השפעות ויסות ביטוי SPRY2 ו-miR-590-5p על אוטופגיה בכונדרוציטים מודל של דלקת מפרקים אוסטאוארטריטיס בבני אדם

Qijie Mei; Wenfei Xu; Shun Wang; Jinrong Guo; Changshen Yuan; Chao Zeng; Haijun Zheng; Kan Duan

doi:10.3791/70883

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

השפעות ויסות ביטוי SPRY2 ו-miR-590-5p על אוטופגיה בכונדרוציטים מודל של דלקת מפרקים אוסטאוארטריטיס בבני אדם

108 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70883

⸱

31 ביולי 2026

Qijie Mei^*¹ , Wenfei Xu^*¹ , Shun Wang² , Jinrong Guo¹ , Changshen Yuan¹ , Chao Zeng¹ , Haijun Zheng¹ , Kan Duan¹

¹The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, ²Guangxi University of Chinese Medicine

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

לחץ דלקתי במודל כונדרוציטים C28/I2 מושרה על ידי IL-1β הגביר את miR-590-5p והפחית את ביטוי SPRY2. מודולציה של ציר זה שינתה את הביטוי של Beclin-1, LC3-II ו-Bcl-2, מה שמרמז על מסלול רגולציה משוער miR-590-5p/SPRY2 שעשוי להשפיע על תגובות הקשורות לאוטופגיה והישרדות כונדרוציטים באוסטיאוארתריטיס.

תקציר

אוסטיאוארתריטיס (OA) היא מחלה ניוונית נפוצה במפרקים, המאופיינת בהרס סחוס מתקדם ואובדן הומאוסטזיס של כונדרוציטים. למרות שאוטופגיה לא מבוקרת תורמת לפתוגנזה של OA, המנגנונים המולקולריים השולטים בתגובות הקשורות לאוטופגיה בכונדרוציטים נותרו לא מובנים במלואם. מחקר זה חקר את תפקיד ציר הוויסות miR-590-5p/SPRY2 בסביבה דלקתית של OA באמצעות כונדרוציטים אנושיים של C28/I2 המושרה על ידי IL-1β. מודל OA במבחנה הוקם על ידי טיפול בתאי C28/I2 ב-IL-1β. הביטוי של miR-590-5p ו-SPRY2 הוערך באמצעות PCR כמותי ו-Western blotting. שיטות רווח ואיבוד תפקוד שימשו להערכת השפעות SPRY2 ו-miR-590-5p על הסמנים הקשורים לאוטופגיה Beclin-1 ו-LC3-II, וכן על החלבון Bcl-2 הקשור להישרדות. ניתוח ביואינפורמטי וניסויי חילוץ שימשו לבדיקת הקשר הרגולטורי בין miR-590-5p ל-SPRY2. טיפול ב-IL-1β הגדיל משמעותית את ביטוי miR-590-5p תוך הפחתת רמות ה-mRNA והחלבון של SPRY2 (P < 0.05). ביטוי יתר של SPRY2 הפחית משמעותית את ביטוי בקלין-1 ו-LC3-II, עם ירידות של כ-65% ו-77% בהתאמה (P < 0.05). לעומת זאת, ביטוי יתר miR-590-5p הגביר את ביטוי Beclin-1, LC3-II ו-Bcl-2, בעוד שעיכוב miR-590-5p הפך השפעות אלו והחזיר את ביטוי SPRY2. ניתוחים פונקציונליים תמכו ב-SPRY2 כיעד רגולטורי משוער במורד הזרם של miR-590-5p. ממצאים אלו מזהים את ציר miR-590-5p/SPRY2 כרגולטור חשוב לביטוי סמנים הקשורים לאוטופגיה ולהישרדות כונדרוציטים בתנאים דלקתיים, ומצביעים על רלוונטיותו הפוטנציאלית כמטרה טיפולית בדלקת אוטופגיה.

מבוא

כצורה הנפוצה ביותר של דלקת מפרקים בעולם, אוסטאוארתריטיס (OA) היא גורם מוביל לכאב, לקות בניידות ולנכות פיזית, ומטילה נטל כבד על מערכות הבריאות והחברה¹. פתולוגית, OA מאופיין בהדרדרציה הדרגתית של סחוס המפרקים, דלקת סינוביאלית ועיצוב פתולוגי של עצם תת-כינורית¹. הערכות אפידמיולוגיות מצביעות על כך שכ-303 מיליון אנשים ברחבי העולם מושפעים מ-OA, ומספר זה צפוי לעלות עם הזדקנות האוכלוסייה ועלייה בשיעורי ההשמנה². בסין, השכיחות של דלקת תסמונת ברך מוערכת ב-8.1%, עם שכיחות גבוהה יותר בקרב נשים ואוכלוסיות כפריות^. למרות השכיחות הגבוהה, אפשרויות הטיפול הנוכחיות מוגבלות בעיקר לניהול תסמינים באמצעות תרופות נוגדות דלקת לא-סטרואידיות (NSAIDs) והתערבות כירורגית למחלה מתקדמת⁴. היעדר תרופות לדלקת מפרקים ניוסטית (DMOADs) משנים מחלה משקף הבנה לא שלמה של המנגנונים המולקולריים המווסתים את ההומאוסטזיס וההישרדות של כונדרוציטים⁵.

השלמות המבנית והפונקציונלית של הסחוס המפרקי תלויה בכונדרוציטים התושבים, השומרים על מחזור מטריקס חוץ-תאי (ECM) באמצעות איזון בין פעילויות אנאבוליות לקטבוליות⁶. במהלך התקדמות OA, כונדרוציטים חשופים למתח מכני חריג ולמתווכים פרו-דלקתיים, במיוחד אינטרלוקין-1β (IL-1β) ופקטור נמק-α גידולי (TNF-α), המעודדים מעבר מסינתזת מטריצה לפירוק^{מטריצתי 6}. IL-1β תורם להריסת הסחוס על ידי גירוי ייצור מטריצת מטלופרוטאנאזים (MMPs) ואגרקנזות, תוך דיכוי סינתזת קולגן ופרוטאוגליקנים מסוג II⁷. בנוסף, IL-1β גורם ללחץ חמצוני ולתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, מה שמוביל לאפופטוזיס ולהזדקנות של כונדרוציטים^. כתוצאה מכך, זיהוי מסלולי איתות תוך-תאיים המווסתים הישרדות כונדרוציטים בתנאים דלקתיים נותר עדיפות במחקר OA.

אוטופגיה היא מסלול התדרדרות ליזוזומלית השמור אבולוציונית, השומר על הומאוסטזיס תאי באמצעות הסרה ומיחזור של אברונים ופגידות חלבונים פגועים⁹. אוטופגיה בסיסית חיונית להישרדות תאית ולאיזון אנרגיה; עם זאת, אוטופגיה לא מאוזנת יכולה לתרום להתקדמות המחלה⁹. ב-OA, אוטופגיה נחשבת בדרך כלל לתגובה מגוננת המסייעת לכונדרוציטים להסתגל ללחץ תאים ולהתנגד לאפופטוזיס^. מחקרים קודמים הציעו כי פעילות אוטופגית יורדת במהלך התקדמות דלקת האוטו-אוטו, במיוחד במחלות בשלב מתקדם, מה שמוביל לפגיעה בבקרת איכות תאית ולהגברת אובדן הכונדרוציטים¹¹. מספר חלבונים משמשים לעיתים קרובות כמדדים לפעילות הקשורה לאוטופגיה. בקלין-1 משתתף בהתחלת האוטופגוזום, בעוד שהמרה של חלבון 1 המשויך למיקרוטובול בשרשרת קלה 3 (LC3-I ל-LC3-II) משמשת באופן נרחב כסמן להיווצרות האוטופגוזומים¹². לעומת זאת, לימפומה של תאי B 2 (Bcl-2) מעכבת את האוטופגיה התלויה בבקלין-1 תוך שהיא גם מפעילה השפעות אנטי-אפופטוטיות¹³. עם זאת, פרשנות של סמנים הקשורים לאוטופגיה דורשת זהירות, שכן מדידות סטטיות של LC3-II ובקלין-1 אינן יכולות להבחין באופן עצמאי בין היווצרות אוטופגוזומים מוגברת לבין פירוק ליזוזומי פגום. למרות מגבלות אלו, מודולציה של מסלולים הקשורים לאוטופגיה נותרה אסטרטגיה טיפולית מבטיחה ל-OA.

מיקרו-RNA (miRNAs) הם RNA קצרים שאינם מקודדים, המווסתים את ביטוי הגנים לאחר שעתוק על ידי קישור לרצפים משלימים בתוך 3′ האזורים הלא מתורגמים (3′-UTRs) של RNA שליח יעד, מה שמוביל לדירוק mRNA או לדיכוי תרגומי¹⁴. ביטוי miRNA חריג נקשר לפתוגנזה של OA באמצעות השפעות על דלקת, אפופטוזיס ועיצוב מחדש של ECM¹⁵. מבין המולקולות הללו, miR-590-5p זכה לתשומת לב בשל תפקידיו הרגולטוריים במטבוליזם העצם ובתהליכים פתולוגיים נוספים. מחקרים קודמים הראו כי miR-590-5p מקדם התמיינות אוסטאוגנית ומדכא אדיפוגנזיס בתאי גזע מזנכימיים¹⁶. במודלים של סרטן, miR-590-5p מציג פונקציות תלויות הקשר כגורם אונקוגני או כמדכא גידולים¹⁷. יתרה מזאת, פרופילי ביטוי מיקרו-RNA שהשתנו, כולל חברים ממשפחת miR-590, נחשפו לשינוי פתולוגי של רקמות מפרקים במהלך OA¹⁸. עם זאת, ראיות שהושגו מתאי גזע או מודלים של סרטן אינן ניתנות להסקה ישירה לכונדרוציטים מפרקים בוגרים. לכן, תפקידו של miR-590-5p בוויסות תגובות כונדרוציטים בתוך המיקרו-סביבה הדלקתית של OA נותר לא מובן במלואו.

כדי לחקור מנגנונים פוטנציאליים במורד הזרם של miR-590-5p ב-OA, בוצעו ניתוחי חיזוי מטרות בסיליקו , שזיהו את Sprouty2 (SPRY2) כמטרה פוטנציאלית במורד הזרם. SPRY2 שייך למשפחת חלבוני Sprouty, שמווסתים באופן שלילי את איתות טירוזין קינאז של קולטנים ומדכאים את הפעלת מסלול RAS/MAPK/^{ERK 19}. מכיוון שאיתות MAPK משפיע על התמיינות כונדרוציטים, תגובות דלקתיות ואוטופגיה, SPRY2 עשוי לייצג צומת רגולטורי חשוב בפתופיזיולוגיה של OA²⁰. מחקרים קודמים מצביעים על כך ש-SPRY2 יכול לדכא תגובות דלקתיות^{במודלים} 21 של דלקת מפרקים שגרונית, להשתתף בוויסות אפופטוזיס במערכות אפיתל²², ומקושר לתגובות הקשורות לאוטופגיה במודלים של פציעות איסכמיות²³. למרות שתצפיות אלו מצביעות על כך ש-SPRY2 משתתף בוויסות האפופטוזיס והאוטופגיה, תפקידו בכונדרוציטים מפרקים נותר מאופיין בצורה לקויה. לכן הושערה כי miR-590-5p ו-SPRY2 יוצרים ציר רגולטורי המשפיע על הישרדות כונדרוציטים תחת לחץ דלקתי.

בהתבסס על תצפיות אלו, הוצע כי miR-590-5p מווסת תגובות הקשורות לאוטופגיה בכונדרוציטים על ידי ויסות ביטוי SPRY2. למרות ש-miR-590-5p ו-SPRY2 נחקרו כל אחד בנפרד בהקשרים ביולוגיים אחרים, הקשר הפונקציונלי ביניהם בכונדרוציטים OA טרם הוכח. במחקר הנוכחי, מודל OA מושרה על ידי IL-1β בכונדרוציטים אנושיים C28/I2 שימש לבחינת דפוסי הביטוי של miR-590-5p ו-SPRY2 ולהערכת השפעתם על ביטוי בקלין-1, LC3-II ו-Bcl-2. על ידי חקירת ציר הרגולציה miR-590-5p/SPRY2, מחקר זה מספק תובנות לגבי המנגנונים האפיגנטיים העומדים בבסיס הישרדות כונדרוציטים ומזהה מטרה טיפולית פוטנציאלית לדלקת מפרקים מיותרת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה נערך באופן בלעדי באמצעות קו התאים המסחרי של כונדרוציטים אנושיים C28/I2. לא השתתפו במחקר זה משתתפים אנושיים, דגימות רקמה אנושית, חומרים שמקורם במטופלים או בעלי חיים חיים. לכן, אישור ועדת הביקורת המוסדית (IRB) ואישור ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית (IACUC) לא נדרשו בהתאם להנחיות המוסדיות והלאומיות. הכלים, הכימיקלים, הערכות והתגובות המשמשים בפרוטוקול מופיעים בטבלת החומרים.

1. תרבית תאים ובניית מודל OA

קו התאים הכונדרוציטים האנושי C28/I2 (פרטים מסופקים בטבלת החומרים) התקבל מספק מסחרי. כדי להבטיח שחזוריות ניסיונית, תאים אומתו באמצעות פרופיל חזרה טנדם קצר (STR) ונבדקו באופן שגרתי לאישור היעדר זיהום במיקופלסמה. תאים בין קטעים 3 ל-8 שימשו לכל הניסויים. התאים נשמרו ב-DMEM עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (כל התגובות מפורטות בטבלת החומרים) בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה לחה המכילה 5%_CO2.

כדי לקבוע את מודל האוסטאוארתריטיס (OA) במבחנה, תאי C28/I2 הוגרו באמצעות IL-1β רקומביננטי אנושי. בהתבסס על ספרות^מבוססת ^6,7, ניסויי אופטימיזציה ראשוניים של מינון-תגובה שנועדו ליצור מצב קטבולי עמיד ללא ציטוטוקסיות מיידית מופרזת, התאים טופלו ב-20 ng/mL IL-1β למשך 24 שעות.

2. קיבוץ ניסיוני וטרנספקציה

כדי להבהיר את המסלולים המכניים, המחקר חולק לשלושה מודולים ניסיוניים עיקריים, שלכל אחד מהם מינימום שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים:

רווח/אובדן תפקוד SPRY2:
התאים הוקצו ל-Control, מודל OA, OA + וקטור ריק (NC), פלסמיד הבעה יתר OA + SPRY2 (OE-SPRY2), וקבוצות RNA קטנות מתאימות (si-NC ושלושה מבנים ספציפיים של si-SPRY2: si-695, si-800, si-896) כדי לסרוק יעילות התאבכות.
מודולציית miR-590-5p:
התאים חולקו לקבוצות מעכבים של Control, מודל OA, OA + מחקה NC, OA + miR-590-5p mimic, OA + מעכב NC, ו-OA + miR-590-5p.
אימות פונקציונלי של הקשר הרגולטורי miR-590-5p/SPRY2:
כדי להעריך עוד יותר את הקשר הרגולטורי המוצע בין miR-590-5p ל-SPRY2, תאים נחשפו לתנאי חיקוי ומעכב miR-590-5p כדי לקבוע האם מודולציית miR-590-5p שינתה את ביטוי SPRY2 במודל OA.
לצורך טרנספקציה, תאי C28/I2 הוזרעו בלוחות של 6 בארות ב-2 ×-10⁵ תאים לבאר. עם הגעה למפגש של 70%–80%, בוצעו טרנספקציות באמצעות תגובת טרנספקציה מסחרית מבוססת שומנים בהתאם לפרוטוקול היצרן ונהלים קבועים להעברת RNA קטן בכונדרוציטים²⁴. בקצרה, פלסמידים (OE-SPRY2 ו-NC; 2 מיקרוגרם/באר) ואוליגונוקלאוטידים (miR-590-5p מדמה/מעכב ו-siRNA; 50 ננומטר) דוללו במדיום סרום מופחת. קומפלקסי הליפיד-DNA/RNA הוקמו בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות לפני שהוספו בדרופ לתאים ב-DMEM ללא סרום. ב-6 שעות לאחר הטרנספקציה, המדיום הוחלף ב-DMEM מלא המכיל 10% FBS, והתאים תורבדו עוד 48 שעות לפני הפקת RNA וחלבון.

3. זיהוי qPCR

סך ה-RNA וה-miRNA בודדו באמצעות ערכת חילוץ ייעודית של miRNA בהתאם לפרוטוקול היצרן. טוהר וריכוז ה-RNA הוערכו באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis, ודגימות עם יחס A260/A280 של 1.8–2.0 שימשו לניתוחים במורד הזרם. שימשו תגובות תעתוק הפוך מסחריות לסינתזת cDNA. הליך המחזור ב-qPCR היה כדלקמן: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס ל-10 שניות, 58 מעלות צלזיוס ל-30 שניות, ו-72 מעלות צלזיוס ל-30 שניות; לאחר מכן ניתוח עקומת התכה לאימות ספציפיות הפריימר והיעדר דימרים של פריימר. β-אקטין ו-U6 שימשו כבקרות פנימיות ל-mRNA ול-miRNA, בהתאמה. הביטוי היחסי של הגנים חושב באמצעות שיטת ^2-ΔΔCt ²⁵. כל רצפי הפריימר, כולל אלו של Col-II, SPRY2, Beclin-1, LC3, Bcl-2, miR-590-5p וגנים ייחוסים, מופיעים בטבלה 1.

שם ראשי	פריימר קדמי (5′-3′)	פריימר הפוך (5′-3′)
U6	ATTGGAACGATACAGAGAGAT	GGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5p	GCGTAAGGCACGGGTG	AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
β-אקטין	TGGCACCCAGCAATGAA	CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA
SPRY2	TAAGCCACTGAGCAAGGAGAT	TGGAAGGTAACACCATAAACAAGG
Bcl-2	TGGGATCCTGCGGATTGAC	TCAGTCTACTTCCTGTGTGTGTGTTG
בקלין-1	TCCCGTGGAATGGAATGAGA	GTAAGGAACAAGTCGGTATCTCTG
LC3-II	CATCCACAAAAATCGGT	GAGCTGTAAGCGCCTTCTAA

טבלה 1: רצפי פריימר המשמשים לניתוח PCR כמותי (qPCR). רצפי פריימר קדימה ואחורה משמשים להגברה וכימות של תמלילי יעד ובקרות ייחוס פנימיות באמצעות qPCR.

אלא אם צוין אחרת, הנתונים מבוטאים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). המשמעות הסטטיסטית נקבעה באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן S-N-K לאחר מבחן. הסמלים מציינים: *P < 0.05 מול שליטה; #P < 0.05 לעומת המודל המצוין או קבוצת הביקורת השלילית; &P < 0.05 לעומת OA+מעכב-NC.

4. זיהוי כתמים מערביים

תאים נקטפו ופורקו באמצעות בופר RIPA בתוספת קוקטיילי מעכבי פרוטאז ופוספטאז, בהתאם להליכים מבוססים של חילוץ חלבון ואימונובלטינג. לאחר צנטריפוגה ב-14,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס להסרת פסולת תאית, נאסף הסופרנטנט, וריכוזי החלבון נמדדו באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA. כמויות שוות של חלבון ליזאט (30 מיקרוגרם) עברו דנויטרציה, נפתרו על ידי SDS-PAGE למשך 1.5 שעה, והועברו לממברנות PVDF ב-300 mA למשך 1.5 שעה^ו-26 שעות. הממברנות נחסמו עם 5% חלב יבש דל שומן במי מלח טריס-בופר המכיל 0.1% Tween 20 (TBST) למשך שעה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגירה ב-4°C למשך 16 שעות עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים (למשל, אנטי-SPRY2, דילול 1:1000). לאחר שלוש שטיפות ב-TBST, הממברנות דגרו עם נוגדנים משניים מתאימים ל-HRP בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. רצועות החלבון הוצגו באמצעות מערכת זיהוי ECL וכמותו באמצעות תוכנת ImageJ.

5. ניתוח סטטיסטי

הנתונים נותחו באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי. כל הניסויים בוצעו עם לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים (n ≥ 3), והנתונים הכמותיים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). לפני בדיקות פרמטריות, הוערכה נורמליות הנתונים באמצעות מבחן שפירו-וילק, והומוגניות של השונות הוערכה. המובהקות הסטטיסטית בין קבוצות מרובות הוערכה באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן פוסט-הוק סטודנט-ניומן-קולס (S-N-K) להשוואות מרובות. P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הקמת מודל דלקתי כונדרוציטים במבחנה

כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שמאחורי הפתולוגיה של אוסטיאוארתריטיס, הוקם מודל דלקתי במבחנה המשתמש בכונדרוציטים אנושיים מסוג C28/I2 שהופעלו בגירוי IL-1β. תוקף המודל אושר על ידי הערכת הביטוי של שרשרת אלפא 1 מסוג קולגן סוג II (Col-II), רכיב ראשי במטריקס החוץ-תאי של סחוס ההיאליני וסימן ההיכר של כונדרוציטים בריאים. ניתוח כמותי גילה כי חשיפה ל-IL-1β הובילה לירידה מובהקת סטטיסטית בביטוי mRNA של Col-II ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקרים קודמים הראו כי miRNA מווסת אוטופגיה בשלבים שונים, כולל התחלה, הארכת ווסיקולה והבשלה²⁷. מעורבות miRNA בפתוגנזה של OA מתועדת יותר ויותר, במיוחד באמצעות השפעות על דלקת, אפופטוזיס, שינוי מטריצה חוץ-תאית ונתיבים הקשורים לאוטופגיה. miR-590-5p נקשר להומאוסטזיס תאי ותהליכים הקשורים לסרטן 28,29,30. בהקשרים הקשורים לשלד וסחוס, דווח כי miR-590-5p מקדם התמיינות כונדרוגנית של ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

המחברים מודים למחלקה לגריאטריה בבית החולים רויקאנג, אוניברסיטת גואנגשי לרפואה סינית, על מתן מתקני ניסוי ותמיכה טכנית למחקר זה. המחברים מודים גם לצוות המעבדה ולעמיתים על סיועו באיסוף וניתוח הנתונים. עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט המחקר במדעי הטבע של אוניברסיטת גואנגשי לרפואה סינית (מענק מס' 2022MS039; LncRNA-GAS5 מתווך ביטוי SPRY2 כדי לעכב אוטופגיה בכונדרוציטים של ברך העכברים: מחקר מנגנון והשפעת התערבות מוקדמת של Huayu Qushi Prescription) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (קרן אזורית) (מענק מס' 82160912; דיון במנגנון על Skp2, התפרקות יוביקוויטינציה של FoxO1, עיכוב אוטופגיה של הברך, OA, כונדרוציטים של הברך, והשפעת ההתערבות המוקדמת של Huayu Qushi Prescription).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Anti-β-actin antibody	Proteintech	66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938	בקרת טעינה פנימית לניתוח Western blot
Anti-SPRY2 antibody	Proteintech	11383-1-AP ; RRID: AB_2196324	גילוי ביטוי חלבון SPRY2
ערכת ניתוח חלבון BCA	Thermo Fisher Scientific	23225	קביעת ריכוז חלבון כולל
קו תאים של כונדרוציטים אנושיים C28/I2	Punocel	CP-H107	מודל כונדרוציטים חוץ גופי למחקרים בדלקת מפרקים ניוונית
DMEM מלא	KeyGen Biotec	KGM12800S	מדיום בסיסי לתרביות תאים שגרתיות
ערכת מיצוי miRNA אולטרה-טהורה של CWBIO	CWBIO	CW0627S	בידוד של RNA כולל ו-miRNA
מערכת איתור ECL	Thermo Fisher Scientific	32106	הדמיה קמילומינצנטית של רצועות חלבון
סרום בקר עוברית (FBS)	Gibco	1891605	תוסף גדילה לתרביות תאים
GraphPad Prism גרסה 9.0	GraphPad Software	N/A	ניתוח סטטיסטי ויצירת גרפים
HiScript II Q RT SuperMix	Vazyme	R223-01	תעתוק חוזר של mRNA ל-cDNA
תוכנת ImageJ	המכונים הלאומיים לבריאות	N/A	כימות עוצמת רצועות ב-Western blot
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000015	טרנספקציה של פלסמידים ואוליגונוקלאוטידים
חקיין miR-590-5p, מעכב ו-NCs	RiboBio	מוכן בהתאמה אישית	ויסות ביטוי miR-590-5p
ערכת סינתזת cDNA מדרגה ראשונה של miRNA	Vazyme	MR101-02	תעתוק חוזר של miRNA ל-cDNA
מדיום Opti-MEM	Gibco	31985-062	הכנת מתחמי טרנספקציה
פניצילין-סטרפטומיצין	Gibco	15140122	מניעת זיהום בקטריאלי בתרביות תאים
קוקטיילים של מעכבי פרוטאז ופוספטאז	MedChemExpress	HY-K0010	הגנה על חלבונים במהלך חילוץ
ממברנות PVDF	Millipore Sigma	ISEQ00010	ממברנת העברת חלבונים לאימונובלוטינג
IL-1β אנושי רקומביננטי	MedChemExpress	HY-P78459	גרימה של תנאים דלקתיים דמויי OA
מאגר RIPA	Beyotime	P0013B	פירוק תאים וחילוץ חלבונים
מבני si-SPRY2 ו-si-NC	GenePharma	מוכן בהתאמה אישית	הפחתת ביטוי SPRY2
פלסמיד חדירת יתר של SPRY2 (OE) וקטור ריק (NC)	GeneChem	מוכן בהתאמה אישית	הערכת השפעות חדירת יתר של SPRY2
ספקטרופוטומטר UV-VIS (NanoDrop 2000)	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	מדידת ריכוז וטוהר RNA

מקורות

Hunter DJ, Bierma-Zeinstra S. Osteoarthritis. Lancet. 2019;393:1745-59.
GBD 2019 Diseases and Injuries Collaborators. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 2020;396:1204-22.
Tang X, et al. The prevalence of symptomatic knee osteoarthritis in China: Results from the China Health and Retirement Longitudinal Study. Arthritis Rheumatol. 2016;68:648-53.
Latourte A, Kloppenburg M, Richette P. Emerging pharmaceutical therapies for osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2020;16:673-88.
Glyn-Jones S, et al. Osteoarthritis. Lancet. 2015;386:376-87.
Kapoor M, et al. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2011;7:33-42.
Goldring MB, Otero M. Inflammation in osteoarthritis. Curr Opin Rheumatol. 2011;23:471-8.
Lepetsos P, Papavassiliou AG. ROS/oxidative stress signaling in osteoarthritis. Biochim Biophys Acta. 2016;1862:576-91.
Mizushima N, Komatsu M. Autophagy: Renovation of cells and tissues. Cell. 2011;147:728-41.
Caramés B, Olmer M, Kiosses WB, Lotz MK. The relationship of autophagy defects to cartilage damage during joint aging in a mouse model. Arthritis Rheumatol. 2015;67:1568-76.
Lotz MK, Caramés B. Autophagy and cartilage homeostasis mechanisms in joint health, aging and OA. Nat Rev Rheumatol. 2011;7:579-87.
Kabeya Y, et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 2000;19:5720-8.
Pattingre S, et al. Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy. Cell. 2005;122:927-39.
Bartel DP. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 2004;116:281-97.
Miyaki S, Asahara H. Macro view of microRNA function in osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2012;8:543-52.
Wu Z, Lin Y, Zhang Z, Pan Y. Melatonin-mediated miR-526b-3p and miR-590-5p upregulation promotes chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. J Pineal Res. 2018;65:e12483.
Chen M, Wang S, Chen Y. miR-590-5p suppresses hepatocellular carcinoma chemoresistance by targeting YAP1 expression. EBioMedicine. 2018;35:142-54.
Endisha H, Rockel J, Jurisica I, Kapoor M. The complex landscape of microRNAs in articular cartilage: biology, pathology, and therapeutic targets. JCI Insight. 2018;3:e98630.
Guy GR, Jackson RA, Yusoff P, Chow SY. Sprouty proteins: Modified modulators, matchmakers or missing links? J Endocrinol. 2009;203:191-202.
Loeser RF. Integrins and chondrocyte-matrix interactions in articular cartilage. Matrix Biol. 2014;39:11-6.
Zhang W, Chen L, Xiong Y. Intraarticular gene transfer of SPRY2 suppresses adjuvant-induced arthritis in rats. Appl Microbiol Biotechnol. 2015;99:6727-35.
Liu Y, et al. MicroRNA-124 facilitates lens epithelial cell apoptosis by inhibiting SPRY2 and MMP-2. Mol Med Rep. 2021;23:381.
Wu Y, Gao Z, Zhang J. Transcription factor E2F1 aggravates neurological injury in ischemic stroke via microRNA-122-targeted Sprouty2. Neuropsychiatr Dis Treat. 2020;16:2633-47.
Jiang P, Zheng Z, Tang Y. miR-590-5p affects chondrocyte proliferation, apoptosis, and inflammation by targeting FGF18 in osteoarthritis. Am J Transl Res. 2021;13:8728-41.
Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 2001;25:402-8.
Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:4350-4.
Panagopoulos PK, Lambrou GI. The involvement of microRNAs in osteoarthritis and recent developments: A narrative review. Mediterr J Rheumatol. 2018;29:67-79.
Barwal TS, Sharma P. miR-590-5p: A double-edged sword in the oncogenesis process. Cancer Treat Res Commun. 2022;32:100593.
Mou K, Chen M. miR-590-5p inhibits tumor growth in malignant melanoma by suppressing YAP1 expression. Oncol Rep. 2018;40:2056-66.
D'Adamo S, et al. Autophagy in osteoarthritis: a target for new therapies. Curr Rheumatol Rep. 2020;22:37.
Agarwal V, Bell GW, Nam JW, Bartel DP. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 2015;4:e05005.
Friedman RC, Farh KK, Burge CB, Bartel DP. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 2009;19:92-105.
Lee CC, et al. Overexpression of sprouty 2 inhibits HGF/SF-mediated cell growth, invasion, migration, and cytokinesis. Oncogene. 2004;23:5193-202.
Frank MJ, et al. Expression of sprouty2 inhibits B-cell proliferation and is epigenetically silenced in mouse and human B-cell lymphomas. Blood. 2009;113:2478-87.
Cui S, et al. Hsa-miR-22-3p inhibits liver cancer cell EMT and cell migration/invasion by indirectly regulating SPRY2. PLoS One. 2023;18:e0281536.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

רפואה גיליון 233 גיליון 233 ערך ריק גיליון תאי C28/I2 מודל אנושי של אוסטיאו ארתריטיס (OA)miRNA-590-5p Beclin-1 LC3II Bcl-2