פרופנטופילין מקל על היפראלגזיה לאחר חתך על ידי ויסות פוספורילציה של ERK1/2 באסטרוציטים ובמיקרוגליה בעמוד השדרה

סיכום

מחקר זה בוחן את ההשפעה של מתן אינטרטקלי של propentofylline על הפחתת היפראלגזיה לאחר חתך, והאם השפעה זו קשורה לשינויים במדדי גלייאל ספונטניים ובפספורילציה של extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 בחולדות.

תקציר

אסטרוציטים של חוט השדרה, מיקרוגליה וקינזה 1 ו-2 מווסתת על ידי אותות חוץ-תאיים (ERK1/2) מעורבים בעיבוד כאב. מחקר זה בחן האם מתן פרופנטופילין (PPF) תוך-תעלתי לפני הניתוח מפחית היפרלגזיה חריפה לאחר חתך בעכברים, והאם השפעה זו קשורה לסממנים גליאליים של חוט השדרה ולפספורילציה של ERK1/2. שישים ושש חולדות זכרים מסוג Sprague–Dawley חולקו באופן אקראי לקבוצות ביקורת (blank), כאב לאחר חתך, תמיסת סליין רגילה, דימטיל סולפוקסיד, PPF ו-U0126. היפרלגזיה מכנית ותרמית הוערכו בקו הבסיס ובשעות 2, 4, 8, 24 ו-72 לאחר החתך. סממנים עצביים וגליאליים של חוט השדרה, p-ERK1/2 ומתווכי דלקת נבחנו באמצעות Western blotting ואימונופלואורסצנציה. ניסויים באסטרוציטים ראשוניים של חוט השדרה שימשו בנוסף לבחינת שחרור מתווכי דלקת התלוי ב-ERK1/2. מתן תוך-תעלתי של PPF לפני הניתוח הפחית היפרלגזיה מכנית ותרמית לאורך תקופת התצפית של 72 שעות, בעוד ש-U0126 הפחית היפרלגזיה בעיקר בתקופה המוקדמת לאחר החתך. 4 שעות לאחר החתך, שני הטיפולים היו קשורים להפחתה בביטוי של GFAP, Iba-1 ו-p-ERK1/2 בחוט השדרה, ולהפחתה בתגובתיות אימונולוגית של TNF-α ו-COX-2. באסטרוציטים בתרבית, PPF הפחית את שחרור מתווכי הדלקת המושרה על ידי LPS, בעוד ש-ERK1/2 פעיל באופן קבוע הפחית השפעה זו. ממצאים אלו תומכים בקשר בין ההשפעה האנטי-היפרלגזית של PPF לבין ויסות תגובות גליאליות, תגובות הקשורות ל-ERK1/2 ותגובות דלקתיות בחוט השדרה לאחר חתך.

מבוא

כאב לאחר חתך, סוג נפוץ של כאב אקוטי בעקבות הליכים כירורגיים, בדרך כלל אינו נמשך יותר מ-7 ימים אך הוא בעל מנגנונים פתולוגיים מורכבים השונים מאלו של כאב דלקתי או נוירופתי^1,2. אם כאב לאחר חתך אינו נשלט כראוי במהלך התפתחותו, הוא עלול להתקדם לתסמונת של כאב כרוני, ואופיו עשוי להשתנות מכאב של פגיעה רקמתית אקוטית לכאב נוירופתי או מעורב³. באופן כללי, מתן משככי כאבים, כגון אופיואידים ותרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידיות, הוא הצורה הנפוצה ביותר של אלגזיה לאחר חתך. עם זאת, שימוש רציף או במינונים גבוהים של תרופות אלו עלול לגרום לתופעות לוואי רבות, נסיבות המדגישות את הצורך באסטרטגיות אלגזיה בטוחות ואפקטיביות יותר.

ראיות מהימנות מעידות כי propentofylline (PPF) מקל על היפראלגזיה בתהליכי כאב שונים^4,5. יתרה מכך, ניתן להשיג את אפקט השיכוך של PPF באופן חלקי על ידי עיכוב הביטוי השכירי של mitogen-activated protein kinases (MAPKs), כגון p38 ו-c-Jun N-terminal kinases (JNKs)⁶. למרות שהשפעותיו של PPF על נתיבי p38 ו-JNK כבר הוכחו, פוטנציאל הוויסות שלו של נתיב ה-extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2), תת-משפחה קריטית נוספת של MAPKs המעורבת באותות כאב, נותר בלתי נחקר בכאב חתוך אקוטי. פער ידע זה חשוב במיוחד בהתחשב בכך שהפעלת ERK1/2 מראה דפוסים זמניים ותאיים מובחנים בהשוואה ל-p38 ו-JNK, מה שמרמז על הזדמנויות טיפוליות ייחודיות פוטנציאליות.

תאי גליה, הכוללים אסטרוציטים, מיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים, נחשבו בתחילה למבנה המקשר והתומך של רקמת העצבים. עם זאת, מחקרים אחרונים הראו כי אסטרוציטים ומיקרוגליה ממלאים תפקיד חשוב בויסות פלסטיות סינפטית ובהעברת מידע על כאב⁷. כמאקרופגים התושבים של המוח ושל חוט השדרה, מיקרוגליה יכולים להיות מופעלים על ידי מספר אותות גירוי חוץ-תאיים בשלב מוקדם מאוד של תהליך הכאב, ולאחר מכן להתרבות ולהפריש כמויות גדולות של ציטוקינים דלקתיים, אשר מגבירים את הולכת אותות הכאב מחוט השדרה אל המוח^8,9. במקביל, אסטרוציטים מופעלים יכולים להגביר את השחרור של הנוירוטרנסמיטר המעורר glutamate ולהעביר מידע ישירות לנוירונים תחושתיים על ידי הגברת התקשורת הבין-תאית¹⁰.

מחקרים הראו כי הפעלת אסטרוציטים מתרחשת בשלב מוקדם (בתוך 24 השעות הראשונות) של כאב המושרה על ידי חתך, בעוד שהפעלת מיקרוגליה מופיעה הרבה יותר מאוחר^11,12. בנוסף, מחקר אחד הצביע על כך שלמיקרוגליה מופעלת יש השפעה מוגבלת על היפראלגזיה מכנית בכאב המושרה על ידי חתך¹³. ממצאים אלו מדגישים שאלות פתוחות בנוגע לתפקידיהם המובחנים של אסטרוציטים ומיקרוגליה בכאב אקוטי. דווח כי Propentofylline, סוכן מוודג של תאי גליה, מקל על היפראלגזיה על ידי ויסות הפעלת אסטרוציטים ומיקרוגליה בעקבות פגיעה כרונית בלחץ עצבי, פגיעה עצבית אקוטית ופגיעה רקמתית אקוטית^4,5. עם זאת, למיטב הידע הנוכחי, אף מחקר לא בחן את השפעות ה-PPF על הפעלת אסטרוציטים או מיקרוגליה בכאב אקוטי המושרה על ידי חתך.

הקינאזות Extracellular signal-regulated kinase 1 and 2, תת-משפחה מרכזית של MAPK המופעלת במורד הזרם של mitogen-activated protein kinase 1 and 2 (MEK1/2), מעורבות במידה רבה בעיבוד נוציצפטי ובפלסטיות נוירונלית^14,15. מחקרים קודמים הראו כי ניתן להשרות phospho-ERK1/2 (p-ERK1/2) בנוירונים של חוט השדרה באמצעות גירוי נוציצפטי, וכי ניתן לזהות אותו גם באסטרוציטים ובמיקרוגליה במצבי כאב דלקתי או נוירופתי^16,17,18,19. בנוסף, דווח כי עיכוב פרמקולוגי של אותיות MEK1/2–ERK1/2 מפחית היפראלגזיה מכנית ותרמית במספר מודלים של כאב^{20,21,22,23,24,25}.

עם זאת, ההתפלגות התאית של ERK1/2 בעמוד השדרה, בייחוד באסטרוציטים ובמיקרוגליה, המופעלת על ידי חתך אקוטי ותפקידה בכאב המושרה על ידי חתך, נותרה לא מוגדרת מספיק. מחקרים קודמים של קבוצת המחקר מצביעים על כך ש-PPF מקל על היפראלגזיה חתכית אקוטית בחולדות על ידי הפחתת סיגנלינג של JNK ו-p38 בעמוד השדרה, אך לא ברור האם PPF מווסת גם סיגנלינג הקשור ל-ERK1/2 בתאי גליה בעמוד השדרה במהלך כאב המושרה על ידי חתך. לפיכך, יש לראות במחקר הנוכחי הרחבה של המסגרות הקיימות של הגליה ו-MAPK במחקר הכאב, ולא פרדיגמה מכניסטית עצמאית לחלוטין. הבחנתו העיקרית מעבודות קודמות טמונה בהתמקדותו הספציפית בכאב חתכי אקוטי, בבחינת ERK1/2 במקום p38/JNK כמרכיב ה-MAPK הרלוונטי, ובהערכת ההתפלגות התאית המוקדמת של p-ERK1/2 בעמוד השדרה ביחס לטיפול ב-PPF.

מחקר זה תוכנן כדי לבדוק האם מתן פרה-אופרטיבי של PPF באופן אינטרטקלי מפחית היפראלגזיה חיתוךית במודל של חיתוך כף רגל של חולדה, והאם אפקט זה קשור לפוספורילציה של ERK1/2 או לשינויים בביטוי של סממנים נוירונליים וגליאליים בעמוד השדרה ומתווכי דלקת, tumor necrosis factor-α (TNF-α) ו-cyclooxygenase-2 (COX-2). באופן ספציפי יותר, מחקר זה נבדל מדיווחים קודמים בשילוב של הערכה התנהגותית עם ניתוח Western blot זמני; בהשוואה פרמקולוגית עם מעכב MEK1/2 מסוג U0126; ובמיקום אימונופלואורסצנטי איכותי של p-ERK1/2 בנוירונים של עמוד השדרה, אסטרוציטים ומיקרוגליה בתוך מודל של כאב חיתוכי אקוטי. למרות שהמסגרת המכניסטית שלו נשענת על ספרות קודמת הקושרת מודולציה גליאלית ואיתות MAPK לכאב, עבודה זו נועדה לספק ראיות נוספות למעורבות אפשרית של תגובות גליאליות הקשורות ל-ERK1/2 בעמוד השדרה בשלב המוקדם של היפראלגזיה חיתוךית.

בהשוואה למשככי כאבים פוסט-אופרטיביים קונבנציונליים, גישות המכוונות למסלולים ספציפיים מאפשרות לבחון רכיב סיגנלינג מוגדר, אך עשויות לספק תועלת מוגבלת בזמן ועלולות לדרוש הזרקה פולשנית; עיכוב של MEK1/2–ERK1/2 הראה השפעות אנטי-היפראלגזיות במספר מודלים ניסיוניים של כאב^{20,21,22,23,24,25}. PPF שונה מעכבי מסלול בודד כיוון שהוא מווסת תגובות גליאליות ונקשר ליותר מתהליך אחד הקשור ל-MAPK^4,5,6. היישום המעשי נותר מוגבל בשל התכנון הפרה-קליני, מתן התרופה באופן אינטרטקלי לפני הניתוח, שימוש בחולדות זכרים בלבד, והיעדר מחקרי בטיחות ובחינת טווחי מינונים במודלים כירורגיים גדולים יותר.

פרוטוקול

הניסויים שנערכו אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים המשני המסונף, אוניברסיטת לנז'ו (Lanzhou University), מחוז גנסו, סין (מספר אישור אתי 2017-070). כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות של האיגוד הבינלאומי לחקר הכאב (International Association for the Study of Pain)²⁶. במחקר נעשה שימוש ב-66 חולדות Sprague–Dawley זכרים בוגרות, ששקלן 200–250 g, אשר הושגו ממרכז מוסמך לבעלי חיים למעבדה. רק חולדות זכרים נכללו במחקר זה כדי לצמצם שונות פוטנציאלית הקשורה להשפעות הורמונליות תלויות-מין. כל הפרוטוקולים בוצעו בהתאם להנחיות של האיגוד הבינלאומי לחקר הכאב (International Association for the Study of Pain)²⁶, וננקטו המאמצים הנדרשים לצמצום הסבל. מידע מפורט על הריאגנטים, consumables, המכשירים והתוכנות ששימשו במחקר זה מופיע בטבלת החומרים.

בעלי חיים

החולדות שהו בזוגות לפני הניתוח ובאופן אינדיבידואלי לאחר החיתוך, עם גישה חופשית (ad libitum) למזון ומים. בחדר נשמר מחזור של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך, והטמפרטורה נשלטה ב-24 °C ± 2 °C.

מודל של הזרקה תוך-תעלתית וכאב לאחר חתך

לצורך מתן תמיסות באופן אינטרתקלי (תוך-ערוקי), חולבנו חולדות תחת הרדמה ב-1.5%–3% sevoflurane (שסופקה באמצעות חרוט לאף) והונחו בתנוחה הפוכה (prone) כאשר עמוד השדרה כפוף. הפרווה מעל אזור המותניים גולחה, והעור מעל המרווח הבין-חולייתי L5–L6 חומם. מיקרו-מזרק הוכנס דרך העור במרווח הבין-חולייתי L5–L6. כניסה מוצלחת לחלל הסוב-אראכנואידי (החלל מתחת לקרום העכביש) זוהתה על ידי תנועה פתאומית של הזנב במהלך קידום המחט, ואושרה בהמשך על ידי הופעת נוזל חוט השדרה (CSF) בעת שאיבה עדינה. אם סימנים אלו לא נצפו, מיקום המחט כוונן לפני ההזרקה. ההזרקה בוצעה רק לאחר ששני קריטריוני האישור התממשו, ובעלי חיים שהראו סימנים נוירולוגיים חריגים לאחר ההזרקה הוצאו מהניסוי. לאחר מכן הוזרק התמיס הרלוונטי לאט, והעור נוקה שוב לאחר ההזרקה. הפרוצדורה הכירורגית נמשכה כ-3 min, והחולדות התאוששו בדרך כלל מההרדמה תוך 5–10 min.

מודל חולדות לכאב חתכי הוקם כפי שתואר בעבר²⁷. לאחר הרדמה, חומם אותו של כף הרגל האחורית חוטר ב-10% povidone–iodine. בוצע חתך אורכי של 1-cm בעור כף הרגל, החל מכ-0.5 cm מהעקב והמשיך לכיוון האצבעות. החתך חדר דרך העור והפציה. את השריר הפלנטרי הרימו בעדינות בעזרת פינצטה אופתלמית ובצעו בו חתך אורכי תוך שמירה על רצף הרקמה הכללי. לאחר מכן הוחזר השריר למקומו, הופעל לחץ עדין להשגת המוסטזיס, והפצע נסגר באמצעות שתי תפרים מסוג mattress בעזרת 3-0 nylon. אתר החתך חוטר שנית לאחר סגירת הפצע. לאחר הניתוח, החולדות שוכנו בנפרד והושארו להתאושש בסביבה שקטה וחמה, מוגנות מאור חזק ועם גישה חופשית למזון ומים. בעלי החיים נוטרו לאחר הניתוח, ואלו שלא עמדו בקריטריונים שהוגדרו מראש הוצאו מהמחקר באופן מיידי. זיהום בפצע נקבע על סמך אדמומיות, נפיחות ועלייה בטמפרטורה המקומית סביב הפצע, הפרשה מוגלתית צהובה-ירוקה חריגה עם ריח רע, עיכוב בריפוי הפצע עם פתיחה מתמשכת של הפצע, נמק והרחבה, וסימנים סיסטמיים הכוללים עלייה בטמפרטורת הגוף, לטארגיה וסירוב להאכיל. קריטריוני החרגה נוספים כללו כישלון בהתאוששות מההרדמה תוך 30 min, חיתוך שריר תוך-ניתוחי או פגיעה נוירו-וסקולרית, פגיעה עצמית לאחר הניתוח, כישלון בהקמת המודל וגירעונות נוירולוגיים, כגון שיתוק של הגפיים האחוריות או חוסר יכולת לשאת משקל שאינו קשור לכאב חתכי. חולדות עם זיהום בפצע או פתיחת תפרים (dehiscence) הוצאו מהמחקר.

מדידה התנהגותית

סף נסיגת כף רגל מכנית (PWMT) וזמן תגובה לנסיגת כף רגל תרמית (PWTL) נמדדו על ידי חוקר שהיה עיוור להקצאת הקבוצות. הבדיקה בוצעה בחדר שקט בשעה עקבית ביום לאחר לפחות 10 min של אקלימטיזציה; הכלוב, רצפת הרשת או הזכוכית, התאורה הסביבתית ועוצמת מקור החום נשמרו קבועים בין הקבוצות. לבדיקת PWMT, סיבי von Frey מכויילים (0.4 g, 0.6 g, 1.0 g, 1.4 g, 2.0 g, 4.0 g, 6.0 g, 8.0 g, 10.0 g, ו-15.0 g) הופעלו בניצב למשטח הפלנטרי הסמוך לפצע עד שהסיב התכופף בערך 1–2 mm. גירויים עוקבים הופרדו ב-2 min, וערך ה-50% PWMT נקבע באמצעות שיטת ה-up-and-down²⁸. לבדיקת PWTL, חוללות הוכנסו למארזים שקופים בודדים על רצפת זכוכית, ומקור החום הקרינתי כוונן למשטח הפלנטרי לצד הפצע. זמן הגבלה (cut-off) של 30 s מנע פגיעה ברקמה, חשיפות עוקבות הופרדו ב-2 min, ונרשם הממוצע של שלוש מדידות²⁹. הרמה של כף הרגל, ניעור או לקיקה נחשבו כתגובת נסיגה חיובית; ניסיונות שהושפעו מטיפוח עצמי (grooming), תנועה או אובדן יישור של מקור החום חזרו לאחר אקלימטיזציה מחודשת.

ניתוח Western blot

במועדים שנקבעו מראש, חוללים החולדות באמצעות פריקה צווארית (cervical dislocation), וחלק העמוד השדרה המותני L4–L6 נאסף במהירות לתוך באפר ליזיס של radioimmunoprecipitation assay בתוספת מעכב פרוטאז ביחס של 100:1. הרקמה עברה הומוגניזציה, נשמרה על קרח למשך 20 min, וסובבה בצנטריפוגה במהירות של 15,000 × g למשך 20 min בטמפרטורה של 4 °C. הנוזל העליון (supernatant) עורבב עם באפר טעינה 4× ביחס של 3:1, חומם במים רותחים למשך 5 min, ואוחסן בטמפרטורה של −80 °C. דגימות חלבון (30 µg לכל נתיב) הופרדו על ג'לים של sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide בריכוז 10% והועברו לממברנות polyvinylidene fluoride של 0.45 או 0.22 µm. העברה מוצלחת נבדקה על ידי אישור הנדידה הצפויה של סמן המשקל המולקולרי שצבע מראש והיעדר אזורים בולטים של העברה לא אחידה או קטועה. הממברנות נחסמו עם 5% חלב רזה ו-3% bovine serum albumin למשך 2 h בטמפרטורת החדר, והודגרו למשך לילה ב-4 °C עם נוגדי ראשוניים נגד NeuN (1:8,000), GFAP (1:4,000), Iba-1 (1:3,000), p-ERK1/2 (1:1,000), t-ERK1/2 (1:3,000), או GAPDH (1:2,000). לאחר שטיפה ב-Tris-buffered saline המכיל 0.05% Tween 20 (pH 7.4), הודגרו הממברנות עם הנוגדן המשני המתאים המצומד ל-horseradish peroxidase (1:5,000) למשך 1 h בטמפרטורת החדר. האותות פותחו באמצעות chemiluminescence משופר ותועדו על סרט צילום תוך שימוש בטווח חשיפה זהה עבור כל מטרה. חוקר שלא היה ידוע לו חלוקת הקבוצות ניתח את צפיפות הפסים באמצעות תוכנה לניתוח תמונות. התמונות הומרו לגווני אפור של 8-bit, אזור עניין מלבני זהה הוחל על כל פס, רקע מקומי מאזור ריק סמוך הופחת, והצפיפות האינטגרלית תועדה. גודל אזור ונוהל רקע זהים שימשו עבור כל הנתיבים בבלוט (blot). NeuN, GFAP, Iba-1, ו-t-ERK1/2 נורמלו ל-GAPDH; p-ERK1/2 נורמל ל-t-ERK1/2; והערכים בוטאו לאחר מכן ביחס לקבוצת הביקורת (blank group).

אימונופלואורסצנציה

בזמנים שנקבעו מראש, חולבנו החולדות תחת הרדמה באמצעות 3% pentobarbital sodium (במינון של 1.5 mL/kg) ובוצע פרפוזיה דרך הלב עם 300 mL של 0.01 mol/L phosphate-buffered saline (PBS; pH 7.4) מקורר מראש, ולאחריו 250 mL של 4% paraformaldehyde מקורר מראש. קיטע L4–L6 של חוט השדרה עבר קיבוע משלים (post-fixation) ב-4% paraformaldehyde למשך 6 שעות, הגנה מפני קיפאון (cryoprotection) למשך לילה ב-20%–30% sucrose–PBS בטמפרטורה של 4 °C, ונחתך לפרוסות בעובי 10 µm בטמפרטורה של −22 °C. הפרוסות נשטפו ב-0.01 mol/L PBS, עברו חסימה (blocking) ב-10% goat serum למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ואומודו למשך לילה ב-4 °C עם נוגדנים ראשוניים נגד NeuN (1:100), GFAP (1:1,000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) או COX-2 (1:50). לאחר שלושה שטיפות ב-PBS, הפרוסות אומודו עם הנוגדן המשני המתאים המצומד לפלואורופור ירוק או אדום (1:400) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, נשטפו שלוש פעמים נוספות ב-PBS ונקבעו (mounted) עם מדיום antifade וזכוכית כיסוי. פרוסות ביקורת שלילית, שעובדו ללא הנוגדן הראשוני, נכללו בכל סדרת צביעה. התמונות נרכשו על ידי חוקר מסוכך (blinded) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה. תמונות סקירה בהגדלה נמוכה נרכשו באמצעות עדשה של 10×, בעוד שתמונות של תגובתיות חיסונית תאית וקו-לוקליזציה נרכשו באמצעות עדשות של 20× או 40× בהתאם לפאנל האיור הרלוונטי. לצורך השוואות בתוך אותו איור וסדרת צביעה, הגדלת העדשה, עוצמת התאורה, זמן החשיפה, הגבר הגלאי (detector gain), הגדרות המצלמה ופרמטרי עיבוד התמונה נקבעו לאחר אופטימיזציה מתחת לסף הרוויה. ערוצי פלואורסצנציה נפרדים נרכשו באופן רצפי כדי לצמצם חפיפה בין הערוצים. שלוש שדות ראייה שאינם חופפים בקרן הגב (dorsal horn) האיפסילטרלית צולמו לכל חיה. עוצמת הפלואורסצנציה כומתה באמצעות תוכנה לניתוח תמונות לאחר המרה ל-8-bit, חיסור רקע באמצעות אזור נטול תאים, והחלת אזור עניין (ROI) וסף (threshold) זהים בתוך כל סדרת צביעה; ערכי השדות חושבו כממוצע כדי לקבל ערך אחד לכל חיה. שדות עם חשיפת יתר, קיפולי רקמה, קרעים, פוקוס לקוי או רקע לא אחיד הוצאו מהניתוח ונרכשו מחדש תחת אותן הגדרות שאינן רוויות. הצביעה התקבלה כאשר מבנה הרקמה היה שלם, האות של מטרה עלה על ביקורת ללא הנוגדן הראשוני, ולא השפיעו על הניתוח קיפולים משמעותיים, קרעים או אזורים רווים.

ניסויי אסטרוציטים ראשוניים של חוט השדרה In vitro

אסטרוציטים ראשוניים מהחוט השדרה של חולדה תורבדו בתנאים סטריליים סטנדרטיים במצע תרבית מלא ב-37 °C באינקובטור לח עם 5% CO₂. התאים שימשו למספר ניסויים כאשר הגיעו לכ-70%–80% התלכדות (confluence), וחולקו לקבוצות של ביקורת, גירוי ב-LPS, LPS + PPF, LPS + U0126, וקבוצות הצלה של ERK1/2. PPF ו-U0126 הוספו בריכוז של 10 µM. תנאי גירוי ה-LPS, הטיפול התרופתי ותנאי האיסוף נשמרו זהים בין בארות מקבילות בכל ניסוי. לצורך ניתוח סלקטיביות המסלול, נאספו ליזאטים של תאים עבור Western blotting של p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, total p38, p-JNK, total JNK, ובקרת טעינה תואמת. על-נוזלי תרבית מבארות מקבילות נאספו, הובהרו באמצעות סרצ'יפוגציה, ונבדקו עבור TNF-α, PGE2, ו-IL-6 באמצעות תגובת ELISA בהתאם להוראות היצרן. דנסיטומטריית ה-Western blot בוצעה על פי אותם עקרונות של ניתוח תמונות שתוארו לעיל. עבור ניסויי הצלה, ביטוי אנדוגני של ERK1/2 דומם באמצעות טרנספקציית siRNA, ומבנה ביטוי של ERK1/2 פעיל באופן קבוע (CA-ERK1/2) הוחדר לפני הטיפול. יעילות ה-Knockdown והביטוי העודף (overexpression) אושרו באמצעות Western blotting לפני פרשנות נתוני הציטוקינים. תאים שנחשפו לחומר הטרנספקציה ללא siRNA פעיל או מבנה ביטוי שימשו כביקורות פרוצדורליות במידת הצורך.

מערך ניסויי

חלוקה לתתי-קבוצות של בעלי חיים ניסייים

החולדות חולקו לשיש קבוצות באמצעות שיטת טבלת מספרים אקראית, וההקצאה לקבוצות הושלמה לפני הבדיקות ההתנהגותיות ואיסוף הרקמות. שש הקבוצות כללו קבוצת ביקורת ריקה (n = 6), קבוצת כאב חתך (IP) (n = 18), קבוצת תמיסת סליין נורמלית (NS) (0.9% NS, 10 µL; n = 9), קבוצת PPF (10 µg ב-10 µL; n = 12), קבוצת dimethyl sulfoxide (DMSO) (10% DMSO, 10 µL; n = 9) וקבוצת U0126 (10 µg ב-10 µL; n = 12). חולדות בקבוצת הביקורת הריקה לא עברו חתך בכף הרגל ולא קיבלו הזרקה תוך-תעלתית (intrathecal), ושימשו כביקורות לא מטופלות. חולדות בקבוצת ה-IP עברו חתך בכף הרגל ללא טיפול מקדים בהזרקה תוך-תעלתית. חולדות בקבוצות ה-NS, PPF, DMSO ו-U0126 קיבלו מתן תוך-תעלתי של החומרים המתאימים 30 דקות לפני החתך בכף הרגל. קבוצת ה-NS שימשה כביקורת לנשא (vehicle control) עבור PPF, בעוד שקבוצת ה-DMSO שימשה כביקורת לנשא עבור U0126.

מינונים של propentofylline ו-U0126

פרופנטופילין (Propentofylline) הוא מודולטור גליאלי, ומינון של 10 µg נבחר מכיוון שהביא להקלה על היפראלגזיה חריפה במחקרים קודמים של קבוצת המחקר. U0126 הוא מעכב MEK1/2 שאינו תחרותי ל-adenosine triphosphate המשמש לחסימת פוספורילציה של ERK1/2. מינונים תוך-תעלתיות (intrathecal) יעילים של 1–10 µg דווחו במודלים שונים של כאב^30,31,32; במחקר הנוכחי נעשה שימוש במינון של 10 µg. U0126 הומס ב-10% dimethyl sulfoxide, בעוד ש-PPF הומס בתמיסת סלין נורמלית 0.9%. הריכוזים הסופיים היו 1 µg/µL. התרופות והנשאים הוכנו לפני הניתוח, נשמרו ב-4 °C ושימשו בתוך 12 h.

השפעת מתן תוך-תעלתי (intrathecal) של propentofylline או U0126 לפני הניתוח על היפראלגזיה

שש חולדות מכל קבוצה נבחרו באופן אקראי למדידה התנהגותית 24 h לפני הניתוח, וערכי ה-PWMTs וה-PWTLs שהתקבלו הוגדרו כקו בסיס. הזרקות תוך-תעלתיות (Intrathecal) בוצעו 30 min לפני הניתוח. כדי להעריך את השפעותיהם של מתן PPF ו-U0126 באופן תוך-תעלתי לפני הניתוח על היפראלגזיה מכנית ותרמית, נמדדו PWMT ו-PWTL בנקודות זמן של 2 h, 4 h, 8 h, 24 h ו-72 h לאחר החתך.

מערך ניסויי להערכת ההשפעות של מתן אינטרטקלי פרה-אופרטיבי של propentofylline או U0126 על ביטוי סמנים עצביים וגליאליים בעמוד השדרה לאחר חתך

כדי לקבוע את נקודת הזמן המתאימה לאחר החתך להערכת השפעת הטיפול, בוצע תחילה ניתוח מהלך זמן מקדימה בקבוצת ה-IP. באופן ספציפי, חוללים חוללים בקבוצת ה-IP בנקודות זמן של 2 h, 4 h, 24 h ו-72 h לאחר החתך, ורמות הביטוי של סממני התאים NeuN, GFAP ו-Iba-1 בחוט השדרה נמדדו באמצעות Western blot (n = 3 לכל נקודת זמן). על בסיס ניתוח מקדימה זה, נבחרו 4 השעות הראשונות לאחר החתך כחלון תצפית מוקדם לאחר החתך, מכיוון שביטוי NeuN הגיע לרמתו הגבוהה ביותר בנקודת הזמן של 4 h ומכיוון ששינויים מולקולריים מוקדמים נחשבו לרלוונטיים ביותר להתפתחות הראשונית של היפראלגזיה לאחר חתך. עם זאת, נקודת הזמן של 4 h לא נועדה לייצג את כל השינויים המולקולריים הזמניים לאחר החתך.

בנקודת זמן נבחרת זו, חוללים חוללים עוקבים שקיבלו הזרקה תוך-תעלתית (intrathecal) לצורך אנליזת Western blot של סמני תאים שונים (נא ספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם. = 3 לקבוצה) והערכת אימונופלורסצנציה של המורפולוגיה של סוגי תאים שונים (נ = 3 לקבוצה). בקבוצת הביקורת, חוללים חוללים באופן אקראי כדי לקבוע את רמות הביטוי הבסיסיות של סממני תא שונים (NeuN, GFAP ו-Iba-1) בחוט השדרה באמצעות Western blot (נּ = 3) ואת המורפולוגיה של תאים שונים (נוירונים, אסטרוציטים ומיקרוגליה) באמצעות אימונופלורסנציה (נ"ש = 3). לפיכך, קבוצת הביקורת הריקה שימשה כביקורת בסיס ללא חתך וללא טיפול.

השפעות הטיפול על p-ERK1/2 שדרכי ועל מתווכי דלקת

כדי לקבוע את נקודת הזמן המתאימה לאחר החיתוך להערכת השפעות הטיפול על ביטוי p-ERK1/2 ועל רמות של ציטוקינים דלקתיים, בוצע תחילה ניתוח מהלך זמן ראשוני בקבוצת ה-IP. באופן ספציפי, חוללים חוללים בקבוצת ה-IP בנקודות זמן של 2 h, 4 h, 24 h ו-72 h לאחר החיתוך, וביטוי p-ERK1/2 בעמוד השדרה נמדד באמצעות Western blot (n = 3 לכל נקודת זמן). על בסיס ניסוי מהלך זמן זה, יחד עם נקודת הזמן שבה ביטוי NeuN היה הגבוה ביותר לאחר החיתוך, נבחרה נקודת הזמן 4 h לאחר החיתוך כנקודת הזמן הקבועה להערכה הבאה של השפעות של PPF או U0126 שניתנו תוך-טתיקה (intrathecally) לפני הניתוח על ביטוי p-ERK1/2 בעמוד השדרה ועל ציטוקינים דלקתיים. נקודת זמן זו נבחרה כחלון תצפית מכניסטי מוקדם ולא כייצוג מקיף של כל השינויים הזמניים לאחר החיתוך.

בנקודת זמן נבחרת זו, חוללים חוללים שקיבלו הזרקה תוך-תעלתית (intrathecal) לצורך ניתוח Western blot של ביטוי p-ERK1/2 (n = 3 לקבוצה) והערכה של ציטוקינים דלקתיים באמצעות אימונופלואורסצנציה (n = 3 לקבוצה). בקבוצת הביקורת הריקה (blank), חוללים הוקרבו באופן אקראי כדי לקבוע את רמות הביטוי הבסיסיות של p-ERK1/2 בחוט השדרה באמצעות Western blot (n = 3) ושל ציטוקינים דלקתיים (TNF-α ו-COX-2) באמצעות אימונופלואורסצנציה (n = 3). כך, קבוצת הביקורת הריקה שימשה כביקורת בסיס ללא חתך וללא טיפול.

מיקום תאי של p-ERK1/2 שוכשך בנוירונים, אסטרוציטים ומיקרוגליה

כדי להעריך באופן מעמיק יותר את ההתפלגות התאית של p-ERK1/2 בעמוד השדרה לאחר החתך, בוצע צביעת אימונופלורסצנציה בקבוצות Blank ו-IP ב-4 h לאחר החתך (n = 3).

ניתוח סטטיסטי

הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. גודל המדגם נקבע בהסתמך על מחקרים קודמים של קבוצת המחקר וניסויי מקדמים. נתונים התנהגותיים נותחו באמצעות ניתוח שונות (ANOVA) דו-כיווני למדידות חוזרות, כאשר הקבוצה שימשה כגורם בין-נבדקי והזמן כגורם תוך-נבדקי. נתוני Western blot של מהלך הזמן הוערכו באמצעות ANOVA חד-כיווני, ולאחריו השוואות זוגיות בתיקון בונפרוני (Bonferroni). נתוני Western blot ואימונופלורסצנציה בנקודות זמן קבועות הוערכו באמצעות ANOVA חד-כיווני עם השוואות מתוכננות בתיקון בונפרוני; השוואות בין שתי קבוצות הוערכו באמצעות מבחן t של Student. נורמליות והומוגניות של השונות נבחנו באמצעות מבחני Shapiro–Wilk ו-Levene, בהתאמה. מבחן דו-זנבי pערך-p < ערך של 0.05 נחשב למשמעותי. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת הניתוח הסטטיסטי המפורטת ב- טבלת חומריםעבור ה במבחנה בניסויי אסטרוציטים, ניסויי תרבית עצמאיים נחשבו כיחידת הניתוח; דנסיטומטריה של Western blot וריכוזי ציטוקינים הושוו באמצעות ANOVA חד-כיווני, ולאחריו השוואות מתוכננות בתיקון בונפרוני (Bonferroni) או מבחן Student's מבחן t להשוואות קבועתיים שנקבעו מראש, לפי הצורך.

זמינות נתונים:

נתונים התומכים בממצאי מחקר זה מסופקים בקובץ משלים 1.

תוצאות

ההשפעות של חתך ושל מתן תוך-תעלתי (intrathecal) טרום-ניתוחי של propentofylline או U0126 על היפראלגזיה לאחר חתך

היפראלגזיה מכנית

לא נמצאו הבדלים משמעותיים ב-PWMTs בין שש הקבוצות 24 שעות לפני הניתוח (p > 0.05; איור 1A,B). בקבוצת ה-IP, ה-PWMT ירד לאחר החתך ונשאר נמוך באופן משמעותי מערך הבסיס מ-2 שעות ועד 72 שעות לאחר החתך (p < 0.05 לעומת baseline; איור 1A). בקבוצות ה-NS וה-DMSO, לא היו הבדלים משמעותיים ב-PWMTs בין נקודות הזמן לאחר החתך (p > 0.05 לעומת קבוצת ה-IP; איור 1B). בקבוצת ה-PPF, ה-PWMT היה גבוה באופן משמעותי מזה של קבוצת ה-IP מ-2 שעות ועד 72 שעות לאחר החתך (p < 0.05 לעומת קבוצת ה-IP; איור 1A), וב-72 שעות לאחר החתך, הוא כבר לא היה שונה באופן משמעותי מערך הבסיס (p > 0.05 לעומת baseline; איור 1A). בקבוצת ה-U0126, ה-PWMTs היו גבוהים באופן משמעותי מאלה של קבוצת ה-IP במהלך 24 השעות הראשונות לאחר החתך (p < 0.05 לעומת קבוצת ה-IP; איור 1A), אך אפקט זה לא נשמר ב-72 שעות לאחר החתך, כאשר ה-PWMT נשאר נמוך באופן משמעותי מערך הבסיס ולא היה שונה יותר באופן משמעותי מזה של קבוצת ה-IP (p < 0.05 לעומת baseline; p > 0.05 לעומת קבוצת ה-IP; איור 1A).

היפרלגזיה תרמית

לא נצפו הבדלים משמעותיים ב-PWTLs בין שש הקבוצות 24 שעות לפני הניתוח (p > 0.05; Figure 1C,D). בקבוצת ה-IP, ה-PWTL ירד מ-24.85 s ± 1.06 s לפני הניתוח ל-4.38 s ± 1.02 s ב-4 שעות לאחר החתך, ולאחר מכן עלה חלקית ל-18.37 s ± 1.38 s ב-72 שעות לאחר החתך, אך נותר נמוך משמעותית מערך הבסיס לאורך תקופת התצפית (p < 0.05 לעומת baseline; Figure 1C). בקבוצות ה-NS וה-DMSO, לא נצפו הבדלים משמעותיים ב-PWTLs בין נקודות הזמן לאחר החתך (p > 0.05 לעומת קבוצת ה-IP; Figure 1D). בקבוצת ה-PPF, ה-PWTL היה גבוה משמעותית מזה של קבוצת ה-IP לאורך תקופת התצפית של 72 שעות (p < 0.05 לעומת קבוצת ה-IP; Figure 1C), וב-72 שעות לאחר החתך, הוא חזר לרמה שלא הייתה שונה משמעותית מערך הבסיס (p > 0.05 לעומת baseline; Figure 1C). בקבוצת ה-U0126, ה-PWTL היה גבוה משמעותית מזה של קבוצת ה-IP במהלך 24 השעות הראשונות לאחר החתך (p < 0.05 לעומת קבוצת ה-IP; Figure 1C); השפעה זו לא נשמרה ב-72 שעות לאחר החתך, כאשר ה-PWTL נותר נמוך משמעותית מערך הבסיס ולא היה שונה משמעותית מזה של קבוצת ה-IP (p < 0.05 לעומת baseline; p > 0.05 לעומת קבוצת ה-IP; Figure 1C).

ניתוח Western blot של שינויים זמניים בביטוי סמני תאים בעמוד השדרה ובפוספורילציה של extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 לאחר חתך

זוהו מספר פסים במשקלים מולקולריים מדויקים באמצעות נוגדן ספציפי על ממбраנות PVDF, כולל NeuN (48 ו-50 kD), GFAP (50 kD), Iba-1 (17 kD), p-ERK1/2 (p-ERK1 = 44 kD; p-ERK2 = 42 kD), t-ERK1/2 (t-ERK1 = 44 kD; t-ERK2 = 42 kD), ו-GAPDH (36 kD). פס ה-GAPDH שימש כביקורת עבור NeuN, GFAP, Iba-1, ו-t-ERK1/2, ופס ה-t-ERK1/2 שימש כביקורת עבור p-ERK1/2.

נתוני Western blotting מחוט השדרה בקבוצת ה-IP הראו עליות בדרגות שונות לאחר החתך (איור 2A). הביטוי של חלבון גרעיני ספציפי לנוירונים הגיע לערכו הגבוה ביותר 4 שעות לאחר החתך (p < 0.001 לעומת קו הבסיס; איור 2A) ונותר מוגבר באופן מובהק 72 שעות לאחר החתך (p < 0.001 לעומת קו הבסיס; איור 2A). רמות של Glial fibrillary acidic protein עלו בהדרגה במהלך תקופת התצפית של 72 שעות (p < 0.001 לעומת קו הבסיס; איור 2A), כאשר הרמה הגבוהה ביותר נצפתה בנקודת הזמן של 72 שעות מבין נקודות הזמן שנמדדו. באופן דומה, גם Iba-1 הגיע לרמה מוגברת באופן מובהק 4 שעות לאחר החתך (p < 0.001 לעומת קו הבסיס; איור 2A) ותנוד בטווח קטן. ראוי לציין כי נתוני Western blotting מחוט השדרה בקבוצת ה-IP הראו כי הפעלת ERK1/2 עלתה רק במהלך 24 השעות הראשונות לאחר החתך (p < 0.05 לעומת קו הבסיס; איור 2B) אך פחתה 72 שעות לאחר החתך (p < 0.05 לעומת קו הבסיס; איור 2B), בעוד שהביטוי של t-ERK/2 לא הראה שינוי מובהק באף נקודת זמן.

ניתוח Western blot של השפעות המתן של מתן propentofylline או U0126 תוך-תעלתי (intrathecal) לפני הניתוח על הביטוי של סמני תאים ושל phospho-extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 בחוט השדרה

נתוני Western blotting הראו כי ביטוי NeuN הגיע לרמתו הגבוהה ביותר 4 שעות לאחר החתך, כאשר המדידה ההתנהגותית הייתה בסף הנמוך ביותר שלה. לכן, השפעותיהם של PPF ו-U0126, שניתנו תוך-גרמיית (intrathecally) 30 דקות לפני הניתוח, על ביטוי סמני תאים ועל פוספורילציה של ERK1/2 נבחנו 4 שעות לאחר החתך.

נתוני Western blotting הראו כי בהשוואה לקבוצת הביקורת (blank group), הביטוי השכירי (spinal expression) של כל סממני התאים עלה באופן מובהק בקבוצת ה-IP ב-4 שעות לאחר החתך (p < 0.05 לעומת baseline; איור 3). בהשוואה לקבוצת ה-IP, מתן PPF תוך-תעלתי (intrathecal) לפני הניתוח הפחית את הביטוי השכירי של NeuN (p < 0.05 vs קבוצת ה-IP; איור 3A), GFAP (p < 0.05 vs קבוצת ה-IP; איור 3B), ו-Iba-1 (p < 0.01 vs קבוצת ה-IP; איור 3C). בהשוואה לקבוצת ה-IP, מתן U0126 תוך-תעלתי לפני הניתוח הפחית גם הוא את הביטוי השכירי של NeuN (p < 0.01 vs קבוצת ה-IP; איור 3D), GFAP (p < 0.05 vs קבוצת ה-IP; איור 3E), ו-Iba-1 (p < 0.01 vs קבוצת ה-IP; איור 3F). עם זאת, כאשר השוו לקבוצת הביקורת, ביטוי NeuN בקבוצת ה-PPF נותר גבוה באופן מובהק מה-baseline (p < 0.01 vs baseline; איור 3A), בעוד שביטוי NeuN בקבוצת ה-U0126 היה נמוך באופן מובהק מזה של קבוצת הביקורת (p < 0.01 vs baseline; איור 3D). עבור GFAP ו-Iba-1, הטקסט מדגיש כעת את ההשוואה לקבוצת ה-IP, כפי שמוצג ב-איור 3. למתן תוך-תעלתי של NS ו-DMSO לפני הניתוח לא הייתה השפעה מובהקת על ביטוים של סממני תאים כלשהם.

נתוני Western blotting הראו כי ביטוי t-ERK1/2 בעמוד השדרה לא נבדל באופן מובהק בין קבוצות ה-Blank, IP, NS ו-PPF ב-4 h לאחר החתך (איור 4A). לעומת זאת, בהשוואה לקבוצת ה-blank, ביטוי p-ERK1/2 עלה באופן מובהק בקבוצות IP ו-NS ב-4 h לאחר החתך (p < 0.001 לעומת קבוצת ה-blank; איור 4B). בהשוואה לקבוצת ה-IP, מתן intrathecal של PPF לפני הניתוח הפחית באופן מובהק את ביטוי p-ERK1/2 ב-4 h לאחר החתך (p < 0.001 לעומת קבוצת ה-IP; איור 4B). בהשוואה לקבוצת ה-NS, ביטוי p-ERK1/2 בקבוצת ה-PPF היה נמוך באופן מובהק גם הוא (p < 0.01 לעומת קבוצת ה-NS; איור 4B). עם זאת, בהשוואה לקבוצת ה-blank, ביטוי p-ERK1/2 בקבוצת ה-PPF נותר גבוה באופן מובהק ב-4 h לאחר החתך. באופן דומה, ביטוי t-ERK1/2 בעמוד השדרה לא נבדל באופן מובהק בין קבוצות ה-Blank, IP, DMSO ו-U0126 ב-4 h לאחר החתך (איור 4C). בהשוואה לקבוצת ה-blank, ביטוי p-ERK1/2 עלה באופן מובהק בקבוצות IP ו-DMSO ב-4 h לאחר החתך (p < 0.001 לעומת קבוצת ה-blank; איור 4D). בהשוואה לקבוצת ה-IP, מתן intrathecal של U0126 לפני הניתוח הפחית באופן מובהק את ביטוי p-ERK1/2 (p < 0.001 לעומת קבוצת ה-IP; איור 4D). בהשוואה לקבוצת ה-DMSO, ביטוי p-ERK1/2 בקבוצת ה-U0126 היה נמוך באופן מובהק גם הוא (p < 0.001 לעומת קבוצת ה-DMSO; איור 4D). ראוי לציין כי בהשוואה לקבוצת ה-blank, ביטוי p-ERK1/2 בקבוצת ה-U0126 לא היה שונה באופן מובהק מזה של קבוצת ה-blank ב-4 h לאחר החתך. לטיפול מקדים ב-NS או ב-DMSO לא הייתה השפעה מובהקת על ביטוי p-ERK1/2 בהשוואה לקבוצת ה-IP.

תצפיות אימונופלואורסצנציה של סמני תאי עמוד השדרה ומתווכי דלקת

תוצאות האימונופלורסצנציה הראו באופן איכותני תגובתיות אימונוהיסטוכימית חזקה יותר של NeuN בקרן הגב האיפסילטרלית 4 שעות לאחר החתך בהשוואה לצד הקונטרלטרלי (איור 5). בקבוצת הביקורת (blank), תמונות מייצגות הראו תגובתיות בסיסית של NeuN, GFAP ו-Iba-1 בקרן הגב של השריר האיפסילטרלי (איור 6A–C). בקבוצת ה-IP, התגובתיות של NeuN הייתה חזקה יותר באופן איכותני מזו של קבוצת הביקורת (איור 6D לעומת איור 6A), התגובתיות של GFAP הייתה גם היא חזקה יותר (איור 6E לעומת איור 6B), והתגובתיות של Iba-1 הייתה מוגברת אף היא (איור 6F לעומת איור 6C). במקביל, אסטרוציטים ומיקרוגליה בקבוצת ה-IP נראו היפרטרופיים, עם גופי תא מורחבים ושלוחות עבות ומסועפות יותר (איור 6E,F).

בקבוצת ה-PPF, תמונות מייצגות הצביעו על תגובה אימונו-היסטוכימית חלשה יותר של NeuN בהשוואה לקבוצת ה-IP (איור 6G לעומת איור 6D), תגובה אימונו-היסטוכימית חלשה יותר של GFAP (איור 6H לעומת איור 6E), ותגובה אימונו-היסטוכימית חלשה יותר של Iba-1 (איור 6I לעומת איור 6F). בקבוצת ה-U0126, תמונות מייצגות הצביעו באופן דומה על תגובה אימונו-היסטוכימית חלשה יותר של NeuN בהשוואה לקבוצת ה-IP (איור 6J לעומת איור 6D), תגובה אימונו-היסטוכימית חלשה יותר של GFAP (איור 6K לעומת איור 6E), ותגובה אימונו-היסטוכימית חלשה יותר של Iba-1 (איור 6L לעומת איור 6F). הן בקבוצת ה-PPF והן בקבוצת ה-U0126, אסטרוציטים ומיקרוגליה נראו פחות היפרטרופיים, עם גופי תא קטנים יותר ושלוחות מעטות ודקיקות יותר (איור 6H,I,K,L). ניתוח עוצמת הפלואורסצנציה התואם עבור NeuN, GFAP ו-Iba-1 היה עקבי עם התצפיות המייצגות של אימונו-פלואורסצנציה (איור 6M–O, בהתאמה).

4 שעות לאחר החתך, התגובה האימונוהיסטוכימית (immunoreactivity) ל-TNF-α ו-COX-2 ועצימות הפלואורסצנציה היחסית היו מוגברות בקרן הגב האיפסילטרלית של קבוצת ה-IP בהשוואה לקבוצת הביקורת (blank group). שני המדדים היו נמוכים יותר לאחר טיפול פרה-אופרטיבי אינטרטקלי ב-PPF או ב-U0126 (איור 7A–C).

מיקום תאי של p-ERK1/2 בעמוד השדרה באמצעות אימונופלואורסצנציה

תוצאות האימונופלורסצנציה הראו כי בקבוצת הביקורת, התגובה האימונוהיסטוכימית ל-p-ERK1/2 הייתה חלשה בחוט השדרה ונצפתה רק בנוירונים חיוביים ל-NeuN (איור 8A–C). לעומת זאת, 4 שעות לאחר החתך, התגובה האימונוהיסטוכימית ל-p-ERK1/2 עלתה באופן משמעותי בקרן הגב של חוט השדרה באותו צד (ipsilateral), והייתה מקומית לא רק בנוירונים אלא גם באסטרוציטים חיוביים ל-GFAP ובמיקרוגליה חיוביים ל-Iba-1 (איור 8D–I). ממצא זה מעיד על כך שהחתך גרם להתפשטות תאית רחבה יותר של p-ERK1/2, מנוירונים בלבד בתנאי הבסיס לנוירונים, אסטרוציטים ומיקרוגליה לאחר הפגיעה.

In vitro תיקוף של המנגנון התלוי ב-ERK1/2 באסטרוציטים של חוט השדרה

כדי להעריך באופן מעמיק יותר האם PPF יכול לדכא שחרור של מתווכי דלקת באמצעות סיגנלינג הקשור ל-ERK1/2 ברמה התאית, עוררו אסטרוציטים ראשוניים של חוט השדרה של חולדה באמצעות LPS וטיפלו בהם ב-PPF או ב-U0126 (10 µM). ניתוח Western blot הראה כי PPF הפחית את ביטוי p-ERK1/2 המושרה על ידי LPS, בעוד שפוספורילציה של p-p38 ו-p-JNK לא השתנתה באופן ניכר (איור 9A), נתון התומך בסלקטיביות יחסית של מסלול ERK1/2 בתנאים אלו. במקביל, PPF הפחית את רמות ה-TNF-α, PGE2 (תוצר מורך של פעילות COX-2) ו-IL-6 בנוזל העל של התרבית בהשוואה לקבוצת ה-Stim; U0126 הפיק אפקטים עיכובים דומים (איור 9B).

כדי לבחון האם הפעלה מתמשכת של ERK1/2 עלולה להחליש את ההשפעה נוגדת הדלקת של PPF, בוצעו ניסויי הצלה (rescue experiments). ביטוי ERK1/2 אנדוגני הושבת באמצעות siRNA, ולאחר מכן הוחדר מבנה של ERK1/2 פעיל באופן קבוע (CA-ERK1/2) (איור 9C). באסטרוציטים המבטאים CA-ERK1/2, PPF לא הפחית עוד את רמות ה-TNF-α, PGE2 או IL-6 באותה מידה (איור 9D), מה שמעיד על כך שדיכוי הפספורילציה של ERK1/2 תורם להשפעה נוגדת הדלקת של PPF במערכת אסטרוציטים in vitro זו.

במבט כולל, ממצאים אלו in vitro מספקים תמיכה מכניסטית ברמה התאית לכך ש-PPF מחליש את שחרור המתווכים הדלקתיים באמצעות מנגנון תלוי-ERK1/2 באסטרוציטים של חוט השדרה, ובכך משלימים את נתוני התצפית in vivo.

איור 1: השפעות של PPF או U0126 תוך-תעלתיים טרום-ניתוחיים על היפראלגזיה מכנית ותרמית מושרית על ידי חתך. (A) PWMT בקבוצות ה-blank, IP, PPF ו-U0126. (B) PWMT בקבוצות ה-IP והבקרה (vehicle-control). (C) PWTL בקבוצות ה-blank, IP, PPF ו-U0126. (D) PWTL בקבוצות ה-IP והבקרה (vehicle-control). הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 6 חולדות לקבוצה) ונותחו באמצעות two-way repeated-measures ANOVA. ***p < 0.001 לעומת קו הבסיס; #p < 0.05, ##p < 0.01 ו-###p < 0.001 לעומת קבוצת ה-IP. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מהלך זמן של ביטוי סממני תאי שגרה ופוספורילציה של ERK1/2 לאחר חתך. (A) כימות וסמירי Western blots מייצגים של NeuN, GFAP, ו-Iba-1 בקבוצת ה-IP מקו הבסיס ועד 72 h לאחר החתך. (B) כימות וסמירי Western blots מייצגים של t-ERK1/2 ו-p-ERK1/2 במהלך אותה תקופה. הערכים נורמלו לקבוצת הביקורת (100%) ומוצגים כממוצע ± SD (n = 3 חולדות לנקודת זמן). הבדלים כלליים נותחו באמצעות one-way ANOVA עם ההשוואות הזוגיות המצוינות. *p < 0.05, **p < 0.01 ו-***p < 0.001 לעומת קו הבסיס. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

איור 3: השפעות של PPF או U0126 באינטרטקלית טרום-ניתוחית על סמנים נוירונליים וגליאליים בעמוד השדרה 4 שעות לאחר החתך. (A–C) NeuN, GFAP, ו-Iba-1 בקבוצות ה-blank, IP, תמיסת סלין רגילה ו-PPF. (D–F) NeuN, GFAP, ו-Iba-1 בקבוצות ה-blank, IP, dimethyl-sulfoxide ו-U0126. תמונות מייצגות של Western blots מוצגות מימין. הערכים נורמלו לקבוצת ה-blank (100%) ומוצגים כממוצע ± SD (n = 3 חולדות לקבוצה). *p < 0.05, **p < 0.01 ו-***p < 0.001 לעומת blank; #p < 0.05 ו-##p < 0.01 לעומת IP; Δp < 0.05, ΔΔp < 0.01 ו-ΔΔΔp < 0.001 לעומת קבוצת ה-vehicle המתאימה. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: השפעות של מתן תוך-תעלתי (intrathecal) פרה-אופרטיבי של PPF או U0126 על פוספורילציה של ERK1/2 בעמוד השדרה 4 שעות לאחר החתך. (A,B) t-ERK1/2 ו-p-ERK1/2 בקבוצות הblank, IP, תמיסת מלח פיזיולוגית (normal-saline) ו-PPF. (C,D) t-ERK1/2 ו-p-ERK1/2 בקבוצות הblank, IP, dimethyl-sulfoxide ו-U0126. תמונות מייצגות של Western blots מוצגות מימין. הערכים נורמלו לקבוצת הblank (100%) ומוצגים כממוצע ± SD (n = 3 חולדות לכל קבוצה). **p < 0.01 ו-***p < 0.001 לעומת blank; ###p < 0.001 לעומת IP; ΔΔp < 0.01 ו-ΔΔΔp < 0.001 לעומת קבוצת הvehicle המתאימה. אנא לחץ כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תגובתיות חיסונית של NeuN בעמוד השדרה בצד האיפסילטרלי והקונטרלטרלי לאחר חתך. נתח רוחבי מייצג של חוט השדרה המותני מקבוצת ה-IP ב-4 h לאחר החתך מראה צביעת NeuN בקרניים הגבייות הקונטרלטרליות והאיפסילטרליות. התמונה מייצגת n = 3 חולדות ומוצגת להשוואה אנטומית איכותית. סרגל קנה מידה = 500 µm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: השפעות של PPF ו-U0126 על תגובתיות חיסונית של נוירונים וגליות בעמוד השדרה 4 שעות לאחר החתך. (A–C) NeuN, GFAP ו-Iba-1 בקבוצת הביקורת (blank). (D–F) צביעה מקבילה בקבוצת ה-IP. (G–I) צביעה מקבילה לאחר טיפול ב-PPF. (J–L) צביעה מקבילה לאחר טיפול ב-U0126. (M–O) עצימויות פלואורסצנציה יחסיות של NeuN, GFAP ו-Iba-1, בהתאמה. הסרגלים מייצגים ממוצע ± SD (n = 3 חולדות לקבוצה); *p < 0.05, **p < 0.01 ו-***p < 0.001 עבור ההשוואות המצוינות. סרגל קנה מידה = 200 µm. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של איור זה.

איור 7: תגובתיות אימונוהיסטוכימית של TNF-α ו-COX-2 בעמוד השדרה לאחר חתך וטיפול. (A) תמונות מייצגות של TNF-α ו-COX-2 מקבוצות ה-blank, IP, PPF ו-U0126 ב-4 h לאחר החתך. (B) עוצמת פלואורסצנציה יחסית של TNF-α. (C) עוצמת פלואורסצנציה יחסית של COX-2. העמודים מראים ממוצע ± SD (n = 3 חולדות לקבוצה); ***p < 0.001 עבור ההשוואות המצוינות. סרגי קנה מידה = 200 µm. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: לוקליזציה תאית של p-ERK1/2 בעמוד השדרה 4 שעות לאחר החתך. (A–C) צביעה משותפת של p-ERK1/2 עם NeuN, GFAP ו-Iba-1, בהתאמה, בקבוצת הביקורת (blank group). (D–F) צביעה משותפת מקבילה בקבוצת ה-IP; חצים מסמנים תאים מייצגים עם קו-לוקליזציה. אדום מציין p-ERK1/2, ירוק מציין את הסמן התאי, וצהוב מציין קו-לוקליזציה. (G–I) עצימויות פלואורסצנציה יחסיות הקשורות לאזורים חיוביים ל-NeuN, GFAP ו-Iba-1, בהתאמה. הטיות מראות ממוצע ± SD (n = 3 חולדות לקבוצה); **p < 0.01 ו-***p < 0.001 עבור ההשוואות המצוינות. סרגל קנה מידה = 100 µm. נא ללחוץ כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: השפעות אנטי-דלקתיות של PPF התלויות ב-ERK1/2 באסטרוציטים ראשוניים של חוט השדרה של חולדה. (A) דוגמאות של Western blots המראות כי PPF הפחית את p-ERK1/2 המושרה על ידי LPS ללא השפעה ניכרת על p-p38 או p-JNK. (B) ריכוזי TNF-α, PGE2 ו-IL-6 בתעשיות העל של התרבית לאחר טיפול ב-LPS, PPF או U0126. (C) Western blots המאשרים knockdown של ERK1/2 בתיווך siRNA וביטוי של ERK1/2 פעיל באופן קונסטיטוטיבי (CA-ERK1/2). (D) ריכוזי TNF-α, PGE2 ו-IL-6 לאחר ביטוי של CA-ERK1/2 עם או ללא PPF. הסרגים מראים ממוצע ± SD מניסויי in vitro בלתי תלויים; ***p < 0.001 עבור ההשוואות המצוינות; ns, לא מובהק. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: נתונים התומכים בממצאי מחקר זה.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

רוב המטופלים סובלים מכאב אקוטי לאחר ניתוח, לא רק מבחינה גופנית אלא לעיתים אף מבחינה נפשית³³, אך עדיין רבים מהמנגנונים המפורטים של כאב פוסט-אופרטיבי אקוטי אינם ידועים. לצד ההשפעות העוצמתיות של תרופות משככות כאבים מגיעות תופעות הלוואי הבלתי נמנעות שלהן, מה שהופך את חקרם של משככי כאבים בטוחים ואפקטיביים לחשיבות קריטית. מחקר זה התבסס על מודל חריתה בחולדות, אשר תוקף בעבר, לסימולציה של כאב פוסט-אופרטיבי אקוטי שהיה פשוט וניתן ליישום להכנה²⁷. המחקר הנוכחי העריך שינויים בסממנים נוירונליים וגליאליים בעמוד השדרה, פוספורילציה של ERK1/2 ומתווכי דלקת לאחר חריתה, ובחן האם האפקט האנטי-היפראלגזי של מתן PPF תוך-תעלתי (intrathecal) לפני הניתוח היה קשור לשינויים מקבילים בפוספורילציה של ERK1/2 בעמוד השדרה וביטוי של ציטוקינים דלקתיים.

בעקבות החתך, חולדות מקבוצת ה-IP פיתחו היפראלגזיה מכנית ותרמית משמעותית, בעוד שטיפול מקדים בחומר נשאי (vehicle) לא השפיע באופן שניתן לזיהוי על התוצאות ההתנהגותיות או המולקולריות. ממצאים אלו תומכים ביציבות המודל ומצביעים על כך שההשפעות שנצפו בקבוצות ה-PPF וה-U0126 אינן סבירות כתוצאה מהליך ההזרקה או מחומר הנשא עצמו. בנוסף, למרות שביטוי NeuN עלה לאחר החתך, יש לפרש שינוי זה בזהירות כשינוי בביטוי סמן עצבי ולא כעדות ישירה להפעלה עצבית. יחד, תצפיות אלו מהוות את הבסיס לבחינת תגובות גליאליות ותגובות הקשורות ל-ERK1/2 בשלב ההתפתחות המוקדם של כאב לאחר חתך.

הוכח כי לתאי גליה יש תפקיד חשוב ביצירה של סינפסות, בהעברה ובאינטגרציה של מידע סינפטי, ובוויסות של פלסטיות סינפטית. התפקודים האימונולוגיים והפרו-דלקתיים של תאי גליה בעיבוד כאב, ובמיוחד של אסטרוציטים ומיקרוגליה שפעילים בעמוד השדרה, עשויים להגביר את הרגישות המרכזית המעורבת בתיווך של היפראלגזיה ושינויים התנהגותיים לאחר ניתוח^7,34. שינויים נוירולוגיים maladaptive בחוט השדרה עשויים להוביל לתגובתיות מוגברת לגירויים מזיקים או לא-מזיקים. ראיות משמעותיות מצביעות על כך שפעילות של אסטרוציטים ומיקרוגליה בעמוד השדרה מעורבת בפיתוח ובשימור של היפראלגזיה במודלים של פגיעה בעצב עמוד השדרה³⁵, כאב המושרה על ידי tissue plasminogen activator¹⁶, כאב חתך^11,12, וכאב מסרטן העצם^19,31. לכן, נראה שפעילות גליאלית בעמוד השדרה היא מאפיין משותף למצבי כאב מרובים, ובחינה נוספת של תפקידה בכאב חתך עשויה להרחיב את ההבנה הנוכחית של מנגנוני כאב לאחר ניתוח.

הממצאים הנוכחיים תומכים בהשקפה לפיה אסטרוציטים ומיקרוגליה בעמוד השדרה משתתפים בתגובת הנוירו-דלקת המוקדמת לאחר חתך¹². במקום להראות דפוסים זמניים זהים, GFAP, Iba-1 ו-p-ERK1/2 הפגינו מהלכי זמן שונים חלקית, מה שמרמז שתהליכים גליאליים שונים עשויים לתרום לשלבים שונים של התפתחות כאב לאחר ניתוח^31,35. ממצאי אימונופלואורסצנציה תמכו עוד בפרשנות זו על ידי הצגת שינויים מורפולוגיים היפרטרופיים באסטרוציטים ובמיקרוגליה לאחר חתך. יחד עם העליות בתגובתיות החיסונית של TNF-α ו-COX-2, תצפיות אלו עולות בקנה אחד עם התפיסה שסיגנלינג דלקתי הקשור לגליות תורם להיפראלגזיה חריפה לאחר חתך^7,36.

פרופנטופילין (Propentofylline), נגזרת של מתילקסנתין, נחקר בתחילה כתרופה פעילה במערכת כלי הדם המוחיים בשל פעילותה נגד טסיות דם ותמיכתה בשימור הזיכרון לטווח ארוך³⁷. עם זאת, ההשפעה הרגולטורית של PPF על תאי גליה הופכת אותה לפוטנציאלית ובעלת ערך גם כתרופה משככת כאבים. מחקרים מצביעים על כך ש-PPF יכולה לעכב את הפעלת המיקרוגליה על ידי בלימת הפירוק של cyclic adenosine monophosphate התוך-תאי והפחתת הספיגה החוזרת של אדנוזין חוץ-תאי^4,5. במחקר in vitro, PPF עיכבה את התרבות האסטרוציטים על ידי שיבוש מסלול ה-mammalian target of rapamycin המושרה על ידי TNF-α⁶. לפיכך, ההשפעה הרגולטורית של PPF על תאי הגליה היא זו המאפשרת את השתתפותה בוויסות תהליכי כאב.

ההשפעה האנטי-היפראלגזית הממושכת של PPF במחקר הנוכחי, יחד עם הירידה בביטוי של GFAP ו-Iba-1, תומכת בפרשנות לפיה מודולציה גליאלית היא מרכיב חשוב בפעולתו האנלגזית של PPF במודל זה. מחקרים קודמים הצביעו גם על כך ש-PPF עשוי לדכא סיגנלינג דלקתי הקשור לגליות במצבי כאב^5,31. בנוסף, הירידה המקבילה ב-TNF-α וב-COX-2 מרמזת כי PPF עשוי להפחית כאב לאחר חתך באופן חלקי על ידי בלימת תגובות דלקתיות הקשורות לגליות. עם זאת, מכיוון שהנתונים הנוכחיים הם אסוציאטיביים ולא מכניסטיים, יש לפרש ממצאים אלו כתמיכה במעורבות גליאלית ולא כהוכחה למסלול סיבתי ישיר.

מעורבותן של ERK1/2, זוג קינזות תלויי-אות תוך-תאיות חשובות, בפיתוח ובשימור של תהליכי כאב שונים (על ידי תיווך של עירור עצבי ופלסטיות סינפטית במוח ובחוט השדרה) הוכחה²¹. לדוגמה, מחקר הראה כי הזרקה של capsaicin או formalin גרמה לעלייה קצרה ומהירה של p-ERK1/2 בחוט השדרה, אך הפעלת ERK1/2 בחוט השדרה נמשכה זמן רב יותר בעקבות הזרקה של complete Freund’s adjuvant או ארס דבורים (לאחר תקופת השהיה קצרה)^38,39. לעומת זאת, במחקר אחר הגיעה הפעלת ERK1/2 בחוט השדרה שנגרמה מפגיעה עצבית לשיאה בשלב מוקדם מאוד ונמשכה למשך זמן מה, כאשר ה-hyperalgesia התפתחה לאחר שיאו של p-ERK1/2³⁵. לפיכך, פוספורילציה של ERK1/2 עשויה להתרחש בשלבים שונים בתהליכי כאב שונים, וביטוי מוגבר של p-ERK1/2 בחוט השדרה עשוי להיות חשוב הן להשראה מיידית והן לתגובה גנטית ארוכת טווח.

במחקר הנוכחי, הפספורילציה של ERK1/2 שנוצרה כתוצאה מהחתך עלתה באופן משמעותי ב-24 השעות הראשונות לאחר החתך בהשוואה לקבוצת הביקורת, והביטוי של p-ERK1/2 הגיע לשיאו 4 שעות לאחר החתך (כפי שתואר בעבר)²⁴, בנקודת הזמן שבה הביטוי של NeuN היה הגבוה ביותר. במקביל, כפי שעלה מתוצאות האימונופלואורסצנציה, הפספורילציה של ERK1/2 שנוצרה בעקבות החתך התפזרה בו-זמנית בנוירונים, באסטרוציטים ובמיקרוגליה בקרן הגב של חוט השדרה בצד האיפסילטרלי, דבר התומך בהשקפה לפיה איתות הקשור ל-ERK1/2 רלוונטי במיוחד לשלב המוקדם של היפראלגזיה לאחר חתך. בנוסף, מתן תוך-תקתי (intrathecal) של U0126 לפני הניתוח הפחית את הביטוי של סמני גליאה שדרליים, NeuN ו-p-ERK1/2 ב-4 שעות לאחר החתך, והקל הן את ההיפראלגזיה המכנית והן את ההיפראלגזיה התרמית במהלך התקופה המוקדמת שלאחר החתך, ממנו ניתן להסיק כי p-ERK1/2 שדרלי עשוי להיות מעורב בשלב המוקדם של היפראלגזיה חריפה לאחר חתך. עם זאת, מכיוון ש-GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 ותוצאות התנהגותיות הראו פרופילים זמניים שונים, יש להגביל את הפרשנות המכניסטית הנוכחית לשלב המוקדם שלאחר החתך המיוצג על ידי נקודת הזמן של 4 שעות, ולא להכלילה אותה על כל התקופה שלאחר הניתוח.

בנוסף, במחקר הנוכחי, מתן תוך-תעלתי (intrathecal) של PPF לפני הניתוח הפחית גם את הפספורילציה של ERK1/2 כ-4 h לאחר החתך, מה שמרמז כי השינויים שנצפו בביטוי של NeuN, GFAP ו-Iba-1 בעמוד השדרה עשויים להיות קשורים, לפחות בחלקם, לאיתות הקשור ל-ERK1/2. מתן תוך-תעלתי של U0126 לפני הניתוח הפחית גם את התגובה האימונוהיסטוכימית של TNF-α ו-COX-2, מה שתומך בקשר אפשרי בין פספורילציה של ERK1/2 לבין ביטוי של מתווכים דלקתיים לאחר חתך. ניסויי האסטרוציטים הנוספים in vitro המוצגים ב-איור 9 סיפקו תמיכה ברמה התאית לרכיב אנטי-דלקתי התלוי ב-ERK1/2, כיוון שהפעלה מתמשכת של ERK1/2 החלישה את יכולתו של PPF להפחית את שחרור TNF-α, PGE2 ו-IL-6. עם זאת, מכיוון שניסויי ההצלה (rescue experiments) הללו בוצעו באסטרוציטים בתרבית ולא בחוט השדרה השלם, ומכיוון שלא בוצעו ניסויי הצלה in vivo או מניפולציה סלקטיבית לסוג תא, יש לפרש את המסקנות ה-in vivo כתומכות ולא כהוכחה נחרצת למנגנון סיבתי התלוי ב-ERK1/2.

כדי לדון בהרחבה בקשרי הגומלין האפשריים בין הפעלת תאי גליה, ביטוי של p-ERK1/2 ושחרור ציטוקינים דלקתיים, נבחנו דפוסי הלוקליזציה המרחבית שנצפו באימונופלואורסצנציה. לאחר החתך, p-ERK1/2 הובע במקביל עם אסטרוציטים חיוביים ל-GFAP ומיקרוגליה חיוביים ל-Iba-1 בקרן הגב של השרה (spinal dorsal horn) כ-4 שעות לאחר החתך. בשילוב עם ממצאי ה-Western blot והאימונופלואורסצנציה, שהראו כי הן PPF והן U0126 היו קשורים להפחתה בביטוי של p-ERK1/2, TNF-α ו-COX-2, נתונים אלו מרמזים כי פוספורילציה של ERK1/2 בתאי גליה בעמוד השדרה עשויה להיות מעורבת בתגובה הדלקתית לאחר חתך. הנתונים ה-in vitro באסטרוציטים ראשוניים תומכים עוד יותר בקשר תאי ישיר בין טיפול ב-PPF, דיכוי של ERK1/2 ושחרור מתווכי דלקת. עם זאת, הראיות ה-in vivo מדגימות קשר ושינויים מקבילים הקשורים לטיפול, בעוד שהניסויים התאיים משלימים אך אינם מחליפים תיקוף סיבתי ספציפי לסוג התא in vivo. מכיוון שניתוח האימונופלואורסצנציה התבסס על מספר מוגבל של בעלי חיים ושדות ראייה, יש לפרש תצפיות אלו בזהירות ובשילוב עם ממצאי ה-Western blot וה-in vitro.

למספר שלבים פרוצדורליים יש השפעה לא פרופורציונלית על השחזוריות. הזרקה תוך-ספינלית (Intrathecal) דורשת הן תגובה אופיינית של הזנב והן אישור של נוזל מוחי-שרישתי; התנגדות במהלך ההזרקה, היעדר אישור, או גרעון נוירולוגי חדש צריכים להוביל להדרה של הנבדק ולא להזרקה חוזרת באותו אתר. בדיקות התנהגותיות רגישות לאקלימטיזציה, לתנאי הכלוב, למיקום הגירוי ולציפיות החוקר, ולכן סמיות (blinding), מרווחי זמן קבועים ותנאי סביבה עקביים הם חיוניים. זמן איסוף הרקמה, העברה אחידה של חלבונים, אינקובציית נוגדנים והגדרות מיקרוסקופיה זהות בתוך כל סדרת צביעה חשובים באותה מידה. בעיות נפוצות כוללות ספי סבילות משתנים כתוצאה מאקלימטיזציה לא מספקת, פסי Western blot חלשים או לא אחידים עקב העברה חלקית או חשיפת יתר, ורקע פלואורסצנטי גבוה עקב שטיפה לא מספקת, ריכוז נוגדנים גבוה מדי או הגדרות רכישה רוויות.

ניתן לשנות את הפרוטוקול בהתאם לשאלה המדעית. ניתן להשתמש בטווח זמנים רחב יותר כאשר יש עניין בתגובות גליאליות מאוחרות, וניתן להוסיף בדיקות של טווחי מינונים או נתיבי מתנה דרכים חלופיים כאשר עדיפות ניתנת להיתכנות תרגומית (translational feasibility). בהשוואה למודלים של כאב דלקתי או נוירופתי, מודל החתך הפלנטרי הוא מהיר ומעשי יחסית ומשחזר פגיעה מוגדרת לאחר ניתוח²⁷. שילוב של בדיקות התנהגותיות, Western blotting ואימונופלואורסצנציה תאית מספק מידע פונקציונלי, מולקולרי ומרחבי משלים; עם זאת, שיטה זו דורשת משאבים רבים יותר מאשר בדיקת נקודת קצה בודדת ואינה מבססת כשלעצמה סיבתיות ספציפית לסוג תא. השוואה פרמקולוגית עם U0126 מחזקת את פרשנות המסלול אך נותרת פחות ספציפית ממניפולציה גנטית או סלקטיבית לסוג תא^{20,21,22,23,24,25}.

יישומים עתידיים כוללים בדיקה של שני המינים, פציעות כירורגיות נרחבות יותר, נתיבי מינון מעשיים מבחינה קלינית, נקודות זמן נוספות לאחר הניתוח, והתערבויות המכוונות לאוכלוסיות גליאליות ספציפיות. זרימת העבודה היא מעשית לסריקת טיפולים מועמדים לשיכוך כאבים או לוויסות גליאלי, מכיוון שמודל החתך הוא קצר, נקודות הקצה ההתנהגותיות הן ניתנות לשחזור, והבדיקות המולקולריות משתמשות בשיטות מעבדה סטנדרטיות. עם זאת, השחזוריות תלויה בקריטריוני החרגה שהוגדרו מראש, הערכת תוצאות באופן עיוור, רכישת תמונות עקבית, ודיווח מלא של נתונים גולמיים והגדרות ניתוח.

מגבלות

למחקר זה מספר מגבלות. ראשית, מודל החתך בכף הרגל האחורית (plantar paw incision) מייצג פגיעה כירורגית מינורית יחסית ועשוי שלא לשקף באופן מלא הליכים כירורגיים נרחבים יותר, כגון תורקוטומיה (thoracotomy) או לפרוטומיה (laparotomy). לפיכך, יש לנקוט משנה זהירות בעת העמקת הממצאים הנוכחיים לסוגים אחרים של כאב פוסט-אופרטיבי. בנוסף, המחקר כלל חולדות Sprague–Dawley זכרים בלבד, מה שמגביל את היכולת להכליל ממצאים אלו בין המינים. בהינתן ההבדלים הידועים בין המינים בתגובות לכאב, בהשפעות אנלגזיות ובדפוסי הפעלת גליות (glial activation), נדרשים מחקרים נוספים שיכללו נקבות.

התצפיות המולקולריות וההיסטולוגיות העיקריות התמקדו בנקודת הזמן של 4 h לאחר החתך. מכיוון שנקודות קצה שונות, כולל GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 ותוצאות התנהגותיות, הראו פרופילים זמניים מובחנים בעקבות החתך, יש להגביל את הפרשנות המכניסטית של הממצאים הנוכחיים בעיקר לשלב המוקדם שלאחר החתך. יתרה מכך, הניסויים המולקולריים כאן בוצעו עם גודל מדגם מוגבל יחסית, דבר שעלול להפחית את החוזק הסטטיסטי של תצפיות אלו.

קינאזות מסוג extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 הוערכו יחד כ-p-ERK1/2; תרומתן האינדיבידואלית לא נבחנה בנפרד. לפיכך, לא ניתן היה לקבוע במחקר הנוכחי את התפקידים השונים של ERK1 ו-ERK2 בעיבוד כאב המושרה על ידי חתך. בנוסף, הכימות של עוצמת הפלואורסצנציה התבסס על מספר מוגבל של בעלי חיים ושדות, ולא כלל ספירת תאים סטריאולוגית או מקדמי קולוקליזציה פורמליים. יש לפרש תצפיות אלו, לפיכך, בזהירות, יחד עם ממצאי ה-Western blot.

לבסוף, למרות שניסויי ההצלה של אסטרוציטים in vitro סיפקו תמיכה מכניסטית לבקרה של מתווכי דלקת התלויה ב-ERK1/2, האירועים הרגולטוריים שמעלה לאחר החתך והאירועים שמתחתיהם ברקמת עמוד שדרה שלמה לא נחקרו לעומק. מערכת תרביות ה-in vitro אינה יכולה לשחזר באופן מלא את האינטראקציות בין נוירונים, אסטרוציטים, מיקרוגליה ותאי מערכת חיסון חודרים בקרן הגב של חוט השדרה. בהתאם לכך, המחקר הנוכחי תומך במכניזם הקשור ל-ERK1/2 אך אינו מבסס סיבתיות תאית מלאה in vivo.

סיכום

המחקר הנוכחי מדגים כי עליות בביטוי של NeuN, GFAP ו-Iba-1 בעמוד השדרה, שנוצרו כתוצאה מחתך, נחלשו על ידי מתן אינטרטקלי של PPF לפני הניתוח. אפקט זה לווה בהקלה על היפראלגזיה מכנית ותרמית חריפה ובהפחתה של פוספורילציה של ERK1/2 ושל ביטוי TNF-α ו-COX-2 לאחר החתך. עם זאת, ממצאים אלו תומכים בקישור (אולם אינם מספקים הוכחה מכניסטית מוחלטת) בין האפקט האנטי-היפראלגזי של PPF לבין פוספורילציה מופחתת של ERK1/2 בתאי גליה של עמוד השדרה (בשלב המלווה בביטוי מופחת של מתווכי דלקת). האפקט האנטי-היפראלגזי של PPF נשמר לאורך כל תקופת התצפית שלאחר החתך, בעוד שהאפקט של מעכב MEK1/2, U0126, היה מוגבל בעיקר לתקופה המוקדמת שלאחר החתך. ממצאים אלו מרמזים כי סיגנלינג של ERK1/2 עשוי להיות רלוונטי במיוחד במהלך ההתפתחות המוקדמת של כאב כתוצאה מחתך. האפקט הממושך יותר של PPF מצביע על כך שמנגנון הפעולה שלו עשוי לערב מסלולים נוספים מעבר לעיכוב של ERK1/2 לבדו. לפיכך, PPF עשוי להוות התערבות טיפולית פוטנציאלית, ולא מטרה ביולוגית, לשיפור הניהול של כאב פוסט-אופרטיבי חריף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בופר PBS בריכוז 0.01 M	Solarbio	P1020
בופר Tris-HCl בריכוז 1.0 M (pH 6.8)	Solarbio	T1020
בופר Tris-HCl בריכוז 1.5 M (pH 8.8)	Solarbio	T1010
10% סודיום דודציל סולפט (SDS)	Solarbio	S1010
10× תמיסת מלאי TBST	Solarbio	T1081
30% אקרילאמיד	Solarbio	A1010
4× בופר טעינת חלבון	Solarbio	P1041
Adobe Photoshop	Adobe	—
אמוניום פרסולפט	Solarbio	A1030
מכונה אוטומטית לייצור קרח קשקשים	צ'אנגשו שוּקֶה (Changshu Xueke)	IMS-40
אלבמין סרום בקר (BSA)	Solarbio	A8020
קריוסטט CM150	Leica	CM150
מד pH דיגיטלי	—	PHS-3C
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	Solarbio	D8371
מאזניים אנליטיים אלקטרוניים	סני	—
ריאגנט לכימילומינצנציה מוגברת (ECL)	Solarbio	PE0010
סרטון	Kodak	—
מיקרוסקופ פלואורסצנציה DP71	Olympus	DP71
תווך שיכון לסריקי קיפאון	סאקורה	4583
מכשיר אלקטרופורזה של ג'ל	BIO-RAD	—
גליצרול	Solarbio	IG0910
גליצין	Solarbio	G8200
נוגדן שני עז נגד עכבר Alexa Fluor 594	Proteintech	SA00013-3
נוגדן משני עיזים נגד עכבר המצומד ל-horseradish peroxidase	ZSGB-BIO	ZB2305
נוגדן משני Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Proteintech	SA00013-2
נוגדן שני עז נגד ארנב המצומד לhorseradish peroxidase	ZSGB-BIO	ZB2301
סרום עיזים	Solarbio	SL038
GraphPad Prism	תוכנת GraphPad	5
צנטריפוגה מקוררת במהירות גבוהה 3K15	סיגמא	3K15
מנער אורביטלי אופקי TS-1000	היימן קילינבייר	TS-1000
ImageJ	National Institutes of Health	1.51j8
מתנול	Tianjin Guangfu	—
נוגדן ראשוני עכברי נגד GAPDH של חולדה	Proteintech	60004-1-Ig
נוגדן ראשוני עכברי נגד p-ERK1/2 של חולדה	CST	9101S
Na2HPO3	Tianjin Beichen Fangzheng	—
NaH2PO3	Tianjin Damao	—
פראפורמאלדהיד	Biosharp	BL539A
זכוכיות מיקרוסקופ בדרגת פתולוגיה	שיטאי	—
פנילמתנסולפוניל פלואוריד (PMSF)	Beyotime	ST506
בדיקת כף הרגל (Plantar Test) 37370	אוגו באסילה	37370
ממברנת פוליוינילידן פלואוריד	Solarbio	—
פרופנטופילין (PPF)	Taosu	T19812
נוגדן ראשוני ארנב נגד COX-2 של חולדה	Abcam	Ab179800
נוגדן ראשוני ארנב נגד GFAP של חולדה	Proteintech	16825-1-AP
נוגדן ראשוני ארנב נגד Iba-1 של חולדה (anti-rat)	Proteintech	10904-1-AP
נוגדן ראשוני ארנב נגד NeuN של חולדה	Abcam	Ab279297
נוגדן ראשוני ארנב נגד t-ERK1/2 של חולדה	Proteintech	11257-1-AP
נוגדן ארנב נגד TNF- של חולדהα נוגדן ראשוני	Proteintech	29652-1-AP
בופר ליזיס RIPA	Solarbio	R0010
SDS	Solarbio	S8010
אבקת חלב דל שומן	Solarbio	D8340
SPSS	IBM	22
טטרהמתילאתילנדיאמין (TEMED)	Solarbio	T8090
Tris	Solarbio	T8060
Triton X-100	Solarbio	T8200
U0126-EtOH	Selleck	S1102
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד	Haier	—
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד	Sanyo	—
מערכת לטיהור מים אולטרה-טהורים	Heal Force	—
סיבי von Frey	North Coast Medical	—