הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

פרופנטופילין מקל על היפראלגזיה לאחר חתך על ידי ויסות פוספורילציה של ERK1/2 באסטרוציטים ובמיקרוגליה בעמוד השדרה

32 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/70927

⸱

14 באוגוסט 2026

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Zhang Ye People's Hospital Affiliated To Hexi University, 2Department of Stomatology, Zhangye Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Anesthesiology, The Second Hospital & Clinical Medical School, Lanzhou University

במאמר זה

סיכום

מחקר זה בוחן את ההשפעה של מתן אינטרטקלי של propentofylline על הפחתת היפראלגזיה לאחר חתך, והאם השפעה זו קשורה לשינויים במדדי גלייאל ספונטניים ובפספורילציה של extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 בחולדות.

תקציר

אסטרוציטים של חוט השדרה, מיקרוגליה וקינזה 1 ו-2 מווסתת על ידי אותות חוץ-תאיים (ERK1/2) מעורבים בעיבוד כאב. מחקר זה בחן האם מתן פרופנטופילין (PPF) תוך-תעלתי לפני הניתוח מפחית היפרלגזיה חריפה לאחר חתך בעכברים, והאם השפעה זו קשורה לסממנים גליאליים של חוט השדרה ולפספורילציה של ERK1/2. שישים ושש חולדות זכרים מסוג Sprague–Dawley חולקו באופן אקראי לקבוצות ביקורת (blank), כאב לאחר חתך, תמיסת סליין רגילה, דימטיל סולפוקסיד, PPF ו-U0126. היפרלגזיה מכנית ותרמית הוערכו בקו הבסיס ובשעות 2, 4, 8, 24 ו-72 לאחר החתך. סממנים עצביים וגליאליים של חוט השדרה, p-ERK1/2 ומתווכי דלקת נבחנו באמצעות Western blotting ואימונופלואורסצנציה. ניסויים באסטרוציטים ראשוניים של חוט השדרה שימשו בנוסף לבחינת שחרור מתווכי דלקת התלוי ב-ERK1/2. מתן תוך-תעלתי של PPF לפני הניתוח הפחית היפרלגזיה מכנית ותרמית לאורך תקופת התצפית של 72 שעות, בעוד ש-U0126 הפחית היפרלגזיה בעיקר בתקופה המוקדמת לאחר החתך. 4 שעות לאחר החתך, שני הטיפולים היו קשורים להפחתה בביטוי של GFAP, Iba-1 ו-p-ERK1/2 בחוט השדרה, ולהפחתה בתגובתיות אימונולוגית של TNF-α ו-COX-2. באסטרוציטים בתרבית, PPF הפחית את שחרור מתווכי הדלקת המושרה על ידי LPS, בעוד ש-ERK1/2 פעיל באופן קבוע הפחית השפעה זו. ממצאים אלו תומכים בקשר בין ההשפעה האנטי-היפרלגזית של PPF לבין ויסות תגובות גליאליות, תגובות הקשורות ל-ERK1/2 ותגובות דלקתיות בחוט השדרה לאחר חתך.

מבוא

כאב לאחר חתך, סוג נפוץ של כאב אקוטי בעקבות הליכים כירורגיים, בדרך כלל אינו נמשך יותר מ-7 ימים אך הוא בעל מנגנונים פתולוגיים מורכבים השונים מאלו של כאב דלקתי או נוירופתי1,2. אם כאב לאחר חתך אינו נשלט כראוי במהלך התפתחותו, הוא עלול להתקדם לתסמונת של כאב כרוני, ואופיו עשוי להשתנות מכאב של פגיעה רקמתית אקוטית לכאב נוירופתי או מעורב3. באופן כללי, מתן משככי כאבים, כגון אופיואידים ותרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידיות, הוא הצורה הנפוצה ביותר של אלגזיה לאחר חתך. עם זאת, שימוש רציף או במינונים גבוהים של תרופות אלו עלול לגרום לתופעות לוואי רבות, נסיבות המדגישות את הצורך באסטרטגיות אלגזיה בטוחות ואפקטיביות יותר.

ראיות מהימנות מעידות כי propentofylline (PPF) מקל על היפראלגזיה בתהליכי כאב שונים4,5. יתרה מכך, ניתן להשיג את אפקט השיכוך של PPF באופן חלקי על ידי עיכוב הביטוי השכירי של mitogen-activated protein kinases (MAPKs), כגון p38 ו-c-Jun N-terminal kinases (JNKs)6. למרות שהשפעותיו של PPF על נתיבי p38 ו-JNK כבר הוכחו, פוטנציאל הוויסות שלו של נתיב ה-extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2), תת-משפחה קריטית נוספת של MAPKs המעורבת באותות כאב, נותר בלתי נחקר בכאב חתוך אקוטי. פער ידע זה חשוב במיוחד בהתחשב בכך שהפעלת ERK1/2 מראה דפוסים זמניים ותאיים מובחנים בהשוואה ל-p38 ו-JNK, מה שמרמז על הזדמנויות טיפוליות ייחודיות פוטנציאליות.

תאי גליה, הכוללים אסטרוציטים, מיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים, נחשבו בתחילה למבנה המקשר והתומך של רקמת העצבים. עם זאת, מחקרים אחרונים הראו כי אסטרוציטים ומיקרוגליה ממלאים תפקיד חשוב בויסות פלסטיות סינפטית ובהעברת מידע על כאב7. כמאקרופגים התושבים של המוח ושל חוט השדרה, מיקרוגליה יכולים להיות מופעלים על ידי מספר אותות גירוי חוץ-תאיים בשלב מוקדם מאוד של תהליך הכאב, ולאחר מכן להתרבות ולהפריש כמויות גדולות של ציטוקינים דלקתיים, אשר מגבירים את הולכת אותות הכאב מחוט השדרה אל המוח8,9. במקביל, אסטרוציטים מופעלים יכולים להגביר את השחרור של הנוירוטרנסמיטר המעורר glutamate ולהעביר מידע ישירות לנוירונים תחושתיים על ידי הגברת התקשורת הבין-תאית10.

מחקרים הראו כי הפעלת אסטרוציטים מתרחשת בשלב מוקדם (בתוך 24 השעות הראשונות) של כאב המושרה על ידי חתך, בעוד שהפעלת מיקרוגליה מופיעה הרבה יותר מאוחר11,12. בנוסף, מחקר אחד הצביע על כך שלמיקרוגליה מופעלת יש השפעה מוגבלת על היפראלגזיה מכנית בכאב המושרה על ידי חתך13. ממצאים אלו מדגישים שאלות פתוחות בנוגע לתפקידיהם המובחנים של אסטרוציטים ומיקרוגליה בכאב אקוטי. דווח כי Propentofylline, סוכן מוודג של תאי גליה, מקל על היפראלגזיה על ידי ויסות הפעלת אסטרוציטים ומיקרוגליה בעקבות פגיעה כרונית בלחץ עצבי, פגיעה עצבית אקוטית ופגיעה רקמתית אקוטית4,5. עם זאת, למיטב הידע הנוכחי, אף מחקר לא בחן את השפעות ה-PPF על הפעלת אסטרוציטים או מיקרוגליה בכאב אקוטי המושרה על ידי חתך.

הקינאזות Extracellular signal-regulated kinase 1 and 2, תת-משפחה מרכזית של MAPK המופעלת במורד הזרם של mitogen-activated protein kinase 1 and 2 (MEK1/2), מעורבות במידה רבה בעיבוד נוציצפטי ובפלסטיות נוירונלית14,15. מחקרים קודמים הראו כי ניתן להשרות phospho-ERK1/2 (p-ERK1/2) בנוירונים של חוט השדרה באמצעות גירוי נוציצפטי, וכי ניתן לזהות אותו גם באסטרוציטים ובמיקרוגליה במצבי כאב דלקתי או נוירופתי16,17,18,19. בנוסף, דווח כי עיכוב פרמקולוגי של אותיות MEK1/2–ERK1/2 מפחית היפראלגזיה מכנית ותרמית במספר מודלים של כאב20,21,22,23,24,25.

עם זאת, ההתפלגות התאית של ERK1/2 בעמוד השדרה, בייחוד באסטרוציטים ובמיקרוגליה, המופעלת על ידי חתך אקוטי ותפקידה בכאב המושרה על ידי חתך, נותרה לא מוגדרת מספיק. מחקרים קודמים של קבוצת המחקר מצביעים על כך ש-PPF מקל על היפראלגזיה חתכית אקוטית בחולדות על ידי הפחתת סיגנלינג של JNK ו-p38 בעמוד השדרה, אך לא ברור האם PPF מווסת גם סיגנלינג הקשור ל-ERK1/2 בתאי גליה בעמוד השדרה במהלך כאב המושרה על ידי חתך. לפיכך, יש לראות במחקר הנוכחי הרחבה של המסגרות הקיימות של הגליה ו-MAPK במחקר הכאב, ולא פרדיגמה מכניסטית עצמאית לחלוטין. הבחנתו העיקרית מעבודות קודמות טמונה בהתמקדותו הספציפית בכאב חתכי אקוטי, בבחינת ERK1/2 במקום p38/JNK כמרכיב ה-MAPK הרלוונטי, ובהערכת ההתפלגות התאית המוקדמת של p-ERK1/2 בעמוד השדרה ביחס לטיפול ב-PPF.

מחקר זה תוכנן כדי לבדוק האם מתן פרה-אופרטיבי של PPF באופן אינטרטקלי מפחית היפראלגזיה חיתוךית במודל של חיתוך כף רגל של חולדה, והאם אפקט זה קשור לפוספורילציה של ERK1/2 או לשינויים בביטוי של סממנים נוירונליים וגליאליים בעמוד השדרה ומתווכי דלקת, tumor necrosis factor-α (TNF-α) ו-cyclooxygenase-2 (COX-2). באופן ספציפי יותר, מחקר זה נבדל מדיווחים קודמים בשילוב של הערכה התנהגותית עם ניתוח Western blot זמני; בהשוואה פרמקולוגית עם מעכב MEK1/2 מסוג U0126; ובמיקום אימונופלואורסצנטי איכותי של p-ERK1/2 בנוירונים של עמוד השדרה, אסטרוציטים ומיקרוגליה בתוך מודל של כאב חיתוכי אקוטי. למרות שהמסגרת המכניסטית שלו נשענת על ספרות קודמת הקושרת מודולציה גליאלית ואיתות MAPK לכאב, עבודה זו נועדה לספק ראיות נוספות למעורבות אפשרית של תגובות גליאליות הקשורות ל-ERK1/2 בעמוד השדרה בשלב המוקדם של היפראלגזיה חיתוךית.

בהשוואה למשככי כאבים פוסט-אופרטיביים קונבנציונליים, גישות המכוונות למסלולים ספציפיים מאפשרות לבחון רכיב סיגנלינג מוגדר, אך עשויות לספק תועלת מוגבלת בזמן ועלולות לדרוש הזרקה פולשנית; עיכוב של MEK1/2–ERK1/2 הראה השפעות אנטי-היפראלגזיות במספר מודלים ניסיוניים של כאב20,21,22,23,24,25. PPF שונה מעכבי מסלול בודד כיוון שהוא מווסת תגובות גליאליות ונקשר ליותר מתהליך אחד הקשור ל-MAPK4,5,6. היישום המעשי נותר מוגבל בשל התכנון הפרה-קליני, מתן התרופה באופן אינטרטקלי לפני הניתוח, שימוש בחולדות זכרים בלבד, והיעדר מחקרי בטיחות ובחינת טווחי מינונים במודלים כירורגיים גדולים יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הניסויים שנערכו אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים המשני המסונף, אוניברסיטת לנז'ו (Lanzhou University), מחוז גנסו, סין (מספר אישור אתי 2017-070). כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות של האיגוד הבינלאומי לחקר הכאב (International Association for the Study of Pain)26. במחקר נעשה שימוש ב-66 חולדות Sprague–Dawley זכרים בוגרות, ששקלן 200–250 g, אשר הושגו ממרכז מוסמך לבעלי חיים למעבדה. רק חולדות זכרים נכללו במחקר זה כדי לצמצם שונות פוטנציאלית הקשורה להשפעות הורמונליות תלויות-מין. כל הפרוטוקולים בוצעו בהתאם להנחיות של האיגוד הבינלאומי לחקר הכאב (International Association for the Study of Pain)26, וננקטו המאמצים הנדרשים לצמצום הסבל. מידע מפורט על הריאגנטים, consumables, המכשירים והתוכנות ששימשו במחקר זה מופיע בטבלת החומרים.

בעלי חיים

החולדות שהו בזוגות לפני הניתוח ובאופן אינדיבידואלי לאחר החיתוך, עם גישה חופשית (ad libitum) למזון ומים. בחדר נשמר מחזור של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך, והטמפרטורה נשלטה ב-24 °C ± 2 °C.

מודל של הזרקה תוך-תעלתית וכאב לאחר חתך

לצורך מתן תמיסות באופן אינטרתקלי (תוך-ערוקי), חולבנו חולדות תחת הרדמה ב-1.5%–3% sevoflurane (שסופקה באמצעות חרוט לאף) והונחו בתנוחה הפוכה (prone) כאשר עמוד השדרה כפוף. הפרווה מעל אזור המותניים גולחה, והעור מעל המרווח הבין-חולייתי L5–L6 חומם. מיקרו-מזרק הוכנס דרך העור במרווח הבין-חולייתי L5–L6. כניסה מוצלחת לחלל הסוב-אראכנואידי (החלל מתחת לקרום העכביש) זוהתה על ידי תנועה פתאומית של הזנב במהלך קידום המחט, ואושרה בהמשך על ידי הופעת נוזל חוט השדרה (CSF) בעת שאיבה עדינה. אם סימנים אלו לא נצפו, מיקום המחט כוונן לפני ההזרקה. ההזרקה בוצעה רק לאחר ששני קריטריוני האישור התממשו, ובעלי חיים שהראו סימנים נוירולוגיים חריגים לאחר ההזרקה הוצאו מהניסוי. לאחר מכן הוזרק התמיס הרלוונטי לאט, והעור נוקה שוב לאחר ההזרקה. הפרוצדורה הכירורגית נמשכה כ-3 min, והחולדות התאוששו בדרך כלל מההרדמה תוך 5–10 min.

מודל חולדות לכאב חתכי הוקם כפי שתואר בעבר27. לאחר הרדמה, חומם אותו של כף הרגל האחורית חוטר ב-10% povidone–iodine. בוצע חתך אורכי של 1-cm בעור כף הרגל, החל מכ-0.5 cm מהעקב והמשיך לכיוון האצבעות. החתך חדר דרך העור והפציה. את השריר הפלנטרי הרימו בעדינות בעזרת פינצטה אופתלמית ובצעו בו חתך אורכי תוך שמירה על רצף הרקמה הכללי. לאחר מכן הוחזר השריר למקומו, הופעל לחץ עדין להשגת המוסטזיס, והפצע נסגר באמצעות שתי תפרים מסוג mattress בעזרת 3-0 nylon. אתר החתך חוטר שנית לאחר סגירת הפצע. לאחר הניתוח, החולדות שוכנו בנפרד והושארו להתאושש בסביבה שקטה וחמה, מוגנות מאור חזק ועם גישה חופשית למזון ומים. בעלי החיים נוטרו לאחר הניתוח, ואלו שלא עמדו בקריטריונים שהוגדרו מראש הוצאו מהמחקר באופן מיידי. זיהום בפצע נקבע על סמך אדמומיות, נפיחות ועלייה בטמפרטורה המקומית סביב הפצע, הפרשה מוגלתית צהובה-ירוקה חריגה עם ריח רע, עיכוב בריפוי הפצע עם פתיחה מתמשכת של הפצע, נמק והרחבה, וסימנים סיסטמיים הכוללים עלייה בטמפרטורת הגוף, לטארגיה וסירוב להאכיל. קריטריוני החרגה נוספים כללו כישלון בהתאוששות מההרדמה תוך 30 min, חיתוך שריר תוך-ניתוחי או פגיעה נוירו-וסקולרית, פגיעה עצמית לאחר הניתוח, כישלון בהקמת המודל וגירעונות נוירולוגיים, כגון שיתוק של הגפיים האחוריות או חוסר יכולת לשאת משקל שאינו קשור לכאב חתכי. חולדות עם זיהום בפצע או פתיחת תפרים (dehiscence) הוצאו מהמחקר.

מדידה התנהגותית

סף נסיגת כף רגל מכנית (PWMT) וזמן תגובה לנסיגת כף רגל תרמית (PWTL) נמדדו על ידי חוקר שהיה עיוור להקצאת הקבוצות. הבדיקה בוצעה בחדר שקט בשעה עקבית ביום לאחר לפחות 10 min של אקלימטיזציה; הכלוב, רצפת הרשת או הזכוכית, התאורה הסביבתית ועוצמת מקור החום נשמרו קבועים בין הקבוצות. לבדיקת PWMT, סיבי von Frey מכויילים (0.4 g, 0.6 g, 1.0 g, 1.4 g, 2.0 g, 4.0 g, 6.0 g, 8.0 g, 10.0 g, ו-15.0 g) הופעלו בניצב למשטח הפלנטרי הסמוך לפצע עד שהסיב התכופף בערך 1–2 mm. גירויים עוקבים הופרדו ב-2 min, וערך ה-50% PWMT נקבע באמצעות שיטת ה-up-and-down28. לבדיקת PWTL, חוללות הוכנסו למארזים שקופים בודדים על רצפת זכוכית, ומקור החום הקרינתי כוונן למשטח הפלנטרי לצד הפצע. זמן הגבלה (cut-off) של 30 s מנע פגיעה ברקמה, חשיפות עוקבות הופרדו ב-2 min, ונרשם הממוצע של שלוש מדידות29. הרמה של כף הרגל, ניעור או לקיקה נחשבו כתגובת נסיגה חיובית; ניסיונות שהושפעו מטיפוח עצמי (grooming), תנועה או אובדן יישור של מקור החום חזרו לאחר אקלימטיזציה מחודשת.

ניתוח Western blot

במועדים שנקבעו מראש, חוללים החולדות באמצעות פריקה צווארית (cervical dislocation), וחלק העמוד השדרה המותני L4–L6 נאסף במהירות לתוך באפר ליזיס של radioimmunoprecipitation assay בתוספת מעכב פרוטאז ביחס של 100:1. הרקמה עברה הומוגניזציה, נשמרה על קרח למשך 20 min, וסובבה בצנטריפוגה במהירות של 15,000 × g למשך 20 min בטמפרטורה של 4 °C. הנוזל העליון (supernatant) עורבב עם באפר טעינה 4× ביחס של 3:1, חומם במים רותחים למשך 5 min, ואוחסן בטמפרטורה של −80 °C. דגימות חלבון (30 µg לכל נתיב) הופרדו על ג'לים של sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide בריכוז 10% והועברו לממברנות polyvinylidene fluoride של 0.45 או 0.22 µm. העברה מוצלחת נבדקה על ידי אישור הנדידה הצפויה של סמן המשקל המולקולרי שצבע מראש והיעדר אזורים בולטים של העברה לא אחידה או קטועה. הממברנות נחסמו עם 5% חלב רזה ו-3% bovine serum albumin למשך 2 h בטמפרטורת החדר, והודגרו למשך לילה ב-4 °C עם נוגדי ראשוניים נגד NeuN (1:8,000), GFAP (1:4,000), Iba-1 (1:3,000), p-ERK1/2 (1:1,000), t-ERK1/2 (1:3,000), או GAPDH (1:2,000). לאחר שטיפה ב-Tris-buffered saline המכיל 0.05% Tween 20 (pH 7.4), הודגרו הממברנות עם הנוגדן המשני המתאים המצומד ל-horseradish peroxidase (1:5,000) למשך 1 h בטמפרטורת החדר. האותות פותחו באמצעות chemiluminescence משופר ותועדו על סרט צילום תוך שימוש בטווח חשיפה זהה עבור כל מטרה. חוקר שלא היה ידוע לו חלוקת הקבוצות ניתח את צפיפות הפסים באמצעות תוכנה לניתוח תמונות. התמונות הומרו לגווני אפור של 8-bit, אזור עניין מלבני זהה הוחל על כל פס, רקע מקומי מאזור ריק סמוך הופחת, והצפיפות האינטגרלית תועדה. גודל אזור ונוהל רקע זהים שימשו עבור כל הנתיבים בבלוט (blot). NeuN, GFAP, Iba-1, ו-t-ERK1/2 נורמלו ל-GAPDH; p-ERK1/2 נורמל ל-t-ERK1/2; והערכים בוטאו לאחר מכן ביחס לקבוצת הביקורת (blank group).

אימונופלואורסצנציה

בזמנים שנקבעו מראש, חולבנו החולדות תחת הרדמה באמצעות 3% pentobarbital sodium (במינון של 1.5 mL/kg) ובוצע פרפוזיה דרך הלב עם 300 mL של 0.01 mol/L phosphate-buffered saline (PBS; pH 7.4) מקורר מראש, ולאחריו 250 mL של 4% paraformaldehyde מקורר מראש. קיטע L4–L6 של חוט השדרה עבר קיבוע משלים (post-fixation) ב-4% paraformaldehyde למשך 6 שעות, הגנה מפני קיפאון (cryoprotection) למשך לילה ב-20%–30% sucrose–PBS בטמפרטורה של 4 °C, ונחתך לפרוסות בעובי 10 µm בטמפרטורה של −22 °C. הפרוסות נשטפו ב-0.01 mol/L PBS, עברו חסימה (blocking) ב-10% goat serum למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ואומודו למשך לילה ב-4 °C עם נוגדנים ראשוניים נגד NeuN (1:100), GFAP (1:1,000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) או COX-2 (1:50). לאחר שלושה שטיפות ב-PBS, הפרוסות אומודו עם הנוגדן המשני המתאים המצומד לפלואורופור ירוק או אדום (1:400) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, נשטפו שלוש פעמים נוספות ב-PBS ונקבעו (mounted) עם מדיום antifade וזכוכית כיסוי. פרוסות ביקורת שלילית, שעובדו ללא הנוגדן הראשוני, נכללו בכל סדרת צביעה. התמונות נרכשו על ידי חוקר מסוכך (blinded) באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה. תמונות סקירה בהגדלה נמוכה נרכשו באמצעות עדשה של 10×, בעוד שתמונות של תגובתיות חיסונית תאית וקו-לוקליזציה נרכשו באמצעות עדשות של 20× או 40× בהתאם לפאנל האיור הרלוונטי. לצורך השוואות בתוך אותו איור וסדרת צביעה, הגדלת העדשה, עוצמת התאורה, זמן החשיפה, הגבר הגלאי (detector gain), הגדרות המצלמה ופרמטרי עיבוד התמונה נקבעו לאחר אופטימיזציה מתחת לסף הרוויה. ערוצי פלואורסצנציה נפרדים נרכשו באופן רצפי כדי לצמצם חפיפה בין הערוצים. שלוש שדות ראייה שאינם חופפים בקרן הגב (dorsal horn) האיפסילטרלית צולמו לכל חיה. עוצמת הפלואורסצנציה כומתה באמצעות תוכנה לניתוח תמונות לאחר המרה ל-8-bit, חיסור רקע באמצעות אזור נטול תאים, והחלת אזור עניין (ROI) וסף (threshold) זהים בתוך כל סדרת צביעה; ערכי השדות חושבו כממוצע כדי לקבל ערך אחד לכל חיה. שדות עם חשיפת יתר, קיפולי רקמה, קרעים, פוקוס לקוי או רקע לא אחיד הוצאו מהניתוח ונרכשו מחדש תחת אותן הגדרות שאינן רוויות. הצביעה התקבלה כאשר מבנה הרקמה היה שלם, האות של מטרה עלה על ביקורת ללא הנוגדן הראשוני, ולא השפיעו על הניתוח קיפולים משמעותיים, קרעים או אזורים רווים.

ניסויי אסטרוציטים ראשוניים של חוט השדרה In vitro

אסטרוציטים ראשוניים מהחוט השדרה של חולדה תורבדו בתנאים סטריליים סטנדרטיים במצע תרבית מלא ב-37 °C באינקובטור לח עם 5% CO2. התאים שימשו למספר ניסויים כאשר הגיעו לכ-70%–80% התלכדות (confluence), וחולקו לקבוצות של ביקורת, גירוי ב-LPS, LPS + PPF, LPS + U0126, וקבוצות הצלה של ERK1/2. PPF ו-U0126 הוספו בריכוז של 10 µM. תנאי גירוי ה-LPS, הטיפול התרופתי ותנאי האיסוף נשמרו זהים בין בארות מקבילות בכל ניסוי. לצורך ניתוח סלקטיביות המסלול, נאספו ליזאטים של תאים עבור Western blotting של p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, total p38, p-JNK, total JNK, ובקרת טעינה תואמת. על-נוזלי תרבית מבארות מקבילות נאספו, הובהרו באמצעות סרצ'יפוגציה, ונבדקו עבור TNF-α, PGE2, ו-IL-6 באמצעות תגובת ELISA בהתאם להוראות היצרן. דנסיטומטריית ה-Western blot בוצעה על פי אותם עקרונות של ניתוח תמונות שתוארו לעיל. עבור ניסויי הצלה, ביטוי אנדוגני של ERK1/2 דומם באמצעות טרנספקציית siRNA, ומבנה ביטוי של ERK1/2 פעיל באופן קבוע (CA-ERK1/2) הוחדר לפני הטיפול. יעילות ה-Knockdown והביטוי העודף (overexpression) אושרו באמצעות Western blotting לפני פרשנות נתוני הציטוקינים. תאים שנחשפו לחומר הטרנספקציה ללא siRNA פעיל או מבנה ביטוי שימשו כביקורות פרוצדורליות במידת הצורך.

מערך ניסויי

חלוקה לתתי-קבוצות של בעלי חיים ניסייים

החולדות חולקו לשיש קבוצות באמצעות שיטת טבלת מספרים אקראית, וההקצאה לקבוצות הושלמה לפני הבדיקות ההתנהגותיות ואיסוף הרקמות. שש הקבוצות כללו קבוצת ביקורת ריקה (n = 6), קבוצת כאב חתך (IP) (n = 18), קבוצת תמיסת סליין נורמלית (NS) (0.9% NS, 10 µL; n = 9), קבוצת PPF (10 µg ב-10 µL; n = 12), קבוצת dimethyl sulfoxide (DMSO) (10% DMSO, 10 µL; n = 9) וקבוצת U0126 (10 µg ב-10 µL; n = 12). חולדות בקבוצת הביקורת הריקה לא עברו חתך בכף הרגל ולא קיבלו הזרקה תוך-תעלתית (intrathecal), ושימשו כביקורות לא מטופלות. חולדות בקבוצת ה-IP עברו חתך בכף הרגל ללא טיפול מקדים בהזרקה תוך-תעלתית. חולדות בקבוצות ה-NS, PPF, DMSO ו-U0126 קיבלו מתן תוך-תעלתי של החומרים המתאימים 30 דקות לפני החתך בכף הרגל. קבוצת ה-NS שימשה כביקורת לנשא (vehicle control) עבור PPF, בעוד שקבוצת ה-DMSO שימשה כביקורת לנשא עבור U0126.

מינונים של propentofylline ו-U0126

פרופנטופילין (Propentofylline) הוא מודולטור גליאלי, ומינון של 10 µg נבחר מכיוון שהביא להקלה על היפראלגזיה חריפה במחקרים קודמים של קבוצת המחקר. U0126 הוא מעכב MEK1/2 שאינו תחרותי ל-adenosine triphosphate המשמש לחסימת פוספורילציה של ERK1/2. מינונים תוך-תעלתיות (intrathecal) יעילים של 1–10 µg דווחו במודלים שונים של כאב30,31,32; במחקר הנוכחי נעשה שימוש במינון של 10 µg. U0126 הומס ב-10% dimethyl sulfoxide, בעוד ש-PPF הומס בתמיסת סלין נורמלית 0.9%. הריכוזים הסופיים היו 1 µg/µL. התרופות והנשאים הוכנו לפני הניתוח, נשמרו ב-4 °C ושימשו בתוך 12 h.

השפעת מתן תוך-תעלתי (intrathecal) של propentofylline או U0126 לפני הניתוח על היפראלגזיה

שש חולדות מכל קבוצה נבחרו באופן אקראי למדידה התנהגותית 24 h לפני הניתוח, וערכי ה-PWMTs וה-PWTLs שהתקבלו הוגדרו כקו בסיס. הזרקות תוך-תעלתיות (Intrathecal) בוצעו 30 min לפני הניתוח. כדי להעריך את השפעותיהם של מתן PPF ו-U0126 באופן תוך-תעלתי לפני הניתוח על היפראלגזיה מכנית ותרמית, נמדדו PWMT ו-PWTL בנקודות זמן של 2 h, 4 h, 8 h, 24 h ו-72 h לאחר החתך.

מערך ניסויי להערכת ההשפעות של מתן אינטרטקלי פרה-אופרטיבי של propentofylline או U0126 על ביטוי סמנים עצביים וגליאליים בעמוד השדרה לאחר חתך

כדי לקבוע את נקודת הזמן המתאימה לאחר החתך להערכת השפעת הטיפול, בוצע תחילה ניתוח מהלך זמן מקדימה בקבוצת ה-IP. באופן ספציפי, חוללים חוללים בקבוצת ה-IP בנקודות זמן של 2 h, 4 h, 24 h ו-72 h לאחר החתך, ורמות הביטוי של סממני התאים NeuN, GFAP ו-Iba-1 בחוט השדרה נמדדו באמצעות Western blot (n = 3 לכל נקודת זמן). על בסיס ניתוח מקדימה זה, נבחרו 4 השעות הראשונות לאחר החתך כחלון תצפית מוקדם לאחר החתך, מכיוון שביטוי NeuN הגיע לרמתו הגבוהה ביותר בנקודת הזמן של 4 h ומכיוון ששינויים מולקולריים מוקדמים נחשבו לרלוונטיים ביותר להתפתחות הראשונית של היפראלגזיה לאחר חתך. עם זאת, נקודת הזמן של 4 h לא נועדה לייצג את כל השינויים המולקולריים הזמניים לאחר החתך.

בנקודת זמן נבחרת זו, חוללים חוללים עוקבים שקיבלו הזרקה תוך-תעלתית (intrathecal) לצורך אנליזת Western blot של סמני תאים שונים (נא ספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם. = 3 לקבוצה) והערכת אימונופלורסצנציה של המורפולוגיה של סוגי תאים שונים (נ = 3 לקבוצה). בקבוצת הביקורת, חוללים חוללים באופן אקראי כדי לקבוע את רמות הביטוי הבסיסיות של סממני תא שונים (NeuN, GFAP ו-Iba-1) בחוט השדרה באמצעות Western blot (נּ = 3) ואת המורפולוגיה של תאים שונים (נוירונים, אסטרוציטים ומיקרוגליה) באמצעות אימונופלורסנציה (נ"ש = 3). לפיכך, קבוצת הביקורת הריקה שימשה כביקורת בסיס ללא חתך וללא טיפול.

השפעות הטיפול על p-ERK1/2 שדרכי ועל מתווכי דלקת

כדי לקבוע את נקודת הזמן המתאימה לאחר החיתוך להערכת השפעות הטיפול על ביטוי p-ERK1/2 ועל רמות של ציטוקינים דלקתיים, בוצע תחילה ניתוח מהלך זמן ראשוני בקבוצת ה-IP. באופן ספציפי, חוללים חוללים בקבוצת ה-IP בנקודות זמן של 2 h, 4 h, 24 h ו-72 h לאחר החיתוך, וביטוי p-ERK1/2 בעמוד השדרה נמדד באמצעות Western blot (n = 3 לכל נקודת זמן). על בסיס ניסוי מהלך זמן זה, יחד עם נקודת הזמן שבה ביטוי NeuN היה הגבוה ביותר לאחר החיתוך, נבחרה נקודת הזמן 4 h לאחר החיתוך כנקודת הזמן הקבועה להערכה הבאה של השפעות של PPF או U0126 שניתנו תוך-טתיקה (intrathecally) לפני הניתוח על ביטוי p-ERK1/2 בעמוד השדרה ועל ציטוקינים דלקתיים. נקודת זמן זו נבחרה כחלון תצפית מכניסטי מוקדם ולא כייצוג מקיף של כל השינויים הזמניים לאחר החיתוך.

בנקודת זמן נבחרת זו, חוללים חוללים שקיבלו הזרקה תוך-תעלתית (intrathecal) לצורך ניתוח Western blot של ביטוי p-ERK1/2 (n = 3 לקבוצה) והערכה של ציטוקינים דלקתיים באמצעות אימונופלואורסצנציה (n = 3 לקבוצה). בקבוצת הביקורת הריקה (blank), חוללים הוקרבו באופן אקראי כדי לקבוע את רמות הביטוי הבסיסיות של p-ERK1/2 בחוט השדרה באמצעות Western blot (n = 3) ושל ציטוקינים דלקתיים (TNF-α ו-COX-2) באמצעות אימונופלואורסצנציה (n = 3). כך, קבוצת הביקורת הריקה שימשה כביקורת בסיס ללא חתך וללא טיפול.

מיקום תאי של p-ERK1/2 שוכשך בנוירונים, אסטרוציטים ומיקרוגליה

כדי להעריך באופן מעמיק יותר את ההתפלגות התאית של p-ERK1/2 בעמוד השדרה לאחר החתך, בוצע צביעת אימונופלורסצנציה בקבוצות Blank ו-IP ב-4 h לאחר החתך (n = 3).

ניתוח סטטיסטי

הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. גודל המדגם נקבע בהסתמך על מחקרים קודמים של קבוצת המחקר וניסויי מקדמים. נתונים התנהגותיים נותחו באמצעות ניתוח שונות (ANOVA) דו-כיווני למדידות חוזרות, כאשר הקבוצה שימשה כגורם בין-נבדקי והזמן כגורם תוך-נבדקי. נתוני Western blot של מהלך הזמן הוערכו באמצעות ANOVA חד-כיווני, ולאחריו השוואות זוגיות בתיקון בונפרוני (Bonferroni). נתוני Western blot ואימונופלורסצנציה בנקודות זמן קבועות הוערכו באמצעות ANOVA חד-כיווני עם השוואות מתוכננות בתיקון בונפרוני; השוואות בין שתי קבוצות הוערכו באמצעות מבחן t של Student. נורמליות והומוגניות של השונות נבחנו באמצעות מבחני Shapiro–Wilk ו-Levene, בהתאמה. מבחן דו-זנבי pערך-p < ערך של 0.05 נחשב למשמעותי. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת הניתוח הסטטיסטי המפורטת ב- טבלת חומריםעבור ה במבחנה בניסויי אסטרוציטים, ניסויי תרבית עצמאיים נחשבו כיחידת הניתוח; דנסיטומטריה של Western blot וריכוזי ציטוקינים הושוו באמצעות ANOVA חד-כיווני, ולאחריו השוואות מתוכננות בתיקון בונפרוני (Bonferroni) או מבחן Student's מבחן t להשוואות קבועתיים שנקבעו מראש, לפי הצורך.

זמינות נתונים:

נתונים התומכים בממצאי מחקר זה מסופקים בקובץ משלים 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השפעות החתך והמתן תוך-תעלתית (intrathecal) של propentofylline או U0126 לפני הניתוח על היפראלגזיה לאחר החתך

היפרלגזיה מכנית

לא נמצאו הבדלים מובהקים ב-PWMTs בין שש הקבוצות 24 שעות לפני הניתוח (p > 0.05; Figure 1A,B). בקבוצת ה-IP, ה-PWMT ירד לאחר החתך ונשאר נמוך באופן מובהק מהקו הבסיס מ-2 עד 72 שעות לאחר החתך (p < 0.05 לעומת קו הבסיס; Figure 1A...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

רוב המטופלים סובלים מכאב אקוטי לאחר ניתוח, לא רק מבחינה גופנית אלא לעיתים אף מבחינה נפשית33, אך עדיין רבים מהמנגנונים המפורטים של כאב פוסט-אופרטיבי אקוטי אינם ידועים. לצד ההשפעות העוצמתיות של תרופות משככות כאבים מגיעות תופעות הלוואי הבלתי נמנעות שלהן, מה שהופך את חקרם של משככי כאבים בטוחים ואפקטיביים לחשיבות קריטית. מחקר זה התבסס על מודל חריתה בחולדות, אשר תוקף בעבר, לסימולציה של כאב פוסט-אופרטיבי אקוטי שהיה פשוט וניתן ליישום להכנה27. המחקר הנוכחי העריך שינויים בסממנים נויר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים אישיים, פיננסיים, מסחריים או אקדמיים.

תודות

המחברים מודים ל-Haijiao Zhou ול-Ming Wang על התמיכה הטכנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בופר PBS בריכוז 0.01 MSolarbioP1020
בופר Tris-HCl בריכוז 1.0 M (pH 6.8)SolarbioT1020
בופר Tris-HCl בריכוז 1.5 M (pH 8.8)SolarbioT1010
10% סודיום דודציל סולפט (SDS)SolarbioS1010
10× תמיסת מלאי TBSTSolarbioT1081
30% אקרילאמידSolarbioA1010
4× בופר טעינת חלבוןSolarbioP1041
Adobe PhotoshopAdobe—
אמוניום פרסולפטSolarbioA1030
מכונה אוטומטית לייצור קרח קשקשיםצ'אנגשו שוּקֶה (Changshu Xueke)IMS-40
אלבמין סרום בקר (BSA)SolarbioA8020
קריוסטט CM150LeicaCM150
מד pH דיגיטלי—PHS-3C
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)SolarbioD8371
מאזניים אנליטיים אלקטרונייםסני—
ריאגנט לכימילומינצנציה מוגברת (ECL)SolarbioPE0010
סרטוןKodak—
מיקרוסקופ פלואורסצנציה DP71OlympusDP71
תווך שיכון לסריקי קיפאוןסאקורה4583
מכשיר אלקטרופורזה של ג'לBIO-RAD—
גליצרולSolarbioIG0910
גליציןSolarbioG8200
נוגדן שני עז נגד עכבר Alexa Fluor 594ProteintechSA00013-3
נוגדן משני עיזים נגד עכבר המצומד ל-horseradish peroxidaseZSGB-BIOZB2305
נוגדן משני Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488ProteintechSA00013-2
נוגדן שני עז נגד ארנב המצומד לhorseradish peroxidaseZSGB-BIOZB2301
סרום עיזיםSolarbioSL038
GraphPad Prismתוכנת GraphPad5
צנטריפוגה מקוררת במהירות גבוהה 3K15סיגמא3K15
מנער אורביטלי אופקי TS-1000היימן קילינביירTS-1000
ImageJNational Institutes of Health1.51j8
מתנולTianjin Guangfu—
נוגדן ראשוני עכברי נגד GAPDH של חולדהProteintech60004-1-Ig
נוגדן ראשוני עכברי נגד p-ERK1/2 של חולדהCST9101S
Na2HPO3Tianjin Beichen Fangzheng—
NaH2PO3Tianjin Damao—
פראפורמאלדהידBiosharpBL539A
זכוכיות מיקרוסקופ בדרגת פתולוגיהשיטאי—
פנילמתנסולפוניל פלואוריד (PMSF)BeyotimeST506
בדיקת כף הרגל (Plantar Test) 37370אוגו באסילה37370
ממברנת פוליוינילידן פלואורידSolarbio—
פרופנטופילין (PPF)TaosuT19812
נוגדן ראשוני ארנב נגד COX-2 של חולדהAbcamAb179800
נוגדן ראשוני ארנב נגד GFAP של חולדהProteintech16825-1-AP
נוגדן ראשוני ארנב נגד Iba-1 של חולדה (anti-rat)Proteintech10904-1-AP
נוגדן ראשוני ארנב נגד NeuN של חולדהAbcamAb279297
נוגדן ראשוני ארנב נגד t-ERK1/2 של חולדהProteintech11257-1-AP
נוגדן ארנב נגד TNF- של חולדהα נוגדן ראשוניProteintech29652-1-AP
בופר ליזיס RIPASolarbioR0010
SDSSolarbioS8010
אבקת חלב דל שומןSolarbioD8340
SPSSIBM22
טטרהמתילאתילנדיאמין (TEMED)SolarbioT8090
TrisSolarbioT8060
Triton X-100SolarbioT8200
U0126-EtOHSelleckS1102
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחדHaier—
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחדSanyo—
מערכת לטיהור מים אולטרה-טהוריםHeal Force—
סיבי von FreyNorth Coast Medical—

מקורות

  1. Bateman C. Pain management—the global sound of silence. S Afr Med J. 2015;105:621-3.
  2. Pogatzki-Zahn EM, Segelcke D, Schug SA. Postoperative pain—from mechanisms to treatment. Pain Rep. 2017;2:e588.
  3. Kaiser U, Kopkow C, Deckert S, Neustadt K, Jacobi L, Cameron P, et al. Validation and application of a core set of patient-relevant outcome domains to assess the effectiveness of multimodal pain therapy (VAPAIN): a study protocol. BMJ Open. 2015;5:e008146.
  4. Tawfik VL, Nutile-McMenemy N, Lacroix-Fralish ML, DeLeo JA. Efficacy of propentofylline, a glial modulating agent, on existing mechanical allodynia following peripheral nerve injury. Brain Behav Immun. 2007;21:238-46.
  5. Wu F, Li H, Sun J, Li X, Jiang W, Huang Y, et al. Inhibition of GAP-43 by propentofylline in a rat model of neuropathic pain. Int J Clin Exp Pathol. 2013;6:1516-22.
  6. Norsted Gregory E, Codeluppi S, Gregory JA, Steinauer J, Svensson CI. Pentoxifylline and propentofylline prevent proliferation and activation of the mammalian target of rapamycin and mitogen-activated protein kinase in cultured spinal astrocytes. J Neurosci Res. 2013;91:300-12.
  7. Ji RR, Chamessian A, Zhang YQ. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 2016;354:572-7.
  8. Grace PM, Hutchinson MR, Maier SF, Watkins LR. Pathological pain and the neuroimmune interface. Nat Rev Immunol. 2014;14:217-31.
  9. Ji RR, Berta T, Nedergaard M. Glia and pain: is chronic pain a gliopathy? Pain. 2013;154 Suppl 1:S10-28.
  10. Chen G, Park CK, Xie RG, Ji RR. Connexin-43 induces chemokine release from spinal cord astrocytes to maintain late-phase neuropathic pain in mice. Brain. 2014;137:2193-209.
  11. Liu Y, Hou B, Zhang W, Wang D, Wang H, Yu G, et al. The activation of spinal astrocytes contributes to preoperative anxiety-induced persistent postoperative pain in a rat model of incisional pain. Eur J Pain. 2015;19(5):733-40.
  12. Obata H, Eisenach JC, Hussain H, Bynum T, Vincler M. Spinal glial activation contributes to postoperative mechanical hypersensitivity in the rat. J Pain. 2006;7:816-22.
  13. Masaki E, Mizuta K, Ohtani N, Kido K. Early postoperative nociceptive threshold and production of brain-derived neurotrophic factor induced by plantar incision are not influenced by minocycline in a rat: role of spinal microglia. Neurosignals. 2016;24:15-24.
  14. Cargnello M, Roux PP. Activation and function of the MAPKs and their substrates, the MAPK-activated protein kinases. Microbiol Mol Biol Rev. 2011;75:50-83.
  15. Roskoski R Jr. ERK1/2 MAP kinases: structure, function, and regulation. Pharmacol Res. 2012;66:105-43.
  16. Berta T, Liu YC, Xu ZZ, Ji RR. Tissue plasminogen activator contributes to morphine tolerance and induces mechanical allodynia via astrocytic IL-1β and ERK signaling in the spinal cord of mice. Neuroscience. 2013;247:376-85.
  17. Bi RY, Meng Z, Zhang P, Wang XD, Ding YQ, Gan YH, et al. Involvement of trigeminal ganglionic Nav1.7 in hyperalgesia of inflamed temporomandibular joint is dependent on ERK1/2 phosphorylation of glial cells in rats. Eur J Pain. 2013;17(7):983-94.
  18. Mikuzuki L, Saito H, Katagiri A, Okada S, Kubo A, Suzuki T, et al. Phenotypic change in trigeminal ganglion neurons associated with satellite cell activation via extracellular signal-regulated kinase phosphorylation is involved in lingual neuropathic pain. Eur J Neurosci. 2017;46:2190-202.
  19. Song Z, Xie W, Chen S, Strong JA, Print MS, Wang JI, et al. STAT1 as a downstream mediator of ERK signaling contributes to bone cancer pain by regulating MHC II expression in spinal microglia. Brain Behav Immun. 2017;60:161-73.
  20. Duncia JV, Santella JB III, Higley CA, Pitts WJ, Wityak J, Frietze WE, et al. MEK inhibitors: the chemistry and biological activity of U0126, its analogs, and cyclization products. Bioorg Med Chem Lett. 1998;8:2839-44.
  21. Ji RR, Gereau RW IV, Malcangio M, Strichartz GR. MAP kinase and pain. Brain Res Rev. 2009;60:135-48.
  22. Li F, Zhang H, Ma X, Zhang X, Wang Y, Zhang J, et al. Annexin A10 contributes to chronic constrictive injury-induced pain through activating ERK1/2 signalling in rats. Int J Neurosci. 2018;128(2):125-32.
  23. Qiu Q, Chai S, Jiang Z, Zhang Y, Liu X, Li M, et al. Propofol produces preventive analgesia via GluN2B-containing NMDA receptor ERK1/2 signaling pathway in a rat model of inflammatory pain. Mol Pain. 2017;13:1744806917737462.
  24. van den Heuvel I, Reichl S, Segelcke D, Zahn PK, Pogatzki-Zahn EM. Selective prevention of mechanical hyperalgesia after incision by spinal ERK1/2 inhibition. Eur J Pain. 2015;19(2):225-35.
  25. Zhang YB, Guo Y, Li H, Wang LN. Gabapentin effects on PKC-ERK1/2 signaling in the spinal cord of rats with formalin-induced visceral inflammatory pain. PLoS One. 2015;10:e0141142.
  26. Zimmermann M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 1983;16:109-10.
  27. Brennan TJ, Vandermeulen EP, Gebhart GF. Characterization of a rat model of incisional pain. Pain. 1996;64:493-9.
  28. Dixon WJ. Efficient analysis of experimental observations. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1980;20:441-62.
  29. Hargreaves K, Dubner R, Brown F, Flores C, Joris J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 1988;32:77-88.
  30. Hao J, Chen H, Madigan MC, Coote JH, Zhang Y, Xu XJ, et al. Roles of peripheral mitogen-activated protein kinases in melittin-induced nociception and hyperalgesia. Neuroscience. 2008;152:1067-75.
  31. Wang LN, Yao M, Yang JP, Peng J, Peng Y, Li CF, et al. Cancer-induced bone pain sequentially activates the ERK/MAPK pathway in different cell types in the rat spinal cord. Mol Pain. 2011;7:48.
  32. Yang F, Sun W, Yang Y, Wang Y, Li CL, Fu H, et al. SDF1-CXCR4 signaling contributes to persistent pain and hypersensitivity via regulating excitability of primary nociceptive neurons: involvement of ERK-dependent Nav1.8 up-regulation. J Neuroinflammation. 2015;12:219.
  33. Apfelbaum JL, Chen C, Mehta SS, Gan TJ. Postoperative pain experience: results from a national survey suggest postoperative pain continues to be undertreated. Anesth Analg. 2003;97:534-40.
  34. Latremoliere A, Woolf CJ. Central sensitization: a generator of pain hypersensitivity by central neural plasticity. J Pain. 2009;10:895-926.
  35. Zhuang ZY, Gerner P, Woolf CJ, Ji RR. ERK is sequentially activated in neurons, microglia, and astrocytes by spinal nerve ligation and contributes to mechanical allodynia in this neuropathic pain model. Pain. 2005;114:149-59.
  36. Marchand F, Perretti M, McMahon SB. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 2005;6:521-32.
  37. Bath PM, Bath-Hextall FJ. Pentoxifylline, propentofylline and pentifylline for acute ischemic stroke. Cochrane Database Syst Rev. 2004;3:CD000162.
  38. Cui XY, Chen Y, Chen J, Ma ZL, Zhao YL, Li YQ, et al. Differential activation of p38 and extracellular signal-regulated kinase in spinal cord in a model of bee venom-induced inflammation and hyperalgesia. Mol Pain. 2008;4:17.
  39. Ji RR. ERK MAP kinase activation in superficial spinal cord neurons induces prodynorphin and NK-1 upregulation and contributes to persistent inflammatory pain hypersensitivity. J Neurosci. 2002;22:478-85.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PropentofyllineWestern Blotting
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.