק בתיקיית הפרויקט. הגבל את הגישה לתיקיית הפרויקט אם הסביבה מכילה נתונים רגישים או נתונים עם אמברגו. הקלט גרסאות תוכנה על ידי ייצוא sessionInfo() ל-results/sessionInfo.txt בסוף תהליך העבודה.
      הערה: פרוטוקול זה מבצע ניתוח in silico של נתוני ספירת RNA-seq ציבוריים ואינו כולל טיפול בדגימות ביולוגיות.

2. השגת מטריצת ספירת ה-RNA-seq והגדרת קבוצות הניסוי

  1. הורד את קבצי מערך הנתונים של GEO עבור GSE162535
    1. הורד את קובץ ה-HTSeq count עבור GSE162535 מ-GEO ושמור אותו בתיקיית הפרויקט כ-GSE162535_All.HTSeq.counts.txt.gz. אמת את שלמות הקובץ על ידי אישור שהקובץ נפתח ללא שגיאה באמצעות gzfile() ו-read.delim().
  2. טעין את ספירות HTSeq ל-R
    1. ייבא את טבלת הספירה הדחוסה באמצעות read.delim(gzfile(...), header = TRUE, check.names = FALSE, quote = "", comment.char = ""). בדוק את האובייקט המיובא באמצעות str(), head(), ו-colnames() כדי לוודא ש:
      1. העמודה הראשונה מכילה מזהי גנים (למשל, AccID). העמודות הנותרות מכילות ספירות ברמת דגימה.
  3. סטנדרטיזציה של סוגי נתונים ופתרון מזהי גנים כפולים
    1. הגדר עמודות לדוגמה ככל העמודות למעט עמודת מזהה הגנים (AccID). לכפות על כל עמודות הדגימה לספירת שלמים. קריסת מזהי גנים כפולים על ידי סכימת ספירות בין שורות החולקות את אותו AccID.
    2. המור את הטבלה המרוכזת למסגרת נתונים סטנדרטית. הגדר שמות שורות למזהה הגנים והסר את עמודת המזהה ממטריצת הספירה.
  4. אימות מבנה מטריצת הספירה
    1. אשר שמטריצת הספירה כוללת 12 עמודות דגימה. אשר שמות עמודות הדוגמה עוקבים אחרי הפורמט AB_1..AB_4, CB_1..CB_4 ו-MB_1.MB_4.
    2. עצור את הביצוע אם למטריצת הספירה אין 12 עמודות.
  5. צור ואמת מטא-דאטה לדוגמה
    1. צור טבלת מטא-נתונים לדוגמה (colData) הכוללת את העמודות הבאות:
      1. דגימה: מזהי דגימה ייחודיים התואמים לשמות העמודות של מטריצת הספירה. קבוצה: מצב ביולוגי שהוקצה לכל דגימה.
    2. שלפו את ההערות המדגימות המתאימות עבור GSE162535 מערך הנתונים מתוך Gene Expression Omnibus (GEO).
    3. אמת כל זהות דגימה באמצעות מידע גישה GEO ושדות סימון לדוגמה המתארים את תנאי הניסוי. מפות כל מזהה דגימה במטריצת הספירה לאנוטציה המאומתת של GEO.
    4. הקצה כל דגימה מאומתת לאחת מהקבוצות הבאות: מוח ביקורת (CB), מוח מלריה מוחית ניסיוני (MB), או מוח מלריה מוחית ניסיוני (AB) שטופל בארטזונט.
    5. סדר את טבלת המטא-דאטה כך שסדר הדגימה יתאים לסדר העמודות של מטריצת הספירה.
    6. השווה מזהי מדגמים בטבלת המטא-דאטה מול מטריצת הספירה כדי לאשר התאמה אחד לאחד. קודד את משתנה הקבוצה כגורם כאשר הרמות מסודרות כ-CB, MB ו-AB.
    7. הגדר את CB כרמת ייחוס להגדרת קבוצת המוח הביקורתית כבסיס לניתוח ביטויים דיפרנציאליים במורד הזרם.
    8. הגדר את שמות השורות של טבלת המטא-דאטה שווה למזהי הדגימה.
      הערה:תוויות הקבוצות לא הוקצו אך ורק לפי סדר הדגימות במטריצת הספירה. זהויות המדגם אומתו באופן עצמאי באמצעות מטא-דאטה של GEO ומידע על הגישה לפני ההתאמה למטריצת הביטויים, כדי לשפר את השחזוריות ולהפחית את הסיכון לטעות בסיווג המדגם.

3. לבנות את מערך הנתונים של DESeq2 ולבצע בקרת איכות בסיסית

  1. חיטוי מטריצת הספירה
    1. החלף ערכים חסרים במטריצת הספירה באפס. אשר את היעדר ערכים חסרים באמצעות סיכומי is.na()-עמודות.
  2. יצירת מערך הנתונים DESeq2
    1. צור DESeqDataSet באמצעות DESeqDataSetFromMatrix() עם: countData = counts; colData = sample_info; עיצוב = ~ קבוצה.
  3. סינון גנים בעלי ספירה נמוכה
    1. הסרת גנים עם סך כל המספרים <10 בכל הדגימות באמצעות dds <- dds[rowSums(counts(dds)) >= 10, ]. רשמו את מספר הגנים השמורים על ידי הדפסת סיכום האובייקט.
  4. הערכת גודל ספריות
    1. מחשב את גדלי הספרייה כסכומי העמודות של מטריצת הספירה המסוננת. צור תרשים ברפלט בגודל ספרייה ושמור אותו כתוצאות/fig/library_sizes.pdf.
    2. בדקו את גרף גודל הספרייה וודאו שאין מדגם בעומק רצף קיצוני שאינו תואם את תכנון המחקר.

4. להריץ את DESeq2 וליצור אובייקטים של טרנספורמציה לצורך ויזואליזציה

  1. התאמה לדגם DESeq2
    1. הרץ מידול ביטויים דיפרנציאליים באמצעות dds < - DESeq(dds). שמור את אובייקט ה-DDS המותאם לכל חילוץ התוצאות במורד הזרם.
  2. יצירת מטריצות ביטוי מומרות
    1. חשב את טרנספורמציית הלוגריתם הרגולרית באמצעות rld <-rlog(dds, blind = FALSE). חשב את הטרנספורמציה המייצבת השונות באמצעות vsd <-vst(dds, blind = FALSE). השתמש ב-rld ו-vsd ל-PCA, אשכולות ומפות חום.
      הערה: השתמש ב-blind = FALSE לשימור מבנה השונות התלוי בקבוצה.

5. ביצוע בקרת איכות גלובלית באמצעות PCA ואשכול מרחק דגימה-למדגם

  1. יצירת ניתוח רכיבים עיקריים (PCA)
    1. חשב PCA באמצעות plotPCA(rld, intgroup = "group", returnData = TRUE). הסבר על שונות אחוז החילוץ עבור PC1 ו-PC2. השרטט בין PC1 ל-PC2 באמצעות ggplot2, תיוג נקודות לפי שם הדגימה וצביעה לפי קבוצה.
    2. שמור את תרשים ה-PCA כתוצאות/fig/PCA_samples.pdf. אשר שכפולים ביולוגיים מתקבצים לפי קבוצה ושאף דגימה לא נפרדת כחריג.
  2. יצירת מפת חום למרחקי דגימה
    1. מחשב מרחקי דגימה זוגיים באמצעות dist(t(assay(vsd))). המרו את אובייקט המרחק למטריצה לצורך ויזואליזציה. צור טבלת אנוטציה לעמודות המכילה את גורם הקבוצה עבור כל דגימה.
    2. צייר את מטריצת המרחק באמצעות pheatmap() ושמור כתוצאות/fig/sample_distance_heatmap.pdf. אשר שהדגימות מתאספות בעיקר לפי קבוצה.

6. חשב את הביטוי הדיפרנציאלי עבור שלושת הניגודים הראשיים

  1. הגדר את הניגודים
    1. הגדר את אפקט המחלה כ-ECM מול בקרה: MB מול CB. הגדר את אפקט הטיפול ב-ECM כטיפול בארטזונט לעומת ECM: AB מול MB. הגדר טיפול מול בסיס כטיפול ארטסונאטי לעומת ביקורת: AB מול CB.
  2. הוצאת תוצאות DESeq2 עם התכווצות שינוי קיפול log2
    1. חלץ תוצאות גולמיות לכל ניגוד באמצעות תוצאות (dds, contrast = c("קבוצה", groupA, groupB)). שינויים ב-log2 fold באמצעות lfcShrink(dds, contrast = c("group", groupA, groupB), res = res, type = "normal").
    2. המרו תוצאות למסגרת נתונים ואחסנו את מזהה הגנים כעמודה בשם gene_id. סדר תוצאות לפי ערך p נומינלי לדיווח יציב.
    3. שמור כל טבלת תוצאות מלאה בתוצאות/טבלאות/ כ:
      1. DESeq2_MB_vs_CB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_MB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_CB_all_genes.csv
        הערה: אם ההתכווצות נכשלת עקב תצורת החבילה, יש להריץ מחדש עם סוג התכווצות חלופי הנתמך בהתקנה המקומית.
  3. הגדרת ספי מובהקות וייצא סטים גנים משמעותיים
    1. הגדר גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) באמצעות: ערך p מותאם (FDR) < 0.05 ושינוי מובסולוט log2 פי ≥ 1. סנן כל ניגוד כדי להוציא גנים עם ערכי p מותאמים חסרים.
    2. ייצוא טבלאות DEG משמעותיות ל: results/tables/DESeq2_MB_vs_CB_sig.csv, results/tables/DESeq2_AB_vs_MB_sig.csv, results/tables/DESeq2_AB_vs_CB_sig.csv
  4. סיכום ספירות DEG לכל ניגוד
    1. חשב את מספר הגנים המשמעותיים בכל חומר ניגוד. שמור את טבלת הסיכום כתוצאות/טבלאות/DE_summary_counts.csv.

7. יצירת גרפים של הרי געש לכל ניגוד.

  1. צור פונקציית גרף הר געש.
    1. חשב -log10 (ערך p מותאם) עבור כל גן. סווג כל גן למעלה, למטה או לא משמעותי באמצעות הספים: FDR < 0.05 ו-|log2FC| ≥ 1.
    2. גרף log2FC (ציר x) מול -log10(FDR) (ציר y) באמצעות ggplot2. הוסף קווי סף מקווקו ב-log2FC = ±1 ו-log10(0.05).
  2. יצוא מגרשי הר געש
    1. שמור כל גרף כקובץ PDF בתוצאות/איור/: volcano_MB_vs_CB.pdf, volcano_AB_vs_MB.pdf, volcano_AB_vs_CB.pdf.
      הערה: השתמש במגבלות ציר עקביות בין ניגודים כדי לתמוך בהשוואה ויזואלית בין דמויות.

8. יצירת תרשימי MA עבור כל ניגוד

  1. ייצוא גרפים של MA ל-PDF יחיד.
    1. פתח מכשיר PDF בשם results/fig/MA_plots.pdf. גרפים MA גרפים עבור כל אובייקט תוצאה גולמי של DESeq2 באמצעות plotMA(). תייגו כל גרף בשם הניגוד. סגור את מכשיר ה-PDF.

9. יצירת מפות חום לביטוי עבור גני DE ייחודיים לשונות גלובלית ולניגודיות.

  1. השרטט את הגנים המשתנים המובילים בכל הדגימות.
    1. חשב שונות לפי שורה בין דגימות מתוך מטריצת הבדיקה של vsd. בחר את 100 הגנים המשתנים ביותר. מרכז ממוצע של כל גן על פני הדגימות.
    2. יצר מפת חום באמצעות pheatmap() עם הערות קבוצות דגימה. שמור את הדמות כתוצאות/איג/heatmap_top100_variable_genes.pdf.
  2. שרטט את הגנים המובעים ביותר באופן דיפרנציאלי עבור כל ניגוד.
    1. בחר את 50 הגנים המובילים לפי ערך p מותאם לכל ניגוד. להוציא את מטריצת הביטוי של ה-VSD ואת מרכז הממוצע שלהם לפי הגן. צרו מפת חום לכל קונטרסט ושמרו כך:
    2. results/fig/heatmap_top50_MB_vs_CB.pdf, results/fig/heatmap_top50_AB_vs_MB.pdf, results/fig/heatmap_top50_AB_vs_CB.pdf
      הערה: הגדל את רוחב וגובה ה-PDF אם תוויות שורות מופעלות.

10. לבצע ניתוח ממוקד של סמנים חיסוניים.

  1. לסכם גנים חיסוניים נבחרים בין ניגודים.
    1. הגדר סט סימנים חיסוניים: Il6, Il1b, Il10, Tnf, Ifng, Il21, ו-Icam1. הוצא log2FC, ערך p, וערך p מותאם עבור גנים אלו מכל טבלת תוצאות ניגודיות.
    2. מאחד את שלושת סיכומי הניגודיות לפי מזהה גן. שמור את הטבלה המאוחדת כתוצאות/טבלאות/immune_genes_summary.csv.
  2. יצר מפת חום לסמן חיסון (rlog).
    1. זהה גנים חיסוניים הנמצאים במטריצת הבדיקה המומרת. חלץ את מטריצת ביטוי ה-rlog עבור גנים חיסוניים קיימים.
    2. ביטוי מרכז ממוצע לפי גן. יצר ושמור את מפת החום בתוצאות/fig/heatmap_immune_genes.pdf.

11. ביצוע ניתוח פאנל חיסון מורחב לפי קטגוריה פונקציונלית

  1. הגדר פאנלים חיסוניים.
    1. הגדר פאנלים של סמני מערכת חיסון לפי קטגוריה, כולל: ציטוקינים פרו-דלקתיים וגנים לתגובה לאינטרפרון, גנים אנטי-דלקתיים ורגולטוריים, כימוקינים, סמני הפעלה מיקרוגליאליים, סמני אסטרוציטים, סמני הפעלה BBB ואנדותליאלים, סמני תאי T וסמני תשישה, סמנים מונוציטים/מקרופאג'ים, גנים למסלול משלים, וגנים ללחץ חמצוני ומוות תאי.
  2. להוציא את תוצאות ה-DE של הפאנל החיסוני לכל חומר ניגוד.
    1. צור טבלת מיפוי מסמלי גנים לקטגוריות חיסוניות. סננו כל טבלת תוצאות ניגודיות עבור גני הפאנל החיסוני. צרף את מיפוי הקטגוריה לכל טבלת תוצאות מסוננת.
    2. מחברים את שלושת טבלאות החיסון הספציפיות לחומר ניגוד לטבלה אחת. שמור את הטבלה המשולבת כתוצאות/טבלאות/immune_panels_DE_all_contrasts.csv. יצר מפת חום מסווגת של ביטויי פאנל חיסון.
    3. זהה גנים של פאנל חיסון הנמצאים במטריצת הבדיקה של RLD. הוספת תוויות קטגוריות לשמות השורות כדי לשמור על סיווג הפאנלים באיור. צייר את מפת החום של rlog עם הערות קבוצות דגימה.
  3. שמור פלטים.
    1. שמור כ: results/fig/heatmap_immune_panels_all.pdf, results/fig/heatmap_immune_panels_all.png

12. יצירת גרפים של הרי געש עם שכבת חיסון

  1. צור גרפים של הרי געש עם שכבת חיסון.
    1. סמן גנים כחסינים או לא חסינים על ידי חיבור מיפוי הפאנל החיסוני לכל טבלת תוצאות ניגודיות. ציינו את כל הגנים הלא-חסינים כנקודות רקע אפורות. שרטט גנים חיסוניים שצובעים לפי קטגוריית החיסון בקדמת התמונה. הוסף קווי סף ב-log2FC = ±1 ו-log10(0.05).
  2. ייצוא חלקות הרי געש עם שכבת חיסון.
    1. שמור גרפים של הר געש עם שכבת חיסון של MB לעומת CB כ:
      1. תוצאות/fig/volcano_MB_vs_CB_immune_overlay.pdf
      2. תוצאות/fig/volcano_MB_vs_CB_immune_overlay.png
    2. שמור את גרפי הר הגעש AB מול MB עם שכבת חיסון כ:
      1. תוצאות/fig/volcano_AB_vs_MB_immune_overlay.pdf
      2. תוצאות/fig/volcano_AB_vs_MB_immune_overlay.png
        הערה: פאנלים גנטיים של מערכת החיסון שנבחרו היו מוגדרים מראש וסווגו לקטגוריות פונקציונליות; הרשימה המלאה של סמלי גנים עם הערות מסופקת בטבלה משלימה S1. טבלה זו מבטיחה שקיפות ושחזוריות, ומאפשרת שימוש חוזר ואימות ישיר של ניתוחים מבוססי פאנלים בין המחקרים.

13. ביצוע ניתוח העשרה פונקציונלית (GO ו-KEGG)

  1. הגדר קבוצות גנים להעשרה
    1. לכל ניגוד (MB מול CB ו-AB מול MB), חלץ גנים (DEGs) המובעים באופן מובהק באמצעות סף p-value מותאם של < 0.05 וסף שינוי קיפול log₂ מוחלט ≥ 1.
    2. פיצל DEGs לגנים עם ויסות גבוה (log₂FC > 0) וגנים עם ויסות נמוך (log₂FC < 0).
  2. הגדר את קבוצת הגנים ברקע (היקום)
    1. השתמש בכל הגנים שנשמרים לאחר סינון ספירה במאגר הנתונים של DESeq2 כיקום הרקע. חלץ סמלי גן מאובייקט DESeq2 המסונן. המרו סמלי גן רקע למזהי Entrez באמצעות פונקציית bitr() עם org. Mm.eg.db.
      הערה: שימוש בקבוצת גנים רקע עקבית מבטיח תוצאות העשרה בלתי מוטות.
  3. מיפוי מזהי גנים להעשרה
    1. המרו את סמלי הגנים של כל קבוצת DEG למזהי Entrez באמצעות bitr(). שמור רק גנים שמופו בהצלחה להעשרת KEGG. דלג על ניתוח העשרה עבור סט גנים אם לא מופה גנים בהצלחה.
      הערה: העשרת אונטולוגיית גנים (GO) משתמשת בסמלי גן, בעוד שהעשרת KEGG דורשת מזהי Entrez.
  4. ביצוע העשרת אונטולוגיית גנים (GO) (תהליך ביולוגי)
    1. הרץ העשרת GO באמצעות enrichGO() עם OrgDb = org. Mm.eg.db. Set keyType = "סמל" ואונטולוגיה (ont) = "BP". ציין את היקום ככל סמלי הגנים המסוננים ממאגר הנתונים של DESeq2.
    2. השתמש ב-pAdjustMethod = "BH" לתיקון בדיקות מרובות. הפעילו ספי מובהקות של pvalueCutoff = 0.05 ו-qvalueCutoff = 0.05. הגבלת גודל קבוצות גנים באמצעות minGSSsize = 10 ו-maxGSSsize = 500.
    3. ייצא תוצאות העשרת GO לתיקיית results/tables/. צור פסים של מונחי GO מועשרים ושמור לתוצאות/fig/.
  5. ביצוע העשרת מסלולי KEGG
    1. הרץ העשרת KEGG באמצעות enrichKEGG() עם אורגניזם = "mmu". ספק מזהי Entrez של קבוצות DEG כגנים קלטים. השתמש ברקע הממופה של Entrez כיקום.
    2. Apply pAdjustMethod = "BH". השתמש בספי מובהקות של pvalueCutoff = 0.05 ו-qvalueCutoff = 0.05. הגבלת גודל קבוצות גנים באמצעות minGSSsize = 10 ו-maxGSSsize = 500.
    3. ייצוא טבלאות העשרה של KEGG לתוצאות/טבלאות/. יצר פסים של מסלולי KEGG מועשרים ושמור לתוצאות/fig/.
      הערה: העשרת KEGG עשויה שלא להניב תוצאות אם מיפוי גנים אינו מספיק; מקרים כאלה מטופלים מבלי להפריע לזרימת העבודה.

14. ביצוע ניתוח העשרה חיסונית בלבד (מודול אופציונלי)

  1. בניית קבוצות גנים ספציפיות למערכת החיסון
    1. הגדר גנים של פאנל חיסון בהתבסס על קטגוריות פונקציונליות שנבחרו במיוחד. חותכים רשימות DEG עם גנים של פאנל חיסון. חלק את ה-DEGs הספציפיים למערכת החיסון לקבוצות עם רגולציה גבוהה ומורידה לכל חומר ניגוד.
  2. לבצע העשרה על קבוצות גנים ייחודיות לחיסון.
    1. יישם את אותם נהלי העשרה של GO ו-KEGG המתוארים בסעיף 13. השתמש בהגדרות זהות של יקום רקע ופרמטרים. שמור פלטים באמצעות שמות קבצים המכילים את התווית "immune" כדי להבדיל אותם מתוצאות העשרה גלובלית.

15. יצירת גרפים של נקודות העשרה (מודול אופציונלי)

  1. העשרת העומס תוצאה.
    1. ייבא טבלאות העשרה GO או KEGG מתיקיית results/tables/.
  2. מדדי העשרת טרנספורמה.
    1. המרו ערכי GeneRatio מפורמט חלקי (x/y) ליחסים נומריים. חשב −log₁₀(ערכי p מותאמים) לצורך ויזואליזציה.
  3. יצר גרפים נקודתיים.
    1. גרף יחס גנים על ציר ה-x ותיאורי מונחים מועשרים בציר ה-y. גודל הנקודות לפי ספירת גנים וצבע לפי −log₁₀ (ערך p מותאם).
    2. בחר מונחים מועשרים עליונים בהתבסס על דירוג ערך p מותאם. שמור את גרפי הנקודות כקבצי PDF ו-PNG בתיקיית results/fig/.

16. שמור מידע על הסשן וסיים את הריצה

  1. ייצא מידע על הסשן.
    1. שמור את פלט sessionInfo() לתוצאות/sessionInfo.txt כדי לתעד את גרסת R וגרסאות החבילה.
  2. אישור השלמה מוצלחת
    1. אשר שתהליך העבודה נוצר: איורים בתוצאות/איור/, טבלאות בתוצאות/טבלאות/.
    2. אשר ששלושת יציאות הניגודיות הראשיות קיימות ואינן ריקות: DESeq2_MB_vs_CB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_MB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_CB_all_genes.csv

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הערכת איכות הנתונים ומבנה טרנסקריפטומי גלובלי

נתוני RNA-seq מ-12 דגימות מוח (CB, MB, AB; n = 4 לכל קבוצה) עובדו באמצעות זרימת העבודה הסטנדרטית. לאחר סינון גנים בעלי ספירה נמוכה (≥10 ספירות בסך הכל), מערך הנתונים נשמר לניתוחים במורד הזרם. ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) של ספירות שעברו rlog-transform הראה הפרדה של דגימות לפי קבוצת ניסוי, כאשר השכפולים התקבצו באופן עקבי בתוך קבוצות (איור 1A–B).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה מציג תהליך עבודה שניתן לשחזר מבוסס DESeq2 לניתוח נתוני RNA-seq בכמויות גדולות בין ניגודים ביולוגיים מוגדרים מראש. הפרוטוקול משלב עיבוד מוקדם סטנדרטי, הקצאת מטא-דאטה מאומתת, נורמליזציה, בדיקות ביטויים דיפרנציאליים ופלטים מובנים במורד הזרם, המאפשר יצירה עקבית ושקופה של תוצאות טרנסקריפטומיות. על ידי הגדרה מפורשת של שלבים ופרמטרים אנליטיים, תהליך העבודה מתוכנן לשפר את השחזוריות וההשוואה בין מחקרים 6,7,11

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים מתחרים.

תודות

לכותבים אין הכרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
clusterProfiler (חבילת R)BioconductorRRID:SCR_016884ניתוח העשרה פונקציונלי (GO ונתיבי KEGG)
DESeq2 (חבילת R)BioconductorRRID:SCR_015687ניתוח ביטוי דיפרנציאלי של נתוני RNA-seq מבוססי ספירה
ggplot2 (חבילת R)CRANRRID:SCR_014601ויזואליזציה של גרפי PCA, גרפי וולקנו ודיאגרמות סיכום
GitHub (אופציונלי)GitHub Inc.RRID:SCR_002630בקרת גרסאות ושיתוף של סקריפטים ניתנים לשכפול
HTSeq-count RNA-seq dataset (GSE162535)NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)RRID:SCR_005012מטריצת ספירת RNA-seq בתפזורת המשמשת כקלט לניתוח
matrixStats (חבילת R)CRANRRID:SCR_016361חישוב יעיל של סטטיסטיקות שורה/עמודה (למשל, שונות)
openxlsx (חבילת R)CRANRRID:SCR_019215ייצוא של טבלאות תוצאות לפורמט Excel
מערכת הפעלהMicrosoft / Apple / LinuxN/Aתומך ב- Windows 10+, macOS או Linux
org.Mm.eg.db (חבילת R)BioconductorRRID:SCR_002815מסד נתונים לסימון גנים של עכבר למיפוי מזהי גנים
מציג PDFכלN/Aצפייה בדמויות פלט (PCA, מפות חום, גרפי וולקנו)
מחשב אישי או תחנת עבודהכלN/Aמומלץ מינימום 16 GB RAM לניתוח RNA-seq
pheatmap (חבילת R)CRANRRID:SCR_016418ויזואליזציה של מפות חום של ביטוי גנים וקלסטרים
תוכנת R לסטטיסטיקה (גרסה ≥ 4.2)קרן R לחישוב סטטיסטיRRID:SCR_001905סביבת חישוב ליבה לכל ניתוח RNA-seq
RColorBrewer (חבילת R)CRANRRID:SCR_015742לוחות צבעים למפות חום וגרפים
RStudio DesktopPosit SoftwareRRID:SCR_000432סביבת פיתוח משולבת (IDE) לסקריפטינג ושכפול
קובץ מטא נתונים של דגימה (פורמט CSV)נוצר / ביאורי GEON/Aאנוטציית דגימה מאוחדת המקשרת דגימות לקבוצות CB, MB ו- AB
stringr (חבילת R)CRANRRID:SCR_019195עיבוד מחרוזות לויזואליזציה ועיצוב העשרה
tibble (חבילת R)CRANRRID:SCR_019186טיפול במסגרת נתונים ומבני נתונים מסודרים
tidyverse (חבילת R)CRANRRID:SCR_019186מניפולציה, שינוי ותצוגת נתונים

מקורות

  1. Storm J, Craig AG. Pathogenesis of cerebral malaria—inflammation and cytoadherence. Front Cell Infect Microbiol. 2014;4:100.
  2. Hinduja S, Kunieda M. Modelling of ECM and EDM processes. CIRP Annals. 2013 Jan 1;62(2):775–97.
  3. Soares SMA, Gualberto ACM, da Costa AC, Gonçalves DA, Gameiro J. A high-fat diet protects C57BL/6 mice from Plasmodium berghei ANKA infection in an experimental malaria study. Front Trop Dis. 2023;4:1188902.
  4. Manzoni G, Try R, Guintran JO, Christiansen-Jucht C, Jacoby E, Sovannaroth S, Zhang Z, Banouvong V, Shortus MS, Reyburn R, Chanthavisouk C. Progress towards malaria elimination in the Greater Mekong Subregion: perspectives from the World Health Organization. Malaria Journal. 2024 Mar 1;23(1):64.
  5. Wang Q, Tang Y, Pan Z, Yuan Y, Zou Y, Zhang H, et al. RNA-seq-based transcriptome analysis of the anti-inflammatory effect of artesunate in early treatment of a mouse cerebral malaria model. Mol Omics. 2022;18(8):716–30.
  6. Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014;15(12):550.
  7. Anders S, Huber W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 2010;11(10):R106.
  8. Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. bioinformatics. 2010 Jan 1;26(1):139-40.
  9. McCarthy DJ, Chen Y, Smyth GK. Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation. Nucleic Acids Res. 2012;40(10):4288–97.
  10. Conesa A, Madrigal P, Tarazona S, Gomez-Cabrero D, Cervera A, McPherson A, et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 2016;17:13.
  11. Yu G, Wang LG, Han Y, He QY. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16(5):284–7.
  12. Hänzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 2013 Jan 16;14(1):7.
  13. Shen-Orr SS, Gaujoux R. Computational deconvolution: extracting cell type–specific information from heterogeneous samples. Curr Opin Immunol. 2013;25(5):571–8.
  14. Subramanian A, Tamayo P, Mootha VK, Mukherjee S, Ebert BL, Gillette MA, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545–50.
  15. Stark R, Grzelak M, Hadfield J. RNA sequencing: the teenage years. Nat Rev Genet. 2019;20(11):631–56.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אימוןולוגיה וזיהוםגיליון 233גיליון 233ערך ריקגיליוןריצוף RNA בכמות גדולהניתוח טרנסקריפטומידלקת נוירוגניתטיפול ב-Artesunateביטוי גנים דיפרנציאליפרופיל מסלולים חיסוניים

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.