מאמר מחקר

השפעות ויסות ביטוי SPRY2 ו-miR-590-5p על אוטופגיה בכונדרוציטים מודל של דלקת מפרקים אוסטאוארטריטיס בבני אדם

DOI:

10.3791/70883

⸱

31 ביולי 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, 2Guangxi University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לחץ דלקתי במודל כונדרוציטים C28/I2 מושרה על ידי IL-1β הגביר את miR-590-5p והפחית את ביטוי SPRY2. מודולציה של ציר זה שינתה את הביטוי של Beclin-1, LC3-II ו-Bcl-2, מה שמרמז על מסלול רגולציה משוער miR-590-5p/SPRY2 שעשוי להשפיע על תגובות הקשורות לאוטופגיה והישרדות כונדרוציטים באוסטיאוארתריטיס.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוסטיאוארתריטיס (OA) היא מחלה ניוונית נפוצה במפרקים, המאופיינת בהרס סחוס מתקדם ואובדן הומאוסטזיס של כונדרוציטים. למרות שאוטופגיה לא מבוקרת תורמת לפתוגנזה של OA, המנגנונים המולקולריים השולטים בתגובות הקשורות לאוטופגיה בכונדרוציטים נותרו לא מובנים במלואם. מחקר זה חקר את תפקיד ציר הוויסות miR-590-5p/SPRY2 בסביבה דלקתית של OA באמצעות כונדרוציטים אנושיים של C28/I2 המושרה על ידי IL-1β. מודל OA במבחנה הוקם על ידי טיפול בתאי C28/I2 ב-IL-1β. הביטוי של miR-590-5p ו-SPRY2 הוערך באמצעות PCR כמותי ו-Western blotting. שיטות רווח ואיבוד תפקוד שימשו להערכת השפעות SPRY2 ו-miR-590-5p על הסמנים הקשורים לאוטופגיה Beclin-1 ו-LC3-II, וכן על החלבון Bcl-2 הקשור להישרדות. ניתוח ביואינפורמטי וניסויי חילוץ שימשו לבדיקת הקשר הרגולטורי בין miR-590-5p ל-SPRY2. טיפול ב-IL-1β הגדיל משמעותית את ביטוי miR-590-5p תוך הפחתת רמות ה-mRNA והחלבון של SPRY2 (P < 0.05). ביטוי יתר של SPRY2 הפחית משמעותית את ביטוי בקלין-1 ו-LC3-II, עם ירידות של כ-65% ו-77% בהתאמה (P < 0.05). לעומת זאת, ביטוי יתר miR-590-5p הגביר את ביטוי Beclin-1, LC3-II ו-Bcl-2, בעוד שעיכוב miR-590-5p הפך השפעות אלו והחזיר את ביטוי SPRY2. ניתוחים פונקציונליים תמכו ב-SPRY2 כיעד רגולטורי משוער במורד הזרם של miR-590-5p. ממצאים אלו מזהים את ציר miR-590-5p/SPRY2 כרגולטור חשוב לביטוי סמנים הקשורים לאוטופגיה ולהישרדות כונדרוציטים בתנאים דלקתיים, ומצביעים על רלוונטיותו הפוטנציאלית כמטרה טיפולית בדלקת אוטופגיה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כצורה הנפוצה ביותר של דלקת מפרקים בעולם, אוסטאוארתריטיס (OA) היא גורם מוביל לכאב, לקות בניידות ולנכות פיזית, ומטילה נטל כבד על מערכות הבריאות והחברה1. פתולוגית, OA מאופיין בהדרדרציה הדרגתית של סחוס המפרקים, דלקת סינוביאלית ועיצוב פתולוגי של עצם תת-כינורית1. הערכות אפידמיולוגיות מצביעות על כך שכ-303 מיליון אנשים ברחבי העולם מושפעים מ-OA, ומספר זה צפוי לעלות עם הזדקנות האוכלוסייה ועלייה בשיעורי ההשמנה2. בסין, השכיחות של דלקת תסמונת ברך מוערכת ב-8.1%, עם שכיחות גבוהה יותר בקרב נשים ואוכלוסיות כפריות. למרות השכיחות הגבוהה, אפשרויות הטיפול הנוכחיות מוגבלות בעיקר לניהול תסמינים באמצעות תרופות נוגדות דלקת לא-סטרואידיות (NSAIDs) והתערבות כירורגית למחלה מתקדמת4. היעדר תרופות לדלקת מפרקים ניוסטית (DMOADs) משנים מחלה משקף הבנה לא שלמה של המנגנונים המולקולריים המווסתים את ההומאוסטזיס וההישרדות של כונדרוציטים5.

השלמות המבנית והפונקציונלית של הסחוס המפרקי תלויה בכונדרוציטים התושבים, השומרים על מחזור מטריקס חוץ-תאי (ECM) באמצעות איזון בין פעילויות אנאבוליות לקטבוליות6. במהלך התקדמות OA, כונדרוציטים חשופים למתח מכני חריג ולמתווכים פרו-דלקתיים, במיוחד אינטרלוקין-1β (IL-1β) ופקטור נמק-α גידולי (TNF-α), המעודדים מעבר מסינתזת מטריצה לפירוקמטריצתי 6. IL-1β תורם להריסת הסחוס על ידי גירוי ייצור מטריצת מטלופרוטאנאזים (MMPs) ואגרקנזות, תוך דיכוי סינתזת קולגן ופרוטאוגליקנים מסוג II7. בנוסף, IL-1β גורם ללחץ חמצוני ולתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, מה שמוביל לאפופטוזיס ולהזדקנות של כונדרוציטים. כתוצאה מכך, זיהוי מסלולי איתות תוך-תאיים המווסתים הישרדות כונדרוציטים בתנאים דלקתיים נותר עדיפות במחקר OA.

אוטופגיה היא מסלול התדרדרות ליזוזומלית השמור אבולוציונית, השומר על הומאוסטזיס תאי באמצעות הסרה ומיחזור של אברונים ופגידות חלבונים פגועים9. אוטופגיה בסיסית חיונית להישרדות תאית ולאיזון אנרגיה; עם זאת, אוטופגיה לא מאוזנת יכולה לתרום להתקדמות המחלה9. ב-OA, אוטופגיה נחשבת בדרך כלל לתגובה מגוננת המסייעת לכונדרוציטים להסתגל ללחץ תאים ולהתנגד לאפופטוזיס. מחקרים קודמים הציעו כי פעילות אוטופגית יורדת במהלך התקדמות דלקת האוטו-אוטו, במיוחד במחלות בשלב מתקדם, מה שמוביל לפגיעה בבקרת איכות תאית ולהגברת אובדן הכונדרוציטים11. מספר חלבונים משמשים לעיתים קרובות כמדדים לפעילות הקשורה לאוטופגיה. בקלין-1 משתתף בהתחלת האוטופגוזום, בעוד שהמרה של חלבון 1 המשויך למיקרוטובול בשרשרת קלה 3 (LC3-I ל-LC3-II) משמשת באופן נרחב כסמן להיווצרות האוטופגוזומים12. לעומת זאת, לימפומה של תאי B 2 (Bcl-2) מעכבת את האוטופגיה התלויה בבקלין-1 תוך שהיא גם מפעילה השפעות אנטי-אפופטוטיות13. עם זאת, פרשנות של סמנים הקשורים לאוטופגיה דורשת זהירות, שכן מדידות סטטיות של LC3-II ובקלין-1 אינן יכולות להבחין באופן עצמאי בין היווצרות אוטופגוזומים מוגברת לבין פירוק ליזוזומי פגום. למרות מגבלות אלו, מודולציה של מסלולים הקשורים לאוטופגיה נותרה אסטרטגיה טיפולית מבטיחה ל-OA.

מיקרו-RNA (miRNAs) הם RNA קצרים שאינם מקודדים, המווסתים את ביטוי הגנים לאחר שעתוק על ידי קישור לרצפים משלימים בתוך 3′ האזורים הלא מתורגמים (3′-UTRs) של RNA שליח יעד, מה שמוביל לדירוק mRNA או לדיכוי תרגומי14. ביטוי miRNA חריג נקשר לפתוגנזה של OA באמצעות השפעות על דלקת, אפופטוזיס ועיצוב מחדש של ECM15. מבין המולקולות הללו, miR-590-5p זכה לתשומת לב בשל תפקידיו הרגולטוריים במטבוליזם העצם ובתהליכים פתולוגיים נוספים. מחקרים קודמים הראו כי miR-590-5p מקדם התמיינות אוסטאוגנית ומדכא אדיפוגנזיס בתאי גזע מזנכימיים16. במודלים של סרטן, miR-590-5p מציג פונקציות תלויות הקשר כגורם אונקוגני או כמדכא גידולים17. יתרה מזאת, פרופילי ביטוי מיקרו-RNA שהשתנו, כולל חברים ממשפחת miR-590, נחשפו לשינוי פתולוגי של רקמות מפרקים במהלך OA18. עם זאת, ראיות שהושגו מתאי גזע או מודלים של סרטן אינן ניתנות להסקה ישירה לכונדרוציטים מפרקים בוגרים. לכן, תפקידו של miR-590-5p בוויסות תגובות כונדרוציטים בתוך המיקרו-סביבה הדלקתית של OA נותר לא מובן במלואו.

כדי לחקור מנגנונים פוטנציאליים במורד הזרם של miR-590-5p ב-OA, בוצעו ניתוחי חיזוי מטרות בסיליקו , שזיהו את Sprouty2 (SPRY2) כמטרה פוטנציאלית במורד הזרם. SPRY2 שייך למשפחת חלבוני Sprouty, שמווסתים באופן שלילי את איתות טירוזין קינאז של קולטנים ומדכאים את הפעלת מסלול RAS/MAPK/ERK 19. מכיוון שאיתות MAPK משפיע על התמיינות כונדרוציטים, תגובות דלקתיות ואוטופגיה, SPRY2 עשוי לייצג צומת רגולטורי חשוב בפתופיזיולוגיה של OA20. מחקרים קודמים מצביעים על כך ש-SPRY2 יכול לדכא תגובות דלקתיותבמודלים 21 של דלקת מפרקים שגרונית, להשתתף בוויסות אפופטוזיס במערכות אפיתל22, ומקושר לתגובות הקשורות לאוטופגיה במודלים של פציעות איסכמיות23. למרות שתצפיות אלו מצביעות על כך ש-SPRY2 משתתף בוויסות האפופטוזיס והאוטופגיה, תפקידו בכונדרוציטים מפרקים נותר מאופיין בצורה לקויה. לכן הושערה כי miR-590-5p ו-SPRY2 יוצרים ציר רגולטורי המשפיע על הישרדות כונדרוציטים תחת לחץ דלקתי.

בהתבסס על תצפיות אלו, הוצע כי miR-590-5p מווסת תגובות הקשורות לאוטופגיה בכונדרוציטים על ידי ויסות ביטוי SPRY2. למרות ש-miR-590-5p ו-SPRY2 נחקרו כל אחד בנפרד בהקשרים ביולוגיים אחרים, הקשר הפונקציונלי ביניהם בכונדרוציטים OA טרם הוכח. במחקר הנוכחי, מודל OA מושרה על ידי IL-1β בכונדרוציטים אנושיים C28/I2 שימש לבחינת דפוסי הביטוי של miR-590-5p ו-SPRY2 ולהערכת השפעתם על ביטוי בקלין-1, LC3-II ו-Bcl-2. על ידי חקירת ציר הרגולציה miR-590-5p/SPRY2, מחקר זה מספק תובנות לגבי המנגנונים האפיגנטיים העומדים בבסיס הישרדות כונדרוציטים ומזהה מטרה טיפולית פוטנציאלית לדלקת מפרקים מיותרת.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נערך באופן בלעדי באמצעות קו התאים המסחרי של כונדרוציטים אנושיים C28/I2. לא השתתפו במחקר זה משתתפים אנושיים, דגימות רקמה אנושית, חומרים שמקורם במטופלים או בעלי חיים חיים. לכן, אישור ועדת הביקורת המוסדית (IRB) ואישור ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC) לא נדרשו בהתאם להנחיות המוסדיות והלאומיות. הכלים, הכימיקלים, הערכות והתגובות המשמשים בפרוטוקול מופיעים בטבלת החומרים.

1. תרבית תאים ובניית מודל OA

קו התאים הכונדרוציטים האנושי C28/I2 (פרטים מסופקים בטבלת החומרים) התקבל מספק מסחרי. כדי להבטיח שחזוריות ניסיונית, תאים אומתו באמצעות פרופיל חזרה טנדם קצר (STR) ונבדקו באופן שגרתי לאישור היעדר זיהום במיקופלסמה. תאים בין קטעים 3 ל-8 שימשו לכל הניסויים. התאים נשמרו ב-DMEM עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (כל התגובות מפורטות בטבלת החומרים) בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה לחה המכילה 5%CO2.

כדי לקבוע את מודל האוסטאוארתריטיס (OA) במבחנה, תאי C28/I2 הוגרו באמצעות IL-1β רקומביננטי אנושי. בהתבסס על ספרותמבוססת 6,7, ניסויי אופטימיזציה ראשוניים של מינון-תגובה שנועדו ליצור מצב קטבולי עמיד ללא ציטוטוקסיות מיידית מופרזת, התאים טופלו ב-20 ng/mL IL-1β למשך 24 שעות.

2. קיבוץ ניסיוני וטרנספקציה

כדי להבהיר את המסלולים המכניים, המחקר חולק לשלושה מודולים ניסיוניים עיקריים, שלכל אחד מהם מינימום שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים:

  1. רווח/אובדן תפקוד SPRY2:
    התאים הוקצו ל-Control, מודל OA, OA + וקטור ריק (NC), פלסמיד הבעה יתר OA + SPRY2 (OE-SPRY2), וקבוצות RNA קטנות מתאימות (si-NC ושלושה מבנים ספציפיים של si-SPRY2: si-695, si-800, si-896) כדי לסרוק יעילות התאבכות.
  2. מודולציית miR-590-5p:
    התאים חולקו לקבוצות מעכבים של Control, מודל OA, OA + מחקה NC, OA + miR-590-5p mimic, OA + מעכב NC, ו-OA + miR-590-5p.
  3. אימות פונקציונלי של הקשר הרגולטורי miR-590-5p/SPRY2:
    כדי להעריך עוד יותר את הקשר הרגולטורי המוצע בין miR-590-5p ל-SPRY2, תאים נחשפו לתנאי חיקוי ומעכב miR-590-5p כדי לקבוע האם מודולציית miR-590-5p שינתה את ביטוי SPRY2 במודל OA.
    לצורך טרנספקציה, תאי C28/I2 הוזרעו בלוחות של 6 בארות ב-2 ×-105 תאים לבאר. עם הגעה למפגש של 70%–80%, בוצעו טרנספקציות באמצעות תגובת טרנספקציה מסחרית מבוססת שומנים בהתאם לפרוטוקול היצרן ונהלים קבועים להעברת RNA קטן בכונדרוציטים24. בקצרה, פלסמידים (OE-SPRY2 ו-NC; 2 מיקרוגרם/באר) ואוליגונוקלאוטידים (miR-590-5p מדמה/מעכב ו-siRNA; 50 ננומטר) דוללו במדיום סרום מופחת. קומפלקסי הליפיד-DNA/RNA הוקמו בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות לפני שהוספו בדרופ לתאים ב-DMEM ללא סרום. ב-6 שעות לאחר הטרנספקציה, המדיום הוחלף ב-DMEM מלא המכיל 10% FBS, והתאים תורבדו עוד 48 שעות לפני הפקת RNA וחלבון.

3. זיהוי qPCR

סך ה-RNA וה-miRNA בודדו באמצעות ערכת חילוץ ייעודית של miRNA בהתאם לפרוטוקול היצרן. טוהר וריכוז ה-RNA הוערכו באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis, ודגימות עם יחס A260/A280 של 1.8–2.0 שימשו לניתוחים במורד הזרם. שימשו תגובות תעתוק הפוך מסחריות לסינתזת cDNA. הליך המחזור ב-qPCR היה כדלקמן: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס ל-10 שניות, 58 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס ל-30 שניות; לאחר מכן ניתוח עקומת התכה לאימות ספציפיות הפריימר והיעדר דימרים של פריימר. β-אקטין ו-U6 שימשו כבקרות פנימיות ל-mRNA ול-miRNA, בהתאמה. הביטוי היחסי של הגנים חושב באמצעות שיטת 2-ΔΔCt 25. כל רצפי הפריימר, כולל אלו של Col-II, SPRY2, Beclin-1, LC3, Bcl-2, miR-590-5p וגנים ייחוסים, מופיעים בטבלה 1.

שם ראשי פריימר קדמי (5′-3′)פריימר הפוך (5′-3′)
U6ATTGGAACGATACAGAGAGATGGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5pGCGTAAGGCACGGGTGAGTGCAGGGTCCGAGGTATT
β-אקטיןTGGCACCCAGCAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA
SPRY2TAAGCCACTGAGCAAGGAGATTGGAAGGTAACACCATAAACAAGG
Bcl-2TGGGATCCTGCGGATTGACTCAGTCTACTTCCTGTGTGTGTGTTG
בקלין-1TCCCGTGGAATGGAATGAGAGTAAGGAACAAGTCGGTATCTCTG
LC3-IICATCCACAAAAATCGGTGAGCTGTAAGCGCCTTCTAA

טבלה 1: רצפי פריימר המשמשים לניתוח PCR כמותי (qPCR). רצפי פריימר קדימה ואחורה משמשים להגברה וכימות של תמלילי יעד ובקרות ייחוס פנימיות באמצעות qPCR.

אלא אם צוין אחרת, הנתונים מבוטאים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). המשמעות הסטטיסטית נקבעה באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן S-N-K לאחר מבחן. הסמלים מציינים: *P < 0.05 מול שליטה; #P < 0.05 לעומת המודל המצוין או קבוצת הביקורת השלילית; &P < 0.05 לעומת OA+מעכב-NC.

4. זיהוי כתמים מערביים

תאים נקטפו ופורקו באמצעות בופר RIPA בתוספת קוקטיילי מעכבי פרוטאז ופוספטאז, בהתאם להליכים מבוססים של חילוץ חלבון ואימונובלטינג. לאחר צנטריפוגה ב-14,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס להסרת פסולת תאית, נאסף הסופרנטנט, וריכוזי החלבון נמדדו באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA. כמויות שוות של חלבון ליזאט (30 מיקרוגרם) עברו דנויטרציה, נפתרו על ידי SDS-PAGE למשך 1.5 שעה, והועברו לממברנות PVDF ב-300 mA למשך 1.5 שעהו-26 שעות. הממברנות נחסמו עם 5% חלב יבש דל שומן במי מלח טריס-בופר המכיל 0.1% Tween 20 (TBST) למשך שעה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגירה ב-4°C למשך 16 שעות עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים (למשל, אנטי-SPRY2, דילול 1:1000). לאחר שלוש שטיפות ב-TBST, הממברנות דגרו עם נוגדנים משניים מתאימים ל-HRP בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. רצועות החלבון הוצגו באמצעות מערכת זיהוי ECL וכמותו באמצעות תוכנת ImageJ.

5. ניתוח סטטיסטי

הנתונים נותחו באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי. כל הניסויים בוצעו עם לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים (n ≥ 3), והנתונים הכמותיים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). לפני בדיקות פרמטריות, הוערכה נורמליות הנתונים באמצעות מבחן שפירו-וילק, והומוגניות של השונות הוערכה. המובהקות הסטטיסטית בין קבוצות מרובות הוערכה באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן פוסט-הוק סטודנט-ניומן-קולס (S-N-K) להשוואות מרובות. P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקמת מודל דלקתי כונדרוציטים במבחנה

כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שמאחורי הפתולוגיה של אוסטיאוארתריטיס, הוקם מודל דלקתי במבחנה המשתמש בכונדרוציטים אנושיים מסוג C28/I2 שהופעלו בגירוי IL-1β. תוקף המודל אושר על ידי הערכת הביטוי של שרשרת אלפא 1 מסוג קולגן סוג II (Col-II), רכיב ראשי במטריקס החוץ-תאי של סחוס ההיאליני וסימן ההיכר של כונדרוציטים בריאים. ניתוח כמותי גילה כי חשיפה ל-IL-1β הובילה לירידה מובהקת סטטיסטית בביטוי mRNA של Col-II ביחס לקבוצת הביקורת. שינוי פנוטיפי זה מצביע על מעבר ראשוני למצב קטבולי הדומה למיקרו-סביבה אוסטיאוארטריטית, ובכך מספק מודל יסוד למחקרים מכניים עתידיים (איור 1).

figure-results-1
איור 1: הקמת מודל אוסטיאוארתריטיס (OA) במבחנה בכונדרוציטים אנושיים ב-C28/I2. התאים טופלו ב-20 ng/mL IL-1β במשך 24 שעות. הביטוי היחסי של mRNA של Col-II נקבע על ידי qPCR, כאשר β-אקטין שימש כבקר הנרמליזציה. הנתונים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD) משלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים (n = 3). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ANOVA חד-כיווני. *P < 0.05 בהשוואה לקבוצת הביקורת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

אימות יעילות הבעה יתר של SPRY2 בתאי C28/I2

לפני הערכת התפקיד הפונקציונלי של Sprouty2 (SPRY2) במודל זה, אומת יעילות ההעברה של וקטור הבעה יתר של SPRY2. כונדרוציטים עברו טרנספקציה עם פלסמיד הבעה יתר (OE) או וקטור ריק שלילי (NC). גם ניתוחי qPCR וגם Western Blot הראו שיפור חזק של SPRY2 ברמות ה-mRNA והחלבון בקבוצת OE בהשוואה לקבוצות ה-NC וקבוצות הביקורת שלא טופלו. נתונים אלו, המוצגים באיור 2, מאשרים כי מערכת הניסוי שמרה על רמות SPRY2 גבוהות, מה שאפשר לחקור את ההשפעות הביולוגיות הספציפיות שלו.

figure-results-2
איור 2: אימות ביטוי יתר של SPRY2 בכונדרוציטים C28/I2. התאים עברו טרנספקציה עם וקטור ריק (NC) או פלסמיד הבעה יתר SPRY2 (OE). רמות ה-mRNA והחלבון היחסיות של SPRY2 הוערכו באמצעות qPCR ו-Western blot, בהתאמה. β-אקטין שימש כבקרת טעינה פנימית. הנתונים מבוטאים כממוצע ±SD (n = 3). *P < 0.05 בהשוואה לקבוצת NC. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

ביטוי יתר של SPRY2 מפחית את האוטופגיה ומווסת את סמני האפופטוזיס בתנאים דלקתיים

ניסויים מאוחרים יותר ניסו לקבוע האם SPRY2 פועל כרגולטור של אוטופגיה ואפופטוזיס בהקשר הדלקתי. לאחר הקמת מודל OA, טיפול ב-IL-1β בלבד גרם לעלייה משמעותית בסמני האוטופגיה בקלין-1 ו-LC3-II, מה שמרמז על תגובה אוטופגית מפצה ללחץ דלקתי. במקביל, ביטוי Bcl-2 עלה בקבוצת המודלים. עם זאת, הכנסת וקטור הביטוי היתר SPRY2 שינתה משמעותית את הפרופיל הזה. כפי שמוצג באיור 3, קבוצת Model+OE-SPRY2 הראתה ירידה משמעותית ברמות mRNA של Beclin-1 ו-LC3-II בהשוואה לקבוצות Model ו-Model+NC. יתרה מזאת, ביטוי יתר של SPRY2 הפחית את העלייה הנגרמת מדלקת של Bcl-2. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-SPRY2 מווסת באופן שלילי את הביטוי של סמנים הקשורים לאוטופגיה בכונדרוציטים דלקתיים.

figure-results-3
איור 3: ביטוי יתר של SPRY2 מחליש את האוטופגיה ומווסת את סמני האפופטוזיס בתנאים דלקתיים המושרים על ידי IL-1β. רמות הביטוי היחסיות של mRNA של SPRY2, Bcl-2, Beclin-1 ו-LC3-II נמדדו על ידי qPCR בקבוצות בקרה, מודל (מטופל ב-IL-1β), מודל+NC ו-Model+OE-SPRY2. β-אקטין שימש כבקרה פנימית. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 3). המשמעות הסטטיסטית נקבעה באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק S-N-K. *P < 0.05 בהשוואה לקבוצת הביקורת; #P < 0.05 בהשוואה לקבוצת Model+NC. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

miR-590-5p מעלה את הסמנים הקשורים לאוטופגיה ומקדם הישרדות כונדרוציטים

לאחר מכן, נחקרה ההשפעה התפקודית של miR-590-5p על סמנים הקשורים לאוטופגיה והישרדות. כפי שמוצג באיור 4, טרנספקציה עם חיקוי miR-590-5p במודל OA העלתה משמעותית את ביטוי Bcl-2, Beclin-1 ו-LC3-II, בניגוד להשפעות המעכבות שנצפו לאחר ביטוי יתר של SPRY2. לעומת זאת, עיכוב miR-590-5p הפחית משמעותית את ביטוי Bcl-2 ובקלין-1, בעוד שהירידה ב-LC3-II לא הגיעה למובהק סטטיסטי. תוצאות אלו מצביעות על כך ש-miR-590-5p מגביר את הביטוי של סמנים הקשורים לאוטופגיה ו-Bcl-2 הקשורים להישרדות בכונדרוציטים, מה שמצדיק חקירה נוספת לגבי יעדי הרגולציה הפוטנציאליים שלו במורד הזרם.

figure-results-4
איור 4: miR-590-5p מגביר את ביטוי הסמנים הקשור לאוטופגיה ואת ביטוי Bcl-2 הקשור להישרדות. רמות הביטוי היחסיות של mRNA של Bcl-2, Beclin-1 ו-LC3-II נמדדו על ידי qPCR במודל OA לאחר טרנספקציה עם miR-590-5p מעתיק, מעכב, או הביקורת השלילית (NC) שלהם. β-אקטין שימש כבקרת הנרמליזציה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 3). *P < 0.05 בהשוואה לקבוצת Model+Mimic-NC; #P < 0.05 בהשוואה לקבוצת Model+Inhibitor-NC (עבור Bcl-2 ו-Beclin-1). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

IL-1β מווסת את ציר miR-590-5p/SPRY2 ואת ביטוי הסמנים הקשור לאוטופגיה

כדי להבהיר את מנגנוני הרגולציה העליונים השולטים ב-SPRY2 והקשר שלו עם miR-590-5p, נבדקו פרופילי הביטוי שלהם בתנאים דלקתיים. לאחר תצפית מורפולוגית על מודל תאי C28/I2 המושרה על ידי IL-1β (איור 5A), אושרו יעילות הטרנספקציה למניפולציה גנטית של SPRY2. גם qPCR וגם ניתוחי Western blot אישרו עלייה חזקה ב-SPRY2 בקבוצת הביטוי המופרז (OE) והפללה מוצלחת בקרב קבוצות ה-RNA הקטן המפריע (siRNA) בהשוואה לקבוצת הביקורת שלהן (איורים 5B ו-5C). לעומת זאת, רמות miR-590-5p עלו באופן משמעותי לאחר טיפול ב-IL-1β.

figure-results-5
איור 5: תצפית מורפולוגית ואימות יעילות הטרנספקציה של SPRY2. (א) תצפית מורפולוגית של תאי C28/I2 לאחר טיפול ב-IL-1β (20×, מיקרוגרף קונסט פאזה). (B) רמות יחסיות של mRNA וביטוי חלבונים של SPRY2 בקבוצות ביטוי יתר (OE) של ביקורת, NC ו-SPRY2. (C) תמונות של Western Blot מייצגות המאשרות הבעה יתר של SPRY2 (משמאל) והפחתת SPRY2 על ידי siRNA ספציפיים (si-896, si-800, si-695) בהשוואה לביקורת (מימין). β-אקטין שימש כבקרת הטעינה הפנימית. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SD (n = 3). *P < 0.05 בהשוואה לקבוצת הביקורת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

כדי לקבוע האם דפוס הביטוי ההפוך הזה משקף קשר רגולטורי פוטנציאלי, נעשה שימוש ב-TargetScan Human 7.1 לזיהוי אתר קישור פוטנציאלי 8mer ל-has-miR-590-5p בתוך 3′-UTR של SPRY2 האנושי (נוקלאוטידים 236–243). יישור הרצף באיור 6 ממחיש את ההשלמה החזויה בין אזור הזרע. לאחר מכן בוצעו ניסויי חילוץ כדי לבדוק באופן פונקציונלי האם מודולציית miR-590-5p שינתה את ביטוי SPRY2 במודל OA. לאחר אישור יעילות הטרנספקציה של המחקה והמעכב miR-590-5p (איורים 7A, B), בדיקות חילוץ הראו כי עיכוב miR-590-5p הפך את הדיכוי הקשור ל-OA של ביטוי mRNA ב-SPRY2 (איור 7C). ה-mimic של miR-590-5p לא הפחית עוד יותר את ביטוי SPRY2 מעבר לדיכוי המסומן שנגרם על ידי IL-1β, בעוד שעיכוב miR-590-5p העלה משמעותית את ביטוי SPRY2 ביחס לבקרה השלילית של המעכב. ממצאים אלו תומכים בקשר רגולטורי הפוך ומשוער בין miR-590-5p ל-SPRY2 בכונדרוציטים דלקתיים.

figure-results-6
איור 6: חיזוי סיליקו של האינטראקציה הרגולטורית המשוערת בין miR-590-5p/SPRY2. ניתוח ביואינפורמטי בוצע באמצעות TargetScan Human 7.131,32 לזיהוי אתרי קישור miRNA פוטנציאליים. הסכימה ממחישה את יישור הרצפים החזוי ואת השלמת אזור הזרע בין has-miR-590-5p לבין 3′-UTR של SPRY2 האנושי (נוקלאוטידים 236–243). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-7
איור 7: השפעות מודולציית miR-590-5p על ביטוי SPRY2 בכונדרוציטים. יעילות הטרנספקציה אושרה על ידי qPCR עבור miR-590-5p המעתיק (A) והמעכב (B) ביחס לביקורת שלהם. (C) ביטוי mRNA יחסי של SPRY2 נמדד בין קבוצות הניסוי שצוינו לאחר מודולציית miR-590-5p במודל OA. U6 ו-β-אקטין שימשו כבקרים פנימיים לכימות miRNA ו-mRNA, בהתאמה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 3). *P < 0.05 בהשוואה לקבוצת הביקורת; #P < 0.05 בהשוואה לקבוצת Mimic-NC או Inhibitor-NC המתאימה; &P < 0.05 בהשוואה לקבוצת OA+מעכב-NC. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

בהתאם לתוצאות באיור 4, השינויים בסמנים הקשורים לאוטופגיה היו מקבילים להשפעות הצפויות מהירידה בביטוי SPRY2, מה שמרמז ש-miR-590-5p עשוי לשפר את הביטוי שלהם על ידי הקלה על עיכוב המתווך על ידי SPRY2. ביחד, ממצאים אלו תומכים בציר איתות משוער שבו IL-1β מעלה את miR-590-5p, miR-590-5p מדכא ביטוי SPRY2, ו-SPRY2 מופחת קשורה להגברת ביטוי הסמנים של בקלין-1 ו-LC3-II.

זמינות נתונים:

הנתונים למחקר זה מסופקים בקובץ המשלים 1.

קובץ משלים 1: מערכי הנתונים ששימשו למחקר זה, כולל נתוני מקור qPCR, תמונות מקור של Western Blot, ותוצרי ניתוח סטטיסטי.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים קודמים הראו כי miRNA מווסת אוטופגיה בשלבים שונים, כולל התחלה, הארכת ווסיקולה והבשלה27. מעורבות miRNA בפתוגנזה של OA מתועדת יותר ויותר, במיוחד באמצעות השפעות על דלקת, אפופטוזיס, שינוי מטריצה חוץ-תאית ונתיבים הקשורים לאוטופגיה. miR-590-5p נקשר להומאוסטזיס תאי ותהליכים הקשורים לסרטן 28,29,30. בהקשרים הקשורים לשלד וסחוס, דווח כי miR-590-5p מקדם התמיינות כונדרוגנית של תאי גזע מזנכימליים אנושיים 16, בעוד שבמודלים של כונדרוציטים OA, הוא יכול לווסת התפשטות, אפופטוזיס ותגובות דלקתיות על ידי מיקוד ב-FGF18,24. עם זאת, עדיין לא ברור האם miR-590-5p משפיע על תגובות הקשורות לאוטופגיה בכונדרוציטים של OA.

לכן, RNAInter ו-TargetScan שימשו לחקר מתווכים פוטנציאליים במורד הזרם, ושני הניתוחים הציעו את SPRY2 כמטרה משוערת הקשורה ל-miR-590-5p. TargetScan Human 7.131,32 זיהה אתר קישור חזוי של אזור זרעים בגודל 8 מאמרים בנוקלאוטידים 236–243 של SPRY2 3′-UTR (איור 6). SPRY2 הוא רגולטור שלילי של איתות טירוזין קינאז/MAPK של קולטנים ומבוטא ברקמות מרובות19. דווח כי העברת גנים תוך-מפרקית מסוג SPRY2 מחלישה דלקת מפרקים הנגרמת על ידי אדג'ובנט בחולדות21. ביטוי יתר של SPRY2 יכול לעכב גדילה, פלישה, נדידה וציטוקינזיס33 בתיווך HGF/SF, בעוד שאובדן תפקוד Spry2 נקשר להיפראקטיבציה של MAPK-ERK ולהגברת התרבות תאי B34. SPRY2 היה מעורב גם בוויסות22 הקשור לאפופטוזיס, בקרת נדידה קשורה ל-miRNA35, ותגובות הקשורות לאוטופגיה במודלים איסכמיים23. יחד, מחקרים אלו תומכים ב-SPRY2 כצומת רגולטורית המקשרת בין איתות דלקתי, מסלולים הקשורים לשרידות ותגובות הקשורות לאוטופגיה.

בהתחשב בקשר שלא דווח קודם לכן בין miR-590-5p ל-SPRY2 בכונדרוציטים של OA, חיזוי ביואינפורמטי של האינטראקציה הפוטנציאלית ביניהם הוביל למחקר ניסויי נוסף. התוצאות הנוכחיות הראו כי SPRY2 היה מוסט באופן משמעותי בעוד ש-miR-590-5p היה מוגבר בכונדרוציטים C28/I2 המופעלים על ידי IL-1β, מה שמשפיע על ציר זה בתגובות דלקתיות של כונדרוציטים. פונקציונלית, ביטוי יתר של SPRY2 הפחית את ביטוי בקלין-1 ו-LC3-II, ותומך באפקט מעכב על ביטוי הסמנים הקשור לאוטופגיה. לעומת זאת, עיכוב miR-590-5p הפחית את ביטוי בקלין-1 ו-Bcl-2 והחזיר את ביטוי SPRY2, בהתאם לקשר רגולטורי הפוך משוער. מכיוון ש-Bcl-2 יכול לעכב אוטופגיה תלויה בבקלין-1 ובמקביל להשפיע על אפופטוטיה13, יש לפרש את העלאת Bcl-2 עם בקלין-1 ו-LC3-II באופן ספציפי להקשר. במודל דלקתי זה, העלאת ויסות Bcl-2 עשויה לשקף בעיקר תגובה אנטי-אפופטוטית הקשורה להישרדות, בעוד שהעלייה בביטוי בקלין-1 ו-LC3-II עשויה לשקף הקלה בדיכוי הקשור ל-SPRY2. ממצאים אלו מצביעים על מודל שבו miR-590-5p מתאם את האיתות הקשור להישרדות כונדרוציטים ואת ביטוי סמני האוטופגיה על ידי דיכוי SPRY2 תחת לחץ דלקתי.

בעוד שמחקר זה מספק תובנות מכניות חשובות לגבי ציר miR-590-5p/SPRY2, יש להכיר במספר מגבלות. ראשית, כל הניסויים בוצעו במערכת דו-ממדית במבחנה באמצעות קו התאים המונצח C28/I2. מודל מפושט זה אינו מסוגל לשחזר במלואו את הלחץ הביומכני, האינטראקציות הרב-תאיות והמיקרוסביבה הדלקתית של סחוס מפרקי ב-vivo, מה שמגביל את היישום התרגומי המיידי של הממצאים. שנית, אף שחיזויים ביואינפורמטיים ובדיקות חילוץ תומכים בקשר רגולטורי משוער בין miR-590-5p ל-SPRY2, היעדר מבחן דו-לוסיפראז מונע אישור חד-משמעי של קישור פיזי ישיר בין miR-590-5p ל-SPRY2 3′-UTR. שלישית, מדידות סטטיות של בקלין-1 ו-LC3-II אינן מסוגלות להבחין בין היווצרות אוטופגוזומים מוגברת לבין פגיעה בפירוק אוטוליזוזומי; לכן, מחקרים עתידיים צריכים להעריך את השטף האוטופגי באמצעות גישות כמו טיפול בבאפילומיצין A1 או בדיקות דיווח פלואורסצנטיות טנדם. העבודה העתידית צריכה לכלול גם פאנל רחב יותר של סמנים פנוטיפיים של OA (למשל, MMP13 ו-ADAMTS5), כונדרוציטים ראשוניים בבני אדם, מודלים של הסחוס התלת-ממדי, ומודלים OA בחיים כמו חוסר יציבות של המניסקוס המדיאלי להערכת ההשפעות ארוכות הטווח של miR-590-5p ומודולציית SPRY2.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים למחלקה לגריאטריה בבית החולים רויקאנג, אוניברסיטת גואנגשי לרפואה סינית, על מתן מתקני ניסוי ותמיכה טכנית למחקר זה. המחברים מודים גם לצוות המעבדה ולעמיתים על סיועו באיסוף וניתוח הנתונים. עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט המחקר במדעי הטבע של אוניברסיטת גואנגשי לרפואה סינית (מענק מס' 2022MS039; LncRNA-GAS5 מתווך ביטוי SPRY2 כדי לעכב אוטופגיה בכונדרוציטים של ברך העכברים: מחקר מנגנון והשפעת התערבות מוקדמת של Huayu Qushi Prescription) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (קרן אזורית) (מענק מס' 82160912; דיון במנגנון על Skp2, התפרקות יוביקוויטינציה של FoxO1, עיכוב אוטופגיה של הברך, OA, כונדרוציטים של הברך, והשפעת ההתערבות המוקדמת של Huayu Qushi Prescription).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Anti-β-actin antibodyProteintech66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938בקרת טעינה פנימית לניתוח Western blot
Anti-SPRY2 antibodyProteintech11383-1-AP ; RRID: AB_2196324גילוי ביטוי חלבון SPRY2
ערכת ניתוח חלבון BCAThermo Fisher Scientific23225קביעת ריכוז חלבון כולל
קו תאים של כונדרוציטים אנושיים C28/I2PunocelCP-H107מודל כונדרוציטים חוץ גופי למחקרים בדלקת מפרקים ניוונית
DMEM מלאKeyGen BiotecKGM12800Sמדיום בסיסי לתרביות תאים שגרתיות
ערכת מיצוי miRNA אולטרה-טהורה של CWBIOCWBIOCW0627Sבידוד של RNA כולל ו-miRNA
מערכת איתור ECLThermo Fisher Scientific32106הדמיה קמילומינצנטית של רצועות חלבון
סרום בקר עוברית (FBS)Gibco1891605תוסף גדילה לתרביות תאים
GraphPad Prism גרסה 9.0GraphPad SoftwareN/Aניתוח סטטיסטי ויצירת גרפים
HiScript II Q RT SuperMixVazymeR223-01תעתוק חוזר של mRNA ל-cDNA
תוכנת ImageJהמכונים הלאומיים לבריאותN/Aכימות עוצמת רצועות ב-Western blot
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015טרנספקציה של פלסמידים ואוליגונוקלאוטידים
חקיין miR-590-5p, מעכב ו-NCsRiboBioמוכן בהתאמה אישיתויסות ביטוי miR-590-5p
ערכת סינתזת cDNA מדרגה ראשונה של miRNAVazymeMR101-02תעתוק חוזר של miRNA ל-cDNA
מדיום Opti-MEMGibco31985-062הכנת מתחמי טרנספקציה
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140122מניעת זיהום בקטריאלי בתרביות תאים
קוקטיילים של מעכבי פרוטאז ופוספטאזMedChemExpressHY-K0010הגנה על חלבונים במהלך חילוץ
ממברנות PVDFMillipore SigmaISEQ00010ממברנת העברת חלבונים לאימונובלוטינג
IL-1β אנושי רקומביננטיMedChemExpressHY-P78459גרימה של תנאים דלקתיים דמויי OA
מאגר RIPABeyotimeP0013Bפירוק תאים וחילוץ חלבונים
מבני si-SPRY2 ו-si-NCGenePharmaמוכן בהתאמה אישיתהפחתת ביטוי SPRY2
פלסמיד חדירת יתר של SPRY2 (OE) וקטור ריק (NC)GeneChemמוכן בהתאמה אישיתהערכת השפעות חדירת יתר של SPRY2
ספקטרופוטומטר UV-VIS (NanoDrop 2000)Thermo Fisher ScientificND-2000מדידת ריכוז וטוהר RNA

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hunter DJ, Bierma-Zeinstra S. Osteoarthritis. Lancet. 2019;393:1745-59.
  2. GBD 2019 Diseases and Injuries Collaborators. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 2020;396:1204-22.
  3. Tang X, et al. The prevalence of symptomatic knee osteoarthritis in China: Results from the China Health and Retirement Longitudinal Study. Arthritis Rheumatol. 2016;68:648-53.
  4. Latourte A, Kloppenburg M, Richette P. Emerging pharmaceutical therapies for osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2020;16:673-88.
  5. Glyn-Jones S, et al. Osteoarthritis. Lancet. 2015;386:376-87.
  6. Kapoor M, et al. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2011;7:33-42.
  7. Goldring MB, Otero M. Inflammation in osteoarthritis. Curr Opin Rheumatol. 2011;23:471-8.
  8. Lepetsos P, Papavassiliou AG. ROS/oxidative stress signaling in osteoarthritis. Biochim Biophys Acta. 2016;1862:576-91.
  9. Mizushima N, Komatsu M. Autophagy: Renovation of cells and tissues. Cell. 2011;147:728-41.
  10. Caramés B, Olmer M, Kiosses WB, Lotz MK. The relationship of autophagy defects to cartilage damage during joint aging in a mouse model. Arthritis Rheumatol. 2015;67:1568-76.
  11. Lotz MK, Caramés B. Autophagy and cartilage homeostasis mechanisms in joint health, aging and OA. Nat Rev Rheumatol. 2011;7:579-87.
  12. Kabeya Y, et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 2000;19:5720-8.
  13. Pattingre S, et al. Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy. Cell. 2005;122:927-39.
  14. Bartel DP. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 2004;116:281-97.
  15. Miyaki S, Asahara H. Macro view of microRNA function in osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2012;8:543-52.
  16. Wu Z, Lin Y, Zhang Z, Pan Y. Melatonin-mediated miR-526b-3p and miR-590-5p upregulation promotes chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. J Pineal Res. 2018;65:e12483.
  17. Chen M, Wang S, Chen Y. miR-590-5p suppresses hepatocellular carcinoma chemoresistance by targeting YAP1 expression. EBioMedicine. 2018;35:142-54.
  18. Endisha H, Rockel J, Jurisica I, Kapoor M. The complex landscape of microRNAs in articular cartilage: biology, pathology, and therapeutic targets. JCI Insight. 2018;3:e98630.
  19. Guy GR, Jackson RA, Yusoff P, Chow SY. Sprouty proteins: Modified modulators, matchmakers or missing links? J Endocrinol. 2009;203:191-202.
  20. Loeser RF. Integrins and chondrocyte-matrix interactions in articular cartilage. Matrix Biol. 2014;39:11-6.
  21. Zhang W, Chen L, Xiong Y. Intraarticular gene transfer of SPRY2 suppresses adjuvant-induced arthritis in rats. Appl Microbiol Biotechnol. 2015;99:6727-35.
  22. Liu Y, et al. MicroRNA-124 facilitates lens epithelial cell apoptosis by inhibiting SPRY2 and MMP-2. Mol Med Rep. 2021;23:381.
  23. Wu Y, Gao Z, Zhang J. Transcription factor E2F1 aggravates neurological injury in ischemic stroke via microRNA-122-targeted Sprouty2. Neuropsychiatr Dis Treat. 2020;16:2633-47.
  24. Jiang P, Zheng Z, Tang Y. miR-590-5p affects chondrocyte proliferation, apoptosis, and inflammation by targeting FGF18 in osteoarthritis. Am J Transl Res. 2021;13:8728-41.
  25. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 2001;25:402-8.
  26. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:4350-4.
  27. Panagopoulos PK, Lambrou GI. The involvement of microRNAs in osteoarthritis and recent developments: A narrative review. Mediterr J Rheumatol. 2018;29:67-79.
  28. Barwal TS, Sharma P. miR-590-5p: A double-edged sword in the oncogenesis process. Cancer Treat Res Commun. 2022;32:100593.
  29. Mou K, Chen M. miR-590-5p inhibits tumor growth in malignant melanoma by suppressing YAP1 expression. Oncol Rep. 2018;40:2056-66.
  30. D'Adamo S, et al. Autophagy in osteoarthritis: a target for new therapies. Curr Rheumatol Rep. 2020;22:37.
  31. Agarwal V, Bell GW, Nam JW, Bartel DP. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 2015;4:e05005.
  32. Friedman RC, Farh KK, Burge CB, Bartel DP. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 2009;19:92-105.
  33. Lee CC, et al. Overexpression of sprouty 2 inhibits HGF/SF-mediated cell growth, invasion, migration, and cytokinesis. Oncogene. 2004;23:5193-202.
  34. Frank MJ, et al. Expression of sprouty2 inhibits B-cell proliferation and is epigenetically silenced in mouse and human B-cell lymphomas. Blood. 2009;113:2478-87.
  35. Cui S, et al. Hsa-miR-22-3p inhibits liver cancer cell EMT and cell migration/invasion by indirectly regulating SPRY2. PLoS One. 2023;18:e0281536.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

233233C28 I2OAmiRNA 590 5pBeclin 1LC3IIBcl 2

מאמרים קשורים