מאמר מחקר
מחקר רטרוספקטיבי זה בדק ויטמין D שנוסף לטיפול בולסארטן, אטורווסטין ופרובוקול ב-150 מטופלים עם נפרופתיה סוכרתית בשלב III במשך 8 חודשים. מטופלים שקיבלו ויטמין D הראו שיפור גדול יותר בתפקוד הכליה, בפרמטרים מטבוליים, בסמנים חיסוניים ובסימנים דלקתיים מאשר מטופלים שקיבלו טיפול סטנדרטי בלבד.
מחקר זה נועד לבחון את היעילות הטיפולית של ויטמין D כתוספת לטיפול משולש מבוסס פרובוקול (ולסרטן + אטורוואסטטין + פרובוקול) אצל מטופלים עם נפרופתיה סוכרתית (DN) ולהעריך את השפעתו על תפקוד מערכת החיסון. בסך הכול נרשמו בדיעבד 150 חולי DN (Mogensen שלב III) בין יולי 2022 למאי 2024. בהתבסס על משטרי התרופות השונות שקיבלו בפרקטיקה קלינית, הם חולקו לקבוצת ביקורת (n = 56) שקיבלה טיפול משולש (ולסרטן + אטורווסטטין + פרובוקול) וקבוצת תצפית (n = 94) שקיבלה טיפול מרובע (טיפול משולש + ויטמין D). הקצאת הקבוצה נקבעה לפי הטיפול בפועל, לא לפי אקראיות. שתי הקבוצות קיבלו עירויי אינסולין יומיים במקביל במשך 8 חודשים. פרמטרים קליניים, כולל תפקוד הכליות (SCr, 24 שעות UPE, UAlb/UCR), פרופילי גלוקוז ושומן, סמנים חיסוניים (תאי CD3+, CD4+, יחס CD4+/CD8+), וגורמים דלקתיים (hs-CRP, IL-6, TNF-α, MCP-1), הוערכו לפני ואחרי הטיפול. התוצאות הראו כי קבוצת התצפית הראתה שיפורים משמעותיים יותר בתפקוד הכליה, בשליטה גליקמית, בפרופילי שומנים ובמודולציה החיסונית (פרופורציות גבוהות של CD3+ ו-CD4+, יחס גבוה יותר של CD4/CD8+, וסמנים דלקתיים מופחתים) בהשוואה לקבוצת הביקורת (כולם P <0.05). לגבי שחרור קליני, קבוצת התצפית הראתה שיעור גבוה יותר (45.74% לעומת 39.29%), אך הבדל זה לא היה מובהק סטטיסטית (χ2 = 0.596, P = 0.440). לסיכום, הוספת ויטמין D הייתה קשורה ליתרונות קליניים גדולים יותר מאשר טיפול משולש מבוסס פרובוקול בלבד בקבוצה רטרוספקטיבית זו של חולי DN, כולל שיפור בתפקוד הכליה, פרופילי גלוקוז ושומנים ואינדיקטורים של תפקוד מערכת החיסון. ממצאים אלו מצביעים על כך שויטמין D עשוי להיות סוכן תוספת מבטיח לניהול DN, אך נדרשים ניסויים מבוקרים אקראיים נוספים לאישור הסיבתיות.
נפרופתיה סוכרתית (DN), בעיה מיקרווסקולרית חמורה מאוד בסוכרת, היא כיום הגורם המוביל לאי ספיקת כליות ברחביהעולם. ככל שמקרי הסוכרת עולים, הושם דגש רב יותר על ניהול וטיפול ב-DN2. עם זאת, למרות ההתקדמות בטיפול ב-DN, תוצאות המטופלים נותרות שליליות, מה שמשפיע משמעותית על רווחתם ומטיל עליהם נזק כלכלי כבד. לכן, גילוי טיפולים יעילים יותר לעצירת התקדמות DN ולהפחתת שכיחות ESRD הוא בעל חשיבות קלינית וחברתית קריטית 3,4.
DN נוצר ומתקדם בתהליכים מורכבים רבים, הכוללים דיסרגולציה של גלוקוז, נזק חמצוני, תגובות דלקתיות ואי-סדירות בזרימת הדם5. מנגנונים אלו פועלים במגע כדי לקדם פגיעות בכליה ופיברוזיס. כיום, הטיפול ב-DN כולל בעיקר שליטה ברמות הסוכר בדם, לחץ דם וליפידים, ויישום ACEI או ARB לעיכוב התקדמותהמחלה. עם זאת, יעילות הטיפולים מוגבלת, ולעיתים קרובות מטופלים סובלים מ-ESRD, מה שדורש דיאליזה או השתלת כליה.
בשנים האחרונות, תפקידו של ויטמין D בניהול DN זכה לתשומת לב. זהו מזון מסיס בשומן, חיוני לאיזון סידן וזרחן, גדילה והתמחות תאים, ותפקוד מערכת החיסון9. מחקרים מצביעים על קשר חזק בין חוסר בוויטמין D לנזק למיקרוכלי דם בסוכרת. ויטמין D מגן על בריאות הכליות באמצעות מנגנונים שונים, כגון שיפור עמידות לאינסולין, עיכוב תגובה דלקתית, הפחתת לחץ חמצוני וויסות RAS10. בנוסף, ויטמין D יכול להפחית פרוטאינוריה ולמנוע נזק לפודוציטים, ובכך לעכב את התקדמות ה-DN. לכן, תוספי ויטמין D עשויים להפוך לאסטרטגיה חדשה לטיפול ב-DN11. פרובוקול הוא נוגד חמצון שמתמודד עם לחץ חמצוני בעיקר על ידי עיכוב חמצון חומצות השומן והפחתת היווצרות רדיקלים12. ב-DN, לחץ חמצוני תורם משמעותית לנזק לכליות. מחקרים מצביעים על כך שפרובוקול מוריד ביעילות את רמות החלבינוריה ומשפר את תפקוד הכליות בקרב הסובלים ממצב13. יתרה מזאת, לפרובוקול יש גם השפעות של ויסות שומנים בדם ועיכוב טרשת עורקים, מה שתומך עוד יותר ביישומו בטיפול ב-DN14.
מעבר למנגנוני הכליה המקומיים, מחקרים ברמת מערכת עדכניים הדגישו כי לחץ חמצוני ואיתות דלקתי ממלאים תפקיד מרכזי בתהליכים נוירודלקתיים נוירופתיים ופריפריים, במיוחדבמחלות מטבוליות וכלי דם. ניתוחים אינטגרטיביים של איתות רדוקס ואינטראקציות בין חנקן תחמוצת ל-ROS מספקים מסגרת מכנית המקשרת בין תפקוד לקוי של האנדותל, חוסר איזון חמצוני ופגיעות באיברים בין הפרעות לב וכלי דם ונוירולוגיות16. יתרה מזאת, מעורבות היפותלמית בדלקת עצבית הקשורה ללחץ ובוויסות נוירואנדוקריני עשויה להשפיע על הומאוסטזיס מטבולי מערכתיותוצאות כליות. פרספקטיבות רחבות אלו תומכות בהיגיון כי מיקוד בדלקת ובלחץ חמצוני, כפי שאנו עושים עם ויטמין D ופרובוקול, יכול להביא ליתרונות רב-מערכתיים מעבר לכליה, במיוחד אצל חולי סוכרת עם מחלות נלוותמורכבות 18.
לסיכום, גם ויטמין D וגם פרובוקול יעילים לניהול DN, והשילוב ביניהם עשוי להשיג אפקט טיפולי אידיאלי. לכן, חקירת השימוש יחד בוויטמין D ופרובוקול להשגת סינרגיה זכתה לפופולריות במחקר הטיפול ב-DN. גם ויטמין D וגם פרובוקול משלימים זה את זה בדרכי הפעולה שלהם, והיישום המשולב עשוי לשפר עוד יותר את השפעות הלחץ האנטי-חמצוני, נוגדי דלקת וויסות התגובה החיסונית, כדי להגן על תפקוד הכליות בצורה מקיפהיותר. בנוסף, ויטמין D עשוי להפחית דלקת אצל חולי DN על ידי ויסות תפקוד מערכת החיסון, ובכך לשפר עוד יותר את התחזית. מחקרים הראו שלחולי DN יש תפקוד לקוי חיסוני, המתבטא בחוסר איזון של תת-קבוצות תאי T ורמות ציטוקינים לא תקינות20,21. הפרעות חיסוניות אלו לא רק משתתפות בתהליך פגיעת הכליה, אלא גם עלולות להשפיע על תגובת המטופל לטיפול ולפרוגנוזה22. לכן, הערכת מדדי תפקוד מערכת החיסון היא חיונית להכוונת ניהול DN.
בהתחשב בראיות הישירות המוגבלות לשילוב ויטמין D ופרובוקול ב-DN, המחקר הנוכחי נועד לבחון האם משטר משולב זה מציע יתרונות קליניים נוספים והשפעות אימונומודולטוריות לעומת טיפול משולש בלבד. באמצעות עיצוב ניסויי מדוקדק וטכניקות אנליטיות מדעיות, מחקר זה יבחן לעומק את היתרונות הטיפוליים של ויטמין D בשילוב עם פרובוקול בחולי DN ואת השפעותיו על סמני תפקוד מערכת החיסון. בהתאם לרקע הנ"ל, המחקר הנוכחי בחר בוולסרטן (ARB) לשליטה בלחץ הדם ועיכוב התקדמות הכליה, באטורבסטטין לניהול דיסליפידמיה, ובאינסולין לשליטה גליקמית כמשטר הבסיס. פרובוקול נוסף כנוגד חמצון למיקוד בלחץ חמצוני, מנגנון מרכזי בהתקדמות DN. ויטמין D נוסף בקבוצת התצפית בשל תפקידו המתפתח באימונומודולציה ובהגנה מחדש. בהתאם לכך, קבוצת הביקורת קיבלה טיפול משולש (ולסרטן + אטורבסטטין + פרובוקול), בעוד קבוצת התצפית קיבלה טיפול מרובע (ולסרטן + אטורבסטטין + פרובוקול + ויטמין D). שתי הקבוצות קיבלו עירוי אינסולין יומי לאורך כל תקופת הטיפול בת 8 החודשים. לאחר הטיפול, נצפו שינויים בתפקוד הכליה, רמות הסוכר והשומנים בדם ובתת-קבוצות תאי החיסון ובמדדי דלקת בשתי הקבוצות. המשמעות הקלינית של ויטמין D בשילוב עם פרובוקול לניהול DN הוערכה על ידי תוצאות טיפוליות מנוגדות. מטרתו היא להכניס אסטרטגיות חדשניות לטיפול ב-DN, להציע למטופלים אפשרויות טיפול יעילות יותר, לשפר את איכות חייהם ולהקל על הוצאות רפואיות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים הכללי של חביי (אישור מס': 2025-LW-0265). בשל אופיו הרטרוספקטיבי של המחקר, התקבל אישור אתי לאחר תקופת איסוף הנתונים, אשר אושר על ידי הוועדה למחקרים לא התערבותיים תוך שימוש בנתונים קליניים אנונימיים. הדרישה להסכמה מדעת בכתב בוטלה.
בחירת משתתפים
משתתפים פוטנציאליים גויסו מהמחלקה לנפרולוגיה בבית החולים הכללי חביי בין יולי 2022 למאי 2024. כל המטופלים נבדקו לפי קריטריוני הכללה והחרגה מוגדרים מראש.
קריטריוני ההכללה היו כדלקמן: אבחון נפרופתיה סוכרתית (DN) במוגנסן שלבIII 23, שהוגדרה כאלבומינוריה מתמשכת עם יחס אלבומין לקריאטינין בשתן (UAlb/UCR) של 30–300 מ"ג/גרם בלפחות שתיים מתוך שלוש דגימות שתן נקודתיות שנאספו במשך 3–6 חודשים, ללא המטוריה או ירידה מהירה בתפקוד הכליה המצביע על מחלת כליות שאינה סוכרתית; קצב סינון גלומרולי מוערך (eGFR) ≥45 מ"ל/דקה/1.73 מ'2 מחושב באמצעות משוואת CKD-EPI; אבחון ראשוני של DN ללא טיפול קודם בוויטמין D, פרובוקול או מדכא חיסון ל-DN; גיל <75 שנים; ומצב יציב קלינית ללא סיבוכים חריפים של סוכרת כמו חומצת קטואבטית סוכרתית או מצב היפר-גליקמי היפרו-אוסמולר, או זיהומים פעילים חמורים בתוך 4 שבועות לפני ההרשמה. ביופסיית כליה לא נדרשה לצורך ההרשמה; עם זאת, חולים עם מחלת כליות שאינה סוכרתית חשודה, כולל משקע שתן פעיל, גלומרולונפריטיס מתקדמת במהירות או מחלה אוטואימונית מערכתית, הוצאו מהחוק.
קריטריוני ההדרה כללו מחלות מערכתיות חמורות כגון ממאירות, מחלות לב קשות או מחלות אוטואימוניות; אלרגיה ידועה לוויטמין D, פרובוקול, ולסרטן, אטורבסטטין או אינסולין; הריון או הנקה; ושימוש עדכני בתרופות בתוך 4 שבועות שעלולות להפריע לתוצאות המחקר, כולל מדכאי חיסון או קורטיקוסטרואידים.
הקצאת קבוצות
רופא הסקר נותר עיוור להקצאת הקבוצות הסופית עד לאישור הזכאות.
נרשמו מאפיינים דמוגרפיים וקליניים בסיסיים, כולל גיל, מין, משך הסוכרת וה-DN, והיסטוריה של יתר לחץ דם או היפרליפידמיה.
מחקר זה השתמש בעיצוב מבוקר רטרוספקטיבי, לא אקראי. כדי למזער הטיית בחירה ולטפל בגורמים פוטנציאליים מבלבלים, כולל שינויים זמניים ושונות רפואית, הקצאת הקבוצות התבססה על סדר הכרונולוגי של הקבלה ולא לפי העדפת הרופא או המטופל.
מטופלים שהתקבלו בין יולי 2022 לדצמבר 2023 קיבלו טיפול משולש סטנדרטי שכלל ולסרטן, אטורבסטטין ופרובוקול, והוקצו לקבוצת הביקורת (n = 56). מטופלים שאושפזו בין ינואר 2024 למאי 2024 וקיבלו טיפול מרובע (ולסרטן, אטורבסטטין, פרובוקול וויטמין D) שובצו לקבוצת התצפית (n = 94).
מספר המטופלים הגדול יותר בקבוצת התצפית שיקף יישום קליני מוגבר של טיפול בוויטמין D משלים במרכז המחקר החל מתחילת 2024, בעקבות ראיות שהתפתחו. המאפיינים הדמוגרפיים והקליניים הבסיסיים היו ניתנים להשוואה בין הקבוצות (טבלה 1; P>0.05), ולא חלו שינויים משמעותיים בקריטריונים האבחנתיים, בשיטות המעבדה או בהרכב צוות הרופאים במהלך תקופת המחקר.
מתן משטר טיפול
כל המשתתפים קיבלו משטר עירוי אינסולין תת-עורי יומי סטנדרטי לשליטה בגליקמיה לאורך כל תקופת המחקר בת 8 החודשים. מינון האינסולין הותאם בנפרד בהתאם לניטור יומי של סוכר נימי דם. המטופלים בקבוצת הביקורת קיבלו ולסרטן (80 מ"ג פעם ביום על קיבה ריקה), טורבסטטין (20 מ"ג פעם ביום) ופרובוקול (250 מ"ג פעמיים ביום) במשך 8 חודשים. המטופלים בקבוצת התצפית קיבלו את אותו משטר ולסרטן, אטורבסטטין ופרובוקול במינונים ולוחות זמנים זהים, יחד עם תוספת ויטמין D יומית דרך הפה.
מינון ויטמין D נקבע לפי רמות בסיסיות בסרום 25-הידרוקסיויטמין D [25(OH)D] שנמדדו בעת ההרשמה באמצעות אימונואסיי אלקטרוכימיליומינסנציה (ECLIA). מספיקות ויטמין D הוגדרה כ-25(OH)D ≥30 ng/mL, חוסר מספקות כ-20 ng/mL ≤25(OH)D <30 ng/mL, וחסר כ-25(OH)D <20 ng/mL. מטופלים שקיבלו תוספים למניעת מחסור קיבלו 600–800 יחידת דלק ליום, בעוד שמטופלים עם חוסר או חוסר בוויטמין D קיבלו 2000 יחידת דלק ליום.
קריטריוני ניטור ועצירה בטיחותיים
כדי להבטיח את בטיחות המשתתפים במהלך תקופת הטיפול בת 8 החודשים, נמדדו רמות סידן, זרחן והורמון פאראתירואיד (PTH) בסרום בבסיס וכל 4 שבועות למעקב אחר היפרקלצמיה הנגרמת על ידי ויטמין D וחוסר איזון בין סידן לזרחן. בוצעה בדיקת אקג (ECG) של 12 עופרות בתחילת השלב ואחרי 8 חודשים להערכת הארכת מרווחי QTc הקשורה לפרובוקול. במטופלים עם QTc בסיסי ≥450 מילישניות אצל גברים או ≥460 מילישניות אצל נשים, האק"ג חזר על עצמו בחודש הראשון.
פרמטרי תפקוד הכליה, כולל קריאטינין ו-eGFR בסרום יחד עם אלקטרוליטים בסרום, נבדקו פעמיים בשבוע במהלך החודש הראשון וחודשי לאחר מכן. המשתתפים קיבלו הוראה לדווח מיד על תסמינים חדשים. קריטריוני הפסקת הטיפול כללו סידן מתוקן בסרום >10.5 מ"ג/ד"ל (2.62 מ"מ/ליטר) שאושר בבדיקות חוזרות בתוך 48 שעות; מרווח QTc >500 מילישניות או >60 מילישניות מהבסיס בשני אקגים רצופים; הכפלת קריאטינין בסרום מהבסיס או התפתחות פגיעה חריפה בכליה לפי קריטריוני מחלת הכליה: שיפור תוצאות גלובליות (KDIGO); וכל תופעת לוואי דרגה ≥3 בהתאם לקריטריוני מונחים נפוצים לתופעות לוואי (CTCAE) הנחשבים כעשוי, סביר או בוודאות קשורה לוויטמין D או פרובוקול. תופעות לוואי חמורות דווחו לוועדת האתיקה של בית החולים בתוך 24 שעות.
איסוף ועיבוד דגימות ביולוגיות
דגימות דם ושתן נאספו לפני תחילת הטיפול ולאחר סיום תקופת הטיפול בת 8 החודשים. כל הדגימות נאספו בבוקר לאחר צום לילה של 8–12 שעות. כ-20 מ"ל דם ורידי נאספו באמצעות טכניקות פלבוטומיה סטנדרטיות למפריד סרום ולצינורות EDTA. דגימות הדם הונחו לקרישה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות וצנטריפוגה ב-1000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. סופרנטנטים שקופים בסרום נאספו בזהירות מבלי להפריע לקריש הדם, לפרווה או לפרווה הבופית, הוכנסו לקריוביאלים לבדיקות שונות, סומנו עם זיהוי משתתף, תאריך וסוג דגימה, ונשמרו בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס עד לניתוח. דגימות סרום יכלו להיאחסן בטמפרטורה של −80°C למשך עד 12 חודשים.
להפרשה של חלבון שתן במשך 24 שעות (24 שעות UPE), המשתתפים זרקו את דגימת השתן הראשונה בבוקר בשעה 7:00 ביום הראשון ולאחר מכן אספו את כל השתן, כולל דגימת השתן הראשונה בבוקר בשעה 7:00 בבוקר ביום השני, לתוך מיכל איסוף שסופק. המשתתפים קיבלו הוראה לאחסן את מיכל האיסוף במקרר במהלך תקופת האיסוף. נפח השתן הכולל נרשם, ערבב היטב ונלקח לניתוח מעבדתי. הדגימות אוחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כאשר ניתחו תוך 24 שעות או בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס לניתוח מאוחר יותר.
לגבי יחס אלבומין לקריאטינין בשתן (UAlb/UCR), דגימות שתן בבוקר הראשון נאספו במיכלים סטריליים ועובדו באופן דומה. אותם פרוצדורות חזרו על עצמן לאחר סיום תקופת הטיפול בת 8 החודשים.
ניתוח פרמטרים ביוכימיים וקליניים
דגימות סרום קפואות הופשרו על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפני ניתוח קריאטינין (SCr) בסרום (SCr). SCr נמדדה באמצעות מבחן קולורימיטרי אנזימטי על אנליזר ביוכימי אוטומטי, בהתאם להוראות היצרן. כיול יומי בוצע באמצעות כיולים רב-שכבתיים, ושתי רמות של חומרי בקרת איכות מסחריים נכללו בכל אצווה. הדגימות נותחו בשכפול, ובדיקות עם מקדם שונות >5% חזרו על עצמן. מגבלת הגילוי הנמוכה ביותר ל-SCr הייתה 2.0 מיקרומול/ליטר.
ריכוז החלבון באליקווטים של שתן של 24 שעות נמדד באמצעות שיטת פירוגאלול רד-מוליבדאט. הדגימות נותחו בכפילות, וחומרי בקרת איכות נכללו בכל ריצה. דגימות מעל טווח הכיול (>3.0 גרם לליטר) דוללו עם סליין רגיל והועברו להערכה מחודשת. ה-UPE של 24 שעות חושב באמצעות ריכוז חלבון בשתן ונפח השתן הכולל.
ריכוזי אלבומין וקריאטינין בשתן בדגימות שתן בבוקר הראשון נמדדו באמצעות אנליז ביוכימי, ולאחר מכן חושב יחס UAlb/UCR.
גלוקוז פלזמה בצום (FPG) וגלוקוז לאחר הארוחה של 2 שעות (2h-PPG) נמדדו באמצעות מד סוכר בדם מאומת ודגימות דם עם דקירה קפילרית, לפי הוראות היצרן.
המוגלובין הגליקטיבי (HbA1c) נותח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים עם מערכת ניתוח HbA1c ייעודית. המשתתפים הונחו להימנע מתרופות להורדת שומן במשך 7 ימים ומארוחות עשירות שומן או אלכוהול במשך 24 שעות לפני איסוף הדם לאחר הטיפול. כולסטרול כולל בסרום (TC), טריגליצרידים (TG), כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL-C) וכולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL-C) נמדדו באמצעות בדיקות אנזימטיות. חומרי בקרת איכות דו-רמתיים נותחו מדי יום. פרמטרי הליפידים נמדדו תחילה בסינגליקאט, ודגימות עם מקדם שונות >10% הוערכו מחדש בכפילות. מגבלות הגילוי היו 0.1 mmol/L עבור TC, 0.05 mmol/L עבור TG, 0.08 mmol/L עבור HDL-C, ו-0.10 mmol/L עבור LDL-C. ערכי LDL-C נקבעו באמצעות בדיקה ישירה או באמצעות משוואת פרידוולד כאשר רמות הטריגליצרידים היו <400 מ"ג/ד"ל.
תפקוד חיסוני וניתוח סמנים דלקתיים
ריכוזי האימונוגלובולין G (IgG) בסרום נמדדו באמצעות ערכת ELISA מסחרית של IgG אנושי. טווח זיהוי הבדיקה היה 1.37–1000 ng/mL, הרגישות הייתה 0.52 ng/mL, מקדם השונות בתוך הבדיקה היה <6%, ומקדם השונות בין הבדיקות היה <9%. כל הדגימות נותחו בשכפול, וחומרים באיכות גבוהה ונמוכה שסופקו עם הערכה נכללו בכל צלחת. לוחות עם ערכי QC מחוץ לשתי סטיות תקן מערכי היעד נדחו וחזרו על עצמם. דגימות מעל הגבול העליון דוללו ביחס 1:2 והוערכו מחדש.
כל המגבים ודגימות הסרום הותאמו לטמפרטורת החדר לפני הניתוח. דגימות הסרום מדוללו לפי הוראות הערכה, בדרך כלל ב-1:100,000 דילול. דגימות סטנדרטיות, דגימות מדוללות ובלקים (100 מיקרוליטר) נוספו לבארות מתאימות של מיקרופלטות מצופות מראש ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. הבארות נשטפו שלוש פעמים לפני הדגירה עם נוגדן ביוטינילציה לגילוי במשך 60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפה נוספת, נוספה פרוקסידאז חזרת ודגרה למשך 30 דקות בחושך. לאחר השטיפה, נוספה תמיסת המצע, והתערובת דגרה בחושך למשך 15 דקות לפני שנוספה תמיסת העצירה. צפיפות אופטית נמדדה ב-450 ננומטר עם אורכי גל ייחוס של 570 ננומטר או 630 ננומטר. נוצרו עקומות סטנדרטיות לחישוב ריכוזי IgG.
תת-קבוצות הלימפוציטים נותחו באמצעות ציטומטריית זרימה על BD FACSCanto II המצויד בלייזרים של 488 ננומטר ו-640 ננומטר. מתח הפיזור הקדמי הוגדר ל-300 וולט, פיזור צד ל-350 וולט, ומתח צינורות פוטומולטיפלייר עבור ערוצי FITC, APC ו-PE ל-400 וולט, 550 וולט ו-480 וולט, בהתאמה. דאבלטים הוצאו באמצעות FSC-A לעומת FSC-H gating.
בוצעה צביעת חיוניות באמצעות 7-אמינואקטינומיצין D (7-AAD), ורק אירועים שליליים של 7-AAD נותחו. דגימות דם מלאות חולקו למבחניות לא מוכתמות, בקרת איזוטיפ ומבחנות. נוגדנים אנטי-אנושיים CD3-FITC, CD4-APC ו-CD8-PE נוספו למבחנות, בעוד שנוגדנים איזוטיפיים-בקרה תואמים נוספו למבחנות. הדגימות נדגרו בחושך בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בקרות פיצוי הוכנו באמצעות BD CompBeads, ופיצוי אוטומטי בוצע בתוכנת FACSDiva. תאי דם אדומים עברו פירוק באמצעות בופר ליזיס RBC, ואז נשטפו והושמו מחדש בבופר צביעה המכיל 7-AAD.
התקנת ציטומטר יומית וחרוזי מעקב שימשו לבקרת איכות. היררכיית השער כללה הדרה של דאבלטים, בחירת לימפוציטים, גייטינג לחיוניות, שער CD3+ וזיהוי תת-קבוצות CD4/CD8. לפחות 50,000 אירועים חיים של לימפוציטים נרכשו בכל דגימה, כאשר סך האירועים שנאספו נע בין 100,000 ל-150,000. הנתונים נותחו באמצעות תוכנת FlowJo, ואחוזים של תאי CD3+, CD4+ ו-CD8+, יחד עם יחס CD4+/CD8+, חושבו.
ריכוזי הסרום hs-CRP, IL-6, TNF-α ו-MCP-1 נמדדו באמצעות ערכות ELISA מסחריות שהושגו. טווחי הגילוי והרגישויות היו כדלקמן: hs-CRP (0.07–12.5 ng/mL; רגישות 0.022 ng/mL), IL-6 (0.7–300 pg/mL; רגישות 0.35 pg/mL), TNF-α (1.6–100 pg/mL; רגישות 0.8 pg/mL), ו-MCP-1 (5–1000 pg/mL; רגישות 2.5pg/mL). כל הבדיקות בוצעו בשכפול. חומרים לשליטה באיכות נמוכה וגבוהה נכללו בכל פלטה. מקדמי השונות בתוך הבדיקה היו <8%, ומקדמי השונות בין הבדיקות היו <10%. ערכים מתחת לגבולות הגילוי נרשמו כמחצית מהגבול התחתון של הכמות, בעוד שערכים מעל הסטנדרט הגבוה ביותר דוללו והוערכו מחדש. הדגימות עברו רק מחזור הקפאה והפשרה אחד לפני הניתוח. נהלי ELISA של ציטוקינים פעלו לפי פרוטוקולים זהים לאלה שתוארו עבור IgG ELISA, בהתאם להוראות היצרן בנוגע לגורמי דילול, תנאי דגירה וטמפרטורות.
הערכת תוצאות קליניות וניהול נתונים
בסיום תקופת הטיפול בת 8 החודשים, רופאים מטפלים, שהיו עיוורים להקצאת קבוצות, העריכו את המצב הקליני של המשתתפים. מטופלים סווגו כמשוחררים כאשר כל קריטריוני השיפור הקליני המוגדרים מראש לנפרופתיה סוכרתית התקיימו לפחות לשבועיים רצופים: ירידה של ≥30% ב-UPE של 24 שעות בהשוואה לקו הבסיס, ייצוב או שיפור ב-eGFR שהוגדרו כירידה <5 מ"ל לדקה/1.73מ' רבוע מהקו הבסיסי, והיעדר סיבוכים חריפים או מצבים אחרים שדורשים טיפול אשפוזי מתמשך. משתתפים שלא עמדו בכל הקריטריונים סווגו כלא שוחררו. שיעורי התגובה הקלינית חושבו לאחר מכן עבור כל קבוצה.
כל הנתונים הדמוגרפיים, המעבדיים והקליניים שנאספו הוזנו למסד נתונים אלקטרוני באמצעות הזנת נתונים כפולה על ידי שני חוקרים עצמאיים. בוצעו בדיקות טווח ועקביות כדי להבטיח דיוק נתונים. נקודות הקצה העיקריות כללו שינויים מהבסיס ל-8 חודשים בפרמטרי תפקוד הכליה, כולל 24 שעות UPE ו-UAlb/UCR, ופרמטרי תפקוד חיסון, כולל אחוז תאי T של CD3+ ויחס CD4+/CD8+. נקודות הקצה המשניות כללו שינויים מהבסיס ל-8 חודשים בפרמטרים גליקמיים (FPG, 2h-PPG, HbA1c), פרופיל שומנים (TC, TG, LDL-C, HDL-C), סמנים דלקתיים (hs-CRP, IL-6, TNF-α, MCP-1), וקצב תגובה קלינית. כל מדדי התוצאה הוערכו בתחילת הטיפול, בתוך 48 שעות לפני תחילת הטיפול, ואחרי הטיפול, בתוך שבוע לאחר סיום תקופת הטיפול בת 8 החודשים.
ניתוח סטטיסטי
כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת SPSS. משתנים רציפים עם התפלגות נורמלית הוצגו כסטיית תקן ממוצעת ±, בעוד שמשתנים קטגוריים הוצגו בתדירות ובאחוזים. מבחני t במדגמים בלתי תלויים שימשו להשוואות בין קבוצות, ומבחני חי-ריבוע למשתנים קטגוריים. המשמעות הסטטיסטית הוגדרה כ-P<0.05. בהתחשב באופי החקר של המחקר ובמספר התוצאות הרב שהוערכו, תוצאות משניות לא הותאמו לרב-רבות. לכן, ערכי P נחשבו לתיאוריים ולא למאשרים. בגלל עיצוב המחקר הלא-אקראי הרטרוספקטיבי, כל ההשוואות בין קבוצות הביקורת לתצפית לא הותאמו לגורמים מבלבלים פוטנציאליים, וייתכן שנשארה הבלבול השאריתי. כל 150 המטופלים הרשומים (56 בקבוצת הביקורת ו-94 בקבוצת התצפית) השלימו את תקופת הטיפול והמעקב המלאה של 8 חודשים. לא אובדו מטופלים במעקב, לא נמשכו או הוצאו מהשירות לאחר ההרשמה. לא זוהו נתונים חסרים למאפיינים בסיסיים או מדדי תוצאה, כולל תפקוד הכליה, פרופילי גלוקוז ושומן, סמנים חיסוניים וגורמים דלקתיים. לכן, לא נדרשו הליכי הקצאה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בסך הכל 238 מטופלים עם נפרופתיה סוכרתית (Mogensen שלב III) נבדקו לראשונה בין יולי 2022 למאי 2024. לאחר החרגת 88 מטופלים (44 לא עמדו בקריטריוני הכללה, 28 עמדו בקריטריוני ההדרה, ו-16 עם רשומות לא מלאות), נרשמו 150 מטופלים זכאים. בהתבסס על סדר האשפוז הכרונולוגי, 56 מטופלים שאושפזו בין יולי 2022 לדצמבר 2023 הוקצו לקבוצת הביקורת (ולסרטן + אטורבסטטין + פרובוקול), ו-94 מטופלים שאושפזו בין ינואר 2024 למאי 2024 שובצו לקבוצת התצפית (תוספת ויטמין D). כל 150 המטופלים (100%) השלימו את תקופת הטיפול וה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מנגנון הפעולה הפוטנציאלי של ויטמין D ב-DN
מחקר זה מצא כי הוספת ויטמין D למשטר מבוסס פרובוקול הייתה קשורה לשיפור גדול יותר במטבוליזם הגלוקוז, תפקוד הכליה, רמות השומן וסמנים חיסוניים אצל מטופלים עם DN. ממצאים אלו מצביעים על תפקיד משלים פוטנציאלי של ויטמין D בניהול DN, אם כי לא ניתן לקבוע מנגנוני סיבתיות מעיצוב רטרוספקטיבי זה.
ראשית, ההשפעה החיובית של ויטמין D על חילוף החומרים של הסוכר מוכרת באופן נרחב. מחקרים רבים מקשרים בין חוסר בוויטמין D
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| −20°C מקפיא | ספק ציוד מעבדה סטנדרטי (למשל, Haier, Thermo) | ULT -20°C סדרה | אחסון של תמציות שתן |
| 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) | BioLegend, Inc. | 420403 | צביעה לקביעת חיוניות; ריכוז סופי 1 µg/mL |
| −80°C מקפיא | Thermo Fisher Scientific (למשל, Revco) | Revco RDE -80°C | אחסון לטווח ארוך של תמציות סרום ופלסמה |
| מיקרופלטות ELISA בעלות 96 באר (הרכבה גבוהה) | Corning Inc. (Costar) | 3590 | משטח בעל חיבור חלבון גבוה; לצורך בדיקות ELISA |
| נוגדן Anti-human CD3-FITC | BioLegend, Inc., סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב | 300306 (שכפול OKT3, טיפוסי) | 5 µL לכל בדיקה; ציטומטריה של זרימה |
| נוגדן Anti-human CD4-APC | BioLegend, Inc., סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב | 317416 (שכפול RPA-T4, טיפוסי) | 5 µL לכל בדיקה; ציטומטריה של זרימה |
| נוגדן Anti-human CD8-PE | BioLegend, Inc., סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב | 301008 (שכפול HIT8a, טיפוסי) | 5 µL לכל בדיקה; ציטומטריה של זרימה |
| Atorvastatin | Pfizer Inc. | H20051407 | 20 מג, דרך הפה, פעם ביום |
| מד ציטומטר זרימה BD FACSCanto II | BD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב | 338960 | מצויד בלייזרים של 488 ננומטר (כחול) ו-640 ננומטר (אדום) |
| מד גלוקוז בדם ופסי לבדיקה | Roche Diagnostics (Accu-Chek) | ערכת Accu-Chek Guide | לצורך בדיקת FPG ו-2h-PPG מדם קפילרי מצביעת אצבע |
| צינורות צנטריפוגה (15 מ"ל, חרוטי) | Corning Inc. | 352096 | פוליפרופילן, סטרילי; לצורך עיבוד דגימה |
| צינורות צנטריפוגה (50 מ"ל, חרוטי) | Corning Inc. | 352070 | פוליפרופילן, סטרילי; לצורך עיבוד דגימה בנפח גדול |
| כדורי CompBeads לתיקון | BD Biosciences | 552843 | שליטה חד-צביעתית לתיקון ציטומטריה של זרימה |
| בקבוקונים קריוגניים (2 מ"ל, חוט חיצוני) | Thermo Fisher Scientific (Nalgene) | 5000-0020 | לאחסון תמציות סרום/שתן; אחסון ב-−80°C או −20°C |
| כדורי CS&T Beads (Cytometer Setup & Tracking) | BD Biosciences | 641319 | בקרת איכות יומית לביצועי ציטומטר זרימה |
| צינורות EDTA Vacutainer (K2 EDTA) | BD Vacutainer | 367863 | 3 מ"ל, חרוטי; לאיסוף דם מלא (ציטומטריה של זרימה, HbA1c) |
| ערכת מבחן צבע קינטי לאנזים לקריאטינין בסרום | Roche Diagnostics GmbH | 4492161190 | כיול: Cfas (Roche); QC: Precinorm U, Precipath U (Roche) |
| מאגר צביעה לציטומטריה של זרימה | BD Biosciences | 554656 | מלח פוספט עם 1% BSA ו-0.1% נתרן אזיד |
| צינורות ציטומטריה של זרימה (12 × 75 מ"מ) | BD Biosciences (Falcon) | 352058 | פוליסטירן, תחתית מעוגלת; לצורך צביעה ורכישה של נוגדן |
| תוכנת FlowJo | BD Biosciences | גרסה 10.8 | ניתוח והמחשה של נתוני ציטומטריה של זרימה |
| ערכת HDL-C Assay (שיטה ישירה) | Wako Pure Chemical Industries, Ltd., אוסקה, יפן | 431-52501 | לצורך מדידת כולסטרול בצפיפות גבוהה |
| מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) לצורך מדידת HbA1c | Bio-Rad Laboratories, Inc. | D-10 | לצורך מדידת HbA1c מדם מלא EDTA |
| מנתח ביוכימי אוטומטי Hitachi 7180 | Hitachi, Ltd., טוקיו, יפן | 7180 | לצורך מדידת SCr, פרופיל שומנים ואלבומין/קריאטינין בשתן |
| ערכת hs-CRP ELISA | R&D Systems, Inc., מיניאפוליס, מינסוטה, ארה"ב | DCRP00 | טווח זיהוי: 0.07–12.5 נג/מ"ל; רגישות: 0.022 נג/מ"ל |
| ערכת Human IgG ELISA | Cloud-Clone Corp., יוסטון, טקסס, ארה"ב | E-80HU | טווח זיהוי: 1.37–1000 נג/מ"ל; רגישות: 0.52 נג/מ"ל; CV תוך-בדיקה <6%; CV בין-בדיקה <9% |
| תוכנ |
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה