מודל עכבר של פגיעת מוח סגורה בראש סיבובית וחוזרת

סיכום

מתואר מודל עכבר שכפול של פגיעת מוח סיבובית, המספק שיטה גמישה לחקור את היסודות התפקודיים והביולוגיים העדינים - כולל שינויים נוירווסקולריים, דלקתיים והתנהגותיים - לאחר פגיעה בודדת או חוזרת בהיעדר נזק מוחי מבני גלוי.

תקציר

פגיעת מוח מזעזעת (CBI), הבסיס הפתופיזיולוגי שמאחורי זעזוע מוח קליני, היא מצב נפוץ אך לא מובן מספיק עם פגיעה נוירולוגית פוטנציאלית ארוכת טווח בקרב תת-קבוצה של מטופלים. CBI חוזר במיוחד, כלומר בספורט מגע, נקשר לליקויים קוגניטיביים מתמשכים ולנוירודגנציה מתקדמת (למשל, אנצפלופתיה טראומטית כרונית, CTE). כדי להתמודד עם פער הידע הזה, הוקם מודל עכברים שניתן לשחזור של פגיעת מוח סיבובית בראש סגור, שמסכם תכונות ביומכניות ופתולוגיות מרכזיות של CBI. פוגע אלקטרומגנטי מונחה סטריאוטקטית שימש לביצוע מכה סטנדרטית לגולגולת שלמה. כדי להפחית את העומס המוקדי על הגולגולת ורקמת המוח הסמוכה, קצה הפגיעה הותקן בכובע סיליקון מותאם אישית. תצורה זו גרמה באופן אמין לסיבוב ראש עם שונות בין-חיותית נמוכה, תוך מניעת שברים בגולגולת או פגיעות ברקמה מיקרוסקופית. כדי לשמר פעילות נוירונית וכלי דם פיזיולוגית ולמנוע השפעות נוירומודולטוריות פוטנציאליות של הרדמה עמוקה, נגרם פגיעת מוח בעכברים בהכרה תחת הרדמה קלה באמצעות α2-אגוניסט מדטומידין. הפגיעות שנגרמו גרמו לתנועת ראש סיבובית שחוזרת עם שונות מינורית בלבד הנובעת ממיקום הראש. שלמות המוח המבנית הוערכה באמצעות הדמיית תהודה מגנטית משוקללת T2 ב-in vivo ואושרה על ידי ניתוחים היסטולוגיים מחוץ לחי (ex vivo ), שלא גילו עדות להפרעה ברקמות, חבלה או מיקרו-דימומים אך הראו הפרעה קלה ונרחבת בממשק המיקרווסקולרי. המודל החדשני הזה של פגיעת מוח סגורה סיבובית מספק פלטפורמה ניסיונית איתנה לחקירות אורך של שינויים עדינים בנוירווסקולריה, דלקתית ומחסום דם-מוח המתרחשים בהיעדר פתולוגיה מבנית גלויה. יישומו מאפשר תובנות מכניות לגבי הפתופיזיולוגיה של זעזוע מוח קליני ותוצאות ניווניות אפשריות של פציעה חוזרת, ובכך מקל על פיתוח סמנים ביולוגיים קליניים נחוצים בדחיפות.

מבוא

פגיעת מוח טראומטית (TBI) נותרה סיבה משמעותית לנכות ארוכת טווח בכל קבוצות הגיל, כאשר מתבגרים וצעירים מושפעים באופן לא פרופורציונלי ^1,2,3. רוב מוחלט של פגיעות טראומטיות מסווגות כקלות (mTBI), המכונות בדרך כלל זעזוע מוח ברמה הקלינית. למרות שזעזוע מוח אינו קשור בהגדרה לנזק מוחי מבני גלוי שניתן לזהות באמצעות הדמיה נוירוגרפית קונבנציונלית, עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שמנגנון הפציעה הבסיסי — המכונה כאן פגיעת מוח מזעזעת (CBI) — מייצג ישות פתופיזיולוגית מובחנת ורלוונטית קלינית.

במיוחד, CBI חוזר, במיוחד כאשר הוא מתרחש ברצף זמני קרוב, כפי שנפוץ בספורט מגע ובסביבות צבאיות, נקשר לירידה קוגניטיבית מתמשכת, תסמינים נוירופסיכיאטריים והתפתחות אנצפלופתיה טראומטית כרונית (CTE)^1,2,3. הפער הנראה לכאורה בין האופי הקל של הפציעה הראשונית לבין הפוטנציאל לתופעות נוירולוגיות ארוכות טווח מהווה אתגר משמעותי הן לאבחון קליני והן למחקר מכניסטי.

עדויות מתפתחות מצביעות על כך ששינויים עדינים אך מתמשכים בממשק הנוירווסקולרי והנוירוגליאלי מהווים מנגנון מחלה רלוונטי⁴. שינויים אלה כוללים שלמות מחסום דם-מוח (BBB), מבנה מיקרווסקולרי, הפעלה גליאלית, התעוררות נוירונית ותהליכי תיקון אנדוגניים, מה שעשוי לקשר בין פתופיזיולוגיה ברמת התא לליקויים תפקודיים והתנהגותיים ארוכי טווח שנצפו לאחר CBI ^5,6,7,8 החוזר במיוחד. ביחד, שינויים כאלה מוכרים יותר ויותר כגורמים פוטנציאליים לעיכוב בליקויים תפקודיים והתנהגותיים לאחר CBI. עם זאת, הטבע המפוזר והרב-פנים מסבך את ההבנה המכניסטית ועד כה מנע את פיתוח התערבויות טיפוליות ממוקדות.

מודלים פרה-קליניים שמסכמים היבטים מרכזיים של המפל הפתופיזיולוגי הם כלים חיוניים לניתוח מנגנונים אלו ולזיהוי דרכי טיפול חדשות. למרות שקיימים מגוון רחב של מודלים ניסיוניים של TBI, רובם תוכננו לחקות פציעות בינוניות עד חמורות או להסתמך על נזק מבני מוקד ^9,10,11. לעומת זאת, יש מחסור מדהים במודלים בעלי חיים למנגנון הפציעה האופייני של CBI⁵. בעיקרון, טראומה מוחית המסומנת כ"קלה" נגרמת על ידי פגיעה מוקדית בראש המקובע היטב, או אפילו על ידי פגיעה קורטיקלית ישירה לאחר קרניוטומיה, אשר סותרת באופן יסודי את מנגנון הפציעה המפוזר, המונע על ידי האצה-האטה, שמגדיר זעזוע מוח בבני אדם ^6,7. למרות שגישות כאלה מאפשרות שליטה מדויקת על פרמטרי הפציעה, היכולת המוגבלת שלהן לשחזר את הדינמיקה של זעזועי מוח אמיתיים מפחיתה את הרלוונטיות התרגומית שלהן.

כדי להתגבר על מגבלות אלו, קיימות מספר שיטות לגרימת פגיעה מוחית סגורה שניתנת לשכפול ומפוזרת 12,13,14. בהתבסס על מושגים אלו ובשאיפה למזער מורכבות טכנית, פותח מודל פגיעה סיבובית מבוקרת בעכברים המשתמש במכה אלקטרומגנטית זמינה מסחרית, המשמש לעיתים קרובות במודלים ניסיוניים אחרים של טראומה (כלומר, פגיעה קורטיקלית מבוקרת, CCI). על ידי מתן השפעה חוזרת לראש הנע בחופשיות, גישה זו שומרת על שלמות מבנית תוך מתן אפשרות לחקירה אורכית של שינויים נוירו-וסקולריים, נוירוגליאליים ותפקודיים לאחר CBI יחיד וחזרתי, בתנאים הקרובים מאוד לתכונות הביומכניות של זעזוע מוח אנושי.

בשילוב עם הערכה התנהגותית אורך, הדמיה ב-vivo והיסטולוגיה אקס-ויבו , מודל זה מספק פלטפורמה גמישה ונגישה לחקר שינויים נוירו-וסקולריים, גליאליים והתנהגותיים לאחר פגיעות בודדות או חזרתיות. לכן, הוא מתאים במיוחד לחקר מנגנוני המחלה המשניים העדינים של CBI, זיהוי פרמטרים תחליפים תרגומיים והערכת התערבויות טיפוליות פוטנציאליות בסביבה ניסיונית קלינית רלוונטית.

פרוטוקול

כל נהלי בעלי החיים עמדו בחוק רווחת בעלי החיים הגרמני ואושרו על ידי רשויות מוסדיות וממשלתיות (LANUV Nordrhein-Westfalen; AZ 81-02.04.2020.A058). הניסויים נערכו בהתאם להנחיות ARRIVE. תהליך עבודה סכמטי מפורט באיור 1. פרוטוקול זה גורם באופן אמין לפגיעת מוח זעזועית, כפי שניתן לראות בפאנל מוגדר של תוצאות אימות מבניות, התנהגותיות ונוירו-וסקולריות (איור 2). כל החומרים ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. שיקולים כלליים

הערה: העכברים אוחסנו חברתית בתנאים סטנדרטיים (מחזור אור/חושך של 12 שעות) עם גישה חופשית למזון ולמים. העכברים התרגלו למתקן הניסוי לפחות 7 ימים לפני הניתוח. בסך הכול נעשה שימוש ב-40 עכברים במחקר הפיילוט הזה, כאשר 10 בעלי חיים הוקצו לכל קבוצת ניסוי (קבוצת ביקורת מזוימת, קבוצת CBI בודדת, CBI חזרתי בתדירות גבוהה, ו-CBI חוזר בקבוצת תדירות נמוכה). התקן מערכת מצלמה מהירה בגובה העיניים כאשר ראש העכבר ממוקם במיקום קבוע מול העכבר (למשל, 10 ס"מ). כדי להבטיח עקביות בין ניסיונות, שמור על מיקום המצלמה וכיוון קבועים. במחקר זה נעשה שימוש ב-GoPro Hero6 במהירות של 240 פריימים לשנייה (fps) ברזולוציה של 1080px. תוכנת ניתוח תנועה בקוד פתוח Kinovea (גרסה 2025.2.0) משמשת לניתוחים קינמטיים שתוארו.

2. השראת כאבים והרדמה

1. הכינו את ההגדרות, כולל המסגרת הסטריאוטקטית והחיבור של הפגיעה האלקטרומגנטית.
2. מתן טרמדול (1 מ"ג/מ"ל) במים שתייה יומיים לפני ההשראה לטראומה וממשיך שלושה ימים לאחר הניתוח (האחרון).
3. השרה הרדמה באמצעות איזופלוראן בתערובת חנקן חמצן/חמצן (O₂ 30%, N₂O 70%), עם איזופלוראן של 4–4.5% בתא השראה.
4. הערך את סבילות הניתוח באמצעות רפלקס צביטת האצבעות. המשך ברגע שאין תגובת גמילה.
5. הוציאו את העכבר מתא האינדוקציה והניחו אותו על כרית חימום בתוך מסגרת הסטריאוטקטיקה. שמור על טמפרטורת הליבה ב-37 ± 1.0 מעלות צלזיוס באמצעות גלאי סיבים אופטיים רקטליים. הגנו על העיניים מהתייבשות על ידי מריחת משחה עינית.
6. לשמור על הרדמה על ידי מתן איזופלוראן ב-2.0–2.5% דרך קונוס אף שמחובר למערכת הסטריאוטקטיבית.

3. הכנת הגולגולת

1. תקבע את העכבר בתוך המסגרת הסטריוטקטית באמצעות מוטות אוזניים ספציפיים.
2. גלח את הקרקפת וחטא היטב את אזור הניתוח עם חומר חיטוי מבוסס אלכוהול.
3. יש להניח הרדמה מקומית בהזרקה תת-עורית של בופיבקאין (0.1 מ"ג/ק"ג).
4. הערכו מחדש את רפלקס צביטת האצבעות לפני חתך העור. יש להמשיך רק בהיעדר תגובת גמילה כדי להבטיח עומק עקבי של ההרדמה.
5. בצע חתך קו אמצעי של כ-7 מ"מ כדי לחשוף את הגולגולת.
6. חשפו בזהירות את הגולגולת מעל עצם הפריאטל הימנית בין ברגמה ללמבדה.
7. ודא שהמסגרת הסטריוטקטית ממוקמת בניצב לגולגולת, כאשר הציר האנכי ממוקם בזווית של 90° יחסית לפני הראש.
8. התקן פין סימון במחזיק הסטריוטקטיקה ומרכז אותו ישירות על ברגמה.
9. לאפס את כל הקואורדינטות הסטריוטקטיות ולהעביר את פין הסמן לקואורדינטות האנטרופוסטריור (AP) והמדיאולטרליות (ML) המוגדרות מראש (במודל שלנו, ב-AP 0.5, ML -2.5). סמן את נקודת היעד עם עט לבד עמיד למים.

4. התאמת משככי כאבים

1. שחרר את העכבר מהאוזניים.
2. הזרקו מדטומידין תת-עורית (0.5 מ"ג/ק"ג) והפחיתו בהדרגה את האיזופלוראן ל-<0.5%.
3. לשמור על הרדמה על < 0.5% איזופלוראן תוך ניטור רציף של נשימה וטמפרטורת גוף.
4. אפשר שיווי משקל בתנאים אלו למשך 10 דקות כדי להגיע למצב הרדמה יציב תוך שמירה על פעילות רשת הנוירונים. קצב נשימה, היעדר תגובות רפלקסיות וטמפרטורת גוף יציבה (37 ± 1.0 מעלות צלזיוס) שימשו כמדדים סטנדרטיים להבטחת עומק הרדמה דומה בין בעלי חיים.

5. השראה במכה

הערה: לפני הניסוי, יש לייצר מחזיק ראש לדגם החי מבידוד צינורות פוליאתילן (PE) הזמין מסחרית, קצף פולימרי סגור תא וללא קישור מוצלב, שמגביל תא כלפי מטה ומאפשר תנועה סיבובית. בנוסף, יש לייצר קצה פגיעה כדורי באורך 5 מ"מ בהתאמה אישית, עשוי סילפורן (יחס 1:1; קשיחות 830 קילופסקל).

1. הסר את גלאי הטמפרטורה הרקטלי והפסיקו את מתן האיזופלורן, ואז הנחו את העכבר במצב שכיבה על מחזיק הראש.
2. חבר את מכסה הסיליקון המותאם אישית לקצה הפוגע המסחרי.
3. התקן את הפוגע האלקטרומגנטי במחזיק הסטריוטקטי וודא שהמכשיר ממוקם בזווית של 10° יחסית לפני הגולגולת.
4. יישר את קצה הפוגע מעל האזור המטרה שהוגדר מראש בגולגולת.
5. הורד את קצה הפוגע במצב המתמשך עד שהוא נוגע בעדינות לפני הגולגולת.
6. משך את קצה הפוגע וקדם אותו לעומק השקע הרצוי (כלומר, 3 מ"מ בניסויים אלו) לכיוון פני הגולגולת. לבעלי חיים בשליטה, תוותר על ההורדה ותעלה את הקצה באותה מידה.
7. התחל להקליט וידאו. יש פגיעה סיבובית אחת על ידי הפעלת הבריח האלקטרומגנטי דרך מתג הבקרה במהירות של 5 מ"מ/ש ואורך פולס של 0.1 מילישניות.
8. משוך את הפוגע מיד לאחר סיום הפגיעה.
9. נגד הרדמה מדטומידין באמצעות אנטגוניסט אטיפמזול (0.5 מ"ג/ק"ג, s.c.).

6. הערכה לאחר פגיעה וסגירת פצע

1. הפוך את העכבר למצב שכיבה.
2. הערכו את הרפלקס היישרוני על ידי רישום הזמן הנדרש לחיה לחזור למצב שכיבה.
3. השרה חוזרת של הרדמה עם איזופלורן בתערובת חנקן חמצן/חמצן (חמצן₂ 30%, N₂O 70%) ב-4% איזופלוראן.
4. הוציאו את העכבר מתא האינדוקציה והניחו אותו על כרית החימום ליד המסגרת הסטריאוטקטית. שמור על טמפרטורת הליבה ב-37 ± 1.0 מעלות צלזיוס באמצעות גלאי סיבים אופטיים רקטליים.
5. תקבע את העכבר במסגרת הסטריאוטקטית באמצעות מוטות אוזניים.
6. סגור את חתך העור באמצעות תפרים מופרעים עם סיבים סופגים את עצמם (למשל, פוליגלקטין 910, 6-0).
7. העבר את העכבר לתיבת חימום ומנטר עד להחלמה מלאה.
8. החזירו את החיה לכלוב הבית שלה.

7. פרדיגמת השפעה חוזרת

1. הקצה עכברים לקבוצות CBI מזויפות, בודדות או חוזרות לפי עיצוב הניסוי.
2. בקבוצות עם פציעות חזרות, קבעו מפגשי CBI נוספים במרווחים מוגדרים (למשל, כל 48 שעות).
3. לפני כל CBI נוסף, יש לתת הקלה טרום-ניתוחית באמצעות טרמדול במי שתייה כפי שמתואר בסעיף 3.1.
4. הרדמה חוזרת, סימון סטריאוטקטי והשפעה בהתאם לאותו הליך המתואר בסעיפים 3–6, כולל הרדמה מקומית עם בופיבקאין (0.1 מ"ג/ק"ג, s.c.), מתן מדטומידין (0.5 מ"ג/ק"ג, s.c.) עם שמירה על איזופלוראן <-0.5%, מיקוד סטריאוטקטי ב-AP 0.5 ו-ML −2.5 יחסית לברגמה, ומתן פגיעה סיבובית עם פוגע אלקטרומגנטי (עומק השקעה 3 מ"מ), מהירות 5 מ"מ/שנייה, משך פולס 0.1 מילישניות, זווית של 10° ביחס לפני השטח של הגולגולת).
5. יש להבטיח מיקום עקבי (מיקום שכיבה על מחזיק ראש קצף פוליאתילן המאפשר תנועה סיבובית), פרמטרי פגיעה זהים (זווית, עומק, מהירות ומשך), ותנאים סטנדרטיים סביב הפרוצדורל ופוסט-פרוצדורלי, כולל אנטיגוניזציה של מדטומידין עם אטיפמזול (0.5 מ"ג/ק"ג, s.c.), השראה חוזרת של הרדמה (איזופלורן 4% ב-O₂ 30%/N₂O7%), ושליטה בטמפרטורה ב-37 ± 1.0 מעלות צלזיוס, לאורך מפגשים חוזרים לשמירה על שחזוריות בין בעלי חיים ונקודות זמן.
6. להבטיח מיקום עקבי, פרמטרי השפעה ותנאי התאוששות לאורך מפגשים חוזרים כדי לשמור על שחזוריות בין בעלי חיים ונקודות זמן.
7. עוקב באופן רציף אחר בעלי חיים לאיתור ליקויים התנהגותיים מצטברים לאחר פגיעות חזרות.

8. ניתוח קינמטי

1. ייצא את הסרטונים בפורמט סטנדרטי (למשל, MP4) לניתוח וטען אותם לתוכנת Kinovea.
2. נווט לחלון הזמן הרלוונטי המכיל פריימים לפני ואחרי ההתנגשות (למשל, -0.025 עד 0.3 שניות מהפגיעה). ודא שאתה מגדיר קצב פריימים מתאים (למשל, 240 fps) בהגדרות התוכנה. הגדר ייחוס קנה מידה (למשל, מרחק בין עיניים).
3. השתמש בכלי המעקב של Kinovea, כדי להקים מערכת מעקב תלת-נקודתית (למשל, עין ימין, עין שמאל, אף; איור 3א). התחל לעקוב אחרי כל נקודה ותתקן ידנית שגיאות מעקב, במיוחד במהלך תנועה מהירה או הסתרה.
4. ייצוא קואורדינטות שעוקבו כקבצי CSV או אקסל.
   הערה: ניתוח קינמטי נוסף בוצע באמצעות סקריפט MATLAB מותאם אישית. נתוני מעקב לפי פתרון זמן שיוצאו מקינובאה יובאו ועובדו מראש כדי להסיר רשומות לא תקינות ולהבטיח קנה מידה עקבי של הזמן. תרגום הראש הוגדר כמרכז של שלושת נקודות הציון (עין ימין, עין שמאל ואף), שממנו נגזרו העתקה ליניארית, מהירות ותאוצה באמצעות דיפרנציאציה נומרית. סיבוב הראש הוערך מכיוון ציר העין–אף, כאשר ההזזה הזוויתית חושבה ביחס לקו בסיס לפני הפגיעה ומהירות זוויתית שהתקבלה כנגזרת הראשונה. כדי להפחית את הגברת הרעש, כל אותות המיקום והזווית הוחלקו באמצעות מסנן סביצקי–גולאי לפני הדיפרנציאציה. פרמטר התוצאה העיקרי היה ההזזה הזוויתית המקסימלית, בעוד שפרופילי מהירות ותאוצה נותחו כמדדים יחסיים לדינמיקת תנועת הראש בין הניסויים.

תוצאות

שיקולים כלליים:

יישום פרוטוקול זה גורם לפגיעת מוח זעזועית באופן שחזורי, כפי שמודגם על ידי סט מוגדר של קריאות אימות מבניות, התנהגותיות ונוירו-וסקולריות (ראו איור 2). שלמות המבנה נשמרה לאחר הפציעה. לא זוהתה הפרעה או דימום מקרוסקופי גלוי ברקמה, מה שמעיד שהפרוטוקול גורם לפגיעה מוחית זעזועית במקום פגיעה חבלתית. הערכה היסטולוגית אישרה ארכיטקטורה שלמה של רקמות ללא עדות לאובדן תאי גס או לקוויטציה. בנוסף, הדמיה מבנית ונית...

דיון

מודל עכבר חדש של CBI בראש סגור המבוסס על פגיעת האצה-האטה מאופיין, הכולל פגיעה קלה אך נרחבת ב-BBB ופנוטיפ נוירופסיכיאטרי ייחודי המזכיר זעזוע מוח קליני. על ידי שחזור המאפיינים המרכזיים של CBI באופן מבוקר ועקבי תוך שמירה על שלמות מבנית, המודל מספק מסגרת ניסויית שימושית ומאופיינת היטב לחקר המנגנונים שמאחורי CBI וההשלכות הנוירו-פסיכיאטריות והקוגניטיביות שלו.

שלבים קריטיים בפרוטוקול הם אלה שקובעים את העומס המכני האפקטיבי של הראש. במיוחד, נדרשים יישור סטריאוטקטי מדוי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תרופות
אנטיפמזול	Vetoquinol	VM 06043/4004	אנטגוניסט מדטומידין (אנטגוניסט α2-אדרנוקפטור), תת-עורית (0.5 מ"ג/ק"ג)
משחה עיניים בפנטן	Bayer	11809917	הגנה על העיניים במהלך הרדמה, טופיקלית
בופיוואקאין	Sigma-Aldrich	B1160000	הרדמה מקומית, תת-עורית (0.1 מ"ג/ק"ג)
איזופלוראן	CP pharma	1214CN	הרדמה, שאיפה (גירוי ותחזוקה)
מדטומידין	Vetoquinol	VM 06043/4003	סדטיבי/חומר מרדים (אגוניסט α2-אדרנוקפטור), תת-עורית (0.5 מ"ג/ק"ג)
טרמדול הידרוכלוריד (100 מ"ג/מ"ל)	Grünenthal	6867645	משכך כאבים הניתן דרך מי שתייה, ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל לעכברים, מ-2 ימים לפני הניתוח עד 3 ימים לאחר הניתוח
ציוד
כרית צוואר מפוליאתילן	מותאם אישית		תמיכה להצבה על הבטן במהלך הפגיעה
כיסוי סטריאוטקסי לסטריאוטקסי אימפקטור Silupran	מותאם אישית		מפזר עומס מכני, מונע נזק מוקדי בגולגולת, מחובר לקצה האימפקטור, 830 kPa
סטריאוטקסי אימפקטור	Leica Biosystems	39463923/IM10131	מכשיר פגיעה אלקטרומגנטי להעברת פגיעה מבוקרת
כלים
GoPro Hero6	GoPro Inc., San Mateo, CA, USA
Kinovea		(גרסה 2025.2.0)
MATLAB	MathWorks, Natick, MA, USA	לא חל