בידוד חזק וזיהוי מרובה תאים נדירים במחזור באמצעות מיקרופלואידיקה צנטריפוגלית רציפה ואימונוציטוכימיה של הידרוג'ל

סיכום

מחקר זה מציג תהליך מיקרופלואידי צנטריפוגלי רציף לבידוד וזיהוי יעיל של תאים נדירים בסירקולציה. המערכת מאפשרת שליטה מדויקת בנוזלים וממזערת אובדן תאים, ומאפשרת ניתוח סימולטני של תת-סוגים מרובים של CRC, כולל CTCs ו-cCAFs, לשיפור דיוק האבחון.

תקציר

תאים נדירים (CRCs) במחזור הדם, כולל תאי גידול במחזור (CTCs) ופיברובלסטים הקשורים לסרטן (cCAFs), הם סמנים ביולוגיים מבטיחים לאבחון ופרוגנוזה. עם זאת, השפע הנמוך מאוד שלהם וההטרוגניות הפנוטיפית שלהם הופכים את הבידוד היעיל והניתוח הרב-פרמטרי למאתגרים טכנית. כאן, אנו מציגים תהליך מיקרופלוידי צנטריפוגלי רציף לבידוד וזיהוי רציפים של CRCs מדם מלא. המחסנית מורכבת מחמישה תאים מחוברים עם שסתומים נשלטים המאפשרים טיפול מדויק במדיום הדם והמדיום במהלך הצנטריפוגה. בהתבסס על פלטפורמת העשרה מאומתת בעבר, זרימת העבודה הנוכחית משלבת קיבוע תאים מבוססי הידרוג'ל עם אימונוציטוכימיה מרובה לתמיכה בזיהוי ואפיון של תת-סוגים שונים של CRC, כולל CTCs ו-cCAFs. לאחר הבידוד, התאים מוחזקים בתוך מטריצת הידרוג'ל כדי לתמוך בשימור התאים במהלך צביעת חיסון חוזרת וניתוח מבוסס הדמיה. באמצעות זרימת עבודה זו, זוהו גם CTCs וגם cCAFs מאותו מדגם, מה שהדגים את היתכנות הניתוח המשולב של אוכלוסיות תאים נדירים מרובות במחזור בתוך זרימת ביופסיה נוזלית אחת. פלטפורמה זו מספקת גישה מעשית וניתנת לשחזור לאפיון תאים נדירים במורד הזרם ביישומי ביופסיה נוזלית.

מבוא

תאים נדירים במחזור הפעולה (CRCs) מוגדרים כתאים הקיימים בזרם הדם בתדירות נמוכה מאוד בהשוואה לרכיבי דם רגילים כמו תאי דם אדומים, תאי דם לבנים וטסיות דם. CRCs מגיעים ממקורות מגוונים, כגון תוצרי לוואי של תהליכים ביולוגיים, שיקום רקמות, החלמת פצעים או פגיעות וסקולריות. דוגמאות מייצגות כוללות תאי אנדותל במחזור הדם, תאי עובר במחזור הדם, מגהקריוציטים, אריתרובלסטים, ותאי אב או גזע שונים ^1,2. למרות שקיומם של CRCs לבדו אינו משקף בהכרח מצב פתולוגי, רמות גבוהות מעידות לעיתים קרובות על מצבים פיזיולוגיים או פתולוגיים חריגים ^3,4. בהתאם לכך, זיהוי ואפיון רגישים של CRCs מספקים תובנות חשובות לגבי תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים דינמיים המתרחשים בגוף.

מבין תתי-הסוגים של CRC, תאי גידול במחזור (CTCs) ופיברובלסטים הקשורים לסרטן (cCAFs) הם סמנים ביולוגיים מרכזיים של סרטן. CTCs מספקים ראיות ישירות להתפשטות תאי הגידול ונחקרים באופן נרחב⁵. שינויים בספירת ה-CTC קשורים לעיתים קרובות לגילוי מוקדם, פרוגנוזה ומעקב אחר תגובה טיפולית⁶. במקביל, cCAFs מייצגים רכיבים סטרומליים שנשפכים לזרם הדם, המשקפים אינטראקציות בין מיקרו-סביבת גידול ויצירת נישה טרום-גרורתית⁷. עם זאת, בהשוואה ל-CTCs, המחקר על cCAFs נשאר מוגבל, והשימושיות הקלינית שלהם רק מתחילה להיחקר^.

CTCs ו-cCAFs עשויים לספק מידע ביולוגי משלים בביופסיה נוזלית, שכן CTCs משקפים התפשטות תאי גידול ותכונות גרורות, בעוד ש-cCAFs עשויים לייצג אותות התקדמות של סטרומל וסביבת מיקרו-סביבה של גידול. ניתוח סימולטני של שתי אוכלוסיות התאים הנדירים הללו עשוי לתמוך בהבנה משולבת יותר של התקדמות הסרטן מאשר ניתוח של כל אחת מהקבוצות בלבד. עם זאת, התועלת הקלינית והתרגומית שלהם מוגבלת משמעותית בשל נדירות קיצונית בדם היקפי, היעדר סמנים מקובלים אוניברסלית של cCAFs, וההטרוגניות המשמעותית של ביטוי הסמנים בין תת-אוכלוסיות תאים, שיחד מקשישים זיהוי אמין. לכן, מזעור אובדן תאים במהלך העשרה וזיהוי הוא קריטי להבטחת ניתוח אמין וחזק. יתרה מזאת, אפיון מקיף של המגוון הפונקציונלי והסמנים של CTCs ו-cCAFs חיוני להבהרת תפקידם בגרורות ולפיתוח סמנים ביולוגיים בעלי משמעות קלינית ^8,9.

כאן, אנו מציגים שיטה לבידוד סימולטני של cCAFs ו-CTCs^10,11, בשילוב זיהוי רב-סמני באמצעות עטיפת הידרוג'ל של תאים נדירים באימונוציטוכימיה (ICC)¹². שיטות בידוד CRC הנוכחיות מתמודדות לעיתים עם מגבלות טכניות, כולל אובדן תאים במהלך עיבוד רב-שלבי, לכידת תאים פנוטיפיים הטרוגניים מוגבלת, והטיית בחירה הקשורה לאסטרטגיות העשרה תלויות סימנים. לעומת זאת, הפלטפורמה המיקרופלואידית הצנטריפוגלית הרציפה ששימשה במחקר זה מבוססת על מסגרת העשרה מקיפה, ובכך מפחיתה את התלות בסמני ברירה חיובית קונבנציונליים. הביצועים האנליטיים והזרימה של פלטפורמת ההעשרה הבסיסית תוארו במחקרים הקודמים^{שלנו 9}.

בהתבסס על פלטפורמה מאומתת זו, המחקר הנוכחי מתמקד בשילוב של קיבוע תאים מבוססי הידרוג'ל ואימונוציטוכימיה מרובת תאי דם, כדי לאפשר בידוד וזיהוי מקיף של אוכלוסיות תאים נדירים מרובות, כולל CTCs ו-cCAFs, במסגרת זרימת עבודה מאוחדת. על ידי שילוב העשרה, שמירת תאים יציבה וניתוח חוזר תואם צביעה, פרוטוקול זה מספק מסגרת מעשית לניתוח משולב של תאים נדירים מדגימות ביופסיה נוזלית.

פרוטוקול

כל ההליכים שכללו דגימות דם אנושיות ממטופלים ותורמים בריאים בוצעו בהתאם להנחיות ועדת הביקורת המוסדית (IRB) של בית החולים סברנס. פרוטוקול המחקר אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של בית החולים סברנס (IRB מס' 4-2013-0059). החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת המכשיר

1. לחץ על מתג ההפעלה כדי להדליק את הכלי.
2. הפעל את מתג הנעילה בלייזר , ואז הפעל את מתג ההפעלה של הלייזר .
3. הפעל את תוכנת ההפעלה וודא שהמערכת מאתחלת כרגיל.
4. מהממשק הראשי של התוכנה, בחרו ב-Device Operation ובחרו את הפרוטוקול המוקדם מראש לדגימות דם מלאות סטנדרטיות של EDTA.

2. הפעלת המכשיר^{- שלב ראשון}

הערה: פרטים על מיקום הכניסה ומבנה המחסנית מוצגים באיור 1A.

1. מהכניסה 6, הוסיפו 2 מ"ל של מגיב A (מדיום גרדיאנט צפיפות) לתא ההתחלתי.
2. מהכניסה 8, הוסף 875 מיקרוליטר של תגובת A לתא ההתרוקנות.
3. התקן את המחסנית על מתקן הדיסק, כדי להבטיח איזון נכון לצנטריפוגה.
4. לחץ על כפתור הדלת ב-CTCeptor כדי לפתוח את המתקן, ואז התקן את מתקן הדיסקים על ה-CTCeptor ואבטח אותו באמצעות ברגי הקיבוע.
5. לחץ על כפתור הדלת כדי לסגור את המתקן, והרץ את שלב ה-Spin Down באמצעות תוכנת CTCeptor (כ-30 שניות).
6. לאחר אישור שה-Reagent A הועבר לחלק התחתון של התא ההתחלתי, שחרר את ברגי הקיבוע והוציא את מתקן הדיסק מהכלי תוך שמירה על המחסנית מותקנת.

3. הפעלת המכשיר^{- שלב שני}

1. לפני טיפול בדגימות דם, יש לבצע את כל ההליכים בארון בטיחות ביולוגית מוסמך ולבוש ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות, חלוק מעבדה והגנה לעיניים, בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדיות.
2. לאחר הסרת המחסנית מהכלי, הזרקו 3 מ"ל דם לתא ההתחלתי דרך פתח 6.
3. התקן את מתקן הדיסקים על ה-CTCeptor ואבטח אותו באמצעות ברגי הקיבוע.
4. הרץ את שלב הסרת תאי הדם הדומים באמצעות תוכנת CTCeptor (כ-40 דקות). במהלך שלב זה, הצנטריפוגציה מפרידה בין פלזמה, תאי דם אדומים ותאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) בתוך המחסנית, והחלק המכיל PBMC מועבר לתא הבא לדלדול הלויקוציטים הבא.
5. לאחר סיום שלב הסרת ה-RBC, הסר את מדף הדיסקים מהמכשיר.

4. הפעלת המכשיר^{- שלב שלישי}

1. חטא בזהירות את אזור העבודה כדי לשמור על סטריליות.
2. מערבולת את התגובה B (חרוזי בידוד לויקוציטים) כדי להבטיח השעיה הומוגנית.
3. הכינו את בופר הכביסה על ידי ערבוב DPBS חופשי של Ca²⁺^{/Mg 2}⁺ עם 0.1% BSA ו-2 mM EDTA (pH 7.4).
4. העבר את נפח ה-Reagent B הרצוי לצינור בנפח 1.5 מ"ל (למשל, 50 מיקרוליטר לכל מחסנית).
5. הוסיפו את בופר הכביסה בנפח פי חמש מ-React B, וערבבו בעדינות באמצעות פיפטינג.
6. מניחים את הצינור על מעמד מגנטי למשך דקה אחת כדי לאפשר לחרוזים ב-React B להצטבר, ואז להשליך בזהירות את הסופרנטנט.
7. החזירו את החרוזים לבופר הכביסה בנפח השווה לנפח החרוז ההתחלתי.
8. אחסן את החרוזים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד השימוש.
9. מיד לפני השימוש, מערבבים 50 מיקרוליטר מהחרוזים המוכנים עם 50 מיקרוליטר DPBS, וטעינו 100 מיקרוליטר מהתערובת לתוך פתח 7.
10. התקן את מתקן הדיסקים על ה-CTCeptor ואבטח אותו באמצעות ברגי הקיבוע.
11. הרץ את שלב הסרת WBCs באמצעות תוכנת CTCeptor (כ-50 דקות). בשלב מתוכנת זה, חרוזי הבידוד הטעונים של הלויקוציטים מעורבבים עם השבר המכיל PBMC על ידי ניעור לקידום קישור בין החרוז ל-WBC, ולאחר מכן הסרה מבוססת צנטריפוגציה של חלק ה-WBC הקשור בחרוזים.
12. לאחר השלמת שלב הסרת ה-WBCs, הסר את מדף הדיסקים מהכלי.

5. איסוף דגימה

1. הכנס קצה פיפטה לפתח 9 של התא הסופי ותלה מחדש את התכולה, ואז העבר את הדגימה שנאספה לצינור של 15 מ"ל.
2. הזרקו 2 מ"ל DPBS ליציאה 9, שטפו את התא היטב על ידי פיפטינג, והעבירו את השטיפה לאותו צינור של 15 מ"ל.
3. חזור על שלב הכביסה פעמיים.
4. כוונו את נפח הנוזל שנאסף בצינור של 15 מ"ל ל-14 מ"ל עם DPBS, סגרו את הצינור וערבבו בעדינות באמצעות היפוך.
5. צנטריפוגה את הצינור ב-380 × גרם למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
6. הסר בזהירות את הסופרנטנט, השאיר כ-1 מ"ל, והשתמש במתלה שנותר לניתוח במורד הזרם.

6. זיהוי CRCs

1. להכנת פולימר קדם-הידרוג'ל, יש לערבב את ה-DPBS החופשי של Ca^2⁺/Mg^2⁺, תמיסת HypICC (תמיסת A (פרה-פולימר), ו-Photoinitiator ביחס של 80:20:1.
2. מערבבים 870 מיקרוליטר של מתלה CRC עם 270 מיקרוליטר פולימר קדם-הידרוג'ל.
3. העבר את התערובת לתא HypICC ולצנטריפוגה ב-500 × גרם למשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים לשקוע בפלטפורמה.
4. הכנס את בקר העובי לתא ה-HypICC כדי לקבוע את עובי ההידרוג'ל.
5. הקרינו את הדגימה באור UV (365 ננומטר) למשך 20–30 שניות מהתחתית כדי לקשר בין שכבת ההידרוג'ל.
6. הסר את בקר העובי ושטוף את התאים המכוסים בהידרוג'ל שלוש פעמים עם DPBS.
7. מקבע את התאים עם 4% פאראפורמלדהיד (PFA) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ואז שטוף את הדגימות שלוש פעמים עם DPBS, 10 דקות כל אחת.
8. חדרו את התאים עם 0.05% טריטון X-100 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. אחר כך שטוף את הדגימות שלוש פעמים עם DPBS, 10 דקות כל אחת.
9. חסום את הדגימות עם 2% BSA למשך שעה בטמפרטורת החדר.
10. דגרו את הדגימות בנוגדנים ראשוניים במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
11. שטוף את הדגימות חמש פעמים עם DPBS, 20 דקות בכל שטיפה.
12. צבעו את הגרעינים ב-Hoechst במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ואז שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם DPBS, 10 דקות כל אחת.
13. במידת הצורך, ניתן לבצע דגירה משנית של נוגדנים בתנאים ללילה כמו דגירה ראשונית.
14. בצע הדמיית מיקרוסקופ פלואורסצנצי וזיהוי CRCs.

7. צביעת חיסון מולטיפלקס של CRCs

1. לאחר צביעת חיסון והדמיה, CRCs יכולים לעבור סבב נוסף של צביעת נוגדנים לאחר הכיבוי.
2. הכינו תמיסת קירור המורכבת מ-4.5% H₂O₂ ו-24 mM NaOH ב-PBS.
3. הסר את ה-DPBS מתא ה-HypICC והוסף את תמיסת הקירור.
4. דגור במשך שעה בטמפרטורת החדר תחת אור לבן עם ניעור.
5. החלף את תמיסת הכיבוי ודגרה למשך שעה נוספת באותם תנאים.
6. שטוף את הדגימות ארבע פעמים עם DPBS למשך 10 דקות בכל שטיפה.
7. התחל מחדש את הליך הצביעה החיסונית משלב החסימה עם 2% BSA.

תוצאות

איור 1A מציג תמונה של מחסנית בודדת המשמשת לבידוד תאים נדירים. המחסנית מורכבת מחמישה תאים נפרדים המחוברים על ידי מיקרו-תעלות ושסתומים נשלטים שמווסתים את זרימת הנוזלים. מבנה המחסנית הוא כדלקמן: (1) תא פלזמה שאוסף פלזמה מופרדת מדם מלא; (2) תא ראשוני שבו הדם המלא מופרד לשכבות פלזמה, תאי דם אדומים ו-PBMC; (3) תא ערבוב שבו משולבים PBMCs מבודדים עם חרוזי בידוד לויקוציטים; (4) תא התרוקנות שמסיר לויקוציטים; (5) תא סופי לאיסוף שבר התא הנדיר המועשר; (6) פתח לטעינה של ד...

דיון

CRCs הם סמנים ביולוגיים חשובים בעלי ערך פוטנציאלי הן לאבחון סרטן והן לפרוגנוזה. עם זאת, כדי לשפר את התועלת הקלינית של ניתוח CRC, חשוב ללכת על טווח רחב יותר של אוכלוסיות CRC מגוונות בפנוטיפית ולתמוך באפיון רב-פרמטרי מקביל¹³. בנוסף, עדויות הולכות וגדלות באונקואימונולוגיה מצביעות על כך שרכיבי מערכת החיסון ומיקרו-סביבת הגידול ממלאים תפקידים קריטיים בעיצוב התגובה הטיפולית, ומדגישים את הצורך להתקדם מעבר למידע ממוקד תאי הגידול בלבד¹⁴. שיקולים אלו ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
15 mL Conical Tube	SPL	50015
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28908
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-545-152
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-585-003
Bovine Serum Albumin	GenDepot	A0100-010
CD45 antibody	Biolegend	304060
CellTracker Green CMFDA	Invitrogen	C7025
CTCD	CTCELLS	CTD-C103	Disc cartridge
CTCD rack	CTCELLS	CTDR-CM3	Disc rack
CTCeptor	CTCELLS	CTM-C2203	CTCeptor
CTR-S Reagent A	CTCELLS	CTR-S1001	density gradient media
CTR-S Reagent B	CTCELLS	CTR-S1002	leukocyte isolation beads
FAP antibody	Invitrogen	PA5-99313
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
HypICC Photoinitiator	CTCELLS	CTR-G1002
HypICC Solution A	CTCELLS	CTR-G1001
HypICC Unit	CTCELLS	CTH-V01	HypICC chamber
Latex glove	Ansell	93743080
Magnetic stand			Fabricated in-house using a 3D printer
Manual Pipetting  (0.5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Manual Pipetting  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
pancytokeratin antibody	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Welegene	LB001-02
SMA antibody	Invitrogen	PA5-18292
Tip, 10 µL	TipOne	9104020333
Tip, 1250 µL	TipOne	9104020740
Tip, 200 µL	TipOne	9104020422
Triton X-100	Signma	X100-100ML
Whole Blood			Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA
β actin antibody	abcam	ab8226