אקוניטין גורם לנזק לשריר הלב בעכברים הקשור להפעלת מסלול האיתות JNK1/2

סיכום

מחקר זה בחן את התפקיד הפוטנציאלי של איתות JNK1/2 בנזק שריר הלב שנגרם מאקוניטין בחולדות. פוספורילציה מוגברת של JNK1/2 הייתה קשורה לנזק שריר הלב, בעוד עיכוב פרמקולוגי של מסלול JNK הקל חלקית על נזק שריר הלב, מה שמרמז כי איתות JNK עשוי להשתתף בקרדיוטוקסיות הנגרמת מאקוניטין.

תקציר

הרעלת אקוניטין חריפה (Acon) עלולה לגרום להפרעת קצב ונזק לשריר הלב; עם זאת, המנגנונים הבסיסיים אינם ברורים. מחקר זה חקר את מנגנון הפגיעה בשריר הלב הנגרמת מהרעלת אקון חריפה. מודל חולדה (n = 51) של הרעלת אקון חריפה הוכח באמצעות מתן תוך-קיבי. מעקבים אלקטרוקרדיוגרפיים שימשו לתיעוד שינויים בקצב הלב. בוצעו צביעות המטוקסילין ואאוזין (HE) וצביעת מסון להערכת פגיעות פתולוגיות שריר הלב והצטברות קולגן. רמות הביטוי של אנזימי לב וחלבונים בדם ורידי זוהו באמצעות ערכות ELISA (בדיקות אימונוסורבנט מקושרות באנזים). הקשר בין המבנה-פעילות בין Acon למסלול JNK נחקר באמצעות עגינה מולקולרית. רמות הביטוי של חלבוני c-Jun N-טרמינל קינאז 1/2 (JNK1/2) הפוספורילטים זוהו באמצעות Western blotting. במחקר זה, נצפו הפרעות קצב חדריות בחולדות לאחר מתן אקון תוך-קיבה. רקמת שריר הלב הראתה סידור לא מסודר של סיבי שריר הלב ותאיים, בליווי הצטברות קולגן לא תקינה. תוצאות העגינה המולקולרית הצביעו על אינטראקציות פוטנציאליות בין Acon ל-JNK1/2. בינתיים, רמות הביטוי של אנזימי וחלבונים בלב, כמו גם של JNK1/2 המזרחן, עלו באופן משמעותי. מחקרים נוספים הראו כי הטיפול במעכב JNK SP600125 הפך חלקית את הפגיעה שריר הלב שנגרמה על ידי אקון בעכברים. תוצאות אלו מצביעות על כך שזרחון JNK1/2 מעורב בהתפתחות פגיעות שריר הלב הנגרמות מהרעלת אקוניטין חריפה. הממצאים מצביעים על כך שהפעלת מסלול האיתות של JNK1/2 תורמת לנזק שריר הלב שנגרם על ידי אקוניטין, וכי עיכוב מסלול JNK1/2 עשוי להקל על פגיעת שריר הלב הנגרמת מרעילה חריפה מאקוניטין.

מבוא

אקון הוא תמצית אלקלואידית טבעית מדיטרפן מצמח האקוניטום ממשפחת הרנונקולאצאה. יש לו אפקטים אנטי-דלקתיים ^1,2, משככי כאבים, אנטי-גידולים, אנטי-ראומטיים, מטבוליזם חיסוני וקידום מחזור הדם ^3,4,5. עם זאת, שימוש לא מתאים או מופרז בתרופות המכילות אקון עלול להוביל לאירועי הרעלה חמורים. התסמינים הנגרמים מהרעלת אקוניטין כוללים תסמינים לבביים⁶, תסמינים נוירולוגיים⁷ ותסמינים במערכת העיכול⁸. בשנים האחרונות דווחו לעיתים קרובות ברחבי העולם על מקרים של הרעלת אקוניט או מוות ^9,10,11. הרעלת אקון מתבטאת בעיקר במערכת הלב וכלי הדם, מערכת העצבים ומערכת העיכול. ביניהם, הסיבה העיקרית למוות מהרעלה היא הרעלת לב. הנזק ללב שנגרם על ידי Acon הוא חמור מאוד; במיוחד, ההופעה הקצרה של התסמונת מקשה על ביצוע טיפול קליני בזמן. בדרך כלל, הרעלת אקון חריפה גורמת לבחילה, שלשולים, סחרחורת, כאבי חזה, קוצר נשימה ותסמינים ראשונים נוספים תוך^{כמה שעות}. נכון לעכשיו, המנגנון המפורט של נזק שריר הלב הנגרם מהרעלת אקון חריפה עדיין אינו ברור, ואין תרופות קליניות יעילות שיכולות להקל ביעילות על נזק שריר הלב הנגרם מהרעלת אקון^12,13.

נזק בהרעלת אקון חריפה שעשוי לאפשר חקר מנגנון נזק שריר הלב עשוי לספק אמצעי משמעותי לחקירה תלויה בזמן. מודל כזה עשוי להיות בעל פוטנציאל לטיפול עתידי בחולים עם הרעלת אקון חריפה ולמנוע התפתחות מוקדמת של התסמונת. מחקרים שיערו את תפקידו של מסלול האיתות c-Jun n-terminal kinase (JNK) בתגובה החיסונית לרעלים. מסלול האיתות של JNK הוא אחד ממסלולי האיתות של קינאז חלבון מופעל על ידי מיטוגן (MAPK). למשפחת JNK שלושה גנים (JNK1/MAPK8, JNK2/MAPK9, ו-JNK3/MAPK10). JNK1 ו-JNK2 יכולים להתבטא ברוב הרקמות, כולל הלב, בעוד ש-JNK3 נמצא בעיקר^במוח, והוא קשור בעיקר ללחץ חמצוני ולתגובה דלקתית של תאים¹⁵. מחקרים מצאו כי מסלול האיתות המתווך על ידי JNK ממלא תפקיד חשוב בפגיעה באיסכמיה/רפרוזיה מוחית ושריר הלב^16,17. מתן C66 מקל על דלקת שריר הלב הנגרמת מתזונה עתירת שומן על ידי עיכוב הפעלת JNK בלב עכברים¹⁸. חומצה כלורוגנית מקלה על פגיעה בקרדיומיוציטים הנגרמת על ידי TNF-α על ידי עיכוב אותות JNK¹⁹. פינוקמברין מקל על נזק שריר הלב והתגובה הדלקתית הנגרמים על ידי עיכוב מסלול האיתות p38/JNK MAPK, ומקל על הפרעות תפקוד לב והפרעות^קצב. מחקרים אלו מצביעים על כך ששינויים באיתות JNK, בעיקר JNK1/2, קשורים קשר הדוק לנזק שריר הלב. בינתיים, JNK הוא גם יעד במורד הזרם של Acon לסדרת פעילויות. מחקר אחד מצא כי מינונים גבוהים של חשיפה לאקון יכולים לתווך את מסלול הפעלת האנזים של JNK, ולגרום לרעילות התפתחותית בעוברי דגי זברה (צעירים) כגון קיצור אורך הגוף, צורת גוף מעוקלת וליקויים בהתפתחות המוח²¹. מחקר זה מציע ש-Acon עשוי להפעיל את מסלול האיתות JNK. עם זאת, תפקיד מסלול האיתות של JNK בנזק שריר הלב הנגרם מהרעלת אקוניטין חריפה אינו ברור.

מחקר זה קבע מודל חולדה להרעלת אקון חריפה בנזק שריר הלב על ידי קביעת מינונים ותחומי זמן תוך-קיבתיים שונים. בנוסף, חקרנו את השפעת אקון על רמת הזרחון של JNK1/2 בשריר הלב ואת הפעלת מסלול האיתות של JNK במודל זה. חקירת תפקיד הפוספורילציה של JNK1/2 בפגיעת שריר הלב בעכברים הנגרמת מהרעלת אקון חריפה מספקת בסיס תיאורטי לחקר נזקי שריר הלב הנגרמים מהרעלת אקון חריפה.

פרוטוקול

תכנון הניסוי ותוכנית היישום אושרו על ידי ועדת הניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת קונמינג לרפואה לאישור (מספר אישור: Kmmu20220652) ב-06/2022. כל תוכניות הניסוי בוצעו בהתאם ל"הנחיות לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת קונמינג לרפואה". רשימת כל החומרים בהם השתמשו במחקר זה מופיעה בטבלת החומרים.

אזהרה: בשל הרעילות הגבוהה של Acon, כל נהלי ההכנה והניהול בוצעו בהתאם לתקנות בטיחות מעבדות מוסדיות. הצוותים שטיפלו באיקון לבשו ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, מעילי מעבדה ומסכות, והנהלים שעסקו בהכנת אקון בוצעו עם אמצעי זהירות מתאימים לצמצום הסיכון לחשיפה. בעלי חיים נבדקו בקפידה במהלך ואחרי מתן האקון לסימנים של רעילות חמורה ומצוקה, ונקודות קצה הומניות יושמו בעת הצורך כדי לצמצם סבל. פסולת ביולוגית וחומרים מזוהמים באקון הושלכו בהתאם לתקנות הבטיחות הביולוגית המוסדית.

טיפול בבעלי חיים

זכרים בוגרים מסוג Sprague-Dawley (SD) (בני חודשיים, משקל 230 גרם) גודלו בבניין ניסויים בבעלי חיים SPF, במרכז הניסויים לחיות באוניברסיטת קונמינג לרפואה. תנאי האכילה של כל חולדות SD טופלו בהתאם לדרישות האכילה של חולדות SPF. הם גודלו באופן אדפטיבי במשך שבוע וצום במשך 12 שעות לפני הניסוי. אקון הומס בבופר אצטט של 0.05 מטר (Acet), וחולדות SD חולקו ל-4 קבוצות לפי עקרון הביקורת האקראית: קבוצה 1 (Acon-1 mg) ניתנה 1 מ"ג/ק"ג Acon באמצעות גוואג'; קבוצה 2 (אקון-2 מ"ג) ניתנה 2 מ"ג/ק"ג אקון על ידי תוך-קיבה; קבוצה 3 (אסט), ניתנה 2 מ"ל 0.05 מ' אצטט עם בופר תוך-קיבה; וקבוצה 4 (ביקורת, ללא טיפול). הדגימות נאספו בשעה אחת, שלוש ו-6 שעות לאחר מתן תוך-קיבה. נחקרו בסך הכל 36 חולדות, כאשר 3 בכל קבוצה ב-1 שעה, 3 שעות ו-6 שעות. בכל נקודת זמן מוגדרת, בוצעו תחילה הקלטות ECG. לאחר מכן, חולדות הורדמו ונאספו דגימות דם לניתוח ביוכימי בדם. לאחר איסוף הדם, העכברים הוקרבו, ורקמת הלב נכרתה במהירות. חלקים מרקמת שריר הלב נקבעו לניתוח היסטולוגי (צביעת HE ו-Masson), בעוד שהרקמות הנותרות נשמרו לניתוח ביטוי חלבון באמצעות Western blotting. בניסויים שבדקו את האקטיבטורים והמעכבים של JNK1/2, חולדות SD יחולקו ל-5 קבוצות לפי עקרון הבקרה האקראית: קבוצת המודל קיבלה מתן אקון תוך-קיבה של 2 מ"ג/ק"ג, וקבוצת המעכב קיבלה הזרקה תוך-צפקית של 6 מ"ג/ק"ג SP600125²² בתחילה, ואחריה 2 מ"ג/ק"ג אקון ב-gavage שעתיים לאחר מכן. קבוצת האגוניסטים קיבלה בתחילה זריקה תוך-מוצקית של 0.1 מ"ג/ק"ג אניזומיצין (אניס)^23,24, ואחריה 2 מ"ג/ק"ג אקון ב-gavage שעתיים לאחר מכן. קבוצת ה-DMSO קיבלה הזרקה תוך-פריטונאלית של 2 מ"ל של תמיסה מעורבבת של DMSO 0.8%. קבוצת הביקורת לא קיבלה טיפול. בסך הכול נחקרו 15 חולדות. כל תוצאות הצביעה נותחו באופן עיוור כדי למזער הטיית תצפית. במהלך תקופת הניסוי, העכברים נבדקו באופן רציף למצב הישרדות וסימני רעילות חמורה לאחר מתן אקוניטין. התמותה נרשמה בכל נקודת זמן תצפית מוגדרת (1 שעה, 3 שעות ו-6 שעות). המוות הוגדר כהפסקה מוחלטת של הנשימה ופעימות הלב. בעלי חיים שהפגינו מצוקה קשה, כולל קוצר נשימה מתמשך, אובדן רפלקס יישור, חוסר יכולת ללכת או מצב גוסס, נחשבו כהגיעו לנקודות סיום אנושיות והועתו מיד בהרדמה עמוקה כדי למזער סבל. מספר מקרי המוות של כל קבוצת חולדות (טבלה 1–4).

מעקב אחרי אלקטרוקרדיוגרם עכברים (ECG)

חולדות בכל קבוצה עברו בדיקות ECG. השיטה הספציפית הייתה כדלקמן: לאחר הרדמה בהזרקה תוך-פריטוניאלית של נתרן פנטוברביטל במינון של 30 מ"ג/ק"ג. העכברים היו קבועים בשכיבה על קונסולת הניסוי של בעלי הבית. המחשב חובר למערכת רכישת וניתוח אותות ביולוגיים BL-420N, וחיבור חוט ה-ECG הוכנס ליציאת הקלט התלת-ערוצית של מערכת BL-420N. הסיכות הוכנסו תת-עורית לצד הפנימי של הגפה הקדמית הימנית, האחורית הימנית והאחורית השמאלית של העכברים. הסיכות הושרתו וחוטאו ב-75% אלכוהול לפני הניתוח, וננקטה זהירות להימנע מהחדרת הסיכות לשרירים. לאחר מכן חוברו קליפסי אלקטרודות חוטי ה-ECG לפינים של כל זרוע. מתג ההפעלה ותוכנת המערכת של מערכת רכישת וניתוח אותות ביולוגיים BL-420N הופעלו. ערוץ 3 נבחר לרכישת אות, וסוג האות הוגדר כ-rat ECG. הפרמטרים נקבעו כך: קצב דגימה, 1 kHz; טווח, 2.0 מ"וולט; קבוע זמן (סינון מעבר גבוה), 200 מילישניות (0.80 הרץ); סינון מעבר נמוך, 100 הרץ; מהירות סריקה, 200.0 ms/div; ומסנן החריץ של 50 הרץ כובה. הוקלט א.ק.ג עופרת II, ונצפו שינויים באקג. לאחר שה-ECG התייצב, בוצעו ניטור והקלטה במשך 3 דקות, והנתונים נשמרו על ידי קבוצות לניתוח מאוחר יותר. לאחר הקלטת הא.ק.ג, קליפסי האלקטרודות והסיכות הוסרו, והעכברים הוחזרו לכלוביהם. העכברים נשמרו חמים, ונשימתן נבדקה עד להחלמה מלאה מהרדמה כדי למנוע מוות הקשור לחנק. הקלטות ECG בסיסיות בוצעו ביום הראשון לפני כל טיפול. ביום השני, העכברים קיבלו אקון באמצעות גאווג' תוך-קיבי, ובוצעו הקלטות א.ק.ג' לאחר שעה, 3 ו-6 שעות לאחר המתן באותו הליך.

צביעת המטוקסילין ואאוסין (HE) וצביעת מסון

הלבבות נחתכו במישור הציר הקצר האופקי, ורקמת הלב מקצה הלב של חולדות SD נאספה וקבעה ב-4% פוליפורמלדהיד בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. הרקמות הקבועות יובשו, נוקו בקסילן, והוטמעו בשעווה פרפין. לאחר מכן, קטעים (בעובי 4 מיקרון) צוברו בצביעת HE ו-Masson לפי הנהלים הסטנדרטיים. בצביעת HE, בוצעה צביעת המטוקסילין במשך 2 דקות, ואז הדגימות הושרתו במים חמים למשך דקה אחת, ולאחר מכן בוצעה צביעת אאוזין במשך 30 שניות. בצביעת מסון, צביעו עם תמיסת המטוקסילין מברזל ויגרט למשך 5 דקות, לאחר מכן עם תמיסת מסון כחולה למשך 3–5 דקות, ולבסוף עם תמיסת אנילין כחולה למשך 1–2 דקות. השקופיות נצפו תחת מיקרוסקופ אופטי רגיל. לכל קטע, חמישה שדות מיקרוסקופיים לא חופפים נבחרו באקראי באותו הגדלה, תוך הימנעות מכלים גדולים וממצאים ברורים. שבר נפח הקולגן (CVF) חושב באמצעות ImageJ, לפי משוואה (1):

(1)

מבחן אימונוסורבנט מקושר באנזימים (ELISA)

לאחר רישום ה-ECG, החולדות הורדמו עם נתרן פנטוברביטל, ולאחר מכן בוצעה לפרוטומיה בקו אמצעי לאיסוף דם ורידי. דגימות דם נאספו על ידי ניקוב של הווריד הנוב התחתון באמצעות מחט לאיסוף דם ורידי חד פעמי. הדם דוגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה, והסופרנטנט נאסף לאחר הצנטריפוגה ב-1000 × גרם למשך 20 דקות. ריכוזי CK-MB, AST, LDH, cTn-1 ו-h-FABP נקבעו באמצעות ערכת בדיקה ELISA. ה-ELISA בוצע לפי הוראות היצרן. ערכי הצפיפות האופטית (OD) של כל באר נקבעו ב-450 ננומטר, באמצעות קורא מיקרופלט.

ניתוח ווסטרן בלוטינג

חלבון כולל הופק מרקמות לב באמצעות ערכת חילוץ חלבון. ערכת בדיקת חלבון BCA שימשה לקביעת ריכוז החלבון. החלבון הכולל (נפח הדגימה של החלבון שנבדק היה 10 מיקרוליטר) הופרד עם אלקטרופורזה של 10% ג'ל דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד והועבר לממברנת PVDF, תוך חסימה בחלב רזה של 5% למשך 30 דקות. לאחר מכן, הממברנה דוגרה במהלך הלילה בנוגדן ראשוני JNK1/2 (1:500), p-JNK1/2 (1:1000) ו-GAPDH (1:4000). למחרת, כל הממברנות נשטפו ב-PBST שלוש פעמים, ואז דגרו בנוגדן משני מתאים (1:5000) למשך שעה. לבסוף, שימשו תגובות כימיליומינסנציות משופרות לזיהוי אותות; התמיסה המתפתחת הונחה באופן שווה בזרם על רצועות הממברנה של PVDF ונתנו לדגירה במשך 10 שניות, לאחר מכן חשיפה, התפתחות והדמיה. עוצמות הכתמים המערביים נמדדו באמצעות תוכנת ImageJ.

אימות עגינה מולקולרית

המבנה המולקולרי התלת-ממדי SDF של אקוניטין הורד ממאגר הנתונים PubChem, ומבנה ה-SDF הומר למבנה mol2 באמצעות תוכנת OpenBabel. הרזולוציה הגבוהה ביותר ומבני החלבון הארוכים ביותר של PDB של JNK1 ו-JNK2 הורדו ממאגרי הנתונים Uniprot ו-Protein Data Bank. הידרוגנציה, הסרת ליגנדים והוספת מימן מלאה בוצעו על חלבונים מקרומולקולריים, בעוד שהוספת מימן מלאה וטעינת אלקטרונים בוצעו על תרכובות מולקולות קטנות, והוקמעו קשרי טורסיה. ניסויי עגינה מולקולרית בוצעו באמצעות AutoDock Vina, שם הוגדרו זיקות קישור ≤-7.0 ק"ל/מול כאינדיקציה לאינטראקציות חזקות בין ליגנד לחלבון. PyMol שימש להמחשת המבנה התלת-ממדי של קומפלקס העגינה, ו-Discovery Studio שימש להמחשת המבנה הדו-ממדי של קומפלקס העגינה.

ניתוח סטטיסטי

כל הניסויים חזרו על עצמם שלוש פעמים בנפרד. GraphPad Prism 8 שימש לניתוח וגרף סטטיסטי של כל הנתונים. כל הנתונים הוצגו כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). מבחן ה-t של התלמידים שימש להשוואות בין שתי קבוצות. להשוואות בין קבוצות מרובות באותו נקודת זמן או ניתוחי מסלול זמן באותה קבוצה, נעשה שימוש ב-ANOVA חד-כיווני. p < 0.05 נחשב לציון²⁵ מובהקים סטטיסטית.

תוצאות

תוצאות א.ק.ג' של חולדות לאחר אקון גאווייג'

מחקרים קודמים הראו שההשפעות הרעילות של אקוניטין מתרחשות בשלב המוקדם, בדרך כלל תוך שעות לאחר מתן^26,27. לכן, כדי ללכוד את ההופעה וההתקדמות המוקדמת של קרדיוטוקסיות חריפה בתוך חלון זמן זה, בחרנו שלוש נקודות זמן: 1 שעה, 3 שעות ו-6 שעות לניסויים. תוצאות האלקטרוקרדיוגרם הראו שלאחר שעה, 3 ו-6 שעות של פעולת אקון, לא התרחשו הפרעות קצב בקבוצת הביקורת ובקבוצת האצט, והשינויים ב-ECG לא היו ברורים. חולדות בקבוצת Acon-1mg סבלו מהתכווצויות חדריות מוקדמות וביגמניה חדרית מוקדמת, בהתאמה, שלישיית חדר מוקדמת, טכיקרדיה חדרית קצרה, טכיקרדיה חדרית מונומורפית, טכיקרדיה חדרית דו-כיוונית, ואחת או יותר הפרעות קצב חדרים. חולדות בקבוצת Acon-2 מ"ג פיתחו התכווצויות חדריות מוקדמות מדי, אחת או יותר הפרעות קצב חדרים, כולל ביגמניה חדרית מוקדמת, טכיקרדיה חדרית קצרה, וטכיקרדיה חדרית דו-כיוונית (איור 1, איורים משלימים 1–2). אקון מקדם נזק פתולוגי לשריר הלב ומגביר את צביעת הקולגן ברקמת שריר הלב של חולדות.

רקמת שריר הלב הוערכה באמצעות צביעת HE. התוצאות הראו כי בהשוואה לקבוצת הביקורת וקבוצת האצ'ט, לאחר טיפול של שעה, 3 שעות ו-6 שעות של טיפול באקון, רקמת שריר הלב של חולדות SD בקבוצת Acon-1 מ"ג הראתה קרע חלקי של סיבי שריר שריר הלב, סידור לא מסודר של תאי שריר הלב, האינטרסטיטיום של שריר הלב מתרחב, בצקת מתרחשת באינטרסטיטיום שריר הלב, רוב תאי שריר הלב נפוחים, הגרעינים מוכתמים ומעובים עמוקות, מספר רב של תאי שריר הלב עוברים התדרדרות, ווקואלות עגולות נוצרות בציטופלזמה של סיבי שריר הלב (המסומנות בחצים). הפסים בסיבי שריר ברקמת שריר הלב של חולדות SD בקבוצת Acon-2 mg היו לא ברורים או נעלמו; סידור צרורי השרירים היה רפוי ומבולגן, החללים הבין-שריריים הורחבו, מספר רב של גרעיני תאים היו מוכתמים עמוקות, פיקנוזה גרעינית, בצקת בין-תאית ותאי שריר הלב היו נפוחים ומנוונים. הציטופלזמה של סיבי שריר הלב הראתה ואקואולות עגולות (מוצגות בחצים) (איור 2A, איור משלים 3A, איור משלים 4A).

צביעת Masson בוצעה להערכת הצטברות קולגן ברקמת שריר הלב. בקבוצות הביקורת והאצט, הקרדיומיוציטים הציגו מורפולוגיה תקינה, עם הצטברות קולגן מינימלית שנצפתה באינטרסטיטיום שריר הלב. בקבוצת Acon-1 מ"ג, נצפו עליות קלות בקולגן מוכתם בכחול באזורים מסוימים. בקבוצת Acon-2 מ"ג, אזורים מוכתמים בכחול נרחבים יותר היו מפוזרים ברקמת שריר הלב, בליווי סידור לא מסודר של שריר הלב והפרעה במבנה שריר הלב התקין. היקף צביעת הקולגן בקבוצת Acon-2 מ"ג היה גדול יותר מאשר בקבוצת Acon-1 מ"ג. ניתוח כמותי הראה כי שבר נפח הקולגן (CVF) עלה באופן משמעותי הן בקבוצות Acon-1 מ"ג והן בקבוצות Acon-2 מ"ג בהשוואה לקבוצות הביקורת וה-Acet (n = 3 חולדות לקבוצה, ANOVA חד-כיוווני, p < 0.05). ראוי לציין כי ערך ה-CVF הגיע לרמתו הגבוהה ביותר בקבוצת Acon-2 מ"ג לאחר 6 שעות לאחר מתן תוך-קיבה (איור 2B, איור משלים 3B, איור משלים 4B). בהתחשב בתקופת התצפית הקצרה (1–6 שעות), ממצאים אלו נוטים לשקף שינויים חריפים בין-תכליתיים, כגון בצקת או שינויים בדפוסי צביעת קולגן, מאשר פיברוזיס שריר הלב המוכר. בנוסף, לא נמצא הבדל משמעותי במשקל הלב בין הקבוצות בשעה אחת, 3 שעות ו-6 שעות לאחר טיפול ב-Acon-1 מ"ג או Acon-2 מ"ג (טבלה 5).

Acon מקדם אנזימים לבביים ורמות חלבון לב בדם הוורידי של חולדות

כדי להעריך נזק שריר הלב שנגרם על ידי אקון, מדדנו את רמות הסמנים של פגיעות לבב, כולל CK-MB, AST, LDH, cTn-I ו-h-FABP. בהשוואה לקבוצות הביקורת וה-Acet, קבוצות Acon-1 מ"ג ו-Acon-2 מ"ג הראו עלייה משמעותית ברמות CK-MB, AST, LDH, cTn-I ו-h-FABP בשעה אחת, 3 שעות ו-6 שעות (n = 3 חולדות לקבוצה, ANOVA חד-כיוווני, p < 0.05). יתרה מזאת, באותו זמן, העליות בסמנים אלו היו בולטות יותר בקבוצת Acon-2 mg מאשר בקבוצת Acon-1 mg (p < 0.05) (איור 3).

תוצאות עגינה מולקולרית

כדי לבחון לעומק את השפעת Acon על מסלול האיתות של נזק שריר הלב בעכברים, השתמשנו בעגינה מולקולרית לזיהוי חלבוני מסלול הקשורים ל-Acon. תוצאות העגינה הראו ש-Acon יכול להיקשר באופן יציב לכיסים הפעילים של JNK1 ו-JNK2 באמצעות אינטראקציות לא קוולנטיות מרובות. ב-JNK1, אקוניטין יצר שני קשרי מימן קונבנציונליים עם ALA267 ו-SER299, עם מרחקי קשרים של 2.0 Å ו-2.1 Å, בהתאמה, מה שמעיד על אינטראקציות כיווניות חזקות התורמות לעיגון הליגנד. בנוסף, נצפו אינטראקציות ואן דר ואלס נרחבות בין אקוניטין לשאריות הסובבות, מה שאפשר השלמה מרחבית קרובה בתוך כיס הקשר. אינטראקציות הידרופוביות, כולל אינטראקציות אלקיל/π-אלקיל עם ILE304, ייצבו עוד יותר את הליגנד בתוך המיקרו-סביבה ההידרופובית. זוהו גם קשרי פחמן-מימן, שיצרו רשת אינטראקציה שיתופית התומכת בקישור ליגנדים (איור 4A–C). ב-JNK2, אקוניטין יצר קשר מימן קונבנציונלי אחד עם LEU302 (2.1 Å), ששימש כאינטראקציה עיגונית מרכזית. בדומה ל-JNK1, אינטראקציות ואן דר ואלס, אינטראקציות הידרופוביות וקשרי פחמן-מימן תרמו יחד לייצוב קומפלקס הליגנד–חלבון (איור 4D–F). תוצאות העגינה של התרכובות שנבדקו מדווחות כציוני קישור (קקלורי/מול) ומוצגות בטבלה 6. בסך הכול, קשרי מימן סיפקו ספציפיות ועיגון, אינטראקציות הידרופוביות שיפרו את הטמעת הליגנדים והזיקה לקשר, ואינטראקציות ואן דר ואלס תרמו ליציבות המורכבת הכוללת. ממצאים אלו מצביעים על כך שאקוניטין יכול ליצור קומפלקסים יציבים עם JNK1 ו-JNK2, מה שתומך בפוטנציאל שלו כסוכן מטרה.

אקון מעלה את רמת הזרחון של JNK

כדי לחקור לעומק את השפעת אקון על מסלול האיתות של JNK ברקמת שריר הלב, הוערך ביטוי הזרחון של JNK1/2 באמצעות ווסטרן בלוטינג. בהשוואה לקבוצות הביקורת וה-Acet, קבוצות Acon-1 מ"ג ו-Acon-2 מ"ג הראו עלייה משמעותית ברמות p-JNK1/2 (n = 3 חולדות לקבוצה, ANOVA חד-כיווני, p < 0.05). יתרה מזאת, רמת הזרחון של JNK1/2 הייתה גבוהה משמעותית בקבוצת Acon-2 מ"ג מאשר בקבוצת Acon-1 mg (p < 0.05) (איור 5A). בתוך קבוצת Acon-2 מ"ג, השוואות בין נקודות זמן שונות הראו שרמות p-JNK1/2 עלו באופן משמעותי בשעה אחת, 3 שעות ו-6 שעות, כאשר הרמה הגבוהה ביותר נצפתה ב-6 שעות (n = 3 חולדות לקבוצה, ANOVA חד-כיווני, p < 0.05) (איור 5B). בהתבסס על תוצאות אלו, נבחרה קבוצת Acon-2 מ"ג ב-6 שעות לניסויים הבאים.

מעכב JNK מקל על נזק פתולוגי שריר הלב וצביעת קולגן ברקמת שריר הלב של חולדות

כדי להעריך את התפקיד הרגולטורי של מסלול האיתות של JNK, רמות הביטוי של p-JNK1 ו-p-JNK2 ברקמת שריר הלב הוערכו באמצעות Western blotting. בהשוואה לקבוצות הביקורת ו-DMSO, קבוצת Acon הראתה רמות ביטוי גבוהות משמעותיות של p-JNK1 ו-p-JNK2 (n = 3 חולדות בכל קבוצה, ANOVA חד-כיווני, p < 0.05). בהשוואה לקבוצת Acon, קבוצת Acon+SP600125 הראתה ירידה משמעותית ברמות p-JNK1 ו-p-JNK2 (n = 3 חולדות לקבוצה, ANOVA חד-כיווני, p < 0.05). לעומת זאת, בהשוואה לקבוצת Acon+SP600125, קבוצת Acon + Anis הראתה רמות ביטוי גבוהות משמעותיות של p-JNK1 ו-p-JNK2 (n = 3 חולדות לכל קבוצה, ANOVA חד-כיוווני, p < 0.05) (איור 6).

ההשפעות של אניס ו-SP600125 על נזק שריר הלב נחקרו לעומק. תוצאות צביעת HE הראו שבהשוואה לקבוצת Acon, הבצקת הבין-תאי ברקמת שריר הלב בקבוצת Acon+SP600125 הופחתה, הנפיחות של חלק מהקרדיומיוציטים נעלמה, והציטופלזמה של התא הייתה אחידה. מרחב השרירים מלא, החלל הבין-שרירי נעשה דק יותר, חלק מסיבי שריר הלב מסודרים בצורה הדוקה ומסודרת, מספר קטן של גרעיני תאים מוכתמים עמוקות, והציטופלזמה של סיבי שריר הלב מראה ואקואולות עגולות קטנות, והנזק הפתולוגי של שריר הלב מטופל. בהשוואה לקבוצת Acon+SP600125, בקבוצת Acon + Anis היו סיבי שריר הלב שבורים, פערי שרירים שהורחבו, סיבי שריר הלב היו מסודרים באופן רופף ומסודר, תאי שריר הלב נפוחו ומנוונים, כרומטין גרעיני היה מוכתם עמוק, והתרחש בצקת בין-תאית (איור 7A).

בוצע צביעת מסון להערכת צביעת קולגן ברקמת שריר הלב. בקבוצת Acon+SP600125 נצפו אזורים מתונים עם צבע כחול באינטרסטיטיום שריר הלב. בהשוואה לקבוצת Acon, שבר נפח הקולגן (CVF) בקבוצת Acon+SP600125 ירד משמעותית, מה שמעיד על החלשה של שינויים אינטרסטיציאליים שנגרמו על ידי אקוניטין. לעומת זאת, בקבוצת Acon + Anis נצפו אזורים נרחבים יותר של קולגן מוצבע בכחול באינטרסטיטיום שריר הלב בהשוואה לקבוצת Acon+SP600125, בליווי עלייה משמעותית ב-CVF (n = 3 חולדות לכל קבוצה, ANOVA חד-כיווני, p < 0.05) (איור 7B). בנוסף, לא היה הבדל משמעותי במשקל הלב בין הקבוצות (טבלה 5). בהתחשב בתקופת התצפית הקצרה (1–6 שעות), שינויים אלו נוטים יותר לשקף שינויים אינטרסטיאליים חריפים, כגון בצקת או שינויים בדפוסי צביעת הקולגן, ולא לפיברוזיס שריר הלב המוכר. ממצאים אלו מצביעים על כך SP600125 מקל על פגיעת שריר הלב הנגרמת מאקוניטין, בעוד שאניסומיצין מחמיר עוד יותר נזק שריר הלב בתנאים ניסיוניים אלו.

מעכב JNK מקל על הביטוי של אנזימי לב וחלבוני לב בסרום של חולדות

תוצאות ELISA הראו שבהשוואה לקבוצת ה-Acon, הביטויים של CK-MB, AST ו-LDH ירדו משמעותית בקבוצת Acon + SP600125, בעוד שהביטויים של CK-MB, AST ו-LDH עלו לאחר פעולת Anis (n = 3 חולדות לקבוצה, ANOVA חד-כיווני, p < 0.05). בנוסף, בהשוואה לקבוצת ה-Acon, הביטוי של cTn-I ו-h-FABP ירד משמעותית בקבוצת Acon + SP600125 (n = 3 חולדות לקבוצה, ANOVA חד-כיווני, p < 0.05). בהשוואה לקבוצת Acon + SP600125, הביטוי של cTn-I ו-h-FABP עלה משמעותית בקבוצת Acon + Anis (n = 3 חולדות לקבוצה, ANOVA חד-כיווני, p < 0.05) (איור 8A–8B).

זמינות נתונים:

כל הנתונים הגולמיים ששימשו במחקר זה זמינים בקבצים המשלימים המצורפים לכתב היד.

איור 1: איור אלקטרוקרדיוגרם של הפרעת קצב בחולדות (לאחר 6 שעות של פעולה אקון). מלמעלה למטה, קבוצת הביקורת, קבוצת האסט, קבוצת Acon-1 מ"ג, וקבוצת Acon-2 מ"ג. סוגי הפרעות קצב ב-Acon-1mg-A-gavage וב-Acon-2 mg-A-gavage (לפי סדר הופעת הפרעות קצב מלמעלה למטה): Acon-1mg-A-gavage: התכווצויות חדריות מוקדמות; ביגמניה חדרית מוקדמת; טכיקרדיה חדרית דו-כיוונית. Acon-2 mg-A-gavage: התכווצויות חדרים מוקדמות מדי; ביגמניה חדרית מוקדמת; פרץ קצר של טכיקרדיה חדרית. קיצורים; B-gavage = לפני Gavage של אקון; A-gavage = אחרי Acon gavage. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: נזק לשריר הלב וצביעת קולגן ברקמת שריר הלב של העכברים, כפי שצוין על ידי צביעת HE ו-Masson. (A) השינויים הפתולוגיים ברקמת שריר הלב של העכברים זוהו על ידי צביעת HE (החץ הצהוב מציין את הוואקואולות העגולות שנוצרו על ידי קרדיומיוציטים פגועים); פס קשקשים = 100 מיקרון. (B) צביעת קולגן ברקמת שריר הלב של חולדה זוהתה באמצעות צביעת מסון; קנה מידה = 50 מיקרון. ממוצע ± SD, n = 3. כל ערכי P חושבו באמצעות ניתוח חד-כיווני עצמאי של שונות. *p < 0.05, **p < 0.01. 40x ו-400x. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

איור 3: רמות CK-MB, AST, LDH, cTn-I ו-h-FABP בסרום חולדה הצביעו על נזק שריר הלב. (A–F). רמות CK-MB, AST, LDH, cTn-I ו-h-FABP נמדדו באמצעות ערכות ELISA. ממוצע±SD, n = 3. כל ערכי ה-p חושבו באמצעות ניתוח חד-כיווני עצמאי של שונות. *p < 0.05, **p < 0.01. קיצורים; CK-MB = קריאטין קינאז-MB; AST = אספרטט אמינוטרנספראז; LDH = לקטט דה-הידרוגנאז; cTn-I = טרופונין לבבי I; h-FABP = חלבון קושר חומצות שומן מסוג לב. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: תוצאות העגינה המולקולרית של Acon עם מסלול JNK. (A–B) ו-(D–E) דיאגרמות האינטראקציה הדו-ממדיות של Acon עם חלבון JNK1/2. (C) ו-(F) דיאגרמות האינטראקציה התלת-ממדיות של Acon עם חלבון JNK1/2. קיצורים; JNK = ק-ג'ון N-טרמינל קינאזה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5: אקון מעלה את רמת הזרחון של JNK. (A–B) רמות הביטוי של p-JNK1/2 ו-JNK1/2 ברקמות שריר הלב של חולדות זוהו באמצעות Western blotting. ממוצע ± SD, n = 3. כל ערכי ה-p חושבו באמצעות ניתוח חד-כיווני עצמאי של שונות. *p < 0.05, *p < 0.01. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 6: מעכב JNK מעכב פוספורילציה של JNK מושרה על ידי אקון. רמות הביטוי של p-JNK1/2 ו-JNK1/2 ברקמות שריר הלב של חולדות זוהו באמצעות Western blotting. ממוצע ± SD, n = 3. כל ערכי ה-p חושבו באמצעות ניתוח חד-כיווני עצמאי של שונות. *p < 0.05, **p < 0.01. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 7: מעכב JNK מקל על נזק פתולוגי שריר הלב וצביעת קולגן בעכברים. (א) השינויים הפתולוגיים ברקמות שריר הלב של העכברים זוהו על ידי צביעת HE (החץ הצהוב מציג את הוואקואולות העגולות שנוצרו על ידי קרדיומיוציטים פגועים); קנה מידה = 100 מיקרון. (B) צביעת קולגן ברקמת שריר הלב של חולדה זוהתה על ידי צביעת מסון; קנה מידה = 50 מיקרון. ממוצע±SD, n = 3. כל ערכי ה-p חושבו באמצעות ניתוח חד-כיווני עצמאי של שונות. *p < 0.05, **p < 0.01. 40 ו-400x. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של האיור הזה.

איור 8: מעכב JNK מוריד את רמות CK-MB, AST, LDH, cTn-I ו-h-FABP בסרום חולדות. (A–B) רמות הביטוי CK-MB, AST, LDH, cTn-I ו-h-FABP זוהו על ידי ערכות בדיקה ELISA. כל ערכי ה-p חושבו באמצעות ניתוח חד-כיווני עצמאי של שונות. ממוצע±SD, n = 3. *p < 0.05, **p < 0.01. קיצורים; CK-MB = קריאטין קינאז-MB; AST = אספרטיט אמינוטרנספראז; LDH = לקטט דה-הידרוגנאז; cTn-I = טרופונין לבבי I; h-FABP = חלבון קושר חומצות שומן מסוג לב. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

	שליטה	אסט	אקון-1 מ"ג	Acon-2 מ"ג
עכברים	9	9	9	9
מספר מקרי המוות של עכברים	0	0	0	0

טבלה 1: מספר מקרי המוות של עכברים לאחר שעה אחת של פעולת אקון. שעה לאחר מתן Acon, אף חולדה לא מתה בקבוצת הביקורת, קבוצת Acet, קבוצת Acon-1 mg, וקבוצת Acon-2 mg. (מספר בעלי החיים שנכללו בניתוח לכל קבוצה היה 3, ועכברים מתים לא הוחלפו).

	שליטה	אסט	אקון-1 מ"ג	Acon-2 מ"ג
עכברים	9	9	9	9
מספר מקרי המוות של עכברים	0	0	0	0

טבלה 2: מספר מקרי מוות של עכברים לאחר 3 שעות של פעילות אקון. 3 שעות לאחר מתן האקון, לא מתו עכברים בקבוצת הביקורת, קבוצת האסטים, קבוצת אקון-1 מ"ג וקבוצת אקון-2 מ"ג. (מספר בעלי החיים שנכללו בניתוח לכל קבוצה היה 3, ועכברים מתים לא הוחלפו).

	שליטה	אסט	אקון-1 מ"ג	Acon-2 מ"ג
עכברים	9	9	9	9
מספר מקרי המוות של עכברים	0	0	4	4

טבלה 3: מספר מקרי המוות של עכברים לאחר 6 שעות של פעילות אקון. 6 שעות לאחר מתן Acon, 4 מתוך 9 חולדות מתו בקבוצת Acon-1 mg, ו-4 מתוך 9 עכברושים מתו בקבוצת Acon-2 mg. (מספר בעלי החיים שנכללו בניתוח לכל קבוצה היה 3, ועכברים מתים לא הוחלפו).

	שליטה	DMSO	אקון	Acon + SP600125	אקון + אניס
עכברים	9	9	9	9	9
מספר מקרי המוות של עכברים	0	0	3	1	3

טבלה 4: מספר מקרי המוות של עכברים לאחר אניס ופעולות SP600125. מספר מקרי המוות של חולדות השתנה בין קבוצות טיפול שונות: בקבוצת Acon-2 מ"ג, 3 מתוך 9 חולדות מתו; בקבוצת Acon+SP600125, 1 מתוך 9 חולדות מתה; ובקבוצת Acon + Anis, 3 מתוך 9 חולדות מתו. (מספר בעלי החיים שנכללו בניתוח לכל קבוצה היה 3, ועכברים מתים לא הוחלפו).

קבוצה	משקל הלב (g)
שליטה	0.71 ± 0.03
אסט	0.73 ± 0.02
אקון-1 מ"ג (שעה)	0.73 ± 0.06
Acon-2mg (שעה)	0.75 ± 0.02
Acon-1mg (3 שעות)	0.71 ± 0.04
Acon-2mg (3 שעות)	0.77 ± 0.03
Acon-1 מ"ג (6 שעות)	0.72 ± 0.03
Acon-2mg (6 שעות)	0.77 ± 0.02
DMSO	0.70 ± 0.03
Acon + SP600125	0.74 ± 0.03
אקון + אניס	0.75 ± 0.04

טבלה 5: משקל הלב של חולדות. לא היה הבדל משמעותי במשקל הלב בין הקבוצות.

ליגנד	JNK1	JNK2
אקון	-7.8 קק"ל/מול	-8.41 קקלור/מול

טבלה 6: תוצאות מחקרי העגינה המולקולרית. ציוני העגינה בין Acon ל-JNK1 הם -7.8 Kcal/mol, וציוני העגינה בין Acon ל-JNK2 הם -8.41 Kcal/mol.

איור משלים 1: איור אלקטרוקרדיוגרם של הפרעת קצב בעכברים (לאחר שעה של פעולה אקון). מלמעלה למטה, קבוצת הביקורת, קבוצת האסט, קבוצת Acon-1 מ"ג, וקבוצת Acon-2 מ"ג. סוגי הפרעות קצב ב-Acon-1mg-A-gavage וב-Acon-2 mg-A-gavage (לפי סדר הופעת הפרעת קצב מלמעלה למטה): התכווצויות חדריות מוקדמות מדי; ביגמניה חדרית מוקדמת; שלישיית חדר מוקדמת; טכיקרדיה חדרית קצרה; דופק חדרי מונומורפי טכיקרדיה; טכיקרדיה חדרית דו-כיוונית. Acon-2 mg-A-gavage: טכיקרדיה חדרית דו-כיוונית. קיצורים; B-gavage = לפני Gavage של אקון; A-gavage = אחרי Acon gavage. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2: איור אלקטרוקרדיוגרם של הפרעת קצב בעכברים (לאחר 3 שעות של פעולה אקון). מלמעלה למטה, קבוצת הביקורת, קבוצת האסט, קבוצת Acon-1 מ"ג, וקבוצת Acon-2 מ"ג. סוגי הפרעות קצב ב-Acon-1mg-A-gavage וב-Acon-2 mg-A-gavage (לפי סדר הופעת הפרעת הקצב מלמעלה למטה): התכווצויות חדריות מוקדמות; התפרצויות קצרות של טכיקרדיה חדרית; טכיקרדיה חדרית דו-כיוונית. Acon-2 mg-A-gavage: התכווצויות חדרים מוקדמות; טכיקרדיה חדרית דו-כיוונית. קיצורים; B-gavage = לפני Gavage של אקון; A-gavage = אחרי Acon gavage. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 3: אקון מקדם נזק לשריר הלב וצביעת קולגן לאחר שעה של פעולת אקון. (א) השינויים הפתולוגיים ברקמות שריר הלב של העכברים זוהו על ידי צביעת HE (הערה: החץ הצהוב מציג את הוואקואולות העגולות שנוצרו על ידי קרדיומיוציטים פגועים); קנה מידה = 100 מיקרון. (B) פיברוזיס ברקמת שריר הלב של חולדה זוהה על ידי צביעת מסון; קנה מידה = 50 מיקרון. ממוצע ± SD, n = 3. כל ערכי ה-p חושבו באמצעות ניתוח חד-כיווני עצמאי של שונות. *p < 0.05, **p < 0.01, 40x ו-400x. אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 4: אקון מקדם נזק שריר הלב וצביעת קולגן לאחר 3 שעות של פעולה אקון. (א) השינויים הפתולוגיים ברקמות שריר הלב של העכברים זוהו על ידי צביעת HE (החץ הצהוב מציג את הוואקואולות העגולות שנוצרו על ידי קרדיומיוציטים פגועים); קנה מידה = 100 מיקרון. (B) צביעת קולגן ברקמת שריר הלב של חולדה זוהתה על ידי צביעת מסון; קנה מידה = 50 מיקרון. ממוצע ± SD, n = 3. כל ערכי ה-p חושבו באמצעות ניתוח חד-כיווני עצמאי של שונות. *p < 0.05, **p < 0.01. 40x ו-400x. אנא לחץ כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

אקון עלול לגרום להפרעות קצב ונזק לשריר הלב; עם זאת, המנגנונים הבסיסיים של נזק שריר הלב שנגרם מאקון עדיין אינם ברורים. במחקר זה, הוכח בהצלחה מודל עכברוש להרעלת אקון חריפה עם פגיעת שריר הלב. תוצאות אלו הראו כי הפעלת מסלול האיתות של JNK עשויה לייצג מנגנון מרכזי במורד הזרם בנזק לשריר הלב הנגרם מהרעלת אקון חריפה. באופן ספציפי, רמות הפוספורילציה של JNK1/2 היו גבוהות באופן משמעותי בעכברים עם הפרעות קצב ונזק שריר הלב שנגרמו על ידי אקון. יתרה מזאת, עיכוב מסלול JNK הפך חלקית את הנזק לשריר הלב שנגרם מהרעלת אקון חריפה. ממצאים אלו מצביעים על כך שהפעלת מסלול JNK ממלאת תפקיד חשוב בפתוגנזה של נזק שריר הלב שנגרם מאקוניטין.

הסיבה העיקרית למוות מהרעלת אקון חריפה היא טוקסיות לב. מחקרים קודמים הראו שלאחר טיפול באקון, סיבי שריר הלב בעכברים הפכו מתנוונים ובלתי מסודרים, צביעות גרעיניות העמיקו, התרחש חדירת נויטרופילים, והופיעו ואקואולות עגולות²⁸. זה תואם לתוצאות המחקר. צביעת HE גילתה כי רקמת שריר הלב בקבוצת הטיפול באקון הראתה שינויים פתולוגיים, כולל סידור חבילות שרירים לא יציב, הרחבת פערי השרירים וקרע של סיבי השריר. בנוסף, בתנאים רגילים, אנזימי הלב CK-MB, AST, LDH וחלבוני לב cTn-I ו-h-FABP נמצאים בכמויות קטנות מאוד בסרום²⁹. כאשר תאי שריר הלב נפגעים, הסמנים הללו ישוחררו לדם בכמויות גדולות 30,31,32,33.

תוצאות המחקר מראות כי CK-MB, AST, LDH, cTn-I ו-h-FABP בסרום הוורידי של חולדות בקבוצת Acon gavage עלו ברמות שונות בכל נקודת זמן תצפית. רמת הביטוי היא הגבוהה ביותר לאחר 6 שעות במתן תוך-קיבה. ממצא זה תואם למחקרים קודמים³⁴. הם מצאו ש-Acon גרם לנזק לקרדיומיוציטים H9C2 בעכברים והגביר את רמות AST. בינתיים, מחקרים קודמים השתמשו ב-Acon כדי לגרום לנזק שריר הלב בעכברים, במטרה לחקור את השפעות הנוגדים על נזק שריר הלב³⁵. הם מצאו שרמות LDH ו-CK-MB בסרום של חולדות עם נזק שריר הלב היו גבוהות. בקיצור, תוצאות הניסוי של זיהוי מפרקי סמני נזק שריר הלב מראות שמודל החולדה של נזק שריר הלב שנגרם מהרעלת אקון חריפה ניתן להוכחה בהצלחה 1, 3 ו-6 שעות לאחר מתן 1–2 מ"ג/ק"ג אקון תוך-קיבה. אפקט המידול של 2 מ"ג/ק"ג אקון לאחר מתן תוך-קיבה למשך 6 שעות הוא הטוב ביותר, ועונה על דרישות הניסויים הבאים.

מחקרים מצאו כי השפעת אקון על תעלות היונים Na⁺ ו-Ca2⁺ מובילה לעלייה בריכוז יוני הסידן התוך-תאי, מה שמפעיל עוד יותר את מסלול האיתות של P38-MAPK ומפעיל את תגובת מפל JNK 36,37,38. הפעלת JNK תקדם נזק שריר הלב^39,40. זה תואם את תוצאות הניסוי הזה. במחקר זה מצאנו ש-Acon קידם את הפוספורילציה של JNK1/2 בקרדיומיוציטים והפעיל את מסלול האיתות של JNK. דבר זה מצביע על כך שהפעלת JNK עשויה לייצג תגובת איתות במורד הזרם התורמת לנזק שריר הלב הנגרמת על ידי אקוניטין. עם זאת, המנגנונים המולקולריים והפרמקוקינטיים שמאחורי גירוי הזרחון של JNK1/2 על ידי אקון דורשים מחקר נוסף.

מחקרים הראו שכאשר כמות גדולה של JNK1/2 עוברת פוספורילציה, מסלול האיתות של JNK מופעל, מה שמתווך את הביטוי הבלתי מבוקר של גנים בגרעין הקרדיומיוציטים ומפריע למחזור התא. עיכוב מסלול האיתות של JNK יכול להקל על נזק שריר הלב^41,42. בתוצאות ה-HE, מעכב מסלול JNK SP600125 יכול להפחית משמעותית את השינויים הפתולוגיים ברקמת שריר הלב שנגרמים על ידי Acon. בינתיים, מחקרים קודמים הראו כי במודל של חולדה של אוטם שריר הלב החריף שנגרם על ידי קשירת עורק כלילי, סיבי קולגן מוכתמים בכחול והצטברות קולגן ברקמת שריר הלב עלו משמעותית, בליווי הפעלת מסלול האיתות JNK. טיפול בגרגירי רפואה סינית מסורתית הפחית את הצטברות הקולגן בשריר הלב באמצעות עיכוב מסלול האיתות JNK^43,44.

בעכברים עם פגיעת שריר הלב הסוכרתית, תכולת סיבי הקולגן (צביעה כחולה) ושבר נפח הקולגן (CVF) עלתה משמעותית. במקביל, נתיב האיתות של JNK הופעל. דווח כי אתנול במינון נמוך מעכב את הפעלת מסלול JNK, ובכך מפחית את העלייה בשקיעת סיבי קולגן ו-CVF ברקמת שריר הלב של חולדות^. במחקר הנוכחי, ניתוח עגינה מולקולרי הראה כי אקוניטין עשוי לקיים אינטראקציה עם JNK1 ו-JNK2 דרך אינטראקציות לא קוולנטיות מרובות; עם זאת, תוצאות אלו צריכות להיחשב כראיות תומכות ואינן מהוות הוכחה ישירה לקשירה פיזיולוגית. יתרה מזאת, ניסויים ב-vivo הראו ש-Acon, כגורם לחץ, הגביר את הפוספורילציה של JNK1/2, ובכך מפעיל את מסלול האיתות של JNK. הפעלה זו הייתה קשורה להגברת הצטברות הקולגן (צביעת כחול) ולעלייה ב-CVF ברקמת שריר הלב של חולדות, מה שהוביל בסופו של דבר לנזק שריר הלב. עם זאת, הוספת מעכב JNK SP600125 עיכבה משמעותית את ההשפעות הרעילות של Acon, והפחיתה את העלייה בערך CVF של רקמת שריר הלב. נזק לשריר הלב משבש את שלמות קרום שריר הלב התקין ואובדן תכולה תוך-תאית למרחב החוץ-תאי, מה שמתבטא ברמות מוגברות של אנזימי שריר הלב בדם^46,47. תוצאות אלו הראו כי העלייה ברמות האנזימים של שריר הלב בדם חולדות גם מצביעה על כך שאקון גרם לנזק לשריר הלב. במקביל, מעכבי JNK עיכבו את הפרשת אנזימי שריר הלב, מה שמרמז כי מעכבי JNK יכולים להקל חלקית על הנזק לשריר הלב שנגרם על ידי Acon.

יש להכיר בכמה מגבלות של מחקר זה. ראשית, גודל המדגם בכל נקודת זמן היה קטן יחסית (n = 3 לכל קבוצה), מה שעשוי להגביל את עוצמת הניתוחים הסטטיסטית, ולא בוצע ניתוח עוצמה פורמלי לפני קביעת גודל המדגם. בנוסף, הוערכו רק טווח מינון אחד של אקוניטין ותקופות תצפית קצרות יחסית (1–6 שעות), מה שהגביל את ההערכה של שינויים פתולוגיים ארוכי טווח ויחסי תגובה למינון. שנית, אף על פי שהגברת הפוספורילציה של JNK1/2 והתערבות פרמקולוגית הצביעו על מעורבות מסלול האיתות של JNK בפגיעה בשריר הלב הנגרמת על ידי אקוניטין, המנגנונים הממשיכים המקשרים בין חשיפה לאקוניטין להפעלת JNK לא נחקרו במלואם. ידוע כי אקוניטין משפיע בעיקר על תעלות Na⁺ עם שערי מתח ועל הומאוסטזיס תוך-תאי של Ca²⁺, מה שעשוי לתרום להפעלת JNK במורד הזרם. עם זאת, אירועי איתות קשורים, כולל מסלולי עומס חמצוני ועומס סידן, לא נבדקו ישירות במחקר הנוכחי. שלישית, ניתוח העגינה המולקולרי סיפק רק ראיות תומכות לאינטראקציות פוטנציאליות בין אקוניטין ל-JNK1/2 ולא ייצג קישור פיזיולוגי ישיר. לא בוצעה אימות ניסויי נוסף, כגון תהודה של פלזמון שטחי או בדיקות משיכה למטה. יתרה מזאת, רק JNK1/2 נחקרו, בעוד שהתפקיד הפוטנציאלי של JNK3 ברעילות הלב הנגרמת מאקוניטין נותר לא ברור. לבסוף, לא בוצעה הערכה אלקטרוקרדיוגרפית לאחר SP600125 או התערבות אניסין. לכן, האם ויסות מסלול JNK משפיע ישירות על הפרעות קצב חדריות הנגרמות מאקוניטין דורש בדיקה נוספת.

לסיכום, Acon מפעיל את מסלול האיתות של JNK, כפי שניתן לראות על ידי זרחון מוגבר של JNK1/2, שעשוי לתרום לנזק שריר הלב, כפי שמעידים הצטברות קולגן מוגברת ושחרור אנזימי לב מוגבר ברקמת שריר הלב של חולדות. בהתחשב בכך שקרדיוטוקסיות הנגרמת על ידי אקוניטין כוללת אירועים רבים במעלה הזרם, כולל הפעלת תעלת Na⁺, עומס יתר של Ca²⁺ ולחץ חמצוני, הפעלת מסלול JNK עשויה לייצג אירוע איתות מרכזי במורד הזרם התורם לנזק שריר הלב.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
4% פאראפורמלדהיד	חברת ווהאן סרוויס-ביו בע"מ.	HJ203501	קיבוע רקמות
אקוניטין (אקון)	צ'נגדו דה-סיטה ביולוגי טכנולוגיה בע"מ.	DRK-0335-960330	תרכובת רעילה למודל גאבאג'
תמיסת אנילין בלו	בייג'ינג סולארביו בע"מ	G1350	צביעת מסון
אניסומיצין (אניס)	MedChemExpress בע"מ	153154	מפעיל/בקרת מסלול JNK
ערכת אסט אליסה	חברת ווהאן חואמי ביוטכנולוגיה בע"מ.	CSB-E13023r	זיהוי אנזימי לב
אוטודוק וינה	קוד פתוח	לא זמין	עגינה מולקולרית
ערכת בדיקת חלבון BCA	סאנגון ביוטכנולוגיה (שנגחאי, סין)	לא צוין	כימות חלבונים
צנטריפוגה	דונגגואן cnzcn בע"מ.	TD5M-WS	1000 פעמים; צנטריפוגציה G
תוכנת Chem3D	פרקיןאלמר	לא זמין	מזעור אנרגיית ליגנד
CK-MB אליסה קיט	חברת ווהאן חואמי ביוטכנולוגיה בע"מ.	CSB-E14403r	זיהוי אנזימי לב
ערכת cTn-I ELISA	חברת ווהאן חואמי ביוטכנולוגיה בע"מ.	CSB-E08594r	זיהוי חלבוני לב
מחט לאיסוף דם ורידי חד-פעמי	KINDLY Co., Ltd.	https://www.kdlchina.cn/specimen-collection/220.html	איסוף דם
תגובת כימילומינסנציה משופרת (ECL)	מיליפור בע"מ.	21302A4	המחשת כתמים מערביים
אאוסין	בייג'ינג סולארביו בע"מ	20200905	H& צביעת E
GraphPad Prism 8	GraphPad Software, Inc.	לא זמין	ניתוח סטטיסטי
המטוקסילין	חברת ווהאן סרוויס-ביו בע"מ.	CR2203066	H& צביעת E
ערכת אליסה h-FABP	חברת ווהאן חואמי ביוטכנולוגיה בע"מ.	CSB-E16184r	זיהוי חלבוני לב
ImageJ Software	המכונים הלאומיים לבריאות (NIH)	לא זמין	כימות כתם מערבי
JNK1/2 נוגדן ראשוני	HuaAn Biotechnology (האנגג'ואו, סין)	ET1609-42	נוגדן ווסטרן בלוט
ערכת LDH ELISA	ביוטכנולוגיה מקושרת באנזימים בשנגחאי	ml003416	זיהוי אנזימי לב
פתרון מסון כחול	בייג'ינג סולארביו בע"מ	20220303	צביעת מסון
קורא מיקרופלט	תרמו פישר סיינטיפיק	ME001000C	מדידת ELISA OD (450 ננומטר)
מיקרוסקופ אופטי (Olympus C33)	אולימפוס (טוקיו, יפן)	C33	הדמיה היסטולוגית
שעוות פרפין	Leica  Co., Ltd.	2110068	הטמעת רקמות
בופר PBST	מיילונביו בע"מ	MA0015-אפריל-27G2	בופר שטיפה
p-JNK1/2 נוגדן ראשוני	HuaAn Biotechnology (האנגג'ואו, סין)	ET1601-28	נוגדן JNK מזרחן
מאגר נתוני חלבונים (PDB)	RCSB	https://www.rcsb.org/	מקור מבנה החלבון
ערכת חילוץ חלבון	סאנגון ביוטכנולוגיה (שנגחאי, סין)	C510003-0050	הפקת חלבון רקמה
מאגר הנתונים PubChem	NIH	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov	מקור מבנה הליגנד
ממברנת PVDF	מיליפור בע"מ.	R1PB81493	ממברנת העברת כתם מערבי
PyMOL	Schrö דינגר, בע"מ.	https://pymol.org/	ויזואליזציה של עגינה
ג'ל SDS-PAGE (10%)	בייג'ינג סולארביו בע"מ	817X031	אלקטרופורזה של חלבונים
אבקת חלב רזה	בייג'ינג סולארביו בע"מ	http://www.solarbio-hd.com/solarbiohd-Products-23261665/	מגיב חוסם (5%)
נתרן פנטוברביטל	תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ.	57-33-0	הרדמה לפרוצדורות בבעלי חיים
SP600125 (מעכב JNK)	MedChemExpress בע"מ	112518	מעכב מסלולי JNK
מתקן דיור בעלי חיים SPF	אוניברסיטת קונמינג לרפואה	לא זמין	תנאי מגורים לבעלי חיים
עכברי ספרג-דולי (זכר, חודשיים, ~230 גרם)	בייג'ינג חואפוקאנג ביולוגית טכנולוגיה בע"מ.	http://www.hfkbio.com/	בעלי חיים ניסיוניים (n = 51)
וייגרט ברזל המטוקסילין	גואנגג'ואו וקסיס בע"מ	18092001	צביעת מסון
קסילן	Tianjin Tjhxsj Co., Ltd.	20220208	ניקוי רקמות