מנגנונים של דדוקציה של שנגשיאן צ'יו באי ספיקת לב באמצעות גישה לא ממוקדת למטבולומיה ופרמקולוגיה רשתית בעכברים

סיכום

מחקר זה אישר את ההשפעה הטיפולית של טעם שנגשיאן צ'יו על אי ספיקת לב באמצעות ניסויים בבעלי חיים. ניתוחי כרומטוגרפיה נוזלית–ספקטרומטריית מסה ופרמקולוגיית רשת בעלי ביצועים אולטרה-ביצועיים זיהו מטרות ומנגנונים טיפוליים פוטנציאליים.

תקציר

הוצעה דקוטיית שנגשיאן צ'יו (SXQY) כאסטרטגיה טיפולית פוטנציאלית לאי ספיקת לב (HF), אך מנגנוני הטיפול שלה עדיין לא ברורים. מחקר זה חקר את ההשפעות הטיפוליות והמנגנונים הבסיסיים של SXQY ב-HF. מודל חולדה של HF הושר על ידי התכווצות אאורטה רוחבית (TAC) וטופל ב-SXQY. תפקוד הלב הוערך באמצעות אקו-לב טרנס-חזה, ומבנה שריר הלב ופיברוזיס הוערכו באמצעות המטוקסילין ואאוזין וצביעת טריכרום של מסון. דגימות הסרום נותחו על ידי מטבולומיקה לא ממוקדת באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים מיוחדים–ספקטרומטריית מסה טנדם. רכיבים הנכנסים לדם מופו למטרות, ומטרות מצטלבות הקשורות ל-HF נותחו באמצעות ניתוח רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI), ולאחר מכן בוצעו ניתוחי Gene Ontology ו-Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). SXQY שיפר משמעותית את תפקוד הלב בעכברי TAC, כפי שניתן לראות בירידה בקוטר הפנימי של החדר השמאלי בדיאסטולה ובעובי הדופן האחורית של החדר השמאלי בדיאסטולה, והגברת שבר הפליטה של החדר השמאלי, והקלה על היפרטרופיה, דלקת ופיברוזיס. סך הכל זוהו 563 תרכובות הזנת דם (367 אב-טיפוס ו-196 מטבוליטים), כאשר 5 תרכובות פעילות מרכזיות זוהו במאגר הנתונים של Traditional Chinese Systems Pharmacology המתאימים ל-63 יעדים. ניתוח רשת חשף 44 גנים חופפים, כאשר Formononetin, Timosaponin BII ו-Sinensetin הם רכיבים מרכזיים, ו-PTGS2, PPARG ו-HSP90AA1 כמטרות מרכזיות. ניתוח PPI זיהה עוד גנים מרכזיים כולל ESR1, PTGS2, PPARG, HSP90AA1, JUN ו-15 גנים נוספים. ניתוח KEGG הראה ש-SXQY פועל בעיקר דרך Ca⁺, פוספטידילינוזיטול 3-קינאז–קינאז חלבון B, אדנוזין מונופוספט מחזורי, ומסלולי דלקת והורמונים. לסיכום, SXQY מפעיל אפקטים מגנים נגד HF על ידי שיפור תפקוד הלב והפחתת עיצוב שריר הלב באמצעות מנגנונים רב-רכיבים, רב-מטריים ורב-מסלולים.

מבוא

אי ספיקת לב (HF) היא תסמונת קלינית המאופיינת בפגיעה במילוי החדר וביכולת הפליטה הנובעות מהפרעות מבניות או תפקודיות לבביות, מה שמוביל לקונסטלציה של סימנים ותסמינים קליניים¹. כשלב הסופי של מחלות לב שונות, HF פוגע משמעותית באיכות חייהם של המטופלים וגורם לתמותה גבוהה ולאשפוזים חוזרים תכופים, ובכך מטיל נטל מחלה משמעותי הן על משפחות^{והן על החברה.} בניהול קליני, תרופות ל-HF מהווה את הבסיס ואבן היסוד של הטיפול, וכוללת בעיקר קטגוריות תרופות מרכזיות כגון משתנים, מעכבי מערכת רנין–אנגיוטנסין, חוסמי בטא, אנטגוניסטים לקולטני מינרלוקורטיקואידים, ומעכבי נתרן–גלוקוז קוטרנספורטר 2 3,4,5,6 . בעוד שתרופות אלו שיפרו חלקית את התחזית של חולי HF, כל אחת מהן נושאת מגבלות ותופעות לוואי מסוימות, כגון הפרעות אלקטרוליטים, ברדיקרדיה וזיהומים בדרכי השתן⁷. לכן, טיפולים פרמקולוגיים ל-HF עדיין דורשים בדיקה נוספת.

הרפואה הסינית המסורתית (TCM) צברה ניסיון קליני נרחב בניהול ארוך טווח של HF. בהדגשת ויסות הוליסטי והתערבות רב-מטרתית, היא מציעה גישה ייחודית לטיפול⁸. בשנים האחרונות, מספר ניסויים מבוקרים אקראיים (RCTs) הוכיחו את היעילות הטיפולית של נוסחאות צמחיות סיניות עבור HF 9,10,11,12,13,14,15. דדוקציה של Shengxian Quyu (SXQY) כבר החלה לעבור בדיקות אקראיות קפדניות כדי לאשר את יעילותה הטיפולית, אך המנגנונים הטיפוליים הספציפיים שלה עדיין דורשים חקירה נוספת ומקיפה^{יותר 16}. פרמקולוגיה רשתית, כתחום מתפתח המשלב ביולוגיה מערכתית, פוליפרמקולוגיה וניתוח חישובי, מציעה כלי עוצמתי להבהרת מנגנוני הפעולה ההוליסטיים של נוסחאות צמחיות סיניות 17,18,19. לכן, מחקר זה עושה שימוש באסטרטגיה משולבת המשלבת מטבולומיקה לא ממוקדת ופרמקולוגיה רשתית לזיהוי רכיבים נספגי דם של SXQY ולהבהיר את המנגנונים הטיפוליים הפוטנציאליים שלו. עבודה זו שואפת לספק בסיס ליישום קליני נוסף של SXQY.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה ורווחת בעלי החיים של בית החולים לידידות סין–יפן (אישור מס' zryhyy21-23-01-09) ובוצעו בהתאם לעקרונות ההחלפה, הפחתה ושיפור כדי לצמצם שימוש וסבל בעלי חיים. חוקרים שביצעו איסוף וניתוח נתונים (כולל מדידות אקו לב והערכה היסטולוגית) היו עיוורים להקצאת קבוצות.

הכנת דגימת SXQY

SXQY מורכב מהרכיבים הצמחיים הבאים: Astragalus membranaceus (Huangqi) (30 גרם), Codonopsis pilosula (דאנגשן; 20 גרם), Cornus officinalis (שנוירו; 15 גרם), Sparganium stoloniferum (סנלנג; 12 גרם), Curcuma zedoaria (ארז'ו; 15 גרם), Cimicifuga heracleifolia (שנגמה; 10 גרם), Bupleurum chinense (צ'איהו; 10 גרם), Platycodon grandiflorus (ג'ייגנג; 10 גרם), Anemarrhena asphodeloides (ז'ימו; 15 גרם), וליאונורוס יפוניקוס (יימו; 15 גרם), עם משקל עשב גולמי כולל של 152 גרם לכל מרשם. כל חומרי הצמח נרכשו ממחלקת הרוקחות של בית החולים הידידות סין–יפן ואומתו על ידי רוקח ראשי לפי שיטות זיהוי פרמקוגנוסטיות סטנדרטיות. קלינית, SXQY ניתנת במינון מרשם אחד (152 גרם) ביום. בהנחה שמשקל גוף ממוצע של בוגר הוא 70 ק"ג, המינון האנושי המתאים הוא 2.17 גרם (עשב גולמי)/ק"ג. בהתבסס על נורמליזציה של שטח פנים הגוף בין בני אדם לעכברים, המינון המקביל של עכברושים חושב כ-13.67 גרם (עשב גולמי)/ק"ג. להכנת דקוקטן, מרשם אחד של SXQY הושר במים מזוקקים ביחס של 10 מ"ל לגרם של צמחי מרפא גולמיים (ללא וירט, בהתבסס על נפח הממס ההתחלתי ללא התאמה לאחר ההשריה) למשך שעה, ולאחר מכן הרתיחה באמצעות מעטפת חימום חשמלית ונשמרה על 100°C תחת רתיחה רציפה למשך שעה. התמצית סיננה דרך גזה (גודל נקבוביות 200–300 מיקרון). השאריות הוצאו פעמיים נוספות בתנאים זהים. הסינון המאוגד רוכז בלחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי בטמפרטורה של 60°C לנפח סופי של 111 מ"ל, מה שהניב ריכוז של 1.37 גרם (תרופה גולמית)/מ"ל. הסוכר המרוכז סינן שוב דרך גזה (גודל נקבוביות 200–300 מיקרון) ונשמר בטמפרטורה של 4°C ושימש תוך 24–48 שעות. למתן התמיסה שימשה ישירות, ונפח הגוואג' חושב על פי ריכוז של 1.37 גרם למ"ל, מה שהוביל לנפח מתן של כ-10 מ"ל/ק"ג להשגת המינון היעד של 13.67 גרם לק"ג.

מודל בעלי חיים

שמונה-עשר זכרים בני 8 שבועות של Sprague–Dawley (SD) הוחזקו בסביבה מותאמת סטנדרטית (23°C ±-2°C, לחות יחסית 50 ±-5%, ומחזור אור/חושך של 12 שעות) עם גישה חופשית למזון ומים. בעלי החיים חולקו באקראי לשלוש קבוצות (n = 6 לכל קבוצה) באמצעות טבלת מספרים אקראית: קבוצה מופעלת על ידי שמה (Sham), קבוצת התכווצות אאורטה רוחבית (TAC), וקבוצה שטופלה ב-SXQY (SXQY). חולדות בקבוצות TAC ו-SXQY הורדמו על ידי שאיפת איזופלורן (השראה 4%, תחזוקה 2%) והונחו על שכיבה על כרית חימום מבוקרת תרמוסטטית בטמפרטורה של 37°C. הרדמה מספקת אושרה על ידי היעדר תגובות רפלקסיות לצביטת כף הרגל, יחד עם קצב נשימה יציב והיעדר תנועה ספונטנית. משחת עיניים הונחה על שתי העיניים כדי למנוע ייבוש בקרנית. לאחר אינטובציה אנדוטרכיאלית, בעלי חיים חוברו למכונת הנשמה של בעלי חיים קטנים בנפח גאות של 4–6 מ"ל ל-200 גרם משקל גוף, קצב נשימה של 70 נשימות לדקה, ויחס נשימה לנשימה של 1:1.

כל ההליכים הכירורגיים בוצעו בתנאים אספטיים. הכלים הכירורגיים עברו עיקור באמצעות אוטוקלב, והאזור הניתוחי הוכן על ידי גילוח וחיטוי בפובידון–יוד ואחריו 70% אתנול. לאחר הכנת אתר הניתוח, בוצע חתך בעור החזה השמאלי, ושרירי החזה הגדולים והקטנים נחתכו בצורה קהה כדי לחשוף את הצלעות. נוצר חתך אופקי של כ-1.0 ס"מ במרחב הבין-צלעי השני עד השלישי הסמוך לגבול הסטרנלי השמאלי. כלי הדם והפאשיה הופרדו באופן חד, והתימוס נמשך בעדינות כדי לחשוף במלואו את הקשת האאורטלית.

הקשת האאורטלית הורמה בזהירות בין העורק האינומינאטי הימני לעורק התרדמה הרגיל השמאלי באמצעות מלקחיים מעוקלים סטריליים, ותפר משי 2-0 הועבר מתחתיה. מחט 16 גייג' מעוקלת עם קצה קהה (קוטר חיצוני 1.6 מ"מ) שונתה ידנית על ידי קהה הקצה וכיפודו לעקמומיות מתאימה לפני השימוש, ולאחר מכן חיטוי באמצעות אוטוקלב. המחט הקהה והמעוקלת שהוכנה הוצבה במקביל לקשת האאורטה, ולאחר מכן התפר נקשר היטב סביב האאורטה והמחט. המחט הוסרה מיד כדי ליצור התכווצות סטנדרטית, והתימוס הונחה מחדש. לאחר אישור היעדר דימום פעיל, דופן החזה והעור נסגרו בשכבות. לאחר הניתוח, הנשימה המכנית נמשכה כ-10 דקות עד שחזרה הנשימה הספונטנית, כפי שמעיד קצב נשימה יציב וסדיר ויכולת לשמור על נשימה ספונטנית ללא תמיכה נשימתית. בשלב זה, הצינור האנדוטרכיאלי הוסר. בעלי חיים שהופעלו בשמה עברו את אותם ניתוחים, למעט שקשת האאורטה לא הייתה קשורה.

לאחר הניתוח, אתר החתך חוטא, ובעלי החיים הוכנסו לכלובים נקיים להחלמה כדי להפחית את הסיכון לזיהום. העכברים הוחזרו לאחר מכן למתקן החיות לשיקום ולמגורים שגרתיים. הקלה בכאבים ניתנה באמצעות בופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג, תת-עורית). חולדות נצפו כל 12 שעות במהלך 72 השעות הראשונות לסימני כאב, מצוקה או סיבוכים כירורגיים, כולל ירידה בתנועה, זקפה, יציבה לא תקינה, נשימה כבדה או שחרור פצע.

שלושה ימים לאחר הניתוח, חולדות בקבוצת ה-SXQY טופלו באור עם 1 מ"ל/100 גרם משקל גוף של תחתון SXQY למשך 9 שבועות. בינתיים, חולדות בקבוצות המופעלות בזיוף ובקבוצות TAC קיבלו נפח שווה (1 מ״ל ל-100 גרם משקל גוף) של מים מזוקקים באמצעות גוואג'.

אקו-לב טרנסטוראקי

בסיום תקופת הטיפול, בוצע אקו-לב טרנס-טוראקי בכל הקבוצות. החולדות הורדמו על ידי שאיפת איזופלוראן והונחו במצב שוכב על פלטפורמת הדמיה ייעודית. החזה הקדמי גולח בקפידה וצופה בשכבה נדיבה של ג'ל אולטרסאונד. הדמיית אולטרסאונד בוצעה באמצעות מערכת אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה לבעלי חיים קטנים, המצוידת בממיר בתדר גבוה (18–40 מגה-הרץ) במצב B ו-M. הממיר הוצב בעדינות על האזור המכוסה בג'ל, עם עומק של 12.29 מ"מ והגברה של 22 dB; הפוקוס הותאם כדי לייעל את איכות התמונה. תמונות ולולאות וידאו נרכשו לניתוח כמותי מאוחר יותר. נמדדו הקוטר הפנימי של קצה החדר השמאלי (LVIDd) ועובי דופן החדר האחורי השמאלית בקצה הדיאסטולה (LVPWd), ושיעור הפליטה של החדר השמאלי (LVEF) חושב באמצעות נוסחת טייכהולץ בהתבסס על מדידות מצב M. לכל פרמטר, המדידות נערכו בממוצע במשך 3–5 מחזורי לב רצופים. כל הרכישות והניתוחים באקו-לב בוצעו על ידי מפעיל מוסמך עם הכשרה פורמלית באקו-קרדיוגרפיה, בהתאם לפרוטוקולים אקו-לביים סטנדרטיים.

איסוף ועיבוד דגימות

לאחר הליך האולטרסאונד, חולדות הורדמו באיזופלורן. החיות הונחו בשכיבה, וחלל החזה נפתח כדי לחשוף את הלב. הלבבות נחתכו במהירות, נשטפו במלח קר עם בופר פוספט, וחולקו לאורך מישור הסגיטלי. רקמות הלב קיבעו מיד ב-4% פאראפורמלדהיד בטמפרטורה של 4°C במשך 24 שעות, ולאחר מכן התייבשות באמצעות סדרת אתנול מדורגת (70%, 80%, 90%, 95%, ו-100%) למשך שעה בכל שלב, שבמהלכה הרקמות הפכו בהדרגה לשקופות ללא התכווצות מורגשת. הדגימות נוקו בקסילן, הוספנו בפרפין מותך בטמפרטורה של 60°C במשך 3 שעות, ואפשרו להתקשה בטמפרטורת החדר (RT; 20°C–25°C). בלוקי רקמת הלב המוטמעים בפרפינים נחתכו וחתכו בעובי 4–6 מיקרון באמצעות מיקרוטום. חלקים הוצפו על אמבט מים שנשמרו על 45°C, הותקנו על מגלשות זכוכית, ויובשו בטמפרטורה של 37°C–40°C במהלך הלילה. המגלשות אוחסנו ב-RT בתנאי לחות נמוכה ושימשו תוך שבוע לצביעה היסטולוגית.

צביעת המטוקסילין ואאוזין (HE)

מקטעים מוטמעים בפרפינים עובדו כך: החתכים עברו תחילה דה-פרפין בטבילה בקסילן I, II ו-III למשך 5 דקות כל אחד, לאחר מכן הידרציה דרך סדרת אתנול אנ-הידר I ו-II ותמיסות אתנול מדורגות (95%, 90%, 80%, 70% ו-50%) למשך 5 דקות כל אחת, ולבסוף שטפו במים מזוקקים ללא שאריות שעווה נראות לעין. החלקים נצבעו בהמטוקסילין האריס למשך 5 דקות ונשטפו במי ברז זורמים למשך 1–2 דקות. התמיינות בוצעה בתמיסת אלכוהול חומצי במשך כ-1–2 שניות, כאשר נקודת הקצה נקבעה על ידי בדיקה ויזואלית כאשר הרקע נראה חיוור בעוד הצביעה הגרעינית נותרה מוגדרת בבירור. לאחר מכן הכחול במים בטמפרטורה של 37°C–45°C ושטיפה במים מזוקקים. לאחר מכן, החלקים צוברו נגד באאוזין מסיס באלכוהול למשך 40 שניות, נשטפו במים מזוקקים, יובשו באמצעות אתנול מדורג, נוקו בקסילן, ולבסוף הורכבו בשרף נייטרלי.

מסון טיינינג

קטעים מוטמעים בפרפין עברו דה-פרפין ברצף בקסילן I, II ו-III במשך 5 דקות כל אחד, לאחר מכן הידרציה באמצעות אתנול אנהידרוס I ו-II ותמיסות אתנול מדורגות (95%, 90%, 80%, 70% ו-50%) למשך 5 דקות כל אחד, ולבסוף נשטפו במים מזוקקים. החלקים הוטבלו בחומצה אצטית של 0.5% (מקורר מראש ל-4°C) למשך שנייה אחת, ולאחר מכן צביעו בתמיסת פוקסין מערכת צביעה טריכרום מסחרית של מסון למשך 10 דקות, ולאחר מכן הבדלה בחומצה פוספומוליבדית למשך 5 דקות וצביעה נגדית עם כחול אנילין למשך 3 דקות. כל החומרים היו רכיבים של אותה ערכה מסחרית ושימשו לפי הוראות היצרן. לאחר הצביעה, החלקים נשטפו שלוש פעמים בחומצה אצטית מקוררת מראש ל-4°C (כ-30 שניות לכל שטיפה), יובשו באמצעות אתנול מדורג, נוקו בקסילן, והותקנו בשרף ניטרלי.

איסוף דגימות סרום לניתוח מטבולומיקה

שישה זכרים בני 8 שבועות של חולדות SD אוחסנו בתנאים דומים לאלו בניסוי in vivo הנ"ל. בעלי החיים חולקו באקראי לקבוצה שטופלה על ידי SXQY ולקבוצת ביקורת כלי רכב (מים מזוקקים; n = 3 לכל קבוצה) באמצעות שיטת אקראיות ממוחשבת. העכברים בקבוצת SXQY קיבלו מינון של 1 מ"ל/100 גרם משקל גוף, בעוד שקבוצת הביקורת קיבלה נפח שווה של מים מזוקקים. לאחר שבעה ימים של טיפול יומי, המנה הסופית ביום השביעי הוכפלה. לאחר הממשל האחרון, החיות צומו במשך 12 שעות. חולדות הורדמו עם איזופלורן עד שאובדן רפלקס הגמילה מהדוושה אושר כאינדיקטור להרדמה מספקת. דגימות דם נאספו מקלקסוס ורידי רטרו-אורביטלי באמצעות צינורות נימים סטריליים והועברו מיד לצינורות מיקרוצנטריפוגה בקוטר 1.5 מ"ל ללא נוגד קרישה. הדם המלא הורשה לעמוד ב-RT למשך שעה וצנטריפוגה ב-1000 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C לקבלת סרום. כאשר הופיעה הפרדה ברורה בין שכבת הסרום השקופה העליונה לקריש הדם, הסרום הסופרנטנטי נשאף בזהירות והועבר לצינורות מיקרוצנטריפוגה נקיים. דגימות הסרום אוחסנו בטמפרטורה של −80°C עד לניתוח הרכיבים הנכנסים לדם.

טיפול מקדים לדוגמה לניתוח מטבולומיקה

דגימות הסרום הופשרו על קרח לאחר הוצאה מאחסון של −80°C וערבבו לזמן קצר במערבולות (10 שניות) כדי להבטיח הומוגניות. סרום של 100 מיקרוליטר הועבר לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, ולאחר מכן נוספה 500 מיקרולטר של ממס חילוץ (20% אצטוניטריל–מתנול המכיל 2-כלורו-L-פנילאלנין כתקן פנימי בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל) כדי לגרום למשקעים חלבונים. התערובת עברה מערבולת בעוצמה במשך 3 דקות וצנטריפוגה ב-12,000 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C. חלק של 470 מיקרוליטר מהסופרנטנט שהתקבל הועבר לצינור חדש והתאדה ליובש באמצעות מאייד חנקן בזרימה נמוכה ומבוקרת של חנקן. לאחר שיקום ב-200 מיקרוליטר של 70% מתנול–מים ומערבולת למשך דקה אחת, הדגימות צנטריפוגות ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C, ו-180 מיקרו-ליטר מהסופרנטנט המובהק הועברו לבקבוקי אוטוסמפלר לניתוח כרומטוגרפיה נוזלית–ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS).

לאחר מכן הועבר אליקו של 200 מיקרוליטר של דגימת SXQY לצינור צנטריפוגה מתויג מראש בנפח 1.5 מ"ל. תמיסת החילוץ הסטנדרטית הפנימית נוספה לכל דגימה ביחס נפח של 1:1 (v/v). התערובת הייתה מעורבבת בוורטקס במשך 15 דקות וצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורה של 4°C. הסופרנטנט שהתקבל נאסף בקפידה וסינן דרך ממברנה מיקרופורית של 0.22 מיקרון, מה שיצר סינון שקוף ללא חלקיקים גלויים. הסינון הועבר לבקבוקי דגימה אוטומטית ונשמר בטמפרטורה של 4°C לפני ניתוח LC-MS/MS (UPLC–MS/MS) בעל ביצועים גבוהים.

הכנת פתרונות סטנדרטיים פנימיים

תמיסת המאגר הפנימית (2-כלורו-L-פנילאלנין) הוכנה על ידי המסה של 1 מ"ג מהתקן הייחוס ב-1 מ"ל של 70% (v/v) מתנול-מים, שהניב ריכוז של 1,000 מיקרוגרם/מ"ל. תמיסת המלאי דוללה עוד יותר עם אותו ממס כדי לקבל תמיסה פנימית תקנית עובדת בריכוז סופי של 1 ppm, שהוכנה טרי, נשמרה בטמפרטורה של 4°C ושימשה תוך 48–72 שעות.

תנאי UPLC–MS/MS

הפרדה כרומטוגרפית בוצעה באמצעות מערכת UPLC שמחוברת לספקטרומטר מסה טנדם. ההפרדה הושגה על עמוד C18 שנשמר בטמפרטורה של 40°C, עם קצב זרימה של 0.35 מ"ל לדקה ונפח הזרקה של 4 מיקרוליטר. השלב הנייד כלל מים אולטרה-טהורים המכילים 0.1% (v/v) חומצה פורמית (A) ואצטוניטריל המכיל 0.1% (v/v) חומצה פורמית (B). שחרור גרדיאנט הוחל כך: 5% B ב-0.0 דקה; העלייה ליניארית ל-25% B ב-2.0 דקות, 35% B ב-3.0 דקות, 60% B ב-5.0 דקות, ו-99% B ב-6.0 דקות; הוחזק על 99% B למשך 1.5 דקות; חזר ל-5% B בדקה 7.6; והייתה מאוזנת ב-5% B עד 10.0 דקות.

זיהוי ספקטרומטרי המסה בוצע באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה המצויד במקור יינון אלקטרוספריי הפועל במצבי יונים חיוביים ושליליים. מתחי הריסוס הוגדרו ל-3500 וולט במצב חיובי ול-3200 וולט במצב שלילי. גז המעטפת וגז העזר הוגדרו ל-30 ו-5 יחידות שרירותיות (מוגדרות על ידי מכשירים), בהתאמה. טמפרטורת צינור העברת היונים וטמפרטורת האידוי נשמרו על 320°C ו-300°C, בהתאמה. סריקות MS מלאות נלקחו בטווח m/z של 84–1250 ברזולוציה של 35,000 עם יעד בקרת הגבר אוטומטי (AGC) של 1.0 × 10⁶, ואחריהן רכישת MS/MS תלויה בנתונים (עשרת הראשונים) ברזולוציה של 17,500 עם יעד AGC של 2.0 × 10⁵ וחלון בידוד של 1.0–1.5 m/z. הוטמעו אנרגיות התנגשות מנורמלות מדורגות של 30, 40 ו-50. עשרת היונים הקדומים החזקים ביותר נבחרו לפירוק עם משך הדרה דינמי של 3 שניות.

עיבוד נתונים גולמיים

נתוני ספקטרומטריית מסה גולמיים הומרו לפורמט mzML באמצעות ProteoWizard. כדי להבטיח אמינות אנליטית, הוכנו דגימות בקרת איכות (QC) מאוחדות על ידי ערבוב נפחים שווים של כל דגימות הסרום. דגימות בקרת איכות הוזרקו במרווחים קבועים (הזרקת QC אחת כל 5–10 דגימות אנליטיות) במהלך ניתוח UPLC–MS/MS כדי לעקוב אחר יציבות המכשיר, עקביות זמן השמירה ויכולת השחזור של האות. השחזוריות הוערכה על בסיס סטיית התקן היחסית של עוצמות השיא בדגימות QC.

זיהוי שיא, תיקון זמן שמירה ויישור שיא בוצעו באמצעות חבילת XCMS. מאפיינים עם שיעור חסר מעל 50% בכל קבוצה הוצאו מניתוח נוסף. תיקון סטיית האות יושם לאחר מכן על אזורי שיא באמצעות שיטת נורמליזציה מבוססת רגרסיית וקטור תמיכה (SVR) שיושמה בתוכנת R הסטטיסטית באמצעות מודלים מבוססי בקרת איכות לתיקון סטיית האות לאורך הריצה האנליטית.

זיהוי מטבוליטים בוצע על ידי התאמת התכונות המתוקנות לספריית תקני ייחוס פנימית (המכילה כ-5,000 תרכובות עם נתוני ספקטרום של MS1 ו-MS2; קנייני ואינו זמין לציבור), וכן מסדי נתונים ספקטרליים זמינים לציבור, כולל Human Metabolome Database (HMDB), Metabolite and Tandem Mass Spectrometry (METLIN), MassBank, ו-Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS), בהתבסס על התאמת מסה מדויקת, יישור זמן שמירה ודמיון ספקטרלי בין MS/MS. התאמת מסה בוצעה באמצעות סבילות של ±25 חלקים למיליון ליוני קדם-ראש (MS1) ויוני מקטעים (MS2), עם סבילות זמן שמירה של ±6 שניות. לחיפוש ספרייה, הוחל סבילות של ±25 ppm ליוני קדם-מלין (Q1) ו-±50 ppm לקטעי MS/MS, עם ציון התאמה מינימלי של MS/MS של 0.3. רק מטבוליטים עם ציון זיהוי מקיף מעל 0.5 נשמרו לזיהוי לא ממוקד. הניקוד הסופי חושב כסכום משוקלל של ציונים תואמים של קטע (0.1), קדימה (0.3) והפוך (0.6). הנתונים שנאספו במצבי יוניזציה חיובית ושלילית אוחדו ברמת התרכובת. עבור הערות כפולות, נבחר הערך עם הביטחון הגבוה ביותר בזיהוי והציון הגבוה ביותר. ההערות הסופיות נאספו לקובץ הערות מטבוליטיות.

קריטריונים לזיהוי תרכובות נספגות

רכיבי אב-טיפוס שנספגו הוגדרו כתרכובות שזוהו בתמצית SXQY ובקבוצת SXQY עם זמני שמירה תואמים בתוך סבילות של ±0.1 דקות. בנוסף, תרכובות אלו נדרשו להציג אזור שיא בקבוצת הטיפול ב-SXQY שהיה לפחות פי שניים גבוה יותר מאשר בקבוצת הביקורת של הרכב או להיעדר מדגימות הביקורת.

מטבוליטים נספגים זוהו באמצעות סט קריטריונים שונה. תרכובות אלו לא זוהו בתמצית SXQY אך היו קיימות בקבוצת הטיפול ב-SXQY. תכונות ספקטרומטריות המסה שלהן נדרשו להיות עקביות עם טרנספורמציות מטבוליות אופייניות, כולל הידרוקסילציה (Δm/z = +15.9949 Da) ודמתילציה (Δm/z = −14.0157 Da). יתרה מזאת, שטח השיא בקבוצת ה-SXQY נדרש להיות גבוה פי שניים לפחות מאשר בקבוצת בקרת הרכב בהתבסס על אזורי שיא מנורמלים לאחר תיקון סטיית האות, אחרת האות המתאים היה צריך להיות בלתי ניתן לזיהוי בדגימות בקרת הרכב.

שליפת גנים הקשורים לתרכובות נספגות

רכיבי הזנת הדם נבדקו בפלטפורמת מאגר וניתוח מערכות פרמקולוגיה של הרפואה הסינית המסורתית (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.ph; ניגשה בינואר ²⁰²⁶). תרכובות שתועדו ב-TCMSP נבדקו כמרכיבים ביואקטיביים מועמדים בהתבסס על ספי זמינות פרמקוקינטיים מוכרים ≥ 30% ודמות-תרופה ≥ 0.18²¹. היעדים המשוערים התואמים לתרכובות שנשארו נאספו לאחר מכן, וכל מזהי המטרה הוסדרו לסמלים גנים רשמיים באמצעות מאגר הנתונים UniProt²².

שליפת מטרות הקשורות למחלה וגני חיתוך

גנים הקשורים ל-HF נאספו ממאגר GeneCards (https://www.genecards.org/; ניגש בינואר 2026) תוך שימוש במונח "אי ספיקת לב" כמונח החיפוש, וגנים עם ציון רלוונטיות ≥ 10 נבחרו לניתוח נוסף. המטרות הקשורות ל-HF נחתכו לאחר מכן עם מטרות קשורות לתרכובות שזוהו מ-TCMSP באמצעות פלטפורמת Weishengxin (https://www.bioinformatics.com.cn; ניגשה בינואר 2026). הגנים החופפים הוגדרו כיעדי חיתוך ושימשו לבניית רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) ולניתוחי העשרה פונקציונלית נוספים.

בניית רשת וניתוחי העשרה פונקציונלית

ניתוח PPI של היעדים שזוהו בוצע באמצעות מסד הנתונים STRING (http://cn.string-db.org/; ניגש בינואר 2026)²³ כאשר המין מוגדר להומו סאפיינס וסף אמון של ≥0.7. נתוני האינטראקציה יובאו לכלי ההמחשה Cytoscape לצורך ויזואליזציה ברשת. ניתוח טופולוגי בוצע באמצעות תוסף NetworkAnalyzer בכלי הוויזואליזציה, וגני המרכז זוהו באמצעות תוסף CytoHubba^{מספר 24,25}. ניתוח העשרת אונטולוגיית גנים (GO) בוצע על מטרות החיתוכים, כולל קטגוריות תהליכים ביולוגיים (BP), רכיב תאי (CC) ותפקוד מולקולרי (MF). מונחי GO עם ערך P < 0.05 נחשבו למשמעותיים, ועשרת המונחים המועשרים ביותר מכל קטגוריה נבחרו לוויזואליזציה²⁶. יעדי החיתוך עברו ניתוח העשרת מסלולים של אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) באמצעות חבילת clusterProfiler בתוכנה הסטטיסטית. מסלולים עם ערך P < 0.05 נחשבו מובהקים סטטיסטית, ו-20 המסלולים המועשרים ביותר נבחרו להמחשה. מסלולים אלו שימשו לאחר מכן לבניית רשת אינטראקציה בין מטרה-נתיב²⁷.

ניתוח סטטיסטי

הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. נורמליות התפלגות הנתונים הוערכה באמצעות מבחן שפירו–וילק, והומוגניות של השונות הוערכה באמצעות מבחן לבין או מבחן בראון-פורסיית' לפני הניתוח. השוואות סטטיסטיות בין קבוצות בוצעו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי באמצעות GraphPad Prism. P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית.

תוצאות

אקו-לב טרנסטוראקי

ניתוח אקו-לב חשף שינוי לב בולט ותפקוד לקוי בעכברי TAC (איור 1). בהשוואה לביקורת ב-Sham, TAC העלה משמעותית את LVIDd ו-LVPWd, בעוד ש-LVEF ירד משמעותית. ראוי לציין כי מתן SXQY הפך חלקית את השינויים הפתולוגיים הללו, כפי שמשתקף בהפחתה משמעותית ב-LVIDd וב-LVPWd ובשיפור נלווה ב-LVEF בהשוואה לקבוצת TAC.

דיון

SXQY נמצא בשימוש נרחב בפרקטיקה הקלינית כבר למעלה משני עשורים, ומדגים יעילות בטיפול במצבים קרדיווסקולריים שונים. לאחרונה, השימוש בו הורחב גם למטופלים עם אי ספיקת לב עם שבר פליטה מופחת ושבר פליטה מופחת במידה קלה¹⁶. במחקר הנוכחי, הוכח מודל עכברים על ידי ניתוח TAC כדי לחקות שינויים פתולוגיים ב-HF, ובינתיים חלק מהעכברים טופלו ב-SXQY כדי לבדוק את יעילותו. אקו-לב טרנסטורקי, צביעת HE וצביעת מסון שימשו להערכת האם המודלים הוצבו בהצלחה והאם SXQY השפיע. HF שנגרם על ידי TAC הע...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-כלורו-אל-פנילאלנין	אלדין	C105993-1 גרם	תקן פנימי; ≥ 98%
אצטוניטריל (דרגת LC-MS)	אלדין	A120771-1L	ממס חילוץ
חומצה אצטית	סולרביולוגיה	G1340	כתמי מאסון; מקורר מראש ל-4 ומעלות; C
בקבוקי אוטוסמפלר	אג'ילנט	5190-9590	לטעינת דגימות LC-MS/MS
בופרנורפין	סריליאנט	B-044S	משכך כאבים
עמודת C18 (1.8 & mu; m, 2.1 מ"מ & פעמים; 100 מ"מ)	מים	176001125	עמודת ACQUITY Premier HSS T3
צינורות נימים, סטריליים	פישרברנד	22-362-566	איסוף דם רטרו-אורביטלי
צנטריפוגה (מקוררת)	קובוטה	N61196-F000	לעיבוד סרום ודגימות
חבילת clusterProfiler	ביו-קונדוקטור	—	חבילת R לניתוח העשרה של KEGG; v4.0.2
מלקחיים מעוקלים, סטריליים	HL-SQX	HL-JP	מניפולציה של קשת האאורטה
תוכנת Cytoscape	NHGRI	NIH NHGRI עד גיל 24 HG012107	גרסה 6.4.1
פלטפורמת הדמיה ייעודית	פוג'יפילם ויזואליסוניקס	מערכת הדמיית אולטרסאונד VisualSonics Vevo 1100	מיקום בעלי חיים במהלך אקו לב
מים מזוקקים	לא זמין	לא זמין	הכנת דקוקציה ושליטה ברכב
מעטפת חימום חשמלית	מידאה	WK2102	רתיחה של דקוקטן
צינור האנדוטרכיה	CWE Inc., ארה"ב	SAR-1000	אינטובציה אנדוטרכיאלית; צינור האנדוטרכיה ששימש במחקר זה שולב בתצורת מכונת הנשמה ולא היה מכשיר נפרד או עצמאי
אתנול (מוחלט)	בייג'ינג יילי פיין כימיקלים בע"מ.	64-17-5	ייבוש ועיקור
חומצה פורמית	אלדין	O930702	תוסף פאזה ניידת
גזה	סולרביולוגיה	YA0720	סינון דקוקטיה; 200– 300 & mu; גודל נקבוביות M
מאגר GeneCards	ג'ינקארדס	—	שליפת מטרות הקשורה למחלה; ניגש בינואר 2026
מסד הנתונים של GNPS	אוניברסיטת קליפורניה סן דייגו	—	מאגר ספקטרלי; גרסה 1.3.16, נתונים נשמרו בארכיון בדצמבר 2025
תוכנת GraphPad Prism	תוכנת GraphPad	—	גרסה 10.1.2; SCR_002798
כרית חימום (תרמוסטטית)	פיזיטמפ	HP-4M	מתוחזק ב-37 ומעלה (37 & deg); C
המטוקסילין ואאוסין (H&) ה) ערכת צביעה	סולרביולוגיה	G1120	צביעה היסטולוגית
מתמר בתדר גבוה	VisualSonics	Vevo F2	18– 40 מגה-הרץ
ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה	תרמו פישר סיינטיפיק	ש: אקסקטיבי	Q אקסקטיבי HF-X
מערכת אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה לבעלי חיים קטנים	פוג'יפילם ויזואליסוניקס	מערכת הדמיית אולטרסאונד VisualSonics Vevo 1100	Vevo 2100
מסד הנתונים של HMDB	קבוצת המחקר וישארט / מרכז החדשנות למטבולומיקה, אוניברסיטת אלברטה	—	מאגר ספקטרלי; גרסת HMDB הנוכחית 5.0; מהדורה 5.0; ינואר 2022
ספריית תקן עיון פנימית	METWARE	—	הרכב ספריית התקן הפנימית: הספרייה מכילה סך של 5,000 תרכובות וכוללת גם מידע MS1 (קדם-מבשר) וגם נתוני ספקטרום MS2 (פיצול). הצהרת זמינות: פורמט נתוני הספרייה הוא .txt. תנאי אחסון: מסד הנתונים מאוחסן בשרת הפנימי של החברה. הרשאות גישה: ספריית סטנדרט זו שנבנתה בעצמה היא ספריית ספקטרלית קניינית של החברה. הוא משמש אך ורק לזיהוי מטבוליטים, אימות תוצאות ומעקב אחר איכות בתוך תהליכי העבודה האנליטיים המבוקרים של החברה. הספרייה אינה זמינה להורדה לציבור. לקוחות יכולים לקבל תוצאות הערות, מידע על פגיעות ותיאורי שדות נחוצים שנוצרים בהתבסס על ספרייה זו.
איזופלוראן	סיגמא-אלדריץ'	792632	הרדמה בשאיפה
מערכת כרומטוגרפיה נוזלית (UPLC)	SCIEX	ExionLC AD	ExionLC AD
מאגר MassBank	קונסורציום MassBank; אגודת ספקטרומטריית המסה של יפן / MassBank Europe	—	מאגר ספקטרלי; גרסה 2024.06; נתונים נשמרו בארכיון בדצמבר 2025
מסון' ערכת כתמים משולשת	סולרביולוגיה	G1340	צביעה היסטולוגית
מסנן ממברנה (0.22 & mu; m)	ביוטיים	FF362	פוליאתרסולפון (PES)
מסד נתונים של METLIN	מכון המחקר סקריפס / מעבדת סיוזדק	RRID: SCR_010500	מאגר ספקטרלי; מאגר זה אינו מספק מספר גרסה שנתי קבוע; נתונים שהורדו ב-2023
מתנול (דרגת LC-MS)	בייג'ינג יילי פיין כימיקלים בע"מ.	67-56-1	ממס חילוץ
צינורות מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)	קורנינג למדעי החיים (ווג'יאנג) בע"מ	MCT-150-C	עיבוד דגימות
מיקרוטום	לייקה	DSC1	חתך רקמות
שרף נייטרלי	סולרביולוגיה	G8590	התקנת מחסנית
מאייד/מקור גז של חנקן	אורגנומציה	N-EVAP	ייבוש דגימות
משחת עיניים	אלדין	08-03-8009	הגנה על העיניים במהלך הרדמה
פרפין	סולרביולוגיה	YA0010	הטמעת רקמות
פאראפורמלדהיד (4%)	סולרביולוגיה	P1110	קיבוע רקמות
סליין ממוגן בפוספט	דו יו יו	DYP1021	שטיפת טישו
חומצה פוספומוליבדית	סולרביולוגיה	G1340	צביעת מסון
Povidone– יוד	סולרביולוגיה	IP3800	חיטוי כירורגי
תוכנת ProteoWizard	קרן פרוטאווויזארד	—	גרסה 3.0.19254
תוכנת R	קרן R	—	גרסה 4.2.2
אידוי סיבובי	QINGDAO JINGCHENG INSTRUMENT CO., LTD	JC-2LZF	ריכוז דקוקציה תחת לחץ מופחת
תפר משי (2-0)	הפולן	NL30RH26A-76	היצרות האאורטה
מכונת הנשמה לבעלי חיים קטנים	CWE Inc., ארה"ב	SAR-1000	אוורור מכני
Sprague– חולדות דולי (זכר, 8 שבועות)	SPF Bio בע"מ	—	RGD_70508; מספר רישיון. SCXK(jing)2024-0001
מאגר מחרוזות	קונסורציום המיתרים	—	ניתוח אינטראקציות חלבונים; ניגש בינואר 2026
חבילת/סקריפט תמיכה בנירמול רגרסיה וקטורית	MetNormalizer	—	תיקון סטיית האות; v1.3.02
מסד הנתונים של TCMSP	TCMSP	—	שליפה מורכבת ומטרה; ניגש בינואר 2026
מסד הנתונים UniProt	קונסורציום UniProt	—	תקנון סמלי גנים
ג'ל אולטרסאונד	MAGNAFLUX	25-912	אקוקרדיוגרפיה
מים אולטרה-טהורים	מוכן במעבדה	—	ממס פאזה נייד
מערבל מערבולת	יאלין	VM-ST	מיקס דגימות
אמבט מים	ג'ולאבו	PURA22	הקטע צף ב-45 ומעלות; C
פלטפורמת ויישנגשין	ויישנגשין	—	ניתוח צמתים של מטרות; ניגש בינואר 2026
תוכנת XCMS	קרן R	—	גרסה 3.16.1
קסילן	אלדין	X775162	דה-פראפיניזציה