מודל עכברים מקיף להערכת מסלולי העברת כבד באמצעות דגימת לימפה וכלי דם בו-זמנית

סיכום

פרוטוקול ניסויי זה מתאר מודל עכברוש מחובר לצינור לימפה כבד, המאפשר הערכה ישירה וכמותית של ניקוז לימפה וכלי דם בכבד. המודל מאפשר דגימה סימולטנית של לימפה כבדית ודם מערכתית כדי לחקור העברת כבד, מטבוליזם ואיתות חיסוני, ותומך במחקרים של פרמקוקינטיקה של תרופות וביולוגיה ספציפית לכבד.

תקציר

הכבד הוא מרכז מטבולי ואימונולוגי מרכזי המעבד חומרים מזינים, זנוביוטיקה ומתווכים חיסוניים במחזור הדם. חומרים מגיעים להפטוציטים ולשאר תאי הכבד דרך הנימים הסינוסואידיים שמקבלים דם מהמעי דרך וריד הפורטל ומהמחזור המערכתי דרך עורק הכבד. סינון פלזמה מהנימים הסינוסואידיים מתנקז אל חלל הדיסה, שם הוא יכול לעבור טרנספורמציה מטבולית, להשתתף במעקב חיסוני או לזרום לכלי לימפה ליצירת לימפה כבדית. דגימה של לימפה כבדית ודם יכולה לסייע בניתוח מפורט של הובלת כבד, תהליכים מטבוליים ופעילות חיסונית. מודל עכברוש כירורגי המאפשר דגימה סימולטנית של יציאת הלימפה הכבדית ודם מערכתית דרך שלושה אתרי קנולציה מובחנים: צינור הלימפה הכבדית, עורק התרדמה ווריד יוגולרי. קנולה לימפה כבדית ועורקית מאפשרות דגימה רציפה, בעוד שקנולה וריד הג'וגולרי יכולה לשמש להידרציה רציפה ותמיכה בנוזלים או לאיסוף דם ורידי, מה שמאפשר השוואה בין דם עורקי לוורידי. קנולציה מוצלחת מניבה קצב זרימת לימפה כבדית של כ-0.1 מ"ל לשעה בעכברים מורדמים, מה שמאפשר דגימת לימפה רציפה של עד 8 שעות תוך ביצוע דגימת דם עורקית וורידית בו-זמנית. מערכת זו מאפשרת השוואה ישירה בין דם עורקי מערכתי לזרימת הלימפה הכבדית, ומאפשרת בדיקה מקיפה של הובלת כבד ופינוי הכבד, וכן תהליכי איתות מטבוליים וחיסוניים. כדי להרחיב את המודל, ניתן לבצע דגימה סופית של עורק הכבד ווריד הפורטל בסוף ההליך כדי לאפשר השוואה ישירה של זרימת כניסה, זרימה יוצאת וניקוז לימפה מהכבד. בסופו של דבר, טכניקות אלו מספקות פלטפורמה גמישה להערכת תהליכים כבדיים, כולל פרמקוקינטיקה של תרופות, שטף חומרים מזינים ומטבוליזם, ותגובות ספציפיות לכבד, בתנאים פתופיזיולוגיים שונים.

מבוא

הכבד הוא איבר מטבולי ואימונולוגי מרכזי האחראי לעיבוד חומרים מזינים, ניקוי רעלים זנוביוטיים ומעקב חיסוני. הכבד הוא האיבר המפיק לימפה הגדול ביותר בגוף. מחקרים ביונקים גדולים מצביעים על כך שהוא תורם 25%–50% מסך זרימת הלימפה ^1,2. במכרסמים, מחקרי קנולציה מראים שכ-10%–20% מכלל זרימת הלימפה בחזה נובעת מהכבד ^3,4. הלימפה הכבדית מקורה בפלזמה המסוננת על פני האנדותל המחובר של הנימים הסינוסואידליים בתוך הפרנכימה של הכבד. הסינון הזה מתאסף במרחב Disse, תא אינטרסטיציאלי בין הפטוציטים לתאי אנדותל סינוסואידיים. הסינון עובר אז דרך מרחב מאל אל אל נימי לימפה פורטליים שמתכנסים לכלי איסוף המתנקזים לכיוון הילום הכבדי והצירנה כילי ^5,6.

מערכת הלימפה הכבדית מחולקת אנטומית לרשתות פורטל, תת-קפסולריות ותת-לובולריות ^6,7. מחקרים עדכניים בהדמיה וולומטרית מראים כי הלימפה הכבדית מהווה רשת תלויה בגורם גדילה וסקולרי אנדותליאלי C (VEGF-C) עם התשלופות הגבוהה, המוגבלת בעיקר למסלולי הפורטל. רשת זו מורכבת בעיקר מנימי לימפה שמתנקזים רטרוגרדית לכיוון וריד הפורטל. לעומת זאת, הלימפטים התת-קפסולריים והתת-לובולריים, המפוזרים לאורך פני השטח הכבדי ובאזורים הוורידיים המרכזיים, בהתאמה, הם נתיבי ניקוז נוספים. הדמיה לאחר המוות האנושית חשפה רשת כלי לימפה צפופה לאורך ורידים כבדיים, מה שמעיד כי פריפורטל ולימפה ורידית כבדית מווסתות יחד את יציאת הלימפה מהכבד⁸.

לימפה כבדית מייצגת אולטרה-פילטרט שמקורו בפלזמה, המשקף^הן תהליכים מטבוליים והן תהליכים חיסוניים^. ניתוחים ביוכימיים מראים כי לימפה כבדית מכילה אלבומין, ליפופרוטאינים, ציטוקינים ומטבוליטים שמקורם בפעילות פרנכימית כבדית ^3,4,6, בהתאם לפרופיל הפרוטאומי הכללי של נוזל הלימפה המדווח ברקמות אחרות¹⁰. מחקרים מוקדמים הראו שלימפה כבדית מכילה מחלקות ליפופרוטאין מובחנות, כאשר ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה (HDL) מייצגים חלק דומיננטי, בהתאם לתפקיד המרכזי של הכבד בסינתזה ובשיקום HDL¹¹. ראוי לציין כי מחקרים עדכניים יותר הראו כי לימפה כבדית מועשרת באסטרים של HDL וכולסטרול בהשוואה ללימפה מזנטרית, מה שמדגיש את תרומתה הייחודית לתנועת שומנים ולהעברה הפוכה של כולסטרול³. יתרה מזאת, הלימפה הכבדית משמשת כצינור חיסוני, הנושא מתווכים חיסוניים, תאים מציגים אנטיגן וווסיקולות חוץ-תאיות המקשרות בין מיקרו-סביבות כבדיות למערכת החיסון^9.

שינויים ביצירת ולימפה בכבד ובניקוז הם מאפיינים מרכזיים של מחלת הכבד. בשחמת כבד ויתר לחץ דם פורטלי, לחץ סינוסואידלי מוגבר גורם לעלייה פי כמה בייצור הלימפה, מה שמוביל ללימפנגיאקטזיה, פיברוזיס ואסציטס לאחר שיכולת הניקוז חורגת. פגיעה כרונית בכבד גם מקדמת לימפנגיה תלויה ב-VEGF-C/VEGFR-3, כאשר עיצוב לימפתי מופרז או חריג תורם לדלקת כבד, בצקת והצטברות שומנים ^9,12. יתרה מזאת, במחלת כבד סטאטית הקשורה לתפקוד מטבולי לקוי (MASLD) ובקרצינומה הפטותאלולרית, הוכח כי צפיפות לימפה כבדית מוגברת קשורה להתקדמות המחלה ולגרורות^13,14.

למרות התפקיד הפיזיולוגי והקליני המרכזי של הלימפה הכבדית, היא נותרת לא נחקרת מספיק ואינה נחקרה במחקר ניסיוני, בעיקר בשל אתגרים טכניים בבידוד לימפה כבדית טהורה. מודלים של איסוף לימפה חזה ומזנטר תוארו באופן נרחב יותר, אך הם מספקים רק תובנות עקיפות לגבי מנגנוני ההובלה בכבד. מגבלה בתחום טופלה על ידי פיתוח מודל קנולציית לימפה כבדית לעכברוש, שאפשר איסוף ישיר של לימפה כבדית⁴. באמצעות גישה זו, הוכח כי רוב קליטת הלימפה של חלבונים טיפוליים הניתנים לווריד מתרחשת בכבד ובמזנטריה. ממצאים אלו מדגישים את הלימפה הכבדית כדרך מרכזית להחלפת מקרומולקולות בין מערכת הדם והלימפה, עם השלכות חשובות על הפרמקוקינטיקה והפצה של תרופות ביולוגיות⁴.

כדי לגשר על הפערים שנותרו, המחקר הנוכחי מתאר מודל מקיף לעכברים המאפשר דגימה סימולטנית של לימפה כבדית ודם מערכתית באמצעות קנולציה של צינור הלימפה הכבדית, עורק הקרוטיד והווריד היוגולרי. גישה זו מאפשרת הערכה בזמן אמת של העברת המומסים בין מרחב בין-תחום הכבדי והמערכתית, ומספקת פלטפורמה ניסויית איתנה לחקר הובלת כבד, חילוף חומרים, איתות חיסוני ונטייה לתרופות בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. המודל כולל גם דגימה סופית אופציונלית של עורק הכבד ווריד הפורטלי, כדי לאפשר השוואה ישירה של זרימת כניסה, יציאה וניקוז לימפה מהכבד.

איור 1. שרטוט של מודל הרב-קנולציה לדגימת לימפה ודם בו-זמנית. מודל קנולציה מקיף המדגים דגימה סימולטנית מהעורק הקרוטידי, וריד הג'וגולרי, עורק הכבד, צינור הלימפה הכבדי והוריד הפורטלי. (א) העורק התרדמי עובר קנולציה לדגימת דם לסירוגין. (B) הווריד היורדי החיצוני עובר קנולציה להזרמה רציפה של מלח כדי לשמור על הידרציה ולפצות על אובדן נוזלים במהלך הדגימה. (ג) העורק הכבדי המשותף, הפועל במקביל לצינור הלימפה הכבדית, עובר קנולציה לדגימת דם סופית. (D) צינור הלימפה הכבדי עובר קנולציה לאיסוף רציף של הלימפה. (ה) וריד הפורטל נגיש באמצעות דקירה במחט לדגימת דם סופית. הפרוצדורות המוצגות ב-(A), (B) ו-(D) מתבצעות לפני דגימה סופית, ואחריהן (C) דגימת עורק כבד ולאחר מכן (E) דגימת וריד פורטל. קיצורים: EJV, וריד צווארי חיצוני; CA, עורק הקרוטיד; SVC, וריד נבוב עליון; IVC, וריד נבוב תחתון; או, אאורטה; CHA, עורק כבד נפוץ; HL, תעלת הלימפה הכבדית; ML, תעלת הלימפה המזנטרית; SMA, עורק מזנטרי עליון; PV, וריד פורטל. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים שכללו בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים של מכון מונאש למדעי התרופות (מזהה אתיקה #46283) ונערכו בהתאם בקפדנות להנחיות המועצה האוסטרלית וניו זילנדית לטיפול בבעלי חיים במחקר והוראה (ANZCCART) ולקוד האוסטרלי לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות (המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי, אוסטרליה)¹⁵.

מודלים של בעלי חיים: זכרים או נקבות חולדות אלבינו ראטוס נורבגיקוס, או עכברי ספרג–דולי (SD) במשקל 250–350 גרם. בעלי החיים הושגו מספקי בעלי חיים במעבדה מורשים (פלטפורמת מחקר בעלי החיים של מונאש) והוחזקו בכלובים מאווררים בנפרד בטמפרטורה מבוקרת (22 ± 2 מעלות צלזיוס) ובמחזור אור–חושך של 12 שעות, עם גישה חופשית למזון ומים לפני הניסויים. בעלי החיים הסתגלו לפחות שבוע לפני הניתוח כדי למזער שונות פיזיולוגית הקשורה ללחץ.

מתואר מודל קנולציה של צינור הלימפה הכבדית, עורק הקרוטיד ווריד היוגולרי, המאפשר דגימה סימולטנית של לימפה כבדית ודם מערכתית. ניתן לבצע דגימה סופית אופציונלית של עורק הכבד ווריד הפורטלי תחת הרדמה לצורך ניתוח השוואתי של זרימת הכבד הנכנסת והיציאה הלימפאתית. הריאגנטים והציוד המשמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנות ביום שלפני הניתוח

1. צום עם העכברוש ללילה אם נדרש לפרוטוקול הניסוי הספציפי. הבטיחו גישה חופשית למים בכל עת.
2. הכינו תמיסת מלח סטרילית לעירוי תוך ורידי במהלך איסוף הלימפה. קבעו את הנפח הנדרש בהתבסס על משך האיסוף (בדרך כלל 3–5 שעות) וקצב עירוי מומלץ של 1.5–3.0 מ"ל/שעה כדי להחליף אובדן נוזלים כתוצאה מאיסוף לימפה ודם, וכן על אובדן פיזיולוגי כמו פליטת שתן.
3. הכינו שלושה קנולות פוליאתילן לקניולציה של צינור הלימפה הכבדית, עורק הקרוטיד והוריד היוגולרי כדלקמן:
   1. צינור הלימפה הכבדי
      1. חתכו קנולה בקוטר חיצוני של 0.8 מ"מ (O.D.), ו-0.5 מ"מ בקוטר פנימי (I.D.) ל-30–35 ס"מ. ודא שהאורך מאפשר איסוף ללא מתח.
      2. הטה את קצה ההחדרה בזווית של כ-45° עם להב ניתוחי סטרילי כדי להקל על ההכנסה.
   2. עורק הקרוטיד
      1. חתכו קנולה 0.8 מ"מ O.D., 0.5 מ"מ מזהה ל-20–30 ס"מ. סמן כ-2–2.5 ס"מ מהקצה הפנימי כדי להצביע על עומק ההכנסה.
   3. וריד הג'וגולרי
      1. חתוך קנולה של 0.8 מ"מ O.D., 0.5 מ"מ מזהה או 0.96 מ"מ O.D., 0.58 מ"מ I.D. ל-50 ס"מ או יותר. סמן 1–1.5 ס"מ מהקצה הפנימי לעומק החדרה. ודא שהאורך יכול להגיע למשאבת ההזלפה ללא מתח.
4. הכינו תמיסה נוגדת קרישה הכוללת 0.1% EDTA במים סטריליים או 20 IU/mL הפארין במי מלח סטריליים.
5. מלאו מזרק של 1 מ"ל בתמיסת נוגדי קרישה וחברו מחט 25G לקנולות O.D. של 0.8 מ"מ או מחט 23G לקנולות O.D. של 0.96 מ"מ.
6. שטפו כל קנולה בערך פי שלושה בנפח הפנימי שלה, כדי לוודא שלא נשארו בועות אוויר.
7. השאר את הקנולות מלאות בנוגדי קרישה וסגורות עם המחט והמזרק המחוברות למשך הלילה. השרייה מוקדמת עם נוגד קרישה ממזערת את יצירת הקרישים.
8. הכינו צינורות איסוף לדם ולימפה. הוסיפו תמיסת נוגדי קרישה להשגת ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל EDTA או 10 IU/mL הפארין לאחר איסוף הדגימות.

2. הכנות מיד לפני הניתוח

1. שטוף את כל הקנולות בנוגדי קרישה כדי לוודא את הבריאות. ודא שאין בועות אוויר.
2. השרה הרדמה בעכברוש עם 5% איזופלוראן בחמצן בקצב של 1 ליטר לדקה בתא השראה.
3. יש לעקוב אחרי הנשימה ולוודא שהקצב האט לכ-1.5 נשימות לשנייה (כ-90 נשימות לדקה), מה שמעיד על עומק הרדמה מספק.
   אזהרה: איזופלוראן הוא חומר הרדמה נדיף ויש להשתמש בו בתוך מערכת הרדמה מאווררת כראוי או במכסה אדים כדי למזער חשיפה תעסוקתית.
4. העבר את העכבר לכרית ניתוח מחוממת (37°C) ושמור על הרדמה עם 1–3% איזופלורן בחמצן המסופק ב-0.4–0.6 ליטר לדקה דרך קונוס אף.
5. ודאו עומק הרדמה מספק בהיעדר רפלקסים של הקרנית וצביטת האצבעות. שמרו על הרדמה לאורך כל הניתוח ותקופת איסוף הלימפה.
   הערה: הרדמה רציפה חיונית למניעת כאב במהלך ניתוח ולמניעת התפרקות קנולה עקב תנועה.
6. גילוח אזורי ניתוח, כולל הרבע הימני של הבטן (קו האמצע עד הצד הימני, כ-2 ס"מ מתחת לצלעות) ואזור הבריח הימני או השמאלי.
7. חטא את כל אזורי הניתוח באמצעות 0.5% כלורהקסידין ואחריו 70% אתנול.

3. קנולציה של עורק הקרוטיד

הערה: הקנולציה של עורק התרדמה עשויה להתבצע לפני או אחרי הקנולציה של הווריד היוגולרי.

1. שמור על אותה תנוחה גבית וחתך צוואר הרחם.
2. הניחו תמיכה קטנה (למשל, מזרק של 3 מ"ל) מתחת לצוואר כדי להרים את אזור הקרוטיד.
   הערה: שלב זה הוא אופציונלי.
3. הפרדו את שרירי הצוואר כדי לחשוף את עורק התרדמה כ-1 ס״מ מתחת לפני העור.
4. בודד את העורק באמצעות מלקחיים מעוקלים של הקשתית. זהה והפרד בעדינות את עצב הואגוס הסמוך כדי למנוע נזק לעצב.
5. הניחו מלקחיים ישרים של גראף מתחת לעורק כדי לחסום את זרימת הדם והבריחו תחתיו שני תפרי משי 4-0. קשור היטב את התפר הפרוקסימלי (הגולגולתי).
6. עשה חתך קטן על פני העורק.
7. הרם בעדינות את פתח הכלי עם קצה מלקחי העדשה כדי לייצב את לומן הכלי להכנסת הקנולה.
8. הכנס את הקנולה לעומק המסומן מראש של 2–2.5 ס"מ. צפו לזרימה חוזרת קלה; אם זה מופרז, חסימו מחדש ונקו לפני הממשיכים.
   אזהרה: ניקור כלי דם וקנולציה כוללים כלים חדים ויש לבצע אותם בזהירות כדי למנוע פציעה מקרית.
9. אשר את המיקום הנכון על ידי משיכת כמות קטנה של דם בעדינות והחדרת תמיסת נוגדי קרישה חזרה לקנולה מבלי להרגיש התנגדות או להבחין בנפיחות תת-עורית.
10. אבטח את הקנולה עם תפרים ואטום את הקצה החיצוני עם פקק.
11. ניתן לעצור את ההליך לזמן קצר לאחר קנולציה של עורק התרדמה תוך שמירה על הרדמה.
12. סגור את הפצע בצוואר עם תפרים סטריליים. סקירה של בידוד עורקי הקרוטיד והקנולציה המוצלחת מוצגת באיור 2.

איור 2: קנולציית עורק התרדמים. (א) שרירי הצוואר הזוגיים משני צידי עורק התרדמה (חצים כתומים). בלוטת הרוק (חצים כחולים) מכובדת בראש. (B) עורק התרדמה החשוף נמצא כ-1 ס"מ מתחת לפני העור. בלוטת הרוק (חצים כחולים) מכובדת בראש. (ג) סידור ניתוחי לפני הכנסת הקנולה, המראה חסימת זרימת דם עם מלקחיים ישרים של גראף ושני תפרי משי שמבודדים את העורק, כאשר הקצה העליון קשור. (ד) כ-2 ס"מ מהקנולה מוכנס בהצלחה לעורק התרדמה (חצים צהובים). קנולה עורק התרדמה מסומנת על ידי החצים הירוקים. (ה) אישור מוצלח של עורק הקרוטיד אושר על ידי משיכת דם אל הקנולה. (F) שלושה תפרים (גודל 4-0) נקשרים סביב עורק התרדמה וקנולה לצורך קיבוע (חצים סגולים). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

4. קנולציה של הווריד היוגולרי

1. מקם את העכברוש בשכיבה גבית עם הצוואר מורחב והראש מעט שמאלה.
2. זהה את הווריד היוגולרי מעל עצם הבריח לפי מיקומו וזרימת הדם הנראית לעין. בצע חתך אלכסוני באורך 1–1.5 ס"מ מהבריח לכיוון קנה הדרך.
3. נתח בצורה ישירה את הרקמה התת-עורית כדי לחשוף את הווריד.
4. הפרד את הווריד מרקמת החיבור הסובבת באמצעות מלקחיים מעוקלים של הקשתית. אשר בידוד על ידי העברת מלקחיים מתחת לווריד.
5. הנח שני תפרי משי 4-0 מתחת לווריד בכל קצה של הקטע החשוף. קשור היטב את התפר הגולגולתי (העליון) כדי לחסום את זרימת הדם.
6. כדי למנוע זרימת דם חזרה, מניחים מלקחיים ישרים של גראף מתחת לווריד והניחו את הידיות על מזרק או תמיכה.
7. בצע חתך קטן (~1 מ"מ) בחלק העליון של הווריד, שליש לאורך המקטע המבודד באמצעות מספריים של איריס.
8. הרם בעדינות את פתח הכלי עם קצה מלקחי העדשה כדי לייצב את לומן הכלי להכנסת הקנולה.
9. הכנס את קצה הקנולה לחתך באמצעות מלקחי קשתית והתקדמו לעומק המסומן מראש (1–1.5 ס"מ).
10. שחרר את החסימה לאחר שהקנולה מתייצבת כדי לאפשר זרימת דם.
    הערה: שמור על אחיזה יציבה כדי למנוע זרימה ורידית לאחור. אם מתרחש דימום, יש לסגור מחדש מיד ולנקות את השדה לפני הממשיכים.
11. אשר את המיקום הנכון על ידי משיכת כמות קטנה של דם בעדינות והחדרת תמיסת נוגדי קרישה חזרה לקנולה מבלי להרגיש התנגדות או להבחין בנפיחות תת-עורית.
12. אבטח את הקנולה עם תפרים גם בקצוות הפרוקסימלי וגם בקצה המרוחק.
13. סתום זמנית את הצינור החיצוני, הסר את המזרק ואטום את הקנולה עם פקק.
14. כסו את החתך בגזה שהולחה במי מלח חמים עד להשלמת הקנולציה של עורק הקרוטיד. תמונות מייצגות של בידוד ורידים ג'וגולריים וקנולציה מוצגות באיור 3.

איור 3: קנולציה של ורידי הג'וגולרי. (א) הווריד היוגולרי (קו שחור מנוקד) ממוקם ממש מתחת לעור מעל עצם הבריח. הקנולה של עורק הקרוטיד המוכרת נצפית קרוב לווריד היוגולרי (חצים ירוקים). (ב) הווריד היוגולרי מבודד בשני תפרי משי; הקצה העליון נקשר. (C) כ-1 ס"מ מהקנולה מוכנס בהצלחה לווריד היוגולרי (חצים צהובים). הקנולה של וריד הג'וגולרי מסומנת על ידי החצים הכחולים; קנולה עורק התרדמת מסומנת על ידי החצים הירוקים. (ד) שלושה תפרים (גודל 4-0) נקשרים סביב הווריד היוגולרי והקנולה לצורך קיבוע (חצים סגולים). קנולציה מוצלחת של וריד הג'וגולרי אושרה על ידי הזרקת מי מלח חלקים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

5. קנולציה של צינור הלימפה הכבדי

1. מקם את העכברוש בשכיבה גבית תחת מיקרוסקופ כירורגי.
2. יש ליצור חתך אופקי בעור בגודל 4–5 ס"מ מהקו האמצעי ועד לצד ימין, כ-1.5–2 ס"מ מתחת לצלעות (איור 4A, B).
3. למשוך את העור ולבצע חתכים תואמים בשרירים האלכסוניים החיצוניים והפנימיים.
4. צרוב או קשור כל כלי דם גדול שנתקלו בהם כדי למנוע איבוד דם מופרז.
5. הזזו בעדינות את האיברים באמצעות מטשי כותנה רטובים במי מלח: הזזו את הכבד לכיוון הסרעפת, הקיבה שמאלה, והמעי הדק תחתון.
6. שמור על איברים נסוגים עם גזה ספוגה במי מלח. אתר החתך ומיקום האיברים מוצגים באיור 4C.
7. לזהות את צינור הלימפה הכבדי (קוטר ~0.6 מ"מ) באמצעות סימני ציון אנטומיים מוכרים. הצינור עובר במקביל ומעט זנב לעורק הכבד, שוכב מדיאלית לכליה הימנית ובסמוך לווריד הנבוב התחתון.
8. התבונן במראה צינור הלימפה הכבדית. בדרך כלל הוא נראה שקוף וציר.
9. יש להבחין בין צינור הלימפה הכבדי לבין צינור הלימפה המזנטרי, שהוא גדול יותר ובדרך כלל נראה אטום או לבן בשל תכולת כילומיקרון. לכן, צינור הלימפה המזנטרי יכול לשמש כנקודת ציון אנטומית המסייעת בזיהוי תעלת הלימפה הכבדית הממוקמת בגולגולת.
10. הסר רקמת חיבור מעל צינור הלימפה והווריד הנבוב באמצעות מלקחיים ישרים של גראפה.
11. צור מעבר מתחת לווריד הנבוב על ידי הכנסת מלקחיים ישרים של גראף דרך המיטה השומנה מתחת לכליה הימנית. התקדמו עד שהקצוות יוצאים בצד הנגדי מתחת לווריד הנבוב, במקביל לתעלה הלימפה הכבדית.
12. אחזו בקצה החיצוני של הקנולה המוכנה עם מלקחי גרפה ישרים ומשכו אותו דרך המנהרה שנוצרה מתחת לווריד הנבוב עד שהקצה יוצא בצד הנגדי.
13. באמצעות מלקחי הומוסטט של Halsted-Mosquito, כופפו את קצה מחט 25G לכ-90°. באמצעות המחט המעוקלת, נקב את תעלת הלימפה הכבדית בצד ימין (הקרוב ביותר למפעיל).
    זהירות: יש להיזהר בעת טיפול במחטים חדות במהלך דקירה בצינור הלימפה כדי למנוע פציעה מקרית.
14. ודאו שהקנולה מלאה בתמיסת נוגדי קרישה ללא בועות אוויר. הכנס את הקצה המשופע בערך 2 מ"מ לתעלה.
15. התבונן בקצה החיצוני של הקנולה לזרימת הלימפה (~ 100 מיקרוליטר/שעה). אם לא נצפית זרימה, יש לכוון או להכניס מחדש את הקנולה.
16. לאחר אישור זרימת הלימפה, סתום את הקנולה לפני שמניחים טיפה קטנה של דבק וטרינרי כדי לאבטח את אתר ההכנסה. לאחר הייבוש, ודאו את זרימת הלימפה דרך הצינור.
17. הסר את הגזה והחזיר את האיברים למקומם המקורי.
18. הניחו את צינור האיסוף המכיל תמיסת נוגדי קרישה מתחת ליציאת הקנולה. וודא שהלימפה זורמת בזרם לתוך הצינור.
19. סגור את דופן הבטן על ידי תפירת שכבות האלכסון הפנימי, האלכסוני החיצוני והעור ברצף. זיהוי וקניולציה מוצלחת של צינור הלימפה הכבדית מוצגים באיור 5.
    הערה: לאחר קנולציה מוצלחת של צינור הלימפה בכבד, ניתן להשהות את ההליך לזמן קצר בזמן שההרדמה וההידרציה נשמרת לפני תחילת איסוף הלימפה.

איור 4: חשיפה לצינורות הלימפה בכבד. (א) סימן אנטומי המציין 1.5–2 ס"מ מתחת לכלוב הצלעות הימני לחתך. (ב) חתך דרך העור ושרירי הבטן, החושף את האיברים הפנימיים. (ג) איברים שמונחים מחדש כדי לחשוף את תעלת הלימפה הכבדית. הכבד מוטה לכיוון הסרעפת, הקיבה משמאל לבעל החיים, והמעי הדק ממוקם תחתון. צינור הלימפה הכבדי ממוקם בין עורק הכבד (החץ הירוק) לעורק המזנטרי (חץ כחול). L: כבד; SI: מעי דק; IVC: וריד נבוב תחתון; RK: הכליה הימנית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5: זיהוי וקניולציה של צינורות הלימפה הכבדיים. (א) ניתן לצפות במבנים הלימפתיים והעורקיים לאחר מיקום מחדש של האיברים ולפני הסרת רקמת החיבור הסובבת. העורק הכבדי (החצים הירוקים) ממוקם בראש ביחס לצינור הלימפה הכבדי הסמוך (חצים צהובים). צינור הלימפה המזנטרי (חצים סגולים) ממוקם מעל העורק המזנטרי (קו שחור מנוקד). מבנים אלו ניצבים בניצב לווריד הנבוב התחתון. IVC: וריד נבוב תחתון; RK: הכליה הימנית. (ב) צינור הלימפה הכבדי (חצים צהובים) ניתן לראות בבירור לאחר הסרת רקמת החיבור הסובבת. צינור הלימפה הכבדי עובר במקביל לעורק הכבד (קו ירוק מנוקד) ולגולגולת ביחס לצינור הלימפה המזנטרי (חצים סגולים) ולעורק המזנטרי (קווי מתאר שחורים מנוקדים). (ג) הקנולה (חצים לבנים) מוכנסת לצינור הלימפה הכבדי (חצים צהובים) דרך הדקירה הקטנה שנעשית בצינור הלימפה (חצים כתומים). ניתן לראות את צינור הלימפה המזנטרי (חצים כחולים). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

6. תקופה לאחר הניתוח

1. מיד לאחר קנולציה מוצלחת של הלימפה הכבדית, יש להתחיל בהידרציה מחדש על ידי הזרקת מי מלח סטריליים בקצב של 1.0–2.0 מ"ל לשעה דרך קנולה הווריד היוגולרי.
2. שמרו על עירוי לאורך כל איסוף הלימפה. לחלופין, ניתן לבצע הידרציה מחדש באמצעות קנולה קיבתית או תריסריון, מה שמאפשר לשמור את קנולה וריד הג'וגולרי לדגימת דם ורידי במידת הצורך.
3. שמרו את החיה תחת הרדמה על כרית ניתוח מחוממת (37°C) לאורך כל תקופת האיסוף.
4. מעקב אחרי קצב הנשימה ועומק ההרדמה לאורך כל הניסוי על ידי התבוננות בדפוסי נשימה ותגובות רפלקסיות, תוך שמירה על הרדמה איזופלורנית באמצעות קונוס אף.
5. ההידרציה נשמרה באמצעות עירוי מלח רציף (1.0–2.0 מ"ל לשעה) דרך קנולה וריד היוגולרי.
6. כדי למזער הפרעות פיזיולוגיות, נפח הדם הכולל שנאסף לפני הדגימה הסופית הוגבל ל-<10% מנפח הדם המשוער במחזור הדם בהתאם להנחיות האתיקה של בעלי החיים המוסדיים.
7. איסוף לימפה כבדית ברציפות לצינורות המכילים נוגדי קרישה. החלפת צינורות איסוף כל שעה או לפי הצורך.
8. איסוף דגימות דם עורקיות בנקודות זמן מוגדרות:
   1. חסום זמנית את הצינור החיצוני וחבר מזרק ריק.
   2. משכו דם עד שהצינור מתמלא.
   3. החלף את המזרק במזרק חדש לאיסוף דגימות ושאב כ-100–200 מיקרוליטר דם עורקי בכל נקודת דגימה מוגדרת.
   4. שטוף את הקנולה בתמיסת נוגד קרישה לאחר כל איסוף.
   5. אטום את הקנולה עם פקק.
9. לאחר סיום איסוף הדגימות, יש להמשיך לדגימה סופית של עורק הכבד ווריד הפורטל או להרוג את העכברוש באופן הומני באמצעות נתרן פנטוברביטון (>100 מ"ג/ק"ג) דרך הקנולה הקרוטידית או הג'וגולרית.

7. דגימה סופית של עורק הכבד ווריד הפורטלי

1. בסיום איסוף הלימפה והדם, יש לשמור על הרדמה עמוקה ולהבטיח נשימה יציבה לפני תחילת דגימת כלי דם סופית.
2. פתח מחדש את החתך הבטני בזהירות כדי לחשוף את חלל הבטן העליון.
3. משוך את הכבד בעדינות לכיוון הסרעפת, את הקיבה שמאלה, ואת המעי הדק תחתון באמצעות גזה רטובה במי מלח כדי לחשוף את צינור הלימפה הכבדי המנוצל.
4. זהה את עורק הכבד, שפועל במקביל ובזנב לצינור הלימפה הכבדית.
   הערה: העורק נראה קטן ובהיר יותר מהוריד הפורטלי ומציג זרימה פועמת יותר.
5. הכינו קנולה פוליוויניל 0.61 מ"מ O.D., 0.28 מ"מ זיהוי פוליוויניל, ממולאת מראש בתמיסת נוגדי קרישה וללא בועות אוויר.
6. באמצעות מלקחיים מעוקלים, בודדו קטע קצר מהעורק הכבדי והניחו תפר משי 4-0 מתחתיו.
7. הרם בעדינות את העורק ומניח תפר שני רחוק לראשון. לקשור את התפר הדיסטלי כדי לשלוט בזרימה החוזרת תוך השארת התפר הפרוקסימלי פתוח לסגירה מאוחרת יותר.
8. באמצעות מיקרו-מספריים דקים, יש לבצע חתך רוחבי קטן (כ-0.5 מ"מ) בדופן העורק בין התפרים.
9. הרם בעדינות את מכסה הכלי עם קצה מלקחי דומונט כדי לייצב את לומן הכלי להחדרת הקנולה.
10. הכנס את הקצה המשופע של קנולה הפוליוויניל לפתח והתקדמו כ-2–3 מ"מ.
11. אבטח את הקנולה על ידי קשירת התפר הפרוקסימלי סביב הכלי והקנולה.
12. אשר את המיקום הנכון על ידי התבוננות בזרימת דם פועמת אל הקנולה או על ידי שאיפה עדינה של כמות קטנה של דם עורקי אדום בוהק.
13. אסוף 0.5–1 מ"ל דם לצינור מסומן מראש המכיל נוגד קרישה.
14. לאחר האיסוף, משכו את הקנולה והגיעו להמוסטזיס על ידי הידוק שני התפרים. החשיפה לעורק הכבד והליך הקנולציה מוצגים באיור 6.
15. זהה את וריד הפורטל, העובר מדיאלי ומאונך לעורק הכבד. לווריד הפורטלי קוטר גדול יותר וצבע כהה יותר בהשוואה לעורק הכבד.
16. התקן מחט 23G או 25G למזרק של 1 מ"ל עם תמיסת נוגד קרישה מוקדם.
17. הכנס את המחט עם שיפוע כלפי מעלה לתוך וריד הפורטל בזווית רדודה (כ-20°–30°) כדי למנוע קריסת כלי דם או קריעה.
18. שאפו בעדינות את נפח הדם הנדרש.
19. מכיוון שדקירה בווריד הפורטלי היא סופנית, יש להרוג את בעל החיים באופן הומני מיד לאחר איסוף הדגימה על ידי מתן >100 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטון דרך הקנולה הקרוטידית או הג'וגולרית בזמן שהחיה נשארת תחת הרדמה עמוקה. מיקום וריד הפורטל ושיטת הדגימה הסופית מוצגים באיור 7.
    זהירות: נתרן פנטוברביטון הוא חומר מבוקר ויש לטפל בו ולתן אותו בהתאם לתקנות המוסדיות ולנהלי בטיחות מתאימים.
20. לאשר מוות בהפסקת נשימה ופעילות לבבית לפני השלכת הגופה, בהתאם לקוד האוסטרלי לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות (NHMRC)¹⁵ ולהנחיות ANZCCART.

איור 6: זיהוי עורק כבד וקניולציה. (א) חשיפה של עורק הכבד (חצים ירוקים). העורק הכבדי ממוקם בסמוך לצינור הלימפה המזנטרי (קו שחור מנוקד) ובניצב לווריד הנוב התחתון. IVC: וריד נבוב תחתון; L: כבד. (ב) בידוד עורק הכבד באמצעות מלקחיים מעוקלים. (ג) החדרה מוצלחת (חצים סגולים) של קנולה פוליוויניל בקוטר 0.61 מ"מ × 0.28 מ"מ (חצים כתומים) לעורק הכבדי (חצים ירוקים), מאובטחים בתפרי משי 4-0 לדגימת דם עורקיים סופית. ניתן להמחיש את צינור הלימפה המזנטרי (קו שחור מנוקד). PV: וריד הפורטל. (ד) לאחר קיבוע הקנולה, מאושרת הפטנטיות של הקנולה על ידי משיכת דם אל הקנולה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 7: זיהוי ורידים פורטליים ודגימת קצה. (א) וריד הפורטל (המסומן על ידי מחט 25G) נמצא בין עורק הכבד (קו מתאר לבן מנוקד) לצינור המרה (קו שחור מנוקד). וריד הפורטל נראה גדול וכהה יותר מהעורק הכבדי וניגש אליו בהרדמה עמוקה לצורך איסוף דם סופי. PV: וריד פורטל; IVC: וריד נבוב תחתון; L: כבד; SI: מעי דק; RK: הכליה הימנית. (ב) החדרה מוצלחת של מחט 25G לווריד הפורטלי (קווי מתאר שחורים מנוקדים) לדגימת דם ורידי סופית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

תוצאות

הגישה הכירורגית המתוארת בסעיף הפרוטוקול מאפשרת זיהוי ברור של צינור הלימפה הכבדית, הממוקם מדיאלית לכליה הימנית ורץ במקביל לעורקי הצליאק והכבד, כפי שדווח קודם⁴. אנטומיה מייצגת וקנולציה מוצגות באיור 5. קנולציה מוצלחת מאושרת על ידי הופעה מיידית של נוזל לימפה שקוף עד מעט עכור, ללא זיהום כילומיקרון חלבי, מה שמרמז על ערבוב מינימלי עם לימפה מזנטרית. תצפית זו תואמת את המאפיינים המדווחים של לימפה כבדית³. זיהוי הלימפה הכבדית התבסס על מיקומה האנטומי ביחס לעורק הכבד ולווריד הנבוב התחתון, וכן על המראה הברור האופייני לה, בניגוד למראה האטום או החלבי הטיפוסי של לימפה מזנטרית.

זרימת הלימפה הכבדית צפויה להישאר יציבה לאורך כל תקופת האיסוף, עם קצב ממוצע של כ-0.1 מ"ל לשעה ^3,4,11. זרימת הלימפה הכבדית בדרך כלל נשארת יציבה ביותר במשך כ-2–3 שעות לאחר הקנולציה בתנאי הרדמה, אם כי תקופות איסוף ארוכות יותר (עד ~6–8 שעות) עשויות להיות אפשריות בתנאים ניסיוניים מיטביים. ערכי זרימת הלימפה המייצגים שדווחו במחקרים קודמים⁴ מסוכמים בטבלה 1. זרימת הלימפה בכבד בדרך כלל נמוכה יותר מזו המדווחת על קצב זרימת תעלות הלימפה המזנטרית והחזה בעכברים מורדמים.

אתרים לימפתיים (מצב מודע)	קצב זרימת הלימפה הממוצע (mL/h)
לימפה חזה (מודע)	1.74 ± 0.33
לימפה בית החזה (הרדמה)	0.65 ± 0.10
לימפה מזנטרית (מורדמת)	0.45 ± 0.11
לימפה כבדית (מורדמת)	0.12 ± 0.02

טבלה 1: קצב זרימת לימפה ממוצע (mL/h) דרך קנולציות של צינורות לימפה חזה, מזנטרי וכבד בעכברים מודעים ומורדמים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM עבור n = 3–5 חולדות. מותאם מטבלה 3 ביאדב ואח' (2018)⁴.

תוצאות מייצגות הממחישות את ההובלה הלימפטית של מקרומולקולות מוצגות באיור 8. דוגמאות אלו מראות כיצד ניתן להשתמש במודל להערכת התאוששות לימפה לאחר מתן תוך-ורידי של מקרומולקולות טיפוליות, כולל כ-60 kDa אינטרפרון פגיליאטד α2a (IFN-PEG40), כ-31 kDa אינטרפרון פגיליאטד α2b (IFN-PEG12), והנוגדן המונוקלונלי טרסטוזומאב, מה שמרמז כי הכבד הוא אתר מרכזי לאקסטרווזציה וגישה לימפה לטיפולים מקרומולקולריים⁴.

איור 8: התאוששות לימפה של טיפולים מקרומולקולריים הניתנים תוך-ורידי בלימפה חזה, מזנטרית וכבדית. האחוז הכולל של המינון שהוחזר בלימפה החזה, המזנטרית והכבדית לאחר מתן תוך-ורידי של אינטרפרונים PEGylated בגדלים מולקולריים שונים (IFN-PEG12 ו-IFN-PEG40) ונוגדן מונוקלונלי (טרסטוזומאב). הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM של התאוששות מהמנה במשך 8 שעות. מותאם מיאדב ואח' (2018)⁴. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

המודל גם מאפשר פרופילינג מפורט של לימפה כבדית³. ניתוחים מייצגים של הרכב הליפידים הלימפה מוצגים באיור 9. בהשוואה ללימפה חזה ומזנטרית, לימפה כבדית מציגה תכולת שומנים כוללת נמוכה משמעותית אך ריכוזי חלבון דומים לאלו של מקורות לימפה אחרים. ניתוח ליפופרוטאינים של לימפה כבדית מדגיש את התפקיד הייחודי של הכבד בהעברת שומנים ובהעברת כולסטרול הפוכה. נתוני הרכב שומנים מייצגים מסוכמים בטבלה 2. HDL לימפה כבדית מועשר באסטרים כולסטריל, HDL לימפה מזנטרית עשיר בעיקר בטריגליצרידים, ו-HDL לימפה חזה מכיל תכולת פוספוליפידים גבוהה יחסית. הבדלים בהרכב אלו מצביעים על תפקידים מובחנים של כל מקור לימפה במטבוליזם ובהעברה של שומן.

	%wt/wt
שברים	פוספוליפיד	כולסטרול חופשי	אסטר כולסטריל	טריגליצריד
לימפה מזנטרית
D-HDL	20 ± 3	1 ± 0	5 ± 1	16 ± 1
L-HDL	21 ± 4	2 ± 0	8 ± 2	23 ± 5
לימפה כבדית
D-HDL	24 ± 1	3 ± 0	12 ± 3	8 ± 1
L-HDL	23 ± 1	6 ± 1	13 ± 2	14 ± 2
לימפה חזה
D-HDL	25 ± 1	1 ± 0	7 ± 0	11 ± 3
L-HDL	29 ± 1	2 ± 0	11 ± 1	11 ± 0
פלזמה
D-HDL	29 ± 2	2 ± 0	20 ± 3	2 ± 0
L-HDL	36 ± 6	2 ± 0	18 ± 3	4 ± 1

טבלה 2: הרכב ליפידים של חלקי ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (D-HDL) וקור (L-HDL) שבודדו מלימפה מזנטרית, כבדית וחזה, ופלזמה. הערכים מייצגים את האחוז במשקל (% משקל/משקל) של פוספוליפיד, כולסטרול חופשי, כולסטריל אסטר וטריגליצריד ביחס לסך חלק הליפידים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. מותאם מטבלה 1 ב-Gracia ואח' (2020)³.

איור 9: הרכב החלבון והליפידים של לימפה מזנטרית, כבדית וחזה. תכולת חלבון ושומן כולל יחסית בלימפה מזנטרית, כבדית וחזה. תכולת הליפידים כוללת פוספוליפידים (PL), טריגליצרידים (TG), אסטרים כולסטריל (CE) וכולסטרול חופשי (FC), המובע כאחוז משקל השומנים ביחס למשקל הכולל של חלבון וליפידים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. מותאם מ-Gracia ואח' (2020)³. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

קנולציה של צינור הלימפה בכבד היא הליך טכני קשה, אפילו עבור מיקרוכירורגים מנוסים. מספר צעדים קריטיים יכולים לשפר את הסיכוי לשמור על שלמות צינורות הלימפה ולהשיג זרימת לימפה יציבה. בעת זיהוי ובידוד תעלת הלימפה הכבדית (שלבים 5.7-5.10), השלב הראשוני הוא להסיר את רקמת החיבור והשומן שמעל צינור הלימפה המזנטרי ווריד נבוב סמוך לתעלה הלימפה הכבדית. תעלת הלימפה הכבדית שקופה ושברירית בהשוואה לתעלה הלימפה המזנטרית העבה והאטומה יותר, וניתן להיקרע בקלות אם מטפלים בה ישירות. צינור הלימפה המזנטרי משמש כנקודת ציון אנטומית שימושית, שכן ניקוי הרקמה שמעליו מגלה את צינור הלימפה הכבדי הממוקם כלפי מעלה. מכיוון שצינור הלימפה הכבדי לעיתים קרובות מציג עיקולים או עקמומיות, המפעיל צריך לבחור נקודת קנולציה לאורך קטע ישר ולכוון את הקנולה במקביל למסלול הטבעי של התעלה כדי למזער את הסיכון לחסימה או קריעה (שלבים 5.11-5.14).

הקנולציה עצמה היא הגורם הקריטי ביותר להצלחה. לאחר ניקוב התעלה (שלב 5.13), ניתן לאמת גישה תוך-אורית ויזואלית על ידי הכנסת קצה המלקחיים לפתח והבטחת שרק דופן כלי אחד מונח מעל המכשיר. הופעתם של שני קירות מנוגדים מעידה על נקב חד מעבר. לאחר אישור גישה תוך-לומינלית, ניתן לקדם את הקנולה בצורה חלקה לאורך התעלה באותה זווית. יש להיזהר להימנע מפגיעה בכלי דם סמוכים, שכן דימום לשדה עלול להכניס דם לקנולה של איסוף הלימפה, לזהם את הדגימה ולהעלות משמעותית את הסיכון להיווצרות קרישים. לאחר הקמת זרימת הלימפה (שלב 5.15), יש לסגור את קצה האיסוף של הקנולה, ויש להניח דבק וטרינרי בזהירות כדי למנוע כניסתה ללומן. יש גם לבדוק את הקנולה לאיתור בועות אוויר, שכן אוויר כלוא מעלה את הלחץ האחורי ועלול להפריע לזרימת הלימפה. מכיוון שהלימפה הכבדית נוצרת תחת לחץ נמוך, יש למקם תמיד את קצה האיסוף של הקנולה מתחת לגובה אתר הניתוח כדי לאפשר ניקוז באמצעות כוח הכבידה.

קנולציה מוצלחת בצינור הלימפה של הכבד מתבטאת בתחילת זרימת הלימפה המיידית. לאחר ההתבססות, הלימפה הכבדית זורמת בדרך כלל במהירות של כ-0.1 מ"ל לשעה, עם תפוקה יציבה למשך מספר שעות. קצב הזרימה עשוי להשתנות בהתאם לאנטומיה, לפיזיולוגיה ולתנאי הניסוי של בעל החיים. לדוגמה, הלימפה נאספה תחת הרדמה איזופלורנית בפרוטוקול זה. הרדמה איזופלורנית עשויה להשפיע על פרמטרים פיזיולוגיים הרלוונטיים לתפקוד הלימפה, ולכן יש לקחת בחשבון תנאים ניסיוניים הכוללים הרדמה בעת פירוש קצבי היווצרות הלימפה¹⁶. קנולציה של צינור הלימפה בכבד דורשת לפרוטומיה ומניפולציה מיקרו-כירורגית עדינה של כלי הלימפה בבטן, ולכן איסוף לימפה מחולדות בהכרה אינו אפשרי במודל זה. מחקרים קודמים שהשוו העברת לימפה בתנאים מורדמים ומודעים או באמצעות משטרי הרדמה שונים הראו כי הרדמה עשויה להשפיע במידה מתונה על קצב זרימת הלימפה האבסולוטי אך אינה משנה באופן מהותי את דפוסי ההובלה הלימפה הכוללים⁴. לכן, ערכי זרימת הלימפה המתקבלים במודל זה צריכים להיות מפורשים בהקשר של תנאי ניסוי מורדמים.

הפחתה או הפסקה הדרגתית של הזרימה במהלך האיסוף נגרמת לרוב מהיווצרות קרישי דם בתוך הקנולה, הנובעת מזיהום דם או הצטברות פיברין. לעיתים ניתן לשחזר את הזרימה על ידי מיקום ולחיצה עדינה על הקנולה עם מלקחיים עדינים כדי לפצל מכנית את הקריש, או על ידי שאיפה עדינה דרך קצה האיסוף של הקנולה כדי לשחרר את החסימה. אם החסימה מוגבלת לחלק החיצוני, ניתן לחתוך את הקנולה קרוב לקריש ולהתחבר מחדש לצינור חדש באמצעות מחבר סיליקון סטרילי. אם הקריש נוצר באתר הקנולציה, בדרך כלל נדרשת קנולציה מחדש. במקרים כאלה, ניתן לנסות להסיר את הדבק בזהירות רבה כדי למנוע קרע בצינור או בכלי הדם הסמוכים. יש לבצע המוסטזיס לפני ניסיון חוזר לקניולציה, שכן אפילו דליפת דם קלה לקנולה מקדמת באופן משמעותי קרישה במערכת הלימפה הכבדית בלחץ נמוך.

גורמים פיזיולוגיים משפיעים גם הם על זרימת הלימפה ועל הפטנסי. זרימת הלימפה הכבדית בעכברים איטית מטבעה מזנטרית או צינור חזה, אפילו בתנאים בסיסיים^17,18. יתרה מזאת, הרדמה כללית יכולה להפחית את זרימת הלימפה במעגלים לימפתיים אחרים בהשוואה^{לעכברים} מודעים ונעים בחופשיות. מכיוון שקנולציית לימפה כבדית דורשת הרדמה ולפרוטומיה, גורמים אלו ככל הנראה תורמים לקצב הזרימה הנמוכים יחסית ולנטייה המוגברת לקרישה שנצפתה במהלך איסוף ממושך. שמירה על הידרציה דרך הווריד היוגולרי או הקנולה במערכת העיכול במהלך האיסוף מסייעת לייצב זרימת הלימפה ולהפחתת היווצרות קרישים. במודל זה, זרימת לימפה כבדית יציבה בדרך כלל ניתנת להשגה למשך 2–3 שעות, ולאחר מכן הזרימה עלולה להידרדר וסביר יותר לקרישה. עם זאת, בתנאים ניסיוניים מיטביים, ניתן לשמור על איסוף הלימפה לפרקי זמן ארוכים יותר, עם משך מקסימלי של עד ~8 שעות מדווח⁴.

הכללת דגימת עורק כבד ווריד פורטל (איור 6 ואיור 7) מרחיבה את היישום של המודל בכך שהיא מאפשרת השוואה ישירה בין זרימת כבד, פליטת לימפה ומחזור דם מערכתית. שלב הדגימה הסופי הזה מאפשר הערכה סימולטנית של העברה מיקרווסקולרית כבדית ופינוי בין-עקיף בתוך בעל חיים יחיד. השוואות כאלה מספקות תובנות חשובות לגבי התפלגות המומסים בין תחום כלי הדם הכבדי והלימפה, במיוחד עבור מקרומולקולות גדולות או תרכובות ליפופיליות התלויות בדיפוזיה אינטרסטיציאלית.

למרות האתגרים הללו, מודל הקנולציה הלימפה בכבד נותר טכניקה חשובה ומלמדת. הכבד תורם חלק משמעותי מזרימת הלימפה הכוללת בגוף, ולימפה כבדית מכילה חלבונים ורכיבים נוספים שמקורם בנוזל בין-תאי כבד. על ידי דגימת לימפה הנפלטת ישירות מהכבד, מודל זה מאפשר ניתוח של מולקולות ותאים היוצאים מהכבד לפני שהם מדוללים על ידי לימפה מזנטרית ומערכתית בצינור החזה. ניתוח ביוכימי של לימפה כבדית מספק תובנות לגבי חילוף החומרים הבין-תחומי בכבד ותהליכי העברת שומנים^12,20. זה משלים את המידע המתקבל מהפורטל או מהדם הסיסטמי, שמשלב את השפעות חילוף החומרים הכבדי וההחלפה החוץ-כבדית. חשוב לציין כי תצורה זו, המשלבת קנולציות ורידיות לימפה כבדית, עורקי קרוטיד וג'וגולרי, מאפשרת הערכה דינמית של גרדיאנטים מומסים בין פליטת הכבד לזרימת כלי דם, ומספקת תמונה מקיפה יותר של הובלת כבד ופינוי הכבד.

מחקרים קודמים שהשתמשו במודל זה מראים כי דגימת לימפה כבדית מאפשרת הערכת התאוששות לימפה של טיפולים מקרומולקולריים והשוואת הובלת המומסים בין הלימפה הכבדית למחזור הדם הסיסטמי. יחד, קנולציה של לימפה כבדית, דגימה וסקולרית מקבילה ופרופיל ביוכימי מספקים פלטפורמה ניסיונית איתנה לחקר דינמיקה מיקרווסקולרית ואינטרסטיציאלית בכבד. המודל מאפשר הערכה סימולטנית של הובלת כבד, מטבוליזם, עיבוד שומנים ואיתות חיסוני, וניתן להתאים אותו לחקור שינויים במצבים פתופיזיולוגיים כמו MASLD או דלקת כבדית.

לסיכום, מודל ניתוחי משופר זה, המשלב גישה לימפה כבדית, עורקית כבדית ופורטלית, מציע גישה מקיפה וניתנת לשחזור לבחינת מסלולי ההובלה בכבד. הוא מאפשר השוואה ישירה של זרימת כלי דם, פליטה אינטרסטיציאלית וניקוז לימפתי, התומכת במחקרים המספקים תובנות מכניות לגבי הובלה, חילוף חומרים ותהליכים פרמקוקינטיים ספציפיים לכבד. בנוסף, היכולת לדגום לימפה כבדית מספקת הזדמנות ייחודית לחקור תנועת תאי חיסון ואנטיגנים מהכבד, ומציעה תובנות חשובות על מעקב חיסוני כבד, דלקת ומנגנוני סבילות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסת נוגד קרישה (EDTA 0.1%)	Invitrogen	AM9261	מניעת היווצרות קרישים בקנולה ובדגימות שנאספו
תמיסת נוגד קרישה (Heparin 20 IU/mL)	Pfizer	00409-2723-01	מניעת היווצרות קרישים בקנולה ובדגימות שנאספו
כלורוהקסידין (0.5%)	McFarlane Medical	12120-OR	משמש לחיטוי אתר ניתוחי
צינורות איסוף (מיקרוצנטריפוגה)	Greiner Bio-One	616201	משמש לאיסוף לימפה ודם
גזה מכותנה	Winc Australia	18874125	משמש לטיפול באיברים ושמירה על לחות
צמר גפן	Pacific Laboratory	1005199	משמש להעברת איברים מחדש במהלך ניתוח
מלקחת קשתית עקומה	Macquarie Medical Systems	TTP5002-5	משמשת לבידוד כלי דם ומניפולציה ברקמות
מלקחת דומונט	Fine Science Tools	11251-35	משמשת לפתיחה וייצוב לומן כלי הדם של העורק הכבדי להכנסת קנולה
אתנול (70%)	Ajax	AJA214-2.5PL	משמש לחיטוי אתר ניתוחי
מלקחת המופסטט הלסטד-יתוש	Fine Science Tools	13009-12	משמשת לכיפוף מחט 25G להנקבת צינור לימפה כבדי
רפידה כירורגית מחוממת (37 °C)	Ratek	IC-WT1	משמרת את טמפרטורת הגוף במהלך הניתוח
תא אינדוקציה	Darvall	1859	משמש לאינדוקציה ראשונית של הרדמה
משאבת עירוי	Adelab Scientific	NE-300	מספקת עירוי מלח מבוקר דרך קנולה
מספריים קשתית	Stark Medical	E-AC985-11	משמשים לחתכים בעור ובשרירים
איזופלורן	Provet Pty Ltd	ISOF07	הרדמה באמצעות שאיפה המשמשת להשראת הרדמה ושמירתה
מלקחת עדשות קלמן-מקפרסון	ProSciTech	TY-1301	משמשת לפתיחה וייצוב לומן כלי הדם של הווריד הצווארי ועורק הראש לצורך הכנסת קנולה
מחט (23G × 1")	Livingstone	DN23GX1.0LV	משמשת לנקב וריד השער ולדגימת דם
מחט (25G × 1")	Livingstone	DN25GX1.0LV	משמשת לשטיפת קנולה ולנקב צינור לימפה כבדי
מערכת הרדמה בצורת חרוט	Darvall	7885	משמרת הרדמה במהלך ניתוח
אספקת חמצן עם מד זרימה	BOC	400NE	גז נושא עבור הרדמה באיזופלורן
קנולה פוליאתילן (0.8 ממ O.D., 0.5 ממ I.D.)	Microtube Extrusions	PE8050	משמשת לקנולציה של עורק הצוואר, הווריד הצווארי וצינור הלימפה הכבדי
קנולה פוליוויניל (0.61 ממ O.D., 0.28 ממ I.D.)	Microtube Extrusions	PIV6128	משמשת לקנולציה של העורק הכבדי
חוטי תפירה ממשי (4-0)	SMI AG	SM8015	משמשים לאבטחת כלי דם וקנולות
נתרן פנטובארביטל	Lyppard Australia Pty Ltd	LETH250	משמש להמתה (>100 מג/ק"ג)
סרום מלח סטרילי (0.9% NaCl)	FreeFlex	K690531	משמש להידרציה ולהשטיפה
מלקחת גרפה ישרה	Fine Science Tools	11150-10	משמשת לבידוד כלי דם עדין
מיקרוסקופ כירורגי	Zeiss	Stemi 2000-CS	משמש לויזואליזציה במהלך קנולציה של צינור לימפה כבדי
סכינים סטריליים לניתוח (לשימוש בסכין)	Livingstone	SBLDCL15	משמשים לחידוד קצוות קנולה במהלך הכנה
מזרק (1 מ"ל)	Terumo	19032-TE	משמש לשטיפת קנולות
מזרק (3 מ"ל)	Terumo	19048-TE	משמש לדגימת דם
מזרק (30 מ"ל)	Terumo	19034-TE	משמש לעירוי מלח
מספריים ואנס	Fine Science Tools	91500-09	משמשים לחתכים כלי דם
דבק רקמות וטרינרי	3M	1469SB	משמש לאבטחת קנולת צינור לימפה כבדי