עומס ברזל הפחית את ביטוי MEG3 ברקמת הלבלב. MEG3 עשוי למלא תפקיד מגן מפני אפופטוזיס β תאי איים המושרה על ידי ברזל, מה שעשוי לכלול מודולציה של מסלול NF-ĸB. מנגנון זה עשוי לתרום לתפקוד לקוי של איים אצל מטופלים עם β-TM עם עומס ברזל.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר מחקר
עומס ברזל הפחית את ביטוי MEG3 ברקמת הלבלב. MEG3 עשוי למלא תפקיד מגן מפני אפופטוזיס β תאי איים המושרה על ידי ברזל, מה שעשוי לכלול מודולציה של מסלול NF-ĸB. מנגנון זה עשוי לתרום לתפקוד לקוי של איים אצל מטופלים עם β-TM עם עומס ברזל.
חולים עם בטא-תלסמיה מג'ורית (β-TM) מציגים לעיתים קרובות מטבוליזם גלוקוז לא תקין, וגורמים כמו עומס יתר של ברזל, אנמיה כרונית, חוסר איזון הורמונלי, תפקוד לקוי בכבד ועמידות לאינסולין הקשורה לדלקת נחשבים לגורמים חשובים לתפקוד לקוי של איי הלבלב. חומצות ריבונוקלאיות ארוכות טווח שאינן מקודדות (lncRNAs) מוכרות יותר ויותר בזכות תפקידן הרגולטורי באפופטוזיס תאים ובהומאוסטזיס גלוקוז. מחקר זה בוחן את תפקיד ה-lncRNA, גן 3 המובע על ידי האם (MEG3), בפגיעה בתאי β האיים הנגרמת מברזל. מודל עכבר עם עומס ברזל הושר באמצעות הזרקה תוך-פריטונאלית של דקסטרון ברזל. הצטברות הברזל ונזק לרקמות בלבלב הוערכו באמצעות צביעת כחול פרוסי, המטוקסילין ואאוזין, והביטוי של MEG3 נמדד באמצעות תגובת שרשרת פולימראז הפוכה (RT-PCR). במבחנה, תאי MIN6 עברו טרנפיקציה עם RNA קטן מתערב MEG3 לבדיקת אפופטוזיס באמצעות ציטומטריית זרימה, ופעילות מסלולי האיתות של NF-kappa (ĸ)B הוערכה באמצעות Western blotting. צביעות היסטולוגיות אישרו שקיעת ברזל משמעותית ונזק מבני ברקמת הלבלב של עכברים עמוסים בברזל. ניתוח RT-PCR חשף ירידה משמעותית בביטוי MEG3 בלבלב (p<0.05). במבחנה, MEG3 knockdown העלה משמעותית את האפופטוזיס של תאי MIN6 בהשוואה לביקורת. ניתוח הכתמים המערביים הראה רמה מוגברת של NF-ĸB, מה שמעיד על הפעלת מסלול האיתות של NF-ĸB בתאים מושתקים-MEG3. ממצאים אלו מצביעים על כך שירידה ב-MEG3 עשויה לשפר את אפופטוזיס תאי β באיים באמצעות איתות NF-ĸB בתנאי עומס ברזל. גן MEG3 עשוי למלא תפקיד מגן מפני אפופטוזיס β תאי איים מושרה על ידי ברזל, מה שעשוי לכלול ויסות של מסלול NF-ĸB. מנגנון זה עשוי לתרום לתפקוד לקוי של איים אצל מטופלים עם β-TM עם עומס ברזל.
בטא (β)-תלסמיות הן קבוצת הפרעות המטולוגיות תורשתיות המאופיינות בהפחתה או היעדר ייצור שרשרת β-גלובין, מה שמוביל לאנמיה כרונית ולאריתרופויאזיס לא יעיל1. אצל מטופלים עם β-תלסמיה מז'ורית (β-TM) התלויה בעירוי, עירויי דם חוזרים וההמוליזה מובילים לעיתים קרובות לעומס ברזל מערכתית, מה שעלול לפגוע באיברים רבים ולתרום למגוון סיבוכים אנדוקריניים, כולל מטבוליזם גלוקוז לא תקין2. בנוסף, אנמיה כרונית מעלה את העומס על הלבלב, חוסר איזון הורמונלי המשפיע על ויסות הגלוקוז, תפקוד לקוי בכבד הפוגע במטבוליזם של הגלוקוז, ועמידות לאינסולין הנגרמת מתהליכים דלקתיים עשויים כולם לתרום להיפרגליקמיה אצל חולים עם β-TM. לכן, הפרעות מטבוליות של גלוקוז ב-β-TM הן רב-גורמיות מטבען 2,3. מטא-אנליזה עדכנית דיווחה כי השכיחות של סוכר בצום פגום, פגיעה בסבילות לגלוקוז (IGT) וסוכרת (DM) בקרב חולים עם β-TM הייתה 17.21%, 12.46% ו-6.54%, בהתאמה, מה שמעיד על עומס הולך וגדל של הפרעות מטבוליות גלוקוז באוכלוסייה זו3.
למרות הרלוונטיות הקלינית הגוברת שלו, המנגנונים הבסיסיים של חילוף חומרים חריג של גלוקוז ב-β-TM עדיין אינם מובנים היטב. מחקרים קודמים הראו כי עומס ברזל כרוני, בעיקר כתוצאה מעירויי חוזר וההמוליזה, עלול להוביל להצטברות ברזל מופרזת בלבלב, במיוחד בתאי β האי. הצטברות זו מקדמת יצירת מיני חמצן תגובתיים ומחמירה לחץ חמצוני, מעוררת תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, פוגעת בסינתזת האינסולין ובהפרשת האינסולין, ולבסוף גורמת לאפופטוזיס תאי β וחסר אינסולין. בנוסף, עומס ברזל עשוי לתרום להתנגדות לאינסולין היקפית דרך דלקת המונעת על ידי לחץ חמצוני והפרעה למסלולי איתות האינסולין. עם זאת, המסלולים המולקולריים המקשרים עודף ברזל לפגיעה בתאי β ולדיסרגולציה מערכתית של גלוקוז הם מורכבים וטרם הוברו במלואם. חומצות ריבונוקלאיות ארוכות (lncRNAs) שאינן מקודדות – קבוצה של תעתיקים ארוכים מ-200 נוקלאוטידים שאינם מקודדים חלבונים – הפכו לווגולטורים חשובים בתהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל הומאוסטזיס גלוקוז, הפרשת אינסולין ותגובות לחץ חמצוני 7,8,9. ידוע שתאי β האיים של הלבלב מבטאים מעל 1,000 lncRNA, מה שמרמז על תפקידם הרגולטורי הפוטנציאלי בשמירה על תפקוד אנדוקריני10.
עם זאת, מעט ידוע על פרופילי הביטוי של ה-lncRNA ותפקידיהם התפקודיים בהקשר של נזק לתאי β האיים הנגרמות מעומס ברזל, במיוחד ב-β-TM. התקדמויות אחרונות חשפו כי LNCRNA MEG3 (MEG3) מקדם הפרשת אינסולין ומעכב אפופטוזיס תאי β בלבלב11. עם זאת, השפעתו על תאי β בלבלב במצבי עומס יתר של ברזל נותרה חמקמקה. בהקשרים פתולוגיים אחרים, הוכח ש-lncRNA מתקשרים עם מסלולי איתות מרכזיים כגון NF-kappa (ĸ)B, JNK ו-Nrf2, אשר מעורבים גם בלחץ חמצוני ופגיעות תאי הקשורות לעומס יתר של ברזל 12,13,14. באופן ספציפי, NF-ĸB הוא גורם שעתוק מרכזי שמופעל תחת לחץ חמצוני והיה מעורב באפופטוזיס תאי β בתנאי עומס ברזל 15,16,17. לכן, מחקר זה בוחן כי הירידה ב-MEG3 עשויה לשפר את אפופטוזיס תאי β באיים באמצעות איתות NF-ĸB בתנאי עומס יתר של ברזל. עבודה זו עשויה לספק תובנות חדשות לגבי המנגנונים המולקולריים שמאחורי מטבוליזם גלוקוז לא תקין ב-β-TM.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הפרוטוקולים הניסיוניים ששימשו במחקר הנוכחי אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים הכללי של היינאן (פרוטוקול מס' 2021-239). מדריך המכון הלאומי לבריאות של ארה"ב לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה והצהרת הלסינקי נשמרו בקפדנות בכל ההליכים הניסיוניים. הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלת החומרים.
1. מודל בעלי חיים ועיצוב ניסויי
שלושים ושישה עכברים זכרים מסוג C57BL/6J (בני 4 שבועות, כ-20 גרם) שימשו במחקר זה. כל העכברים הוחזקו בתנאי מעבדה סטנדרטיים (20–25 מעלות צלזיוס, לחות יחסית של 50%–65%, מחזור אור/חושך של 12 שעות) עם גישה חופשית למזון ולמים. לאחר תקופת הסתגלות בת 7 ימים, חולקו העכברים באקראי לשתי קבוצות (n=18 לכל קבוצה): קבוצת עודף הברזל (קבוצת המודל), שקיבלה זריקות תוך-פריטונאליות של ברזל דקסטרן (0.2 גרם/ק"ג) פעמיים בשבוע במשך 4 שבועות; וקבוצת הביקורת, שקיבלה נפחים שווים של תמיסת מלח רגילה באמצעות הזרקה תוך-צפקית. לאחר 4 שבועות, העכברים הושמתו, ונקצרו רקמות הלבלב לניתוח נוסף.
2. מדידת ברזל בסרום
דגימות דם נאספו מהסינוס הרטרו-אורביטלי תחת 1% הרדמה פנטוברביטלית במהלך הדייסטרוס. לאחר שעמדו בטמפרטורת החדר במשך שעה, הדם צונטר בצנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס, 3,000 סל"ד למשך 15 דקות. הסרום הופרד ואוחסן בטמפרטורה של -80°C. ריכוזי הברזל בסרום נקבעו באמצעות ערכת בדיקת ברזל קולורימטרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
3. ניתוח היסטולוגי
דגימות רקמת הלבלב הוטבלו ב-4% פאראפורמלדהיד לקיבוץ, ולאחר מכן הטביעה של פרפין לפני הכנת החתך. חתכי רקמה סדרתיים בעובי של 4–5 מיקרון נאספו ועוברו באמצעות הליכים סטנדרטיים של דה-פרפיניזציה והידריה מחודשת. בדיקה היסטומורפולוגית בוצעה לאחר מכן באמצעות צביעת המטוקסילין ואאוזין, בעוד שהפקדת הברזל ברקמות הלבלב הוערכה באמצעות צביעת כחול פרוסי בהתאם לפרוטוקולי צביעה היסטולוגיים קונבנציונליים.
4. תרבית תאים וטרנספקציה קטנה של חומצה ריבונוקליאית מפריעה
תאי β הלבלב של MIN6 גודלו במדיום Eagle מותאם של Dulbecco עתיר גלוקוז, שהושלם ב-15% סרום בקר עוברי, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 10 מ"מ HEPES, 50 מ"מ פירובט נתרן ו-50 מיקרומול/ליטר β-מרקפטואנול. כל הניסויים בוצעו ב-80% מפגש תאים. בכל פעם במהלך תרבית התאים, לוקחים 6–8 מ"ל של מדיום תרבית. התאים נשמרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% CO₂. למחקרים פונקציונליים, תאי MIN6 בשלב הגדילה הלוגריתמי עברו טרנפיקציה עם RNA קטן (si)RNA מתערב ספציפי ל-lncRNA (שמכוון ל-lncRNA נבחר בהתבסס על תוצאות מיקרו-מארי; קבוצת המעכבים) או קבוצת המעכב NC של siRNA שלילי בביקורת באמצעות Lipofectamine 2000, לפי הוראות היצרן. לאחר גידול במשך 24 שעות, תאים נותחו באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qRT-PCR) או ווסטרן בלוט כדי לקבוע יעילות הדחיפה. רצפי המטרה של siRNA זה היו כדלקמן: siMEG3: GCGUCUCUCUGUGCCAUUUTTAAAUGGCACAGGAAGACGCTT; siNC: UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT. כל ניסוי נערך בשלוש עותקים וחזר על עצמו שלוש פעמים.
5. בדיקת תגובת שרשרת פולימראז שעתוק הפוך
סך ה-RNA הופק מדגימות רקמת לבלב ותאי MIN6 באמצעות תגובת בידוד RNA מבוססת פנול זמינה מסחרית, בהתאם להוראות היצרן. DNA משלים סונתז באמצעות ערכת שעתוק הפוכה בנפח תגובה כולל של 20 מיקרוליטר. לאחר שעתוק הפוך, ריכוז ה-cDNA ברוב הדגימות היה כ-1 מיקרוגרם/מיקרוליטר בהתבסס על ניתוח כימות דגימה. לאחר מכן, נעשה שימוש ב-1 מיקרוליטר של תבנית cDNA להגברה כמותית בזמן אמת של PCR. qRT-PCR בוצע באמצעות ערכת זיהוי PCR מבוססת SYBR Green בתנאי מחזור הבאים: 95 °C ל-30 שניות, 90 °C ל-15 שניות, 60 °C ל-34 שניות, ו-68 °C ל-30 שניות. רמות ביטוי גנים יחסיות נקבעו באמצעות שיטת מחזור סף השוואתי (שיטת 2-ΔCT ). GAPDH שימש כגן ייחוס פנימי לנרמול נתוני PCR בזמן אמת. כל הליכי הניסוי בוצעו בהתאם לפרוטוקולי היצרנים השונים, וכל ניסוי חזר על עצמו לפחות שלוש פעמים באופן עצמאי. רצפי הפריימרים ששימשו במחקר זה מופיעים בטבלאות המשלימות 1 וטבלה 2.
6. ערכת ספירת תאים-8
קיבולת התרבות התאים נקבעה באמצעות בדיקת ערכת ספירת תאים-8 בהתאם להנחיות היצרן. בקצרה, תאי MIN6 צויפו בלוחות תרבית של 96 בארות בצפיפות של 5 x 103 תאים לבאר לאחר העברה עם si-MEG3 או si-NC ונשמרו במשך 24 שעות. בנקודות הזמן המיועדות הוכנסו 10 מיקרוליטר של תגובת קיום תאים לכל באר, והלוחות הוטמעו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. ערכי הספיגה נמדדו לאחר מכן ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט. חיוניות התאים חושבה כאחוז יחסית לקבוצת הביקורת.
7. זיהוי אפופטוזיס באמצעות ציטומטריית זרימה
שינויים אפופטוטיים בתאי MIN6 נבדקו באמצעות ערכת זיהוי אפופטוזיס Annexin V-FITC/PI בהתאם להוראות היצרן. לאחר 48 שעות של טרנספקציה של siRNA, תאים נקטרו, נשטפו פעמיים עם סליין קר עם בופר פוספט קר, והוסגרו מחדש בבופר קישור. לאחר מכן, תאים דוגרו עם 5 מיקרוליטר אנקסין V-FITC ו-5 מיקרוליטר פרופידיום יוד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בתנאי חשוך. מיד לאחר הצביעה, הדגימות נותחו באמצעות ציטומטריית זרימה. אוכלוסיות תאים אפופטוטיים מוקדמות ומאוחרות נמדדו באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטרי זרימה. שיעור התאים האפופטוטיים חושב לאחר מכן להשוואות בין-קבוצתיות. כל ניסוי בוצע באופן עצמאי שלוש פעמים.
8. ניתוח כתם מערבי
ניסויי ווסטרן בלוט בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שדווחו קודםלכן 18. תאים עוכלו תחילה עם טריפסין, נאספו ופורסמו על קרח באמצעות בופר ליזיס של בדיקת רדיואימונופרציפיטציה. ריכוזי החלבון נמדדו, וכמויות שוות ערך של חלבון הועברו להפרדה על ג'לים אלקטרופורזה של 10% נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד לפני העברה לממברנות פוליווינילידין פלואוריד. לאחר חסימת הממברנה, דגימות הודגרו עם נוגדנים ראשוניים נגד NF-κB (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000), קספאז-3 (1:1000) וגליצראלדהיד-3-פוספט דה-הידרוגנאז (GAPDH) (1:2000) ביחס הדילול המצוין, ואחריהם דגירה עם נוגדנים משניים הקשורים לפרוקסידאז חזרת. אותות החלבון זוהו באמצעות מערכת כימילומינסנציה וכמותו באמצעות תוכנת ImageJ. GAPDH שימש כבקרת העומס הפנימי, ורמות ביטוי החלבון הוצגו כשינויים בקפלים ביחס לקבוצת הביקורת.
9. ניתוח סטטיסטי
הנתונים הוצגו כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). השוואות בין קבוצות בוצעו באמצעות מבחן Mann–Whitney U19 באמצעות ניתוח סטטיסטי. ערך p <0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הערכת מודל העכבר של עומס ברזל ומדידת ביטוי גן 3 המובע על ידי האם ברקמות הלבלב
כדי לחקור את תפקיד MEG3 ב-vivo, הקמנו מודל עומס יתר ברזל בעכברים באמצעות הזרקה תוך-פריטונלית של ברזל דקסטרן. בהשוואה לקבוצת הביקורת, רמות הברזל בסרום בקבוצת המודל עלו באופן משמעותי (p<0.05) (איור 1A). בדיקה היסטולוגית גילתה שקיעת ברזל בולטת ברקמות הלבלב, כפי שמודגם בצביעת המטוקסילין–אאוזין וצביעת כחול פרוסי. יתרה מזאת, מיקרוסקופ אלקטרוני גילה נזק מבני בתאי אקינר בלבלב...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מטבוליזם גלוקוז לא תקין הוא סיבוך נפוץ וחמור אצל מטופלים עם β-TM, שלעיתים מתבטא ב-IGT או DM. במחקר זה מצאנו כי עודף הברזל הוביל לפגיעה בלבלב והפחית משמעותית את הביטוי של lncRNA MEG3 ברקמת הלבלב, בליווי אפופטוזיס מוגבר בתאי β האי. יתרה מזאת, הפלת MEG3 בתאי MIN6 קידמה אפופטוזיס תאי β והייתה קשורה להפעלת NF-ĸB, מה שמעיד על קשר מכני פוטנציאלי בין MEG3 לבין תפקוד לקוי של תאי β שנגרם מעומס ברזל. תוצאות אלו מצביעות על כך ש-MEG3 עשוי למלא תפקיד מגן בתאי β בלבלב בתנאי עומס ברזל ולתרום לפתוגנזה של...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.
מחקר זה מומן על ידי קרן המדע הטבעי של מחוז היינאן בסין (822QN445) וקרן ועדת החינוך של היינאן (Hnky2024-30).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1M Tris-HCL (pH=6.8) | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | T1020 | |
| 50bp DNA Ladder | TIANGEN | MD108 | |
| 50bp DNA Ladder | TIANGEN | MD108 | |
| 6×DNA Loading Buffer | TIANGEN | GH101-01 | |
| 6×DNA Loading Buffer | TRANS | GH101-01 | |
| -80ºC refrigerator | BIOBASE | BDF-86V348 | |
| ABI 7500 real-time PCR system | Applied Biosystems, USA | ||
| Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit | MULTI SCIENCES | AP101-100-kit | |
| BCA Protein Assay Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd. | E-BC-K318-M | |
| Biopulverizer | biospec | ||
| BSA | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | A8020 | |
| C57BL/6J male mice | Gempharmatech Co,Jiangsu,China | ||
| CCK-8 Cell Proliferation Assay Kit | KeyGEN BioTECH | KGA317 | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| DMEM | KeyGEN BioTECH | ||
| Flow cytometry | ACEA Biosciences, USA | NovoCyte 2060R | |
| Fluorescence PCR instrument | Bio-Rad Laboratories, Shanghai | ||
| Glycine | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | G8200 | |
| High-capacity cDNA reverse transcription kit | Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA | ||
| HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | R223-01 | |
| HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | R223-01 | |
| HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Servicebio | GB23301 | 1/2000 |
| HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Servicebio | GB23303 | 1/2000 |
| Human LncRNA Array V5.0 | Arraystar,Rockville, Maryland, USA | ||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| Microarray scanner | Agilent Technologies,California, USA | ||
| MIN6 cell | procell | KGM12800N | |
| Mini-Bead-Beater-16 | biospec | ||
| Mouse Anti-GAPDH | TransGen Biotech | HC301 | 1/2000 |
| NanoDrop spectrophotometer | NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA | ND-2000 | |
| PAGE Pre-Solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | A1010 | |
| Primers | Generay Biotech,Anhui, China | ||
| PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser | CWBIO,Jiangsu, China | ||
| PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
| Rabbit Anti Bax | proteintech | 50599-2-ig | 1/5000 |
| Rabbit Anti Bcl-2 | abcam | ab194583 | 1/1000 |
| Rabbit Anti Caspase3 | abcam | ab184787 | 1/2000 |
| Rabbit Anti P65 | abcam | ab32536 | 1/8000 |
| Rabbit Anti p-P65 | Affinity | af2006 | 1/1000 |
| TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa, Japan | ||
| TRIzol | Invitrogen life technologies, Carlsbad, CA, USA | ||
| TRIzol reagent | CWBIO,Jiangsu, China | ||
| Ultra-sensitive chemiluminescence imaging system instrument | Bio-Rad Laboratories, Shanghai | Chemi DocTM XRS+ | |
| Ultraviolet spectrophotometer | NanoPhotometer | NP80 |