מאמר שיטה

יצירה והבדילה של אורגנידים אפיתליים ריחניים אנושיים מתאי גזע בוגרים

DOI:

10.3791/70917

⸱

3 באפריל 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Department of Otolaryngology, People's Hospital of Tibet Autonomous Region, 2The Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, West China Hospital, Sichuan University, 3The Department of Medicine and Engineering Interdisciplinary Research Laboratory of Nursing & Materials, West China Hospital, Sichuan University, 4The Department of Otolaryngology, People's Hospital of Shannan City in Tibet Autonomous Region, 5The Upper Airways Research Laboratory, Department of Otolaryngology, Ghent University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר גישה מבוססת לבידוד תאי אב ריח מרקמת טורבינה עליונה בוגרת אנושית ליצירת אורגנואידים אפיתליים ריחניים. הוא גם מפרט אסטרטגיית השראה כימית שמטרתה להניע את ההבדלה של אורגנואידים אלה לנוירונים חושיים בוגרים וחושיים ריחניים, ובכך לאפשר מידול של נוירוגנזה ריחית אנושית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיתל הריח האנושי מחזיק ביכולת נוירוגנית יוצאת דופן, הנתמכת על ידי אוכלוסייה תושבת של תאי גזע בסיסיים; עם זאת, הקמת מודל דינמי במבחנה שמסכם בנאמנות את תהליך ההתחדשות הזה התבררה כמאתגרת. כאן אנו מציגים פרוטוקול מבוסס ליצירת אורגנואידים ריחניים מתאי אב מבודדים מרקמת טורבינה עליונה בוגרת של בני אדם. אורגנואידים אלה שומרים על גבעול, כפי שניתן לראות בביטוי SOX2, ומציגים דפוס התמיינות מאורגן מרחבי, המאופיין בביטוי אחיד של הסמן הנוירוני הלא בוגר GAP43 ומיקום פריפרי של סמן הנוירון החירי הבושל OMP. התמיינות ממוקדת לאחר מכן עם מעכב נוץ' LY411575, מפעיל Wnt CHIR-99021, וחומצה רטינואית יצרה תאים דמויי נוירונים חושיים בעלי סמן חיובי שהביעו יחד את OMP ואת הסמן הנוירוני Tuj1 (מחלקה III β-tubulin). מודל זה שמקורו באדם עוקף את מגבלות מערכות העכברים ומספק פלטפורמה חוץ-גופית חזקה לחקר נוירוגנזה ריחנית, אנוסמיה הקשורה לקורונה והפרעות ניווניות נוספות הקשורות לריחות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת הריח האנושית תומכת בנוירגנזה רציפה,1 תהליך שמונע בעיקר על ידי תאי גזע בסיסיים באפיתל הריח, ובפרט תאי בסיס אופקיים (HBCs) ותאי בסיס גלובוזיים (GBCs). 2,3 GBCs מתמיינים באופן קבוע לנוירונים חושיים ריחניים (OSNs), בעוד ש-HBCs נשארים שקטים עד שהם מופעלים על ידי פציעה. 4,5 תפיסת הריח מתחילה כאשר מולקולות ריח נקשרות לקולטנים על הריסים של OSNs, ומפעילות מפל העברת אותות שמעביר מידע לפקעת הריח ולקליפת המוח. 6 התפתחות ותחזוקת הפונקציה החושית הזו נשלטים על ידי אפיתל הריח.

תפקוד ריח לקוי הנגרם מפגיעות פיזיות, כימיות או ביולוגיות לעיתים נפתר באופן ספונטני. 7 עם זאת, היא משפיעה על 1.5% עד 25% מאוכלוסיית העולם8 ויכולה לנבוע מסיבות מגוונות, כולל טראומה,9 זיהומים,10 והפרעות ניווניות כמו אלצהיימר ומחלת פרקינסון; במקרים אלו, ההחלמה הספונטנית לעיתים קרובות אינה שלמה או נעדרת. גישות טיפוליות עכשוויות, כמו אימון ריח ומתן קורטיקוסטרואידים, מראות יעילות מוגבלת. 12,13 פער טיפולי זה נובע מהבנה לא שלמה של המנגנונים השולטים בהישרדות והתחדשות נוירואפיתליום הריח לאחר פציעה, פער ידע שהוחמר עוד יותר בשל חוסר היעילות של מודלים נוכחים במבחנה לחקר ביולוגיה ריחנית אנושית.

בשנים האחרונות, פיתוח מודלים אורגניים אנושיים מגוונים יצר פלטפורמות טכנולוגיות חדשות לחקר מחלות אנושיות. 14 אורגנואידים שמקורם בתאי גזע בוגרים (AdSCs), המכונים גם תאי גזע תושבי רקמה, נוצרו בהצלחה עבור מגוון רקמות שמקורן באנדודרם, כולל הקיבה, הכבד, הלבלב, הריאות ושלפוחית השתן. 15,16,17,18,19 לעומת זאת, קביעת אורגנואידים אפיתליים ריחניים אנושיים מתוך פלקוד הריח שמקורו באקטודרם נותרה מאתגרת טכנית. אתגר מעשי מרכזי הוא הקושי להשיג באופן עקבי רקמת אפיתל ריחית חיה מהטורבינה העליונה של האדם. המיקום והיקף אזור הריח משתנים מאוד בין אנשים ועובר ניוון משמעותי הקשור לגיל. איסוף לא מכוון של אפיתל נשימתי במקום ריח פוגע בתוצאות התרבית. כדי להתמודד עם זה, שיפרנו את פרוטוקול 2021 של רן ואח', אשר הצליחו לתרבית אשכולות תאים מריר ריח אנושי,20 כדי לייצר באופן אמין אורגנואידים אפיתליים ריחניים אנושיים. הגישה שלנו מייצרת אורגנואידים אפיתליים ריחניים אנושיים עם ארכיטקטורה תלת-ממדית ומאורגנת היררכית, ותומכת בהבדלתם לנוירונים חושיים ריחניים. מודל זה מספק פלטפורמה ניסיונית חשובה לחקר המנגנונים שקובעים את גורלם של תאי גזע אפיתליים בהריח ולסינון סוכנים טיפוליים פוטנציאליים להפרעות ריח.

לסיכום מפורש, המטרה העיקרית של שיטה זו היא לקבוע תהליך עבודה סטנדרטי ליצירת והבחנה בין אורגנואידים אפיתליים ריחניים אנושיים לתאי אב בוגרים. ההיגיון בגישה זו הוא לטפל בפער הקריטי שנוצר מהיעדר מודלים פיזיולוגיים רלוונטיים במבחנה של מערכת הריח האנושית. בהשוואה לתרביות דו-ממדיות (2D) מסורתיות של מונו-שכבות או מודלים של עכברים, מערכת תלת-ממדית (תלת-ממדית) זו, שמקורה, בבני אדם, מציעה יתרון ברור של סיכום נאמן של הארגון המרחבי המורכב וההקשר הגנטי הספציפי לאדם של רירית הריח. כדי שחוקרים ישקולו פרוטוקול זה, חשוב להכיר בכך שבידוד מדויק של אפיתל ריח בר קיימא מהטורבינה העליונה של האדם, תוך הימנעות מזיהום באפיתל הנשימה, הוא אתגר יוצא דופן ומושפע מאוד מגיל המטופל ומהשונות האנטומית האישית. לכן, פרוטוקול זה מתאים במיוחד לחוקרים שיש להם גישה עקבית לדגימות קליניות אנושיות ומבקשים למודל נוירוגנזה ריחית אנושית, אנוסמיה הנגרמת על ידי וירוס, או ליקויים ריחניים הקשורים להפרעות ניווניות עצבית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נערך באישור ועדת הביקורת המוסדית (IRB) של בית החולים מערב סין באוניברסיטת סצ'ואן (אישור מס' 2024 (31)). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים המשתתפים לפני איסוף הרקמות ופרסום הנתונים. דגימות רקמת טורבינה עליונה נאספו ממטופלים שעברו ניתוח בסיס גולגולת אנדוסקופי או ניתוח סינוסים אתמואידיים עבור רינוריאה של נוזל מוח-שדרה.

1. עיבוד והובלה של דגימות רקמה

  1. מיד לאחר האיסוף, הניחו את דגימות הרקמה במדיום הובלה סטרילי מקורר מראש, המורכב ממדיום בסיסי DMEM/F12/HEPES בתוספת 10% סרום בקר עוברי ותמיסת 5% פניצילין–סטרפטומיצין, והעבירו אותן למעבדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: הסרום מסייע לשמור על חיוניות התא, בעוד שתערובת האנטיביוטיקה מונעת זיהום מיקרוביאלי אפשרי במהלך המעבר. שמור על זמן ההובלה מתחת לשעתיים כדי לשמור על חיוניות התאים.

2. עיבוד רקמות מוקדם (מבוצע על קרח)

  1. העבר את הדגימה לצלחת תרבית סטרילית מקוררת, הסר את מדיום ההובלה, ושוטף את הרקמה עם בופר PBS מותאם המכיל 5% תמיסת פניצילין–סטרפטומיצין. בצע את השטיפה כך: הוסף 5 מ"ל של תמיסת שטיפה מקוררת מראש למערכת, טפח בעדינות על הרקמה 5–7 פעמים, ואז שואף את הנוזל במלואו. חזור על מחזור השטיפה הזה 3 פעמים כדי להסיר תאי דם ושאריות רקמה.
  2. באמצעות מיקרומספריים סטריליים, טחנו את הרקמה לחתיכות בגודל של כ-1–2 מ"מ 3.
    הערה: בשלב זה, שמרו על הידרציה של הרקמות, אבטחו אותה עם מלקחיים קהים, ומזערו את זמן הגיזום כדי לשמור על חיוניות התאים.

3. עיכול אנזימטי

  1. העבר את הרקמה המקוטעת מכנית לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל והוסף 3 מ"ל של בופר עיכול תרכובת מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) (המכיל 0.125% טריפסין ו-10 U/mL DNase I), תוך שמירה על יחס אנזימים לנפח רקמה של 3:1. דגרו את הצינור באמבט מים בטמפרטורה של 37°C עם ערבוב עדין למשך 20 דקות. בדקו את הדגימה כל 5 דקות כדי לעקוב אחרי התקדמות העיכול ולמנוע הצטברות רקמות.
  2. עצרו את העיכול על ידי הוספת כמות שווה של תמיסת סיום, מדיום בסיסי DMEM/F12/HEPES בתוספת 10% סרום בקר עוברי. הפיפט בעדינות את התערובת מעלה ומטה פי 10 כדי להבטיח ערבוב מלא ומגע יעיל בין האנזימים לרכיבים המעכבים.
    הערה: ה-α1-אנטי-טריפסין הנמצא בסרום מנטרל ביעילות את פעילות הטריפסין.

4. הכנת מתלים חד-תאיים

  1. הניחו מסננת תאים של 40 מיקרון מעל צינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל. באמצעות קצה פיפטה קיצוץ בנפח 1 מ"ל, העבר את הרקמה והנוזל המעוצלים מהצינור של 15 מ"ל אל המסננת. סובב בעדינות את החומר על המסנן עם קצה הפיפטה כדי להקל על המעבר, ואז שטוף את המסננת עם 1–2 מ"ל נוסף של תמיסת סיום. לאחר שכל הנוזל עבר דרך המסננת, העבר את הסינון מהצינור של 50 מ"ל לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 15 מ"ל.
  2. צנטריפוגה את המתלים ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. התבונן בכדור התא הייחודי בתחתית הצינור ושאוף בזהירות את הסופרנאנט, תוך השארה של כ-100 מיקרוליטר כדי למנוע הפרעה או אובדן כדור התא.

5. הקמת מערכת תרבות תלת-ממדית

  1. בלי להחזיר את כדור התא לתווך התרבית, יש לשלב אותו ישירות עם Matrigel באמצעות קצה פיפטה מקורר מראש ועם קישור נמוך להשגת צפיפות מדויקת של 10,000 תאים/מיקרוליטר. יש לשחרר 40 מיקרו-ליטר של תערובת תאים-מאטריגל זו לכל באר של צלחת 24 בארות ו-20 מיקרוליטר לכל צלחת קונפוקלית עם תחתית זכוכית. דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר למאטריגל לפולימר וליצור פיגום תלת-ממדי.
  2. לאחר התגבשות המטריגל, הוסף בעדינות 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי גזע עצביים ללא סרום לאורך דופן הבאר כדי למנוע הפרעה לג'ל. שמרו תרביות בתנור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂, והחליפו את המדיום כל 3 ימים במדיום טרי ומחומם מראש.
    הערה: מדיום תרבית תאי גזע עצביים ריחניים מורכב מ-DMEM/F12/HEPES בתוספת הרכיבים הבאים: R-ספונדין 1 (200 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Wnt3a (50 ng/mL), EGF (50 ng/mL), Y-27632 (10 מיקרומטר), סוכן אנטימיקרוביאלי ראשוני (100 מיקרוגרם/מ"L), תוסף N2 (1%), תוסף B27 (2%) ו-L-גלוטמין (1%).

6. מעבר והבחנה

  1. קרר מראש את תמיסת ההתאוששות האורגנואידי על קרח במשך 10 דקות לפני השימוש; שואבים את מדיום הגידול מהבארות, ואז מוסיפים 1 מ"ל של תמיסת התאוששות קרה לכל באר. הטה את הלוח לזווית של 45° ושאוב בעדינות ומשחרר את התמיסה פי 5–7 כדי לשחרר אורגנואידים ממטריצת ממברנת הבסיס ולהעביר את המתלה לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל. דגרו את הצינור על קרח למשך 3–5 דקות, ואז צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והסירו בזהירות את הסופרנטנט, והשאירו מאחור כ-100 מיקרוליטר נוזל כדי למנוע אובדן הכדור.
  2. הוסיפו 1 מ"ל של תגובת דיסוציאציה אורגנואידית ישירות לכדור התא ודגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין ב-220 סל"ד למשך 5 דקות. סיימו מיד את העיכול על ידי הוספת נפח שווה של תמיסת סטופ והפיפט בעדינות על התערובת למעלה ולמטה פי 5 כדי להבטיח אחידות. צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לאיסוף התאים המנותקים.
  3. החזירו את כדור התא ב-Matrigel בנפח של 40 מיקרו-ליטר לבאר עבור לוחות 24 בארות או 20 מיקרוליטר לבאר למנות תרבית קונפוקליות עם תחתית זכוכית; ערבבו היטב באמצעות קצה פיפטה מקורר מראש עם חיבור נמוך כדי להבטיח מתלה אחיד. לאחר הזריעה בצלחות או צלחות מתאימות, דגרו את המבנים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר פולימריזציה של Matrigel ויצירת פיגומים תלת-ממדיים. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית ספרואיד מיוחד ללא סרום לתאי גזע עצביים ריחניים לאורך דפנות הבאר כדי למנוע הפרעה לג'ל. לשמור תרביות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ ו-95% לחות יחסית.
  4. כ-7 ימים לאחר המות, לאחר שהדור החדש של אורגנואידים אפיתליים ריחניים התחדש לספרואידים, שואבים את מדיום ההרחבה מהצלחות הקונפוקליות עם תחתית זכוכית ומחליפו אותו במדיום הבדלה. החלף את מדיום ההבחנה במדיום טרי ומחומם מראש כל 3 ימים. נוירונים ריחניים מובחנים מורפולוגית בדרך כלל מתגלים תחת מיקרוסקופיה לאחר כ-7 ימים של התמיינות.
    הערה: מדיום ההתמיינות מורכב מ-DMEM/F12/HEPES בתוספת R-Spondin 1 (200 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Wnt3a (50 ng/mL), EGF (50 ng/mL), Y-27632 (10 מיקרומון), LY411575 (5 מיקרומטר), CHIR99021 (3 מיקרומון), חומצה רטינואית (RA, 1 מיקרומון), סוכן אנטימיקרוביאלי ראשוני (100 מיקרוגרם/מ"ל), תוסף N2 (1%), תוסף B27 (2%) ו-L-גלוטמין (1%).

7. אימונופלואורסצנציה

  1. שאפו את מדיום הגידול ושטפו בעדינות את הדגימות פעם אחת עם 500 מיקרו-ליטר של PBS. הסר את ה-PBS, ואז הוסף 500 מיקרול של 4% פאראפורמלדהיד וקבע את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. שואף והשליך את הקיבוע; לאחר מכן שטפו את הדגימות הקבועות עם PBS (3 x 500 מיקרוליטר) ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 48 שעות.
  2. שאיפת ה-PBS והוספה 500 מיקרוליטר של תמיסת חדירות (0.2% טריטון X-100 ב-PBS), דגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ואז שאיבה ושליפת התמיסה. שטוף את הדגימות עם 0.02% PBST (0.02% טריטון X-100 ב-PBS; 3 x 500 מיקרוליטר).
  3. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת חסימה (3% BSA ב-PBS) ודגר במשך שעה בטמפרטורת החדר.
  4. שואבים את תמיסת החסימה והחליפו ב-500 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית, המוכנה על ידי דילול הנוגדן הראשוני המתאים (למשל, אנטי-GAP43 ב-1:160, אנטי-OMP ב-1:50, או אנטי-SOX2 ב-1:50) בתמיסת חסימה, והדגר ללילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. למחרת, שאיפת תמיסת הנוגדן הראשית ושוטפים את הדגימות עם 0.02% PBST (3 x 500 מיקרוליטר).
  5. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית, המכילה נוגדן משני מצומד של Alexa Fluor 488 – או Alexa Fluor 555 – מדולל ב-1:500 בתמיסת חסימה, ודוגר בטמפרטורת החדר בחושך למשך שעה. שאיפת תמיסת הנוגדן המשני וביצוע שטיפות נוספות עם 0.02% PBST (3 x 500 מיקרוליטר).
  6. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת DAPI (DAPI מדוללת ב-PBS) ודגר בחושך במשך 10 דקות לצביעת גרעינים. שאיפת תמיסת DAPI ושוטפת את הדגימות עם 0.02% PBST (3 x 500 מיקרוליטר). אחסן את הדגימות המוצבעות בטמפרטורה של 4°C עד 48 שעות לפני ההדמיה.

8. הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. לבצע מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות גודל ציר Z של 1 מיקרון עבור אורגנואידים בקוטר של ≤100 מיקרון, ו-0.5 מיקרון עבור אורגנואידים גדולים מ-100 מיקרון. לצלם תמונות במצב רציף רב-ערוצי, תוך סריקה בסדר הבא: DAPI, FITC, TRITC ו-Cy5. ייבא את קבצי רצף התמונה של Z-stack שנרכשו לתוכנת הרינדור התלת-ממדי (למשל, Imaris). השתמש בפונקציית רינדור הנפח התלת-ממדי כדי ליצור מודל תלת-ממדי מלא של האורגנואיד. צפו במודל המשוחזר הזה כדי להמחיש את ההתפלגות המרחבית של סמנים תאיים מסוימים (למשל, SOX2, GAP43 ו-OMP) ולאשר באופן איכותי את הארכיטקטורה ההיררכית ומצב ההבחנה הנוירונית של אורגנואידים אפיתליים בהריח כנקודת הסיום הסופית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידוד רקמת אפיתל ריחית ותרבות של אורגנואידים אפיתליים ריחניים ראשוניים
כדי להקים מערכת תרביות לאורגנואידים אפיתליים ריחניים, בודדנו אפיתל ריח מרקמת טורבינה עליונה אנושית והטמינו אותו במטריצה תלת-ממדית של מטריג'ל (איור 1). בהתבסס על תנאי התרביות המוגדרים שדווחו על ידי רן ואחרים, אימתנו וכיווננו את הריכוזים של גורמי גדילה מרכזיים, EGF, Noggin, Wnt3a ו-R-pondin 1, יחד עם מעכב ROCK Y-27632. שילוב זה תמך בחוזקה בהתרחבות והתרבות של אורגנואידים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגנואידים מייצגים מודל ייחודי במבחנה משום שהארכיטקטורה התלת-ממדית המאורגנת שלהם משקפת במידה רבה את זו של רקמות אנושיות מקומיות, ובמקרים מסוימים ניתן להבחין בהם היסטולוגית מהאיברים האמיתיים. 14 הקמת מודלים אורגנואידיים אנושיים היא לכן קריטית לחקר מחלות אנושיות. כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מערכת תרבית אורגנואידית מתאי אפיתל הריח ראשוניים בבני אדם, אשר מתבוננים באופן אמין לנוירונים חושיים ריחניים בוגרים. גישה זו מתגברת על מגבלות השיטות המסורתיות, שהסתמכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים מכל הלב לכל המטופלים שתרמו בנדיבות דגימות רקמת טורבינות מעולה, מחקר זה לא היה מתאפשר ללא תרומתם. התקבלה תמיכה כספית למחקר, כתיבה ו/או פרסום של מאמר זה. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (Ba L: 82160209 and 82460217), קרן שיתוף הפעולה המיוחדת למדע וטכנולוגיה של אוניברסיטת סצ'ואן–ממשלת העיר זיגונג (Yang H: 2023CDZG-18), וקרן המדע הטבעי של האזור האוטונומי של טיבט (Cong TC: XZ2023ZR-ZY10(Z)).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ALEXA FLUOR 488 DONKEYThermoA110551:500
ALEXA FLUOR 555 DONKEYThermoA315721:500
Anti-GAP43 antibodyAbcamab75810 1:160
Anti-OMP antibodySANTA CRUZsc-3658181:50
Anti-Sox-2 antibodySANTA CRUZsc-3658231:50
B-27 SupplementGibco175040442%
CHIR99021NovoproteinHY-101823 μM
DMEM/F12/HEPESProcellPM150310/
Glutamax (L-glutamine supplement)Gibco350500611%
LY411575NovoproteinHY-507525 μM
Matrigel (basement membrane matrix)Corning3562314% (Vol/Vol)
N-2 SupplementGibco175020481%
Organoid Dissociation ReagentPrecedoPRS-ODR/
Organoid Recovery SolutionThewellbioMS04-100/
Primocin (primary antimicrobial agent)Invivogenant-pm-05100 μg/mL
Recombinant Human EGFNovoproteinC02950 ng/mL
Recombinant Human NogginNovoproteinCB89100 ng/mL
Recombinant Human RSPO1NovoproteinCX83200 ng/mL
Recombinant Human Wnt3aNovoproteinC18K50 ng/mL
Retinoic acidMCEHY-146491 μM
Y27632MCEHY-1007110 μM

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hummel, T., et al. Olfactory dysfunction: etiology, diagnosis, and treatment. Dtsch Arztebl Int. 120 (9), 146-154 (2023).
  2. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
  3. Peterson, J., et al. Activating a reserve neural stem cell population in vitro enables engraftment and multipotency after transplantation. Stem Cell Rep. 12 (4), 680-695 (2019).
  4. Schnittke, N., et al. Transcription factor p63 controls the reserve status but not the stemness of horizontal basal cells in the olfactory epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (36), E5068-E5077 (2015).
  5. Schwob, J. E., et al. Stem and progenitor cells of the mammalian olfactory epithelium: taking poietic license. J Comp Neurol. 525 (4), 1034-1054 (2017).
  6. Takeuchi, H. Olfactory cilia, regulation and control of olfaction. Physiol Rep. 12 (19), e70057 (2024).
  7. Lin, B., et al. Injury induces endogenous reprogramming and dedifferentiation of neuronal progenitors to multipotency. Cell Stem Cell. 21 (6), 761-774.e5 (2017).
  8. Huang, T., Wei, Y., Wu, D. Effects of olfactory training on posttraumatic olfactory dysfunction: a systematic review and meta-analysis. Int Forum Allergy Rhinol. 11 (7), 1102-1112 (2021).
  9. Hura, N., et al. Treatment of post-viral olfactory dysfunction: an evidence-based review with recommendations. Int Forum Allergy Rhinol. 10 (9), 1065-1086 (2020).
  10. Doty, R. L. Olfactory dysfunction in neurodegenerative diseases: is there a common pathological substrate?. Lancet Neurol. 16 (6), 478-488 (2017).
  11. Patel, Z. M., et al. International consensus statement on allergy and rhinology: olfaction. Int Forum Allergy Rhinol. 12 (4), 327-680 (2022).
  12. Liu, J., et al. A novel surgical treatment for long lasting unilateral peripheral parosmia: olfactory cleft blocking technique. Auris Nasus Larynx. 48 (6), 1209-1213 (2021).
  13. Seo, B. S., et al. Treatment of postviral olfactory loss with glucocorticoids, ginkgo biloba, and mometasone nasal spray. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135 (10), 1000 (2009).
  14. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  15. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528.e17 (2018).
  16. Loomans, C. J. M., et al. Expansion of adult human pancreatic tissue yields organoids harboring progenitor cells with endocrine differentiation potential. Stem Cell Rep. 10 (3), 712-724 (2018).
  17. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  18. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  19. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136.e6 (2015).
  20. Ren, W., et al. Expansion of murine and human olfactory epithelium/mucosa colonies and generation of mature olfactory sensory neurons under chemically defined conditions. Theranostics. 11 (2), 684-699 (2021).
  21. Li, X., et al. Age-dependent activation and neuronal differentiation of Lgr5+ basal cells in injured olfactory epithelium via notch signaling pathway. Front Aging Neurosci. 12, 602688 (2020).
  22. Dai, Q., et al. Notch signaling regulates Lgr5+ olfactory epithelium progenitor/stem cell turnover and mediates recovery of lesioned olfactory epithelium in mouse model. Stem Cells. 36 (8), 1259-1272 (2018).
  23. Wang, L., et al. Chitinase-like protein Ym2 (Chil4) regulates regeneration of the olfactory epithelium via interaction with inflammation. J Neurosci. 41 (26), 5620-5637 (2021).
  24. Ma, Z., et al. TMEM59 ablation leads to loss of olfactory sensory neurons and impairs olfactory functions via interaction with inflammation. Brain Behav Immun. 111, 151-168 (2023).
  25. Li, W., et al. A single-cell transcriptomic census of mammalian olfactory epithelium aging. Dev Cell. 59 (22), 3043-3058.e8 (2024).
  26. Chen, Z. H., et al. Matrix metalloprotease-mediated cleavage of neural glial-related cell adhesion molecules activates quiescent olfactory stem cells via EGFR. Mol Cell Neurosci. 108, 103552 (2020).
  27. Shechtman, L. A., et al. Generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells. J Vis Exp. (170), e62300 (2021).
  28. Liu, M., et al. Multimodal spatiotemporal monitoring of basal stem cell-derived organoids reveals progression of olfactory dysfunction in Alzheimer’s disease. Biosens Bioelectron. 246, 115832 (2024).
  29. Abranches, E., et al. Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo. PLoS One. 4 (7), e6286 (2009).
  30. McLean, W. J., et al. Clonal expansion of Lgr5-positive cells from mammalian cochlea and high-purity generation of sensory hair cells. Cell Rep. 18 (8), 1917-1929 (2017).
  31. Freemantle, S. J., et al. Developmentally-related candidate retinoic acid target genes regulated early during neuronal differentiation of human embryonal carcinoma. Oncogene. 21 (18), 2880-2889 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SOX2Notch

מאמרים קשורים