הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד ותרבות של תאי אנדותל מיקרווסקולריים במוח העכבר

165 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70909

⸱

17 ביולי 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Vascular Physiology Laboratory, 2Biomedical Sciences Doctorate Program, Universidad de Talca, 3Faculty of Health Sciences, University of Talca, 4Group of Research and Innovation in Vascular Health, GRIVAS Health, 5Consortium for Research and Innovation Neurovascular (NEUROVAS)

במאמר זה

סיכום

הוצג פרוטוקול לבידוד ותרבות ראשונית של תאי אנדותל מיקרווסקולריים במוח (BMECs) מרקמת מוח של עכברים יילודים, במטרה ליצור מודל עמיד במבחנה לחקר תפקוד מחסומי דם-מוח בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

תקציר

תאי אנדותל מיקרווסקולריים במוח (BMECs) הם המרכיב התאי העיקרי של מחסום הדם-מוח (BBB) והם ממלאים תפקיד מרכזי בוויסות ההובלה המולקולרית ובשמירה על הומאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. מודלים אמינים במבחנה של אנדותליום מוח חיוניים לחקר פיזיולוגיה של BBB ותפקוד לקוי במחלות נוירולוגיות ומערכתיות. מתואר פרוטוקול שניתן לשחזור לבידוד ותרבות ראשונית של BMECs מקורטקס מוחי של עכברים יילודים. השיטה כוללת ניתוח רקמת קורטיקלית, דיסוציאציה מכנית ואנזימטית, הסרת שאריות מיאלין באמצעות מדרג צפיפות אלבומין בסרום בקר (BSA), והעשרת תאי אנדותל באמצעות בחירה חיסונית מבוססת CD31. תאים מבודדים מתורבתים לאחר מכן על לוחות מצופים קולגן ומאופיינים בהערכה מורפולוגית, זיהוי אימונופלואורסצנציה של סמנים אנדותליאליים, בדיקות היווצרות צינורות אנגיוגניים ומדידות התנגדות חשמלית טרנס-אנדותלית (TEER) להערכת תכונות המחסום. פרוטוקול זה מספק גישה אמינה לקבלת תרביות BMEC ראשוניות המתאימות לחקר ביולוגיית BBB, איתות אנדותליאלי ואינטראקציות נוירו-וסקולריות בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.

מבוא

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא מבנה מאוד מיוחד שמווסת בקפדנות את חילופי החומרים בין מערכת העצבים המרכזית (CNS) למחזור הדם הסיסטמי1. ה-BBB מורכב בעיקר מתאי אנדותל מיקרווסקולריים במוח המחוברים באמצעות חיבורים הדוקים. תאי אנדותל אלו פועלים בתוך מערכת רב-תאית הנקראת יחידת הנוירו-וסקולר (NVU), הכוללת גם אסטרוציטים, פריציטים, נוירונים, תאי גליה וממברנהבסיסית 2. מבין המרכיבים הללו, תאי אנדותל מיקרווסקולריים במוח (BMECs) ממלאים תפקיד מרכזי בכך שהם יוצרים שכבה רציפה עם חיבורים צפופים, אלפי מערכות מובילים סלקטיביות, תנועה וזיקולרית מוגבלת, והגבלת חדירת תאי החיסון באמצעות ביטוי נמוך של מולקולות הידבקות שמגבילות את מעבר המומסים והתאים לפרנכימת המוח 3,4.

בנוסף לתפקידם כמחסום פיזי וסלקטיבי, ה-BMECs מעורבים באופן פעיל בתהליכים חיוניים, כולל איתות נוירו-וסקולרי, ויסות זרימת דם מוחית, תגובות חיסוניות מקומיות, ובמיוחד אנגיוגנזה מוחית5. התהליך האחרון הוא מפתח בהתפתחות העוברית, אך הוא מופעל מחדש גם במצבים פתולוגיים כמו שבץ, איסכמיה או דלקת. BMECs מגיבים לאותות פרואנג'וגניים כגון גורם גדילה אנדותליאלי וסקולרי (VEGF) ופקטור גדילה שלייתי (PLGF), ומתאמים את היווצרות ובשלות כלי דם חדשים 6,7. לכן, תפקוד לקוי של אנדותל המוח עלול לפגוע קשות בשלמות ה-BBB ובהומאוסטזיס של המוח.

חקר BMECs במבחנה מאפשר לנו למודל הן את הפיזיולוגיה של BBB והן את המנגנונים שמווסתים את האנגיוגנזה של המוח. עם זאת, בידוד תאים אלה מרקמת המוח מציב אתגרים טכניים משמעותיים בשל מורכבות הרקמה העצבית, שפע המיאלין והצורך בתרביות עם טוהר אנדותלי גבוה. למרות שקיימים קווי תאים מונצחים, יש להם מגבלות משמעותיות מבחינת הייצוג הפנוטיפי והתפקודי שלהם8.

בהקשר זה, הפרוטוקולים לתרבית ראשונית של BMECs ממודלים של עכברים יילודים מהווים כלי ניסויי עוצמתי, שכן הם שומרים על תכונות מורפולוגיות, מולקולריות ותפקודיות רבות של אנדותל המוח בחי. עם זאת, מספר פרוטוקולים מבוססים לבידוד BMEC בעכברים מסתמכים על דיסוציאציה מכנית בשילוב עם גרדיאנטים של צפיפות (דקסטרן או פרקול), שלעיתים מובילים להעשרה משתנה של אנדותל וזיהום שאריתי על ידי פריציטים, אסטרוציטיםושאריות מיאלין. טיהור מבוסס אנטיביוטיקה באמצעות פורומיצין משפר את טוהר האנדותל (עד ~95%) אך עלול לגרום ללחץ תאי בשל עיכוב סינתזת חלבונים והשפעות אפשריות על פנוטיפ אנדותל10. לחילופין, גישות מבוססות מיון תאים מופעל-פלואורסצנציה (FACS) מספקות אוכלוסיות מטוהרות מאוד אך דורשות ציוד מיוחד ועיבוד נרחב, מה שעלול להפחית את הקיימות והיכולת להרחבה11. פרוטוקולי יילודים עדכניים יותר נמנעים מגרדי צפיפות ומפחיתים את מספר שלבי הצנטריפוגה, משפרים את התפוקה תוך הגבלת זיהום12.

בהתבסס על רקע זה, עבודה זו מתארת פרוטוקול אופטימלי לבידוד וגידול תאי אנדותל ממיקרו-כלי דם במוח של עכבר יילודה. שיטה זו משלבת דיסקציה אנטומית מדויקת, עיכול אנזימטי יעיל, הסרת מיאלין באמצעות גרדיאנט אלבומין בסרום בקר (BSA), והעשרה באמצעות אימונוסלקציה עם מיקרוספירות מגנטיות המחוברות לסמן CD31. הפרוטוקול מאפשר קבלת תרביות ראשוניות ברות-קיימא, שכפול ומועשרות, המתאימות למחקרים של אנגיוגנזה מוחית, אינטראקציה נוירו-וסקולרית, איתות אנדותליאלי ותפקוד לקוי של BBB בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ועדת הביואתיקה והבטיחות הביולוגית של אוניברסיטת ביו-ביו אישרה את הפרויקט (מענק Fondecyt 1240925). העבודה עם בעלי חיים בוצעה בהתאם לעקרונות המרכזיים של שלושת ה-R בשימוש בבעלי חיים ניסיוניים13 ובהתאם להמלצות ההנחיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה שפורסמו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות של ארצות הברית14. בעלי החיים הוחזקו בסביבות מתאימות בביוטריום של אוניברסיטת ביו-ביו בתנאי מגורים סטנדרטיים (מחזור אור/חושך של 12 שעות, טמפרטורה מבוקרת של 22 ± 2 מעלות צלזיוס, עם גישה חופשית למזון ולמים).

כדי להשיג את התאים, השתמשו בעכברים בהריון מסוג בר (WT) (C57BL/6), בגילאי 4 עד 6 חודשים. לאחר הלידה, הגורים נשארו עם האם עד היום החמישי לאחר הלידה (P5). בשלב זה, הצאצאים הורדמו עמוק באיזופלורן עד לאובדן הרפלקסים לפני המתת חסד. היפותרמיה שימשה אך ורק כתוסף למזעור תנועה ומיד אחריה עריפת ראש. כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית (AVMA) להמתת חסד של בעלי חיים (2020)15 ולתקנות הבינלאומיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה (NIH)14. הקורטקס המוחי בודד ושימש לפיתוח פרוטוקול ניסויי זה (ראו פרוטוקול שלב 3). טבלת החומרים מפרטת את החומרים והנוגדנים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת תווך התרבית האנדותליאלית

  1. להכנת 500 מ"ל מדיום תרבית לתאי אנדותל במוח העכברים, במיכל סטרילי, יש לערבב 250 מ"ל DMEM עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), 250 מ"ל מדיום תרבית תאי אנדותל עם 10% FBS.
    הערה: מדיום התרבית מספק גורמי גדילה חיוניים לאנדותל ותומך בהתרבות תאים. אם המוצר המוזכר (ראו טבלת החומרים) אינו זמין, ניתן להוסיף תוספים מקבילים לתאי אנדותל (כגון ECGS, הידרוקורטיזון ו-L-גלוטמין) ל-DMEM + FBS כדי להשיג תנאי גדילה דומים16.
  2. סנן סטרילי את כל התווך (10% FBS) דרך מסנן 0.22 מיקרון כדי להבטיח סטריליות.
  3. אחסן את המדיום המוכן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הכינו מדיום טרי כל 2–4 שבועות כדי לשמור על פעילות גורמי הצמיחה.

2. ציפוי לוחות התרבית

הערה: כדי לקדם את היצמדות התאים ולשמור על הפנוטיפ האנדותליאלי, יש לצפות מראש את לוחות התרבית בקולגן מסוג I. השלבים בתהליך זה הם כדלקמן:

  1. הכינו את תמיסת הציפוי המוקדם על ידי ערבוב קולגן מסוג I (0.1 מ"ג/מ"ל), M חומצה אצטית למסיסת הקולגן, ומדיום בסיסי סטרילי כדי להגיע לנפח כולל של 15 מ"ל. ערבבו בעדינות עד שהקולגן נמס לחלוטין והתאימו את התמיסה ל-pH 4.0 במידת הצורך. סנן סטרילי את התמיסה דרך מסנן 0.22 מיקרון ושמר על קרח עד לשימוש לשמירה על יציבות הקולגן.
    הערה: קולגן מסוג I מחקה את ממברנת הבסיס, תומך בחיבור תאי אנדותל, ועוזר לשמור על פנוטיפ התא.
  2. הומוגניזציה של התמיסה בתנאים סטריליים. מרחו את התמיסה באופן שווה כדי לכסות את כל פני השטח של צלחות התרבית.
    הערה: משתמשים רק בנפח הנדרש לכיסוי המשטח.
  3. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה (12–16 שעות) כדי לאפשר לקולגן לספוג כראוי. לפני זריעת תאים, הסר את תמיסת הציפוי העודפת ושוטף את הלוחות פעמיים עם מלח סטרילי עם 1x PBS, pH 7.4 סטרילי (1x PBS, pH 7.4) כדי להסיר חומצה שנותרה וקולגן לא קשור.

3. בידוד תרבית תאים מעורבים במוח

הערה: פרוטוקול זה מבוסס על דוחות קודמים 9,17 שנועדו לבודד BMECs מהקליפת המוח של עכברי P5.

  1. להקריב חמישה גורים מסוג P5 באמצעות הרדמה עמוקה עם איזופלורן; השתמשו בהיפותרמיה רק כתוספת, ואחריה כריתת ראש צווארית.
    הערה: מהשלב הזה ואילך, כל ההליכים חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגי בזרימה למינרית.
  2. אסוף את המוחות (איור 1A) והניח אותם ב-PBS קר וסטרילי (1x) בצינור קוני בנפח 50 מ"ל עד שכל המוחות מעובדים.
  3. הפרדו את קרום המוח על ידי גלגול זהיר של כל מוח על ממברנת ניטרוצלולוזה מעוקרת. העבר את המוח ללוח בגודל 100 מ"מ המכיל PBS קר (1x). באמצעות סכין סטרילית, יש להסיר את גזע המוח, המוחון, התלמוס והפקעת הריח (איור 1B,C).
  4. אסוף את הקורטקס המוחי החופשי מהקרום המוח ומאוחסן אותם ב-PBS קר (1x). העבר מיד את כל קליפת המוח לצינור קוני בגודל 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל PBS 1x על קרח (איור 1D).
  5. מפרקים מכנית את הרקמה באמצעות מספריים סטריליים, ואחר כך פיפטה בעובי 1 מ"ל עד שלא נצפו חתיכות, והתלייה הומוגנית (איור 1E).
    הערה: ניתן לחתוך את קצה הפיפטה כדי להפחית את המתח המכני במהלך הטריטורציה. פירוק רקמות מושג באמצעות יניקה מבוקרת ופיפטינג עדין, בעוד שפתח קצה רחב יותר ממזער כוחות גזירה ופירוק מכני של תאים, ובכך שומר על חיוניות התא.
  6. אסוף את כל הרקמות והניח אותן בצינורות של 15 מ"ל.
  7. כדי לעכל את הרקמה, העבר את הדגימה לצינור קוני סטרילי בנפח 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל תמיסת קולגנאז (2 מ"ג/מ"ל ב-DMEM) ודגירה במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על שייקר אורביטלי במהירות 180 סל"ד.
  8. לאחר העיכול, הוסף 5 מ"ל DMEM בתוספת 10% FBS למתלים ולצנטריפוגה ב-3,000 × גרם למשך 10 דקות (ראו איור 1F). זרוק את הסופרנטנט.
  9. כדי להסיר את המיאלין, החזירו את הכדור ל-4 מ"ל של 20% BSA ב-PBS (בלי v) ובצנטריפוגה ב-3,000 × גרם למשך 20 דקות (איור 1G). לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את השכבה החלבית העליונה המכילה מיאלין באמצעות פיפטת פסטר והשליך כל סופרנטנט שנותר (איור 1H).
  10. החזירו את הכדור ל-2 מ"ל DMEM המכיל 10% FBS, ואז צנטריפוגה שוב ב-3,000 × גרם למשך 10 דקות. להשליך את הסופרנטנט, ואז להחזיר בעדינות את הכדור האחרון ל-1 מ"ל DMEM שמכיל 10% FBS.
    הערה: בשלב זה, ההשעיה הסופית מכילה אוכלוסייה הטרוגנית של תאים שמקורם במוח הנובעת מפירוק רקמות. תערובת זו עשויה לכלול תאי אנדותל מיקרווסקולריים במוח, אסטרוציטים, פריציטים ותאי עצב נוספים. נדרשים צעדי טיהור וגידול נוספים כדי להעשיר את BMECs באופן סלקטיבי.
  11. לפני ציפוי התאים המבודדים, יש להסיר את תמיסת הציפוי מלוחות התרבית המוכנים (ראה שלב 2.3) ולשטוף כל באר פעמיים עם PBS סטרילי (1x).
  12. זרעו את התאים התלויים (שלב 3.10) על הצלחות המצופות (מומלץ: צלחות 60 מ"מ).
    הערה: בדרך כלל, כל תחום התא המתקבל מבידוד אחד מתפזר לצלחות מצופות אחת או שתיים, שכל אחת מהן מכילה 5 מ"ל של מדיום גדילה אנדותליאלי.
  13. לשמור על התרביות בתווך תאי אנדותל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לחות עם 5% CO₂. החלף את המדיום כל 2–3 ימים. כאשר התרביות מגיעות למפגש של 90–100%, יש לבצע אימונוסלקציה באמצעות חרוזים מצופים CD31 להעשיר את תאי האנדותל.
    הערה: לאחר הבידוד וההקמת תרבית ראשונית, ההליך מניב בדרך כלל כ-5 ×-10 או6 תאים בכל תכנה, אשר נצמדים ללוחות מצופים קולגן ומפתחים את המורפולוגיה האופיינית לאבני הרצוף של שכבות מונו-שכבות אנדותליות.

4. בידוד תאי אנדותל מיקרווסקולריים במוח (BMECs) באמצעות חרוזי CD31 מגנטיים

  1. הכנה וניתוק תאים
    1. כאשר התרביות מגיעות למפגש של 90–100%, שטוף את התאים 3 פעמים עם PBS (פעם אחת) כדי להסיר את המדיום ששאר.
    2. הוסף 1 מ"ל טריפסין (0.5% 1x) לצלחת ודגר במשך 3–5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את התאים.
    3. לנטרל את הטריפסין על ידי הוספת 1 מ"ל של תרבית אנדותל עם 10% FBS. העבר את תליית התא (~2 מ"ל) לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי ולצנטריפוגה ב-220 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. זרוק את הסופרנטנט.
  2. הכנת חרוזי CD31 מגנטיים
    1. הניחו 8 מיקרוליטר של חרוזי CD31 מגנטיים בצינור חדש בנפח 15 מ"ל. שטפו את החרוזים עם 1 מ"ל של תמיסת Hank's 1%, ותחזירו אותן בעדינות על ידי הזזת הצינור.
    2. הנח את הצינור על מגנט למשך 2 דקות כדי להניח את החרוזים. הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לחרוזים. חזור על שלב הכביסה שלוש פעמים.
      הערה: תמיד עבוד קרוב למגנט כדי למנוע אובדן החרוזים, ובצע שלב זה בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהום של תרבית התאים הראשונית.
  3. דגירה של תאים עם חרוזים
    1. החזירו את כדור התא ל-1 מ"ל של תמיסת Hank 1% המכילה FBS (כדי להפחית קישור לא ספציפי).
    2. העבר את התאים לצינור המכיל את החרוזים השטופים מראש באמצעות פיפטה של 1,000 מיקרוליטר. דגרו את התערובת על קרח בניעור עדין במשך 20 דקות.
  4. הפרדה מגנטית של תאי אנדותל
    1. הניחו את הצינור על מגנט למשך 3 דקות כדי להשקיע תאי אנדותל הקשורים לחרוזים.
    2. הסר בזהירות את הסופרנטנט.
      הערה: בשלב זה, ניתן לטהר שני סוגי תאים מבודדים—תא אנדותלי אחד (ראה שלב 4.5), ותערובת של סוגים שונים של תאי מוח. בשלב זה, קיימות שתי אפשרויות.
      1. הסר והשליך את הסופרנטנט (כלומר, תערובת תאי המוח) תוך שמירה על הצינור על המגנט. שטפו את התאים הקשורים לחרוזים (כלומר, תאי CD31+ ) ב-2 מ"ל של תמיסת האנק וחזרו על הפעולה פי 3.
      2. השתמשו בסופרנטנט המכיל פסולת תאית כדי ליצור תרבית חדשה המכילה תאים לא נבחרים (למשל, פיברובלסטים, אסטרוציטים, מיקרוגליה, נוירונים, פריציטים ואחרים).
  5. גידול BMECs מטוהרים
    1. החזירו את תאי האנדותל הקשורים בחרוזים ל-7 מ"ל של מדיום אנדותלי מלא (10% FBS).
    2. זרעו את התאים על פלטה בגודל 60 מ"מ שהייתה מצופה קודם לכן בקולגן במהלך הלילה (ראו סעיף 2). דגרו בתנאים סטנדרטיים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂).
      הערה: הפנוטיפ האנדותליאלי נשמר עד למעבר (p) 3 בתנאי התרבית המתוארים. כדי לשמור על תכונות הקשורות למחסום דם-מוח, מומלץ לבצע בדיקות ניסיוניות באמצעות מעברים מוקדמים (p0–p3).

5. אפיון תאים

  1. תצפית מיקרוסקופית על תאים שנלכדו בחרוזים
    הערה: בתנאי התרבית המתוארים בפרוטוקול זה, ניתן לשמור על BMECs ראשוניים עד שלושה מעברים (p3) תוך שמירה על המורפולוגיה והפנוטיפ האנדותליאליים האופייניים להם. בהתאם לצפיפות הזריעה ולקצב הצמיחה, ניתן לשמר תרביות בדרך כלל עד כ-2–3 שבועות במבחנה לפני שיתרחשו שינויים פנוטיפיים משמעותיים.
    1. לאחר אימונוסלקציה עם חרוזי CD31 מגנטיים, התבוננו בתאים המחוברים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (איור 2A).
      1. חפשו תאי אנדותל חיוביים ל-CD31 המציגים מורפולוגיה טיפוסית של אבנים ויוצרים שכבות מונוגניות הומוגניות בתוך 5–7 ימים.
        הערה: במהלך הבחירה החיסונית, חרוזים מגנטיים מצופים CD31 נקשרים במיוחד לתאי האנדותל, ובכך מעשירים את אוכלוסיית האנדותל. לאחר תהליך הבחירה, ניתן עדיין להבחין בחרוזים (בקוטר של כ-4.5 מיקרון) כשהם קשורים או מופנמים על ידי תאי אנדותל במהלך המעברים הראשונים. אלו בדרך כלל פוחתים עם שטיפות ושמירה על תרביות נוספות ואינם מפריעים לחיוניות ה-BMEC או לצמיחת התאים (איור 2B).
      2. השתמש במורפולוגיה אחידה ובהיעדר תאים מוארכים או דמויי אסטרוציטים כדי להעריך את טוהר אוכלוסיית האנדותל.
  2. אימונופלואורסצנציה עבור CD31 ו-GLUT1
    1. זרעים 2 × 103 BMECs על כיסויי כיסוי ותרבית מצופים קולגן עד להגיע למפגש של 80–90%.
    2. מקבע את התאים עם 4% פאראפורמלדהיד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (22–25 מעלות צלזיוס) ושטוף עם PBS.
    3. פרמייביליז עם 0.1% טריטון X-100 ל-5 דקות וחסימת קישור לא ספציפית עם 5% BSA ל-30 דקות.
    4. דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים נגד CD31 ו-GLUT1 (נשא גלוקוז ייעודי לאנדותל המוח).
    5. שטפו עם PBS ודגרו במשך שעה עם נוגדנים משניים פלואורסצנטיים מתאימים.
    6. גרעיני נגד צבע עם 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) והרכבת הכיסויים עם מדיום הרכבה נגד פייד.
    7. הדמיינו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה או קונפוקלי. חפשו CD31 שממוקד בגבולות התאים (איור 3A), בעוד ש-GLUT1 מראה התפלגות ציטופלזמית וממברנה, המאשר זהות אנדותליאלית ופנוטיפ אנדותליום מוחי (איור 3B).
      הערה: תמונות מייצגות מבידוד BMEC עצמאי מדגימות את המורפולוגיה והביטוי הסמנים הטיפוסי של BMECs מתורבתים. נוכחות חלבוני חיבור הדוקים, כמו קלאודין-5, יכולה לשמש גם לאפיון אנדותל המוח. כדי להעריך את טוהר התרביות האנדותליאליות, ניתן לבצע צביעת אימונופלואורסצנציה נוספת באמצעות סמנים שליליים לסוגי תאי עצב אחרים. לדוגמה, חלבון חומצי סיבי גליאלי (GFAP) עשוי לשמש לזיהוי אסטרוציטים, ומולקולת מתאם קישור סידן מיוננת 1 (Iba1) לזיהוי תאי מיקרוגליה. היעדר צביעה לסמנים אלו מאשר את היעדר זיהום מאוכלוסיות תאי הלא-אנדותליות הללו (איור 3C,D).
  3. מבחן יצירת צינורות
    הערה: תאי אנדותל מציגים יכולת פרואנג'וגנית בבדיקות Matrigel18, וזהות אנדותל ניתנת לאישור באמצעות בדיקה זו.
    1. ציפו מראש לוח עם 96 בארות במטריג'ל ואפשרו לה לפולימר במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. זרע 1 ×10 4 BMECs לכל באר ב-100 מיקרוליטר של תווך אנדותלי מלא (10% FBS). דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ועוקבים את היווצרות הצינורות במשך 4–8 שעות באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (איור 4A).
    3. כמת את אורך הצינור הכולל, מספר החיבורים והרשתות באמצעות ImageJ (תוסף Ananalyzer של Angiogenesis)19. (איור 4B).
      הערה: היכולת של BMECs ליצור מבנים צינוריים מקושרים מאשרת את הפוטנציאל האנגיוגני שלהם ואת תפקוד האנדותל.
  4. מדידת התנגדות חשמלית טרנסאנדותל (TEER)
    הערה: תאי אנדותל מוח חייבים ליצור מחסום הדוק, שכן הם מרכיב קריטי ב-BBB20. יש לאשר את היכולת האנדותליאלית ליצור מחסום חשמלי.
    1. זרעו 20,000 BMECs על שכבות טרנסוול מצופות קולגן (גודל נקבוביות 0.4 מיקרון) בתא העליון ובתרבית עד שהן מגיעות למפגש.
    2. מדדו TEER באמצעות וולטוהמטר אפיתל להערכת שלמות השכבה המונולית. רישום ערכי TEER מדי יום עד לייצוב; עלייה בהתנגדות מצביעה על היווצרות חיבורים בין-תאיים הדוקים, האופייניים למחסומי אנדותל פונקציונליים (איור 4C).
      הערה: שרידי תערובת התאים הלא נבחרת, כולל אסטרוציטים, יכולים לשמש ליצירת מערכת קוקולטורה. תצורה זו דורשת אופטימיזציה קפדנית של יחס התאים בין החלק העליון (BMECs) לתחתון (תערובת תאים לא נבחרת), שיש לסטנדרט בכל מעבדה. תצורת הקוקולטורה הזו הותאמה מדגמי BBB21 שתוארו קודם.
    3. זרעו את תערובת התאים הלא נבחרת (שלב 4.4.2.2) בבאר התחתונה של לוח התרבית ואת ה-BMECs בצד העליון של ממברנת ההכנסה של טרנסוול.
      הערה: ניסוי מייצג שהשווה בין תנאי מונוקולטורה לקוקולטורה נכלל להערכת הידוק המחסום באמצעות מדידות TEER (איור 4C).

6. הרחבה ותחזוקה של BMECs מטוהרים

  1. תנאי תרבות
    1. לשמור את ה-BMECs המטוהרים במדיום תרבית אנדותליאלי מלא (10% FBS) בטמפרטורה של 37°C בתנור לחות (95% לחות) עם 5% CO₂. החליפו את מדיום התרבית כל 2–3 ימים כדי לספק חומרים מזינים טריים ולשמור על חיוניות התא.
  2. ניטור גדילה ומורפולוגיה של תאים
    1. התבוננו בתרביות מדי יום תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי לעקוב אחר ההתקשרות, הצמיחה והמורפולוגיה של התאים. חפשו את המורפולוגיה האופיינית לאבנים של BMECs, היוצרות שכבה מונו-קונטנטית בתוך 5–7 ימים.
  3. תת-תרבות ומעבר
    1. כאשר התרביות מגיעות ל-80–90% מפגש, מנתקים תאים עם טריפסין של 0.05–0.1% למשך 3–5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. מנטרל את הטריפסין בנפח שווה של מדיום שלם, צנטריפוגה ב-220 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והשיה מחדש את הכדור בתווך אנדותליאלי טרי.
    3. זרעו את התאים על לוחות מצופים קולגן בצפיפות הרצויה להמשך התפשטות.
      הערה: יש להגביל את מעברי BMEC ל-3–5 כדי לשמור על פנוטיפ אנדותל ושלמות תפקודית.
  4. שימור קריופלי אופציונלי
    1. לאחסון ארוך טווח, החזירו את ה-BMECs למדיום הקפאה (10% DMSO בתווך אנדותליאלי מלא). הקפיאו בהדרגה ל-80 מעלות צלזיוס במקפיא בקצב מבוקר, ואז העבירו לחנקן נוזלי לאחסון ארוך טווח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר בידוד ותרבות של BMECs ראשוניים מעכברים יילודים (P5). תאים אלו הם המרכיב התאי העיקרי של ה-BBB ולכן מהווים כלי ניסויי חשוב לחקר פיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה של כלי דם מוחיים. בידוד ותרבות מוצלחים של תאי אנדותל מיקרווסקולריים במוח (BMECs) הוכחו באמצעות הערכות מורפולוגיות, פנוטיפיות ותפקודיות.

תהליך הבידוד הוביל להשליית תא שמקורה בקורטקסים מוחיים מפורקים לאחר הסרת אזורים לא קורטיקליים, עיכול אנזימי והסרת מיאלין באמצעות גרדיאנט BSA, כפי שמוצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הבידוד של BMECs הוא כלי כלי לחקר המנגנונים המווסתים את הפיזיולוגיה של ה-BBB ואת תפקודו הלקוי בפתולוגיות שונות של מערכת העצבים המרכזית(CNS), כולל שבץ. בניגוד לקווי תאים מונצחים, תרביות BMEC ראשוניות שומרות על תכונות פנוטיפיות ותפקודיות מרכזיות של אנדותל המוח, כולל ביטוי של חלבונים הקשורים הדוק, ויכולת אנגיוגנית המייצגת את ה-in vivo. הקשר 8,10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

חלקים מהמאמר נכתבו עם ChatGPT של OpenAI (GPT-4, גרסת יולי 2025) כדי לשפר בהירות, שפה וקוהרנטיות. המחברים בחרו, ערכו ואישרו באופן ביקורתי את כל התוכן הנתמך בבינה מלאכותית. לא נעשה שימוש בכלי בינה מלאכותית לניתוח נתונים, פירוש תוצאות או יצירת מסקנות מדעיות.

תודות

המחברים רוצים להודות לחוקרים השייכים ל-GRIVAS Health ול-NEUROVAS על תרומתם החשובה. מחקר זה מומן על ידי Fondecyt Regular 1240295.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
60 mm culture platesCorning430166
96 Well culture platesCorning41122107
Acetic acidSigma-AldrichA6283
Antibiotic-Antimycotic (optional)Gibco15240062
Anti-CD31Santa Cruz sc-466941:100
Anti-GFAPThermo Fisher Scientific13-03001:500
Anti-GLUT1Abcamab1157301:200
Anti-Iba1Santa Cruzsc-327251:500
Anti-mouse IgG Alexa Fluor (594 Dye)Thermo Fisher ScientificA-110051:500
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor  (488 Dye)Thermo Fisher ScientificA-110081:500
Automatic and serological pipettes Oxford LP  OXL.OXL.OSP-5C
Basal medium (for collagen solution)Gibco (DMEM)11965092
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA9647
Collagenase type IISigma-AldrichC6885
DAPIThermo Fisher Scientific622481 µg/mL
DMEM (high glucose)Thermo Fisher Scientific11965092
EndoGRO-MV Complete MediumMerck MilliporeSCME004Endothelial cell growth medium
Falcon tubes (15 & 50 mL)Corning®352096 / 352070
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco (Thermo Fisher)16000044
Fluorescence MicroscopeMoticBA410
Gloves, masks, lab consumablesVarious suppliers—
Heparin (100 U/mL)Sigma-AldrichH3393
Inverted MicroscopeOlympus CKX41
Magnetic separation magnetEasySep  NC9284020
Orbital Shaker (37 °C)Thermo Fisher ScientificSK-0180-S
ParafilmBemisPM996
PBS (1×)Thermo Fisher Scientific10010023
Refrigerated CentrifugeHITACHICT5RE
ScalpelFine Science ToolsVarious
Scissors and fine tweezersFine Science ToolsVarious
Sterile nitrocellulose membraneBIO-RAD1620094
Type I collagenCorning 30394

מקורות

  1. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. , (2020).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. , (2006).
  3. Saili, K. S., et al. Blood-brain barrier development: systems modeling and predictive toxicology. Birth Defects Res. , (2017).
  4. Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions. J Neuroimmune Pharmacol. , (2006).
  5. Tam, S. J., Watts, R. J. Connecting vascular and nervous system development: angiogenesis and the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. , (2010).
  6. Crouch, E. E., et al. Ensembles of endothelial and mural cells promote angiogenesis in prenatal human brain. Cell. , (2022).
  7. Risau, W. Developing brain produces an angiogenesis factor. Proc Natl Acad Sci U S A. , (1986).
  8. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: an overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. , (2016).
  9. Assmann, J., et al. Isolation and cultivation of primary brain endothelial cells from adult mice. Bio Protoc. , (2017).
  10. Bernard-Patrzynski, F., et al. Isolation of endothelial cells, pericytes and astrocytes from mouse brain. PLoS One. , (2019).
  11. Czupalla, C., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. Collagenase-based single cell isolation of primary murine brain endothelial cells using flow cytometry. Bio Protoc. , (2018).
  12. Nicolicht-Amorim, P., et al. Simple and efficient protocol to isolate and culture brain microvascular endothelial cells from newborn mice. Front Cell Neurosci. , (2022).
  13. Lee, K. H., Lee, D. W., Kang, B. C. The 3Rs principles in laboratory animal experiments. Lab Anim Res. , (2020).
  14. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th ed, National Academies Press. Washington (DC). (2011).
  15. American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg (IL). (2020).
  16. Ruck, T., et al. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  17. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protoc. , (2021).
  18. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312(2014).
  19. Carpentier, G., Berndt, S., Ferratge, S., Rasband, W., Cuendet, M., et al. Angiogenesis analyzer for ImageJ: a comparative morphometric analysis of "endothelial tube formation assay" and "fibrin bead assay". Sci Rep. , (2020).
  20. Dithmer, S., Blasig, I. E., Fraser, P. A., Qin, Z., Haseloff, R. F. The basic requirement of tight junction proteins in blood-brain barrier function and their role in pathologies. Int J Mol Sci. , (2024).
  21. Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB J. , (2002).
  22. Liebner, S., Czupalla, C. J., Wolburg, H. Current concepts of blood-brain barrier development. Int J Dev Biol. , (2011).
  23. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. , (2010).
  24. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. , (2005).
  25. Rahman, N. A., Rasil, A. N. H. M., Meyding-Lamade, U., Craemer, E. M., Diah, S., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: a systematic review. Brain Res. , (2016).
  26. Wu, W. Z., Bai, Y. P. Endothelial GLUTs and vascular biology. Biomed Pharmacother. , (2023).
  27. Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines (Basel). , (2021).
  28. Pusztaszeri, M. P., Seelentag, W., Bosman, F. T. Immunohistochemical expression of endothelial markers CD31, CD34, von Willebrand factor, and Fli-1 in normal human tissues. J Histochem Cytochem. , (2006).
  29. Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. , (2023).
  30. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier: from physiology to disease and back. Physiol Rev. , (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מדעי המוחגיליון 233גיליון 233החודש ב-JoVEגיליוןתאי אנדותל של המוחתרבית ראשוניתמחסום דם-מוחאנגיוגנזה מוחית

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.