מאמר שיטה

זיהוי היסטונים שעברו שינוי כסבסטרטים קשירים של בני משפחת הספינדלין האנושיים 4 (SPIN4) באמצעות מערכי פפטידים ומשיכת נוקלאוזום טבעית

DOI:

10.3791/70934

⸱

27 במרץ 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cellular and Molecular Pathogenesis, Department of Pathology, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 2Center for Precision Medicine and Genomics Research, Children's National Research Institute, 3Department of Endocrinology, Children's National Hospital, 4Department of Pediatrics, George Washington University School of Medicine and Health Sciences, 5Massey Comprehensive Cancer Center, Virginia Commonwealth University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וריאנטים גנטיים בבני אדם מסוג ספינדלין ממשפחת 4 (SPIN4) זוהו לאחרונה אצל חולים עם עודף התפתחות עצם, הפרעה התפתחותית חדשה. מוצגים פרוטוקול ותוצאות חדשות המתארות את הזיהוי הביוכימי של היסטונים מותאמים בהקשר של נוקלאוזומים כסובסטרטים של קישור SPIN4.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חבר משפחת ספינדלין האנושי 4 (SPIN4) הופיע זה עתה כגורם חדש לגידול העצם. זוהו וריאנטים של אובדן תפקוד ב-SPIN4 אצל מטופלים שהפגינו תסמונת גדילה מופרזת לפני ואחרי הלידה, אשר מועברת באופן דומיננטי המקושר ל-X. SPIN4 מכיל שלושה חזרות טנדם של תחומי טיודור, שכל אחד מהם יוצר כלוב ארומטי נפרד. תחומי טיודור אלו נחשבים לדומייני קריאה אפיגנטיים עבור שאריות ארגינין וליזין מתילציה של היסטונים בהתבסס על הומולוגיית רצף. עם זאת, המצעדים המדויקים של SPIN4 אינם ברורים. ה-SPIN4 האנושי, הן בצורת הצורה הפראית והן המוטנטית הגורמת למחלות, נוצר בהצלחה באמצעות מערכת ביטוי תאי חרקים. באמצעות מערך פפטידים של שינוי היסטונים, נקבעו זיקות קשירה דיפרנציאליות בין SPIN4 מסוג פראי למוטנטי. אימות פונקציונלי הראה עוד כי SPIN4 הוא קורא אמיתי של מתילציה של היסטון H3 ליזין 4 (H3K4me), כפי שניתן לראות במשיכה ביוכימית של מונונוקלאוזומים מקומיים. גישה משולבת זו מאפשרת זיהוי מהיר של יעדי קישור של חלבוני קורא אפיגנטיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חבר משפחת ספינדלין 4 (SPIN4) הוא קורא אפיגנטי ולאחרונה נחשב למעורב בתסמונת צמיחת יתר, עם קונסטלציה של גדילה מופרזת לפני ואחרי הלידה וגובה 1,2. עכברי Spin4 knockout (KO) סיכם את הפנוטיפ האנושי המדויק, ותמך בסיבתיות. עד כה, SPIN4 הוא הקורא האפיגנטי הבלעדי היחיד שזוהה שמווסת באופן שלילי את צמיחת העצם. עם זאת, התכונות הביוכימיות של SPIN4, קורא אפיגנטי קריטי לצמיחה, לא אופוינו, מה שיוצר פער ידע קריטי בהבנת המנגנונים הבסיסיים הגורמים למחלות בהפרעה ההתפתחותית החדשה הזו. SPIN4 מכיל שלושה חזרות טנדם של דומיינים טיודוריים, אשר נחשבים בדרך כלל לתחומי חלבון קורא היסטון מתילציה או ליזין3. וריאנט SPIN4D82H missense זוהה לאחרונה אצל מטופל עם תסמונת צמיחת יתר עצם לפני הלידה ואחריה. מוטציה זו משפיעה על תחום הטיודור הראשון של SPIN4; עם זאת, הסובסטרטים הרלוונטיים של תחומי טיודור אלו אינם ברורים, מה שמגביל את הדיסקציה הפונקציונלית של ויסות הכרומטין והביטוי הגנטי התלוי ב-SPIN4 במהלך התפתחות העצם.

זיהוי סובסטרטים חדשים לקשירת היסטונים בדומיינים של חלבוני קורא אינו תלוי בגישה אחת וסטנדרטית. שינויים פוסט-תרגומיים (PTMs) של היסטונים מתרחשים בעיקר בזנבות ההיסטונים הבולטים החוצה מחלקיקי הליבה של הנוקלאוזומים. הזיהוי של PTMs על זנבות היסטונים על ידי תחומי חלבון קורא משתנה מאוד ולעיתים דורש אינטראקציות אלקטרוסטטיות רב-ערכיות הכוללות DNA נוקלאוזומלי, DNA מקשר ו/או תחומי היסטונים אחרים כדי לייצב יחד את האינטראקציה בין הקורא למטרה4. כיום, PTMs של פפטידי זנב היסטונים נבנו בצורת מיקרו-מערכים והופצו על ידי מספר ספקים5. בעוד שסקר PTM מבוסס פפטיד זנב היסטוני עבור מטרות קישור של תחומי חלבון קורא הוא בעל תפוקה גבוהה, לעיתים קרובות הוא מניב פגיעות חיוביות שגויות בהיעדר נוקלאוזומים. יתרה מזאת, תנאי הניסוי למסכים כאלה הם אמפיריים מאוד ומשתנים מחלבון לחלבון, מה שמקשה טכנית על טיפול בהם. סינון PTM מבוסס נוקלאוזום סינתטי מספק קריאה חזקה בהרבה, אך הוא יקר יותר ובעל תפוקה נמוכה יותר, שכן שיקום נוקלאוזומים הנושאים שילובים משתנים של PTMs הוא מאתגר מטבעו.

פרוטוקול זה מתאר גישה מהירה לזיהוי PTMs היסטונים בנוקלאוזומים כמטרות קישור ל-SPIN4. SPIN4 הרקומביננטי עבר שיקום וסונן מול מערך פפטידים PTM היסטוני מסחרי כדי לזהות מטרות קישור פוטנציאליות. מונו-נוקלאוזומים מקומיים המכילים PTMs היסטונים אנדוגניים שונים נוצרו לאחר מכן מתאים חיים. משיכת SPIN4 של מונוקלאוזומים אפשרה אימות ממוקד מבוסס נוגדנים של PTMs היסטונים לאחר הסקר הראשוני. אסטרטגיה ביוכימית משולבת זו מדגימה גישה של הוכחת עקרון לגילוי מטרות חסכוניות בזמן ובעלות, וניתן ליישם אותה בקלות לזיהוי תת-קרקעי קישור של חלבוני קורא אפיגנטיים אחרים שמאופיינים בצורה לקויה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הניסיוניים שכללו תאים HEK293FT בוצעו בהתאם להנחיות ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית (IBC) של אוניברסיטת וירג'יניה קומונוולת'.

1. טיהור SPIN4 האנושי רקומביננטי

  1. שכפול SPIN4 או SPIN4D82H באורך מלא עם תג אפיטופ FLAG בקצה N 1× לתוך וקטור באקולו-ויראלי 6,7.
  2. הכנת בקולווירוס על ידי העברת תאי Sf9 עם וקטורים בקולו-ויראליים, איסוף וירוסים כאשר התאים מתפוצצים, העלות, ואחסן את הווירוס בטמפרטורה של −80°C 6,7.
  3. בבקבוק Erlenmeyer בנפח 500 מ"ל, הוסיפו 100 מ"ל מדיום גידול, 1.5 ×-108 תאי Sf9, ו-1 מ"ל P1 בקלו-וירוס.
  4. דגרו את התרבית בטמפרטורה של 27.5 מעלות צלזיוס בדגמת שייקר אורביטלית שמכוונת ל-125 סל"ד למשך 72 שעות בחושך.
  5. מטהר FLAG-SPIN4 באמצעות ג'ל זיקה FLAG בבופר ליזיס BC150 המכיל מעכבי פרוטאז ומשחרר את החלבון באמצעות 1× פפטיד FLAG ב-0.1 מ"ג/מ"ל.
  6. כדי להסיר לחלוטין את פפטיד 1× FLAG, דיאליז הוציא את FLAG-SPIN4 נגד בופר אחסון חלבון BC150 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בסדר הבא:
    1. דיאליזה ראשונה: 1 ליטר, 1 שעה.
    2. דיאליזה שנייה: 2 ליטר, בלילה.
    3. דיאליזה שלישית: 1 ליטר, 1 שעה.
  7. רכז את החלבון המפורט לנפח הרצוי (עבור SPIN4, מ-600 מיקרוליטר עד 150 מיקרוליטר).
  8. קבעו את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונינית (BCA), וחישבו את הריכוז המולרי בהתאם.
  9. כמות החלבון הגולמי שנאספה בכל שלב טיהור והתפוקה המשוערת המתאימה מסוכמים בטבלה המשלימה 1. הטיהור בוצע מ-250 מ"ל של תרבית Sf9 באמצעות 400 מיקרוליטר של תערובת ג'ל אנטי-FLAG.
  10. דילל SPIN4 מרוכז ב-10× בבופר אחסון חלבון BC150 (טבלה משלימה 2). טעינו 1, 2, 5, 10 ו-20 מיקרוליטר על ג'ל SDS–PAGE של 15% והמחישו באמצעות צביעת קומאסי כחולה (איור 1A).
  11. כימות עוצמת התחום באמצעות תוכנת ניתוח תמונה לקביעת עוצמת האות היחסית בין נתיבים עם נפחים שווים.
  12. חלק את יחס העוצמה במשקל המולקולרי של כל חלבון כדי לקבל את היחס המולרי.
  13. השתמשו ביחס מולרי זה כדי לתקן את הריכוז המולרי שהוערך בשלב 1.8.
  14. חלבון מטוהר באליקווט, מקפיא במהירות בחנקן נוזלי, ואחסן בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס. לשימוש קצר טווח, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה לפני שממשיכים לניסוי הבא.

2. מערך פפטידי היסטון

  1. הכינו בופר חסימת מערך פפטידים על ידי המסה של 5 גרם אלבומין סרום בקר (BSA) בבופר אחסון חלבונים BC150 לנפח סופי של 100 מ"ל.
  2. באופן אופציונלי, יש לתאר את אזור התגובה במערך הפפטידים באמצעות עט סימון הידרופובי כדי למזער את צריכת המגבים.
  3. הנח כמה דפי נייר סינון בצלחת פטרי בגודל 15 ס"מ והרטיב אותם במים.
  4. מקם את מערכי הפפטידים על ניירות הסינון הלחים.
  5. הוסיפו בזהירות בופר חסימה של 300 מיקרוליטר כדי לכסות כל אזור מערך לחלוטין.
  6. כסו את צלחת הפטרי ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 1–3 שעות.
  7. הכינו את FLAG-SPIN4 בבופר חסימה לריכוז סופי של 1 מיקרומטר.
  8. הכינו 1× פפטיד FLAG בבופר חסימה לריכוז סופי של 1 מיקרומון.
  9. כדי לשפר את יחס האות לרעש ולהפחית רקע לא רצוי, בצע את השלבים הבאים בחדר קר. העבר את המערכים החסומים (עם צלחת הפטרי) לחדר הקר לפני הוספת חלבונים.
  10. הסר מיתר חוסם מהמערכים.
  11. הוסף בזהירות את חלבון FLAG-SPIN4 או פפטיד FLAG הרצוי כבקרה לכל בלוק.
  12. כסו את צלחת הפטרי ודגרו את הלילה בחדר הקר.
  13. הוסיפו כ-50 מ"ל בופר שטיפה של מערך פפטידי לקופסת כביסה של Western Blot והביאו אותו לחדר הקר.
  14. להשליך את תמיסת החלבון ולהעביר מיד את המערכים לבופר השטיפה, צד התגובה כלפי מעלה.
  15. שטוף את המערכים חמש פעמים כך: שתי השטיפות הראשונות דקה אחת כל אחת, ושלוש השטיפות הנותרות 5 דקות כל אחת.
  16. שטוף את המערכים עם בופר חוסם של מערך פפטידים כדי להסיר שאריות אבקה, ואז החזיר אותם לצלחת פטרי.
  17. הכינו תמיסת נוגדנים נגד FLAG בדילול של 1:2000 והוספו 300 מיקרוליטר לכל בלוק.
  18. דגרו בטמפרטורת החדר במשך שעה.
  19. חזור על שלבים 2.14 עד 2.16 כדי לשטוף את המערכים.
  20. הכינו תמיסת IgG (נוגדן משני) אנטי-עכבר עם HRP ב-1:6000 ודילול של 1:6000 והוסיפו 300 מיקרוליטר לכל בלוק.
  21. דגרו בטמפרטורת החדר במשך שעה.
  22. חזור על שלבים 2.14 עד 2.16 כדי לשטוף את המערכים.
  23. הניחו את המערכים בתוך מגן גיליונות שקוף.
  24. הוסף כ-1 מ"ל מצע כימילומינסנציה משופרת (ECL), כדי להבטיח כיסוי אחיד של פני השטח של התגובה.
  25. הסר בועות אוויר וצלם תמונות כימילומינסנטיות ושדה בהיר באמצעות מערכת הדמיה מתאימה (למשל, מצלמים דיגיטליים או סרטים אוטורדיוגרפיים) (איור 1B).
  26. ניתוח עוצמת האות לפי תוכנת מערך הפפטידים וכלים מקוונים נלווים (איור 2A–C).

3. ביטוי בקנה מידה גדול של FLAG-SPIN4 לבדיקת pulldown

  1. בבקבוק Erlenmeyer בנפח 500 מ"ל, הוסיפו 125 מ"ל ESF921 מדיום, 1.8 × 108 תאי Sf9, ו-1.2 מ"ל P1 בקלו-וירוס המבטא FLAG-SPIN4או FLAG-SPIN4 D82H.
  2. דגרו בטמפרטורה של 27.5 מעלות צלזיוס בדגמת שייקר אורביטלית (125 סל"ד) למשך 72 שעות.
  3. אליקווט את התרבות כך:
    1. 4 מ"ל תרבית לצינור של 15 מ"ל לצורך טיטרציה.
    2. 30 מ"ל תרבית לארבעה צינורות של 50 מ"ל.
  4. צנטריפוגה את הצינורות ב-600 × גרם למשך 15 דקות וזרוק את הסופרנטנט.
  5. הקפיאו את הכדורים בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

4. טיטרציה של יחס חרוזים-ליזאט עבור FLAG-SPIN4 ו-FLAG-SPIN4D82H

  1. הוסף 1 מ"ל בופר ליזיס BC150 לכל אחד מהכדורים של Sf9 מ-5 מ"ל תרבית Sf9 המתוארת בסעיף 3, שלב 3.1.
  2. סוניקציה את הליזאטים כדי להבטיח הפרעה מלאה: 30% משרעת, 5 שניות הפעלה/5 שניות כבויה, לזמן סוניקציה כולל של 15 שניות.
  3. צנטריפוגה ב-20,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות, והעברת הסופרנטנט לצינורות טריים של 1.5 מ"ל.
  4. הכינו 20 מיקרוליטר תערובת ג'ל אנטי-אפיניטי לכל תגובת משיכה למטה (60 מיקרוליטר ל-3 טיטרציות)
  5. שטוף את החרוזים עם בופר ליזיס BC150:
    1. הוסיפו 1 מ"ל בופר ליזיס BC150 ומערבולת לזמן קצר.
    2. צנטריפוגה ב-3,000 × גרם למשך דקה.
    3. שאפו והשליכו את הסופרנטנט.
  6. החזירו את החרוזים ל-40 מיקרוליטר בופר ליזיס BC150 עבור כל תגובת משיכה אחת (120 מיקרוליטר ל-3 טיטרציות).
  7. שלבו את הליזאט בצינורות של 1.5 מ"ל המכילות בופר ליזיס BC150, ותליית חרוזים (טבלה משלימה 3)
  8. דגרו את הצינורות על סיבוב צינורות על 15 סל"ד בטמפרטורה של 4°C למשך 1.5 שעה.
  9. צנטריפוגה ב-3,000 × גרם למשך דקה אחת ושאיפת הסופרנאנט.
  10. שטפו את החרוזים שלוש פעמים כדלקמן:
    1. החזיר את החרוזים לזמן קצר בבופר ולמערבולת של 500 מיקרוליטר BC150.
    2. צנטריפוגה ב-3,000 × גרם למשך דקה.
    3. שאפו את הסופרנטנט.
  11. החזירו את החרוזים בבופר Laemmli של 20 מיקרוליטר 1× ודגרו בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  12. צנטריפוגה ב-3,000 × גרם למשך דקה אחת.
  13. הרץ את הסופרנטנט על ג'ל SDS–PAGE של 15% וצביע עם Coomassie Blue כדי להעריך את תפוקת החלבון.
  14. בהתבסס על הנתונים, בחרו יחס ליזאט לחרוז שממלא את אתרי הקישור של הנוגדנים בחרוזים. בניסויים, ≥300 מיקרוליטר ליזאט לכל 20 מיקרוליטר חרוזים הספיקו להשגת קיבולת קישור מלאה.
    הערה: "רוויה של אתרי קישור נוגדנים" מוגדרת כנקודה שבה הגדלת נפח הליזאט כבר אינה מביאה לשיקום גבוה יותר של חלבון היעד.
    הערה: באותה מולריות, ל-SPIN4D82H יש זיקה נמוכה יותר לג'ל זיקה FLAG לעומת המקבילה הטבעית.
    הערה: במסגרת ניסויית זו, 1 מ"ל ליזאט נגזר מ-6 מיליון תאי Sf9 (מחושב כ-1.5 ×10 6 תאים/מ"ל × 4 מ"ל), מה שמעיד ש-SPIN4 המובע מ~6 מיליון תאי Sf9 מספיק לרוויה של 20 מיקרוליטר של תערובת ג'ל אנטי-FLAG אפיניטי.

5. הכנה רחבת היקף של ג'ל FLAG-SPIN4 עם זיקה אנטי-FLAG כפיתיון

  1. לכל חלבון שיבדוק, יש לאסוף שני כדורים מתרביות של 30 מ"ל. החזירו כל כדור לבופר ליזיס BC150 בנפח 6 מ"ל, העבירו לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, וכווננו את הנפח הכולל ל-13 מ"ל עם בופר ליזיס BC150.
  2. סוניקט כל דגימה על הקרח בעוצמה של 100%, 15 שניות הדלקה ו-30 שניות כבויה, לזמן סוניקציה כולל של 2 דקות.
  3. העבר את הליזטים לצינורות צנטריפוגות מהירים מקוררים מראש ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 20,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 15 דקות.
  4. הוסף 200 × (מספר דגימות + 1) × 1.1 מיקרוליטר של תערובת ג'ל אנטי-FLAG לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
  5. שטוף את החרוזים עם >5 עמודות (CV) של בופר ליזיס BC150 פעם אחת.
  6. החזירו את החרוזים ל-400 × (מספר דגימות + 1) × 1.1 מיקרוליטר של בופר ניתוק BC150.
  7. העבר את הסופרנטנטים שהושגו בשלב 4 לצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל.
  8. הוסף 500 מיקרוליטר של מתלה חרוזים מסוג Step 5.7 לכל צינור.
  9. בצינור אחד, יש להוסיף 3 מ"ל בופר ליזיס BC150 ו-60 מיקרוליטר של 1× FLAG פפטיד (100 מ"מ) כבקרה שלילית.
  10. דגרו את הדגימות על סיבוב צינורות על 120 סל"ד בטמפרטורה של 4°C למשך 1.5 שעה.
  11. צנטריפוגה ב-2,000 × גרם למשך 5 דקות וזרוק את הסופרנטנט.
  12. תלה מחדש את החרוזים בכמות מתאימה של סופרנטנט והעבר לצינורות של 1.5 מ"ל.
  13. צנטריפוגה ב-3,000 × גרם למשך דקה אחת ושאיפת הסופרנאנט.
  14. שטפו את החרוזים חמש פעמים עם בופר ליזיס BC150 כדלקמן:
    1. החזירו את החרוזים לתלייה במאגר ליזיס BC150 של 1 מ"ל.
    2. בשטיפות הרביעית והחמישית, הנח את הדגימות על סיבוב צינורות על 20 סל"ד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    3. צנטריפוגה ב-3,000 × גרם למשך דקה אחת ושאיפת הסופרנאנט.
  15. החזירו את החרוזים לתוך בופר ליזיס של 200 מיקרוליטר BC150.
  16. קחו 9 מיקרוליטר מהמתלה של החרוז/בופר ונתחו את תכולת החלבון ב-15% SDS–PAGE ואחריהם צביעת Coomassie כחולה.
  17. מכיוון שקלט החלבון עולה על קיבוצי הקישור של החרוזים, כמות החלבון הקשור לנפח החרוזים צריכה להיות דומה בין דגימות שונות. כימות חלקי של עוצמת הרצועה באמצעות ניתוח תמונות דיגיטלי והתאמת כמויות החרוזים לתגובות הבאות.

6. הכנת מונו-נוקלאוזומים מתאי HEK293FT

  1. גידול תאים HEK293FT בכלי תרבית רקמה בגודל 15 ס"מ עד כ-90% מפגש באמצעות 10% סרום בקר עוברי (FBS) במדיה DMEM בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5%CO2 .
  2. תאי HEK293FT מעבר מוקדם מתקבלים מסחרית ומאומתים באמצעות פרופיל STR.
    הערה: צלחת אחת בגודל 15 ס"מ מניבה ~27 מיליון תאים, שזה מספיק ל-1–2 תגובות משיכה למטה. לשש תגובות (כולל בקרות שליליות), הכינו לפחות שלוש מנות בגודל 15 ס"מ. אם שינוי פוסט-תרגומי (PTM) של ההיסטון היעד נדיר או לא יציב, הגדילו את מספר התאים 2–10× בהתאם.
  3. (אופציונלי) בהתאם לשינוי ההיסטונים הרלוונטי, הוסף מעכבי PTM מתאימים (טבלה משלימה 2) למדיום התרבית ודגר במשך 24 שעות.
    הערה: שלב זה עשוי להיות מושמט אם קיימים שפע של PTMs היסטונים.
  4. כאשר תאים מגיעים לכמעט 100% חיבור אחד, אספו אותם כך:
    1. שאפו את מדיום התרבות.
    2. שטוף תאים בעדינות עם 10 מ"ל PBS קר מאוד, ואז שאיף.
    3. הוסיפו 5 מ"ל PBS קר.
    4. גרד תאים על קרח והעבר לצינור של 50 מ"ל (כל הצלחות ניתנות לשלב).
    5. צנטריפוגה ב-13,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות.
    6. זרוק את הסופרנטנט.
  5. (אופציונלי) או להמשיך מיד או להקפיא את כדור התא לשימוש מאוחר יותר:
    1. העריך את נפח הכדור.
    2. החזירו ל-9× נפח כדורים של בופר G כדי להגיע לריכוז סופי של גליצרול של 20%.
    3. הקפיאו במהירות בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס.
  6. אם ממשיכים עם כדור קפוא, הפשיר את הכדור על קרח, צנטריפוגה בטמפרטורה של 1,300 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 5 דקות, וזרוק את הסופרנטנט.
  7. החזירו את הכדור (טרי או מופשל) בנפח 10× של בופר TMSD (40 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5, 5 מ"מ MgCl2, 250 מ"מ סוכרוז, 1 מ"מ DTT) המכילים מעכבי פרוטאז באמצעות פיפטה סרולוגית.
  8. הכינו 10% NP-40 בבופר TMSD טרי, והוסיפו 0.11× נפח תגובה כולל להשגת ריכוז סופי של ~1%.
  9. דגרו את המתלה על סיבוב צינורות על 120 סל"ד ב-4°C למשך 5 דקות.
  10. מערבבים 10 מיקרוליטר מהמתלה עם 10 מיקרוליטר טרייפן כחול, וצפו תחת מיקרוסקופ כדי לעקוב אחרי צביעת גרעינית. ודאו שהגרעינים מבודדים לחלוטין מהציטוזול (איור 3A).
  11. כאשר כ-95% מהגרעינים הם חיוביים בכחול טריפאן, ממשיכים לשלב הבא. לתאי HEK293FT, דגירה של 1% NP-40 למשך 5 דקות בדרך כלל מספיקה. לגבי סוגי תאים אחרים, יש לבדוק ולהתאים את זמן הדגירה.
  12. צנטריפוגה ב-1,300 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 5 דקות, והשליכו את הסופרנטנט.
  13. תלה את הכדור בנפח של 10× של בופר TMSD.
  14. חזור על שלבים 6.12 עד 6.13 חמש פעמים כדי להסיר לחלוטין את שארית NP-40.
  15. תלה את הכדור בנפח 5× של בופר B.
  16. הוסף יחידת נוקלאז מיקרוקוקלי (MNase) אחת לכל 10,000 גרעינים, ודגר באמבט מים בטמפרטורה של 37°C. לעיתים ערבבו את הצינור במהלך הדגירה כדי לשמור על הגרעינים תלויים באופן אחיד
  17. בנקודות הזמן המצוינות (0.5, 1 ו-2.5 שעות), משוך 50 מיקרוליטר מהתגובה לצינורות של 1.5 מ"ל, מוסיפים מיד 1 מיקרוליטר של 0.5 M EDTA-Na (pH 8.0), ומערבולת.
  18. חלצו DNA מכל נקודת זמן לפי ההליך הבא:
    1. הוסף 80 מיקרוליטר H₂O, 30 מיקרוליטר 10% SDS, ו-20 מיקרוליטר 5 מטר NaCl; מערבולת.
    2. הוסף 200 מיקרוליטר פנול/כלורופורם; מערבולת ביסודיות.
    3. צנטריפוגה ב-20,000 × גרם, RT, 3 דקות.
    4. העבר בזהירות את הסופרנטנט לצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל.
    5. הוסף 1 מ"ל 100% אתנול ו-20 מיקרוליטר 3 מ' נתרן אצטט (pH 5.2); מערבולת.
    6. צנטריפוגה ב-20,000 × גרם, RT, 5 דקות.
    7. הסר סופרנטנט, הוסיף 1 מ"ל 70% אתנול.
    8. צנטריפוגה ב-20,000 × גרם, RT, דקה אחת.
    9. הסר את הסופרנטנט וייבש את הכדור בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס עם הפקק פתוח למשך 10 דקות.
    10. החזירו את הכדור לתלות בבופר TE של 50 מיקרוליטר.
  19. הרץ דגימות על ג'ל אגרוז TBE 1% כדי לאשר את גודל ה-DNA המונוקלאוזומי (147 bp) (איור 3B).
  20. (אופציונלי) יעילות העיכול של נוקלאז מיקרוקוקלי (MNase) משתנה בין סוגי תאים, ניתן להוסיף MNase נוסף באמצע תגובה במידת הצורך כדי להסיר לחלוטין פולי-נוקלאוזומים. לדוגמה, אם דגימות של 1 h ו-2 h נראות דומות, הוסף עוד MNase ב-3 שעות.
  21. כאשר נצפים תחום דומיננטי ~147 bp, או כאשר MNase נוסף/דגירה מורחבת כבר לא משנה את גודל השבר, יש לעצור את התגובה על ידי הוספת 0.5 M EDTA-Na (pH8.0) לריכוז סופי של 2 mM.
  22. צנטריפוגה ב-1,300 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 5 דקות. אסוף את הסופרנטנט (S1).
  23. החזירו את הכדור בנפח של 10× כדוריות של מעכבי בופר TE + פרוטאז ודחפו את הדגימה על סיבוב צינור על 20 סל"ד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך לפחות 30 דקות.
    הערה: יעילות חילוץ מונו-נוקלאוזום משתנה בין סוגי תאים. NaCl של 0-300 mM ניתן לשמש להפקת נוקלאוזומים ביעילות.
  24. צנטריפוגה ב-1,300 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 5 דקות. אסוף את הסופרנטנט (S2).
  25. העבר 50 מיקרוליטר כל אחד מ-S1 ו-S2 לצינורות נפרדים בנפח 1.5 מ"ל.
  26. ניתחו את כל החלקים באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז (שלבים 6.17 עד 6.18) להערכת התפלגות גודל ה-DNA ויעילות החילוץ. רוב המונוקלאוזומים נמצאים בשבר S2 (איור 3C).
  27. העבר S2 לצינורות צנטריפוגה מהירים וסובב ב-20,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות להסרת חומר בלתי מסיס.
  28. אסוף את הסופרנטנט ודיאליז נגד בופר הליזה BC150 (ללא מעכבים):
    1. דיאליזה ראשונה: 1 ליטר, 1 שעה.
    2. דיאליזה שנייה: 2 ליטר, בלילה.
  29. לאחר הדיאליזה, יש צנטריפוגה שוב ב-20,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות להסרת שאריות בלתי מסיסות.
  30. אסוף את הסופרנטנט האחרון.
  31. מערבבים 5 מיקרוליטר מהסופרנטנט עם 35 מיקרוליטר בופר ליזיס BC150 ו-10 מיקרוליטר 5× בופר Laemmli, חממו ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, וטענו 1, 2, 5, 10 ו-20 מיקרוליטר על ג'ל SDS–PAGE של 15%.
  32. עומס 1, 2 ו-5 מיקרוליטר של 0.1 מ"ג/מ"ל BSA בבופר Laemmli כנקודת ייחוס להערכת תפוקה.
  33. צבע עם כחול קומאסי, והערכת תפוקת נוקלאוזום חצי-כמותית באמצעות תוכנת ניתוח תמונה (איור 3D).

7. משיכת נוקלאוזום מותאמת למטה

  1. הכינו 2× בופר חסימת חרוזים על ידי המסה של 1 גרם BSA בבופר ליזיס BC150 לנפח סופי של 10 מ"ל, ואז מערבולת עד להמסה מלאה.
  2. העבר חרוזי FLAG-SPIN4-WTו-FLAG-SPIN4 D82H המכילים כמויות מולריות שוות ערך של חלבון (מסעיף 5, שלבים 5.16 עד 5.17) לצינורות נפרדים בנפח 1.5 מ"ל.
  3. הוסף נפח שווה של חרוזי בקרה שליליים (מסעיף 5, שלב 10) לדגימת FLAG-SPIN4-WT.
  4. כוון את הנפח הכולל של כל דגימות החרוזים כך שיהיה זהה באמצעות בופר ליזיס BC150.
  5. הוסף נפח שווה של 2× בופר חוסם חרוזים לכל צינור המכיל חרוזים ובופ ליזיס BC150.
  6. דגרו את הדגימות על סיבוב צינור שמוגדר ל-20 סל"ד בטמפרטורה של 4°C במהלך הלילה (O/N).
  7. הפשיר כמות מתאימה של 1× נוקלאוזום שמופק מתאי HEK293FT על קרח. הנפח הנדרש תלוי ביחס המולרי הרצוי בין נוקלאוזום ל-SPIN4. לאופטימיזציה ראשונית, השתמשו ביחס מולרי של 1:1 בין נוקלאוזום ל-SPIN4.
  8. ערבב 1× נוקלאוזום בנפח שווה של 2× בופר חוסם חרוזים.
  9. שלבו את התערובת משלב 7.8 עם החרוזים החסומים מראש בצינור של 15 מ"ל.
  10. דגרו את התערובת על סיבוב צינורות על 20 סל"ד בטמפרטורה של 4°C למשך 4 שעות או כל הלילה.
  11. צנטריפוגה ב-3,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס, למשך 3 דקות.
  12. השליכו בזהירות את הסופרנטנט.
  13. החזירו את החרוזים לבופר ליזיס BC150 בנפח 1 מ"ל והעבירו לצינורות של 1.5 מ"ל.
  14. שטפו את החרוזים שלוש פעמים כדלקמן:
    1. צנטריפוגה ב-3,000 × גרם, דקה אחת, ושאיפת הסופרנאנט.
    2. החזירו את החרוזים לתלייה במאגר ליזיס BC150 של 1 מ"ל.
    3. מדי פעם ערבבו את הצינור כדי לשמור על החרוזים תלויים באופן שווה בזמן הכביסה.
  15. שטפו את החרוזים פעמיים נוספות כדלקמן:
    1. צנטריפוגה ב-3,000 × גרם, דקה אחת, ושאיפת הסופרנאנט.
    2. החזירו את החרוזים ל-1 מ"ל בופר ליזיס BC150.
    3. סובב ב-20 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות.
  16. לאחר הכביסה, תלויים מחדש את החרוזים בנפחים של 9 עמודות (CV) של בופר ליזיס BC150.
  17. קח 160 מיקרו-ליטר מכל דגימה, ערבב עם 40 מיקרוליטר 5× בופר Laemmli, וחמם ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    הערה: מומלץ לבצע שחרור פפטידי FLAG של קומפלקס חלבון-נוקלאוזום, שמניב תוצאות נקיות יותר עם רקע מועט יותר.
  18. צנטריפוגה ב-3,000 × גרם, בטמפרטורת החדר, למשך 5 דקות.
  19. טעין 5 מיקרוליטר מהסופרנטנט על ג'ל SDS–PAGE של 15% ובצע צביעת כסף (איור 4A).
  20. טעין עוד 5 מיקרולטר של הסופרנטנט על ג'ל SDS–PAGE של 15%, העבר לממברנת PVDF, ובודק את הנוגדנים הראשוניים והמשניים המתאימים ל-PTMs של ההיסטונים (איור 4B).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לחקור את תת-החומרים הקשורים של SPIN4 האנושי, SPIN4 מסוג פראי ומוטנט שמקורו בחולה הקשור לתסמונת צמיחת יתר שוחזרו באמצעות מערכת ביטוי תאי חרקים Sf9. באופן ספציפי, מדובר במוטציה של חומצה אספארטית (D) להיסטידין (H) שגויה בשארית 82 (D82H), שנמצאת בתחום הטיודור הראשון של SPIN4, מה שמרמז על תפקידה בוויסות קישור הסובסטרט של SPIN4. וקטור בקלו-ויראלי המקודד SPIN4 יחיד עם סימון FLAG שימש לביטוי חלבונים בתאי Sf9, ואחריו טיהור זיקה FLAG בשלב אחד והסרה תחרותית של 1× פפטיד FLAG (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הוצגה שיטה חסכונית בזמן ובעלות לזיהוי ביוכימי של PTMs היסטונים ספציפיים כמטרות לחלבון שאינו מאופיין היטב, ולהערכת האופן שבו המוטציה הקשורה למחלה משפיעה על הזיקה הקשירה של המטרה. היתרון של שיטה זו הוא שהיא אינה דורשת בנייה מחדש יקרה או ממושכת של נוקלאוזומים סינתטיים. גישה זו ניצלה את הנוחות של מערכי פפטידים היסטונים PTM מסחריים, תוך הבטחת ש-SPIN4 הוא קורא H3K4me אמיתי באמצעות שימוש במונונוקלאוזומים מקומיים כסובסטרטים קשירים פיזיולוגיים רלוונטיים. שלב קריטי בשיטה זו הוא שיקום מוצלח של חלבו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לכל חברי Yu and Jee Lab בעבר ובהווהו על התמיכה הטכנית שלהם. J.-R.Y. נתמך על ידי פרס NIH NIGMS למחקר מקסום חוקרים (MIRA) R35GM160046. יה. ג' נתמך על ידי בית החולים הלאומי לילדים ועל ידי מכון המחקר לילדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לסארסטדט72.690.001ניסויים כלליים
צלחת תרבית רקמה 15 ס"מסארסטדט83.3903.300ניסויים כלליים
צינורות צנטריפוגה חרוטיים בנפח 15 מ"לסארסטדט62.554.101ניסויים כלליים
צינורות צנטריפוגה חרוטיים בנפח 50 מ"לסארסטדט62.548.004ניסויים כלליים
500 מ"ל בקבוק ארלנמאיירסטלר סיינטיפיקCT229809תרבית תאים ב-Sf9
Amersham ImageQuant 800 CCD ImagerציטיבהIMQ800מערכת הדמיה CCD
ג'ל זיקה אנטי-FLAG M2סיגמא-אלדריץ'A2220משיכה ביוכימית
נוגדן M2 נגד FLAGסיגמא-אלדריץ'F1804כתם מערבי
אפרוטיניןMedChemExpressHY-P0017מעכב פרוטאז
ניתוח מערך Sofrwareמוטיב פעילhttps://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zipניתוח נתוני מערך פפטידים ממודים
ASI אגארוזה LEאלקלי סיינטיA7700ג'ל DNA
מערכת ביטוי באקולו-וירוס Bac-to-Bacתרמו-סיינטיפיק10359016ביטוי באקולו-ויראלי
בנזמידין הידרוכלורידMedChemExpressהיי-W018781מעכב פרוטאז
אלבומין סרום בקר (BSA)סיגמא-אלדריץ'A9647תקן כימות חלבונים
ברומופנול כחולתרמו-סיינטיפיקA18469.08בופר למלי
קומאסי בריליאנט בלו R-250תרמו-סיינטיפיק20278צביעת ג'ל חלבון
דיתיותרייטול (DTT)סיגמא-אלדריץ'  D5545בופר Lysis
EDTAמוצרי מחקר RPIE58100בופר Lysis
מצע כימילומינסנציה משופרת (ECL)ציטיבהRPN2232כתם מערבי
מדיום תרבית תאי חרקים ESF 921מערכות ביטוי96-001תרבית תאים ב-Sf9
אתנול (200 proof)ספקטרום כימיקליםET107משקעים ב-DNA
מערכת ההדמיה EVOS M5000InvitrogenM5000הדמיה כללית
פפטיד דגלMedChemExpressHY-P7006הלושן משיכה למטה
גליצרולסיגמא-אלדריץ'  G77893מאגר אחסון
נוגדן H3K4me1  מוטיב פעיל39300כתם מערבי
נוגדן H3K4me2  איתות סלולרי9725Tכתם מערבי
נוגדן H3K4me3  איתות סלולרי9751Tכתם מערבי
HEK293FT תאיםתרמו-סיינטיפיקR70007קו תאי פיברובלסט עובריים בכליה האנושית
HEPESסיגמא-אלדריץ'  H3375בופר Lysis
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאותhttps://imagej.net/ij/download.html  תוכנת עיבוד תמונה מבוססת Java
לופטין המיסולפטMedChemExpressHY-18234Aמעכב פרוטאז
נוקלאז מיקרוקוקלי (MNase)NEB M0247Sאנדונוקלאז לעיכול כרומטין
מודל 120 סוניק דיסמברטורפישר סיינטיפיקFB120110סוניקציה
מערך פפטידים היסטונים מודיפיקציהמוטיב פעיל13005מבחן קשירת חלבונים
פפשטטין AMedChemExpressHY-P0018מעכב פרוטאז
פרוקסידאז IgG חלק מונוקלונלי נגד עכבר IgG, ספציפי לשרשרת קלהJackson ImmunoResearch115-035-174כתם מערבי
pFastBac1-Flag-SPIN4תרמו-סיינטיפיק10360014וקטור ביטוי באקולו-ויראלי
pFastBac1-דגל-SPIN4-D82Hתרמו-סיינטיפיק10360014וקטור ביטוי באקולו-ויראלי
פנול: כלורופורם: איזואמיל אלכוהול (25:24:1)סיגמא-אלדריץ'P2069טיהור DNA
ערכת בדיקת חלבון BCA Pierce Rapid Goldתרמו-סיינטיפיקPIA53226כימת חלבון
ערכת הכתם הכסופה פירסתרמו-סיינטיפיק24612זיהוי חלבונים
מעכב פרוטאז PMSFתרמו-סיינטיפיק36978מעכב פרוטאז
ג'ל פוליאקרילאמידיוצר בתוך החברהלא זמיןג'ל חלבון
תאי חרקים Sf9ATCCCRL-1711קו תאים של חרקים לביטוי נגיף בקולו
מכשיר דיאליזה Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCOתרמו-סיינטיפיק69572דיאליזה חלבונית
נתרן אצטטסיגמא-אלדריץ'S8750משקעים ב-DNA
נתרן כלוריד פישר BP358-1מאגרים כלליים
סודיום דודסיל סולפט (SDS)סיגמא-אלדריץ'  L3771מאגרים כלליים
תמיסת טרייפן בלו (0.4%)תרמו-סיינטיפיק15250061צביעת גרעינים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lui, J. C., et al. Loss-of-function variant in SPIN4 causes an X-linked overgrowth syndrome. JCI Insight. 8 (9), e167074(2023).
  2. Chawla, N., Rajput, M., Shriyan, R., Bachani, S., Gupta, A. Clinical observation of a rare Binder phenotype with fetal overgrowth due to a SPIN4 mutation. Matern Fetal Med. 7 (1), e0030(2025).
  3. Lu, R., Wang, G. G. Tudor: a versatile family of histone methylation readers. Trends Biochem Sci. 38 (11), 546-555 (2013).
  4. Ruthenburg, A. J., Li, H., Patel, D. J., Allis, C. D. Multivalent engagement of chromatin modifications by linked binding modules. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 983-994 (2007).
  5. Mauser, R., Jeltsch, A. Application of modified histone peptide arrays in chromatin research. Arch. Biochem Biophys. 661, 31-38 (2019).
  6. Hsu, C. I., et al. Paraspeckle protein NONO regulates active chromatin by allosterically stimulating NSD1. Cell Rep. 44 (1), 116247(2025).
  7. Hsu, C. I., Yeh, E., Chen, C. C. L., Sahn, M., Yu, J. R. Protocol for reconstituting enzymatic activities for ultra-large histone methyltransferases NSD1 and SETD2 using a baculovirus expression system. STAR Protoc. 6 (1), 103963(2025).
  8. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8 (11), 5367-5374 (2009).
  9. Fuhrmann, J., Thompson, P. R. Protein arginine methylation and citrullination in epigenetic regulation. ACS Chem Biol. 11, 654(2015).
  10. Zhao, F., et al. Molecular basis for histone H3 “K4me3-K9me3/2” methylation pattern readout by Spindlin1. J Biol Chem. 295 (49), 16877(2021).
  11. Padeken, J., Methot, S. P., Gasser, S. M. Establishment of H3K9-methylated heterochromatin and its functions in tissue differentiation and maintenance. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (9), 623-640 (2022).
  12. Greschik, H., et al. The histone code reader Spin1 controls skeletal muscle development. Cell Death Dis. 8 (11), e3173(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SPIN4 ProteinHistone ModificationPeptide ArrayNative Nucleosome PulldownTudor DomainHistone ReaderH3K4 MethylationWestern BlotBone Growth RegulationPost Translational Modification

מאמרים קשורים