שיטה משולבת למידול שבץ פוטוטרומבוטי ורישום אופטרודה ב-vivo של פעילות נוירונית ואסטרוציטית בעכברים מתנהגים

סיכום

פרוטוקול זה מספק שיטה משולבת הכוללת העברת ויראלית, השתלת אופטרודה, השראה פוטותרומבוטית, רישום סימולטני של פעילות אסטרוציטים ונוירונים, וגירוי אופטוגנטי של אסטרוציטים. שיטה משולבת זו שואפת לספק חקירה מקבילה של מערכת היחסים בין האסטרוציטים לנוירון בשלבים החריפים ועד הכרוניים של שבץ איסכמי.

תקציר

חקירת הדינמיקה בין אסטרוציטים לנוירון לאחר שבץ איסכמי היא חיונית להבנת מנגנוני ההתאוששות לאחר שבץ. עם זאת, המתודולוגיות הנוכחיות לעיתים קרובות אינן מצליחות ללכוד אינטראקציות בזמן אמת בין נוירונים לאסטרוציטים בבעלי חיים המבצעים משימות התנהגותיות מסוימות, מה שמגביל את יכולתנו לחקור את השלב החריף של פתולוגיית השבץ. פרוטוקול זה מציג שיטה משולבת המשלבת מודל שבץ פוטותרומבוטי עם הקלטת אלקטרופיזיולוגיה רב-ערוצית סימולטנית ופוטומטריית סיבים בעכברים ערים ומתנהגים באמצעות אופטרוד מותאם אישית. הפרוטוקול כולל השראת איסכמיה מוקדית באמצעות פוטותרומבוזיס, ואחריה הקלטה סימולטנית של קפיצות עצביות וחולפים אסטרוציטיים של סידן. האופטרוד מאפשר אספקה מקבילה של פוטותרומבוזיס, הקלטת אותות סידן ומניפולציה אופטוגנטית ללא צורך בניתוחים נפרדים. תוצאות מייצגות מאשרות את ההצלחה בהקלטה סימולטנית של אות סידן אסטרוציטי וזינוק נוירוני. מניפולציה אופטוגנטית של אסטרוציטים יוצרת שינויים מדידים בדפוסי הירי הנוירונים (הפחתת תדירות הירי של נוירונים פירמידליים ב-1.55 ± 0.45 הרץ ובין נוירונים ב-3.64 ± 1.37 הרץ לעומת גירוי פרה-אופטוגנטי, n = 2), מה שמאשר שהמערכת מסוגלת לחקור אינטראקציות בין אסטרוציטים לנוירונים. גישה משולבת זו מתמודדת עם פערים קריטיים במתודולוגיית מחקר שבץ על ידי מתן הקלטות רב-מודליות בזמן אמת מהשלב החריף ועד הכרוני של שבץ בבעלי חיים מתנהגים.

מבוא

שבץ איסכמי נותר אתגר בריאותי עולמי עיקרי, ומייצג סיבה מובילה הן לתמותה והן לנכות נרכשת לטווח ארוך ברחבי העולם ^1,2,3. שיעור הנכות הגבוה הקשור לשבץ איסכמי קשור למגוון רחב של תסמינים קליניים, החל משיתוק מוטורי ואובדן חושים ועד לפגיעה קוגניטיבית ^4,5,6. יש צורך דחוף להעמיק בהבנה של המנגנונים הפתולוגיים וההחלמה של שבץ איסכמי במהלך שלב התיקון. מעבר לכשל נוירוני, הכשל הקטסטרופלי של האסטרוציטים הודגש לאחרונה ^7,8. האסטרוציטים, התאים הגליאליים השכיחים ביותר, הם מרכיב חיוני במערכת העצבים המרכזית וכן בסינפסה התלת-חלקית. בכל שלב במפל האיסכמי, האסטרוציטים ממלאים תפקיד חיוני ומשפיעים עמוקות על ההתאוששות הנוירונית והתפקודית ^9,10,11. במוח הבריא, האסטרוציטים והנוירונים מחוברים פונקציונלית דרך הסינפסה התלת-חלקית, שבה תהליכים אסטרוציטיים מכסים את הטרמינלים לפני ואחרי הסינפסה ומשתתפים באופן פעיל בהעברה סינפטית ^7,8. האסטרוציטים מווסתים את ריכוזי הגלוטמט החוץ-תאיים באמצעות נשאי חומצות אמינו מעוררים, שומרים על הומאוסטזיס אשלגן דרך תעלות Kir4.1, ומווסתים את חוזק הסינפטי באמצעות שחרור גליוטרנסמיטר באמצעות אקסוציטוזה תלויה בסידן ^7,8. בהקשר זה, טרנזיינטים תוך-תאיים של סידן אסטרוציטי מייצגים פעילות אסטרוציטית וקשורים קשר הדוק לירי נוירונים⁷. במהלך שבץ איסכמי, מערכת היחסים המדויקת הזו מופרעת במהירות. קריסת גרדיאנטים יוניים בעקבות כשל אנרגטי גורמת לשחרור גלוטמט מסיבי ודפולריזציה מתפשטת, מה שמוביל לפגיעה נוירונית אקסיטוטוקסית ולהתרבות אסטרוציטים תגובתיים¹². אסטרוציטים בליבת האוטם וסביבתה עוברים שרשרת של שינויים פתולוגיים, כולל עומס יתר של סידן, פגיעה בספיגה חוזרת של גלוטמט, אובדן קישור הסינפסות וכישלון בשחרור הגליוטרנסמיטר¹³. במקביל, פעילות הקפיצות הנוירונים מדוכאת באופן עמוק כאשר נוירונים מאבדים את החיוניות ואת שלמות פוטנציאל הממברנה^14,15. באזור הפריה-אקוורקט, נוירונים שורדים ואסטרוציטים תגובתיים משתתפים באינטראקציות דינמיות הנחשבות לקריטיות לקביעת תוצאות ההחלמה לאחר שבץ; עם זאת, הקורלציות האלקטרופיזיולוגיות והסידן בזמן אמת של אינטראקציה זו בבעלי חיים ערים ומתנהגים עדיין מאופיינים בצורה לקויה^13,16. כתוצאה מכך, הבנת פעילות אסטרוציטית לצד אותות עצביים נחשבת לאבן יסוד בהתאוששות תפקודית עצבית לאחר פגיעה איסכמית.

פוטותרומבוזיס היא מודל איסכמי נפוץ בשימוש; הוא משתמש בצבע רגיש לאור ואור מקומי כדי לגרום לנגעים איסכמיים באזורים ממוקדים ספציפיים¹⁷. פרוטוקולי המידול וההקלטה הנוכחיים של שבץ מפריעים לחקירת אינטראקציה בין אסטרוציטים לנוירון לאחר שבץ על ידי שלושה צווארי בקבוק טכניים עיקריים 17,18,19. הפרדה בין מידול והקלטה היא חיסרון נפוץ ברוב הפרוטוקולים הנוכחיים, וגורם לפער זמן בין הקמת המודל לבין הקלטת האות בזמן אמת^20,21. עם זאת, דקות עד שעות לאחר שבץ איסכמי הן תקופה חיונית שבה גם נוירונים וגם אסטרוציטים עוברים תנודות דרסטיות^12,22. ללא ניטור מקביל של אינטראקציה בין אסטרוציטים לנוירון מיד לאחר האירוע האיסכמי, חקירת התערבות מוקדמת יעילה בשבץ איסכמי תיפגע עמוקות. מגבלה נוספת של הפרוטוקולים הנוכחיים טמונה בבידוד מודאליות ההקלטה; רוב המתודולוגיות הנוכחיות מותאמות לסוג אחד של אות. לדוגמה, אלקטרופיזיולוגיה רב-ערוצית מציעה זיהוי של ירי נוירונים ופוטנציאלי שדה מקומיים (LFPs) אך עיוורת למצבי איתות של תאי גליה^15,16. לעומת זאת, ניטור דינמיקת האסטרוציטים באמצעות הדמיית סידן ב-in vivo לוכד תנודות אסטרוציטיות אך חסר נתוני ירי נוירונים. צוואר הבקבוק האחרון בפרוטוקולים הנוכחיים נראה כמצב ההקלטה של בעל החיים; ברוב הפרוטוקולים, החיה מורדמת או נע בחופשיות. עם זאת, תפקוד לקוי מוטורי נחשב לאחד התוצרים הבעייתיים ביותר של שבץ; הבנת הקשר בין התנהגויות מסוימות לאירועי האסטרוציטים-נוירון היא חיונית. לכן, יש צורך דחוף בשיטה משולבת המסוגלת לבצע מודל שבץ פוטוטרומבוטי תוך כדי לכידת אותות אסטרוציטים ונוירונים בעכברים ערים המבצעים בדיקות התנהגות מסוימות. המתודולוגיות הקיימות מתייחסות רק לתת-קבוצה של דרישות אלו. הדמיית סידן בשני פוטונים מספקת רזולוציה מרחבית יוצאת דופן של דינמיקת מיקרודומיינים אסטרוציטית במוח השלם, אך דורשת שבעלי החיים יהיו קבועים בראש או מרדמים, מה שמונע הערכה התנהגותית טבעית, ואינה יכולה ללכוד בו-זמנית נתוני קוצים נוירונליים רב-ערוציים¹³. פוטומטריית סיבים עצמאית מאפשרת ניטור סידן אסטרוציטי בבעלי חיים מתנהגים בחופשיות, אך נשארת עיוורת לדפוסי ירי נוירונים, ואינה מספקת קריאה אלקטרופיזיולוגית של פונקציית המעגל¹⁶. אלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאית רב-ערוצית פותרת את פעילות הקפיצה של יחידות נוירונים ופוטנציאלי שדה מקומיים ברזולוציה זמנית גבוהה אך אינה מספקת מידע על מצב האיתות של האסטרוציטים¹⁵. עם זאת, אף אחת מהשיטות הללו אינה יכולה לגרום בו זמנית לשבץ פוטוטרומבוטי מדויק ולבצע הקלטה מולטימודלית מאותו אתר אנטומי ללא הפסקה.

כדי להתמודד עם המגבלות הטכניות הקיימות, אנו מציעים מערכת משולבת זו. מערכת זו מתמודדת עם שלוש המגבלות בתוך מכשיר מושתל כרוני אחד, ומאפשרת השראה מקבילה לפוטותרומבוזיס, רישום סידן אסטרוציטי באמצעות פוטומטריה סיבית, ואלקטרופיזיולוגיה נוירונית רב-ערוצית בעכברים ערים ומתנהגים בחופשיות—מרגע תחילת השבץ ועד לשלבים הכרוניים של השבץ. היתכנות השיטה הזו מאומת באמצעות השתלה כרונית של אופטרוד מותאם אישית למוחות העכברים, המבטא אינדיקטור סידן ספציפי לאסטרוציטים וקטור ויראלי אופטוגנטי. באמצעות השיטה, תנועות סידן אסטרוציטיות ופעילויות ירי נוירונים נרשמות ומנותחות בו-זמנית במהלך משימות התנהגותיות ותחת מודולציות אופטוגנטיות.

פרוטוקול

פרוטוקול זה קיבל אישור מוועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים באוניברסיטת גואנגג'ואו לרפואה סינית (00379474) והתבצע בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי מדריך המכון הלאומי לבריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. יושמו כל האמצעים האפשריים כדי למזער את מספר בעלי החיים במחקר זה.

1. העברת וקטורים ויראליים

הערה: סעיף זה מתאר את ההזרקה הסטריוטקסית של וקטורי AAV ספציפיים לאסטרוציטים לקורטקס המוטורי (M1FL). המטרה היא להשיג ביטוי יציב וספציפי לאסטרוציטים הן של מדד הסידן GCaMP6s והן של מבנה האופטוגנטי opto-vTRAP לפני השתלת אופטרודה. הציוד העיקרי הנדרש: מסגרת סטריאוטקסית, מערכת ורנייה דיגיטלית, מיקרופיפט זכוכית ומשאבת מיקרו-אינפוזיה.

1. הנח את העכבר בתא ההשראה; יש להתחיל בהרדמה עם איזופלוראן של 3%–4% וריכוז האיזופלוראן יכול לעלות למקסימום 5% בדקה הראשונה עד שהעכבר לא מגיב.
   אזהרה: איזופלוראן הוא חומר הרדמה נדיף. בצע את כל ההליכים תחת הנשמה פעילה. הימנע מחשיפה אישית ממושכת.
2. העבר את העכבר למסגרת הסטריאוטקסית המצוידת במסכת הרדמה, והשתמש ב-1–2% איזופלורן לשמירה על מישור הרדמה עמוק.
3. בדוק את עומק ההרדמה כל 10 דקות באמצעות קצב נשימה, רפלקס פלפרלי וצביטת אצבעות. שמור על טמפרטורת גוף העכבר ב-36–37.5 מעלות צלזיוס עם כרית חימום מבוקרת משוב.
4. מרחו משחה עינית על העיניים כדי למנוע נזק לקרנית במהלך ניתוח.
5. אבטח את העכבר למסגרת סטריאוטקסית עם מוטות אוזניים ומוט פה. כוון את מוטות האוזניים כדי לוודא שראש העכבר קבוע בצורה סימטרית. ודא שהראש משותק באמצעות בדיקה עדינה.
6. הסר את השיער היטב עם קרם הסרת שיער ובצע חתך קו אמצע עם מספריים כירורגיים לחשיפת הגולגולת. נקה את הפריאוסטאום בעזרת מלח ומקליות כותנה כדי לחשוף את הברגמה והלמבדה.
7. הנמיך את המיקרופיפטה הזכוכית כדי לגעת בברגמה ולמבדה; שימו לב לקואורדינטת ה-Z על ה-vernier הדיגיטלי. כוון את מוט הפה כדי לוודא שההבדל הוא <0.04 מ"מ.
8. הורידו את המיקרופיפטה הזכוכית כדי לגעת בברגמה ואפסו את הוורנייה הדיגיטלית לאפס. הזיזו את המיקרופיפטה 2.3 מ"מ שמאלה וימינית מברגמה ברצף; שימו לב לקואורדינטת ה-Z על ה-vernier הדיגיטלי. כוון את מוטות האוזניים כדי לוודא שההבדלים הדו-צדדיים הם <0.04 מ"מ.
9. איפס את ה-vernier הדיגיטלי לאפס ב-Bregma וסמן את קליפת המנוע (M1FL; AP: +1.5 מ"מ, ML: +0.74 מ"מ). השתמש במיקרו-קידוח עם מקדחות 0.5 מ"מ (קצה עגול) כדי לקדוח חור קטן בקוטר של כ-0.5 מ"מ במיקום המסומן. קדחו בזהירות כדי למנוע דימום ונזק לרקמת המוח; יש להוריד מלח קר כדי לפצות על החום שנוצר במהלך תהליך הקידוח.
10. הורידו את המיקרופיפטה הזכוכית המחוברת למשאבת מיקרו-אינפוזיה לאתר היעד (DV: -0.94 מ"מ משטח המוח). לפני הטעינה, מערבבים AAV9-GfaABC1D-GCaMP6s ו-AAV9-GfaABC1D-opto-vTRAP בנפחים שווים להכנת תערובת ויראלית. הזרקו 400 ננוליטר מהתערובת (200 ננוליטר מכל וקטור) בקצב של 50 ננוליטר לדקה.
    הערה: הקוקטייל הוויראלי מכיל: 200 ננוליטר של אינדיקטור סידן ייחודי לאסטרוציטים (AAV-GfaABC1D-GCaMP6s, 1.0 ×^{10 13} vg/mL) ו-200 ננוליטר של וקטור ויראלי אופטוגנטי ייחודי לאסטרוציטים (AAV-GfaABC1D-opto-vTrap, 1 ×^{10 13}vg/mL). העברה ספציפית לאסטרוציטים אושרה בתת-קבוצה של בעלי חיים על ידי צביעת אימונופלואורסצנציה ל-GFAP, מה שאישר את המיקום המשותף של המדווח הפלואורסצנטי עם תאים חיוביים ל-GFAP והיעדר ביטוי בתאים שליליים ל-GFAP.
    אזהרה: וקטורי AAV הם סוכנים ביולוגיים רקומביננטיים; לטפל בכל הוקטורים הוויראליים והפסולת בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית של המוסד.
11. השאירו את הפיפטה במקום 10 דקות לאחר סיום ההזלפה כדי לאפשר דיפוזיה ויראלית טובה יותר ולמנוע זרימה חוזרת. למשוך את הפיפטה באיטיות, לתפור את הקרקפת (4-0, 20 מ"מ, 3/8 עיגול), ומניח את העכבר על כרית חימום עד שיתאושש לחלוטין.
    הערה: נדרשת תקופה של 3–4 שבועות לביטוי ויראלי מיטבי. ציר הזמן המפורט של הפרוטוקול מוצג באיור 1A.

2. בדיקת Optrode ואימות תפקודי

הערה: לפני ההשתלה, יש לבדוק פיזית את האופטרודה המיוצרת אישית ולעבור בדיקה אופטית כדי לוודא שהיא מסוגלת להעביר אור בכל שלושת המצבים התפקודיים (פוטותרומבוזה, גירוי אופטוגנטי ופוטומטריה סיבית). הציוד העיקרי הנדרש: מיקרוסקופ, מד הספק אופטי ומקורות לייזר בתדרים של 532 ננומטר, 488 ננומטר, 470 ננומטר ו-405 ננומטר.

1. בדיקה פיזית של האופטרוד:
   1. הנח את האופטרוד המיוצר תחת מיקרוסקופ כדי לבדוק את סידור אתרי ההקלטה.
   2. ודא ש-16 חוטי המיקרו-טונגסטן מחוברים באופן אחיד ומקיפים את הסיב האופטי המרכזי. בדוק אם יש חוטים מעוקמים או מצטלבים שיכולים לגרום לקצרים חשמליים.
   3. ודאו שקצה הסיב האופטי קצר יותר מחוטי הטונגסטן (איור 1B).
      הערה: קצה הסיב האופטי צריך להיות שקוע ב-100-200 מיקרון מקצות האלקטרודה²³. הזזה זו, שאומצה מ-Lee ואחרים^, מבטיחה שחרוט האור מכסה מספיק את אזור ההקלטה תוך מניעת רעש פוטואלקטרי מופרז. מומלץ לחוקרים לאמת אמפירית את ההזזה המתאימה תחת האופטרוד שלהם.
2. חבר את הסיב האופטי למקור המידול בלייזר ובמקור ההקלטה. השתמש במד הספק אופטי למדידת הפלט בקצה הסיב עבור שלושת המצבים הפונקציונליים הבאים (איור 1B):
   1. מצב מידול פוטוטרומבוטי: לוודא שהמערכת יכולה לספק אור גל רציף (CW) בעוצמה גבוהה (532 ננומטר).
      הערה: משתמשים בסיבים עם NA 0.22 בניסוי זה. קוטר הנקודות המוארות המשוער ב-100–200 מיקרון מתחת לקצה הסיב הוא כ-200–400 מיקרון. ודא שההספק בקצה מגיע ל->20 מ"וואט כדי להבטיח הפעלה מוצלחת של רוז בנגל והיווצרות טרומבוס.
   2. מצב מניפולציה אופטוגנטית: בדוק את פלט הלייזר הפולסי (למשל, 488 ננומטר ל-opto-vTrap).
      הערה: כיול ההספק ל-10 mW בקצה; זה מותאם להפעלה של opto-vTRAP בעומק הקלטה של 0.94 מ"מ בקורטקס המנוע. באזורים אחרים במוח, מומלץ לבצע אימות התנהגותי או אלקטרופיזיולוגי.
   3. מצב פוטומטריה סיבית (הקלטת סידן): בדקו את אור העירור בעוצמה נמוכה (למשל, 470 ננומטר ו-405 ננומטר).
      הערה: ודאו שהפלט יציב ומתחזק ברמה נמוכה מאוד (<50 מיקרוואט) כדי למזער את הפוטוטוקסיות וההלבנה של מדד הסידן (למשל, GCaMP6s) במהלך ההקלטה לטווח ארוך.

3. השתלת אופטרודה כרונית

הערה: סעיף זה עוסק בהליך הניתוחי להשתלת הפוטרוד כרונית באתר ההזרקה הוויראלית. המיקום המדויק של קואורדינטות ההזרקה הוא קריטי כדי להבטיח שהאלקטרודות והסיבים האופטיים ידגמו את אזור ה-GCaMP6s והביטוי של opto-vTRAP. הציוד העיקרי הנדרש: שלדת סטריאוטקסית, מקדח מיקרו, מלקחיים, ברגי קרניופלסטיה, ג'ל אגרוז ומלט דנטלי.

1. להרדמה, קיבוע סטריאוטקסי, הכנת הגולגולת ואיזון, יש לבצע את אותו הליך כפי שמתואר בסעיף 1, למעט שבמהלך החתך בקרקפת, יש להסיר 1.5 ס"מ ×-1.5 ס"מ מהקרקפת תוך שמירה על מספיק עור סביב העיניים.
2. נקה את הגולגולת עם מי חמצן ו-0.9% מלח. זהה את הברגמה ואפס את הוורנייה הדיגיטלית לאפס.
3. השתמש במקדחה (0.8 מ"מ, קצה עגול) כדי לגסות בעדינות את פני השטח של הגולגולת ולאפשר הידבקות טובה יותר של מלט דנטלי.
4. סמן את הקורטקס המוטורי עם סמן (M1FL; AP: 1.5 מ"מ, ML: 0.74 מ"מ), ואז משתמשים בו כנקודת מרכז כדי לצייר ריבוע בגודל 5 מ"מ × 5 מ"מ (איור 1C).
   1. השתמש במקדחה במהירות מתאימה (כ-10000 סל"ד) ועקב אחרי הריבוע. הורד מלח קר כל הזמן על מסלול הקידוח במהלך הקידוח כדי לפצות על החום שנוצר מקידוח במהירות גבוהה ולמנוע נזק לרקמת המוח. עצור מיד אם פתח העצם משתחרר (איור 1C).
5. קדחו שלושה חורים קטנים (בקוטר 0.5 מ"מ) מעל ההמיספרה והמוחון הנגדיים, והשתלו ברגי קרניאופלסטיה בחורים. ודאו שכל בורג מגיע לדורה מאטר, אך הימנעו מחדירה נוספת ונזק נוסף לרקמת המוח (איור 1C).
6. השתמשו במלקחיים כדי להסיר את פלפל העצם שהשתחרר קודם. הימנעו מכוח נוסף כלפי מטה במהלך ההסרה כדי למנוע נזק לרקמת המוח ולשמור על הדורה מאטר שלם.
   הערה: אם מתרחש דימום, ניתן להשתמש בספוג המוסטטי כדי לעצור את הדימום במהירות.
7. השתמשו במלקחיים עם קצה דק במיוחד (<0.03 מ"מ × 0.01 מ"מ) כדי להסיר את הדורה מטר בחלון הגולגולת. מנעו מקצה המלקחיים להילחץ ישירות לרקמת המוח במהלך תהליך זה.
   הערה: לאחר הסרת העצם, חשוב מאוד לשמור על לחות רקמת המוח. מומלץ להשתמש בכדורי כותנה סטריליים מושרים במלח כדי לכסות את החלון כאשר לא מתבצעת הליך, כדי למנוע נפיחות ונזק נוירוני כתוצאה מיובש.
8. מקבע את האופטרודה לזרוע המיקרומניפולטור של המסגרת הסטריאוטאקסית והעבר אותה מעל חלון הגולגולת. שזור היטב את הארקה הכסופה ואת חוטי ההתייחסות של האופטרוד לשלושת ברגי הקרניאופלסטיה (איור 1C).
9. נקה את משטח החלון הגולגולתי עם מי מלח סטריליים כדי לוודא שאין דימום או קרישי דם שיפגעו בהכנסת האלקטרודות. הורידו לאט את האופטרודה לעומק הרצוי (DV: -0.94 מ"מ) בקצב של 1 מיקרומטר לשנייה.
   הערה: יש להרטיב את רקמת הקורטקס החשופה במי מלח סטריליים במהלך ההשתלה.
10. מרחו שכבת אגרוז מעל חלון הגולגולת לאחר ההשתלה כדי להגן על רקמת הקורטקס מפני מלט דנטלי.
11. מרחו 3–4 שכבות של מלט דנטלי כדי לכסות את הגולגולת החשופה, כדי להבטיח שכל האופטרודה מעוגנת. הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית לאחר שהמלט הדנטלי מתקשה (איור 1C).
12. לספק הקלה לכאבים למשך 3–5 ימים ולתת לעכבר להתאושש במשך שבוע עד שבועיים לפני ההקלטה והמודל.

4. מידול פוטותרומבוטי והקלטה מקבילה

הערה: סעיף זה מתאר הרגלים התנהגותיים, תיעוד בסיסי, השראה לשבץ באמצעות פוטותרומבוזיס, והליכי רישום לאורך זמן לאחר שבץ. הפוטתרומבוזיס מועבר דרך האופטרוד המושתל בעוד שמתבצעות אלקטרופיזיולוגיה ופוטומטריה סיבית בו-זמנית. הציוד העיקרי הנדרש: מכשיר רוטרוד, מד חוזק אחיזה, מערכת פוטומטריית סיבים, מערכת רישום עצבית רב-ערוצי, צבע רוז בנגל ומקור לייזר ב-530 ננומטר.

1. תן לעכבר לעבור הכשרה התנהגותית לפני המודל.
   הערה: כל בעלי החיים אוחסנו ונבדקו בתנאי מעבדה סטנדרטיים. תנאי מגורים: טמפרטורת החדר 20–25 מעלות צלזיוס, לחות יחסית 50%–60%, במחזור אור/חושך של 12 שעות (אורות דלוקים ב-07:00). לבעלי החיים הייתה גישה חופשית למזון ומים לאורך כל המחקר. כל הבדיקות וההליכים הכירורגיים בוצעו במהלך שלב האור. סשנים של רישום התנהגות נערכו במהלך שלב האור בזמן קבוע מדי יום כדי למזער שונות צירקדית בפעילות הנוירונים ודינמיקת הסידן האסטרוציטית. תא ההקלטה נשמר גם הוא בטמפרטורת סביבה של 20–25 מעלות צלזיוס.
   1. למבחן הרוטרוד, תנו לעכבר לרוץ ברציפות על המוט המסתובב במשך 5 דקות במשך 3 ניסויים רצופים, כאשר הרוטארוד מאיץ מ-4 ל-40 סל"ד במשך 5 דקות.
   2. למבחן חוזק האחיזה, תן לעכבר ללמוד למשוך את מוט הבדיקה עם כפות הקדמיות שלו, ולהשלים שלושה ניסויים רצופים עם תוצאות משתנות בפחות מ-10%.
2. הגדר את פרמטרי רכישת הנתונים עבור פוטומטריית סיבים.
   1. השתמש במערכת פוטומטריה סיבית דו-גל או משולשת כדי לעורר את מדד הסידן (למשל, GCaMP6s). עבור GCaMP6, הגדר את ערוץ האות ל-470 ננומטר ואת ערוץ הבקרה ל-405 ננומטר כדי לתקן ארטיפקטים בתנועה ואוטופלואורסצנציה.
      הערה: חשוב מאוד לבדוק שוב את עוצמת הלייזר כדי לוודא שהפלט בקצה הסיב הוא בין 20–40 מיקרווואט ולמנוע פוטו-טוקסיות.
   2. קבע את קצב דגימת איסוף הנתונים ל-60–100 הרץ, מה שיהיה מספיק ללכוד חולפי סידן אסטרוציטיים.
3. הגדר את פרמטרי רכישת הנתונים לאלקטרופיזיולוגיה רב-ערוצית.
   1. ודא שכל הרכיבים במערכת ההקלטה (כולל המכשיר לבדיקת חוזק האחיזה והכלוב) מחוברים לאדמה כראוי כדי להפחית רעש. השתמש בהפניה חציונית משותפת (CMR) במהלך ההקלטה כדי להסיר ארטיפקטים גלובליים.
      הערה: חשוב מאוד לבדוק את תצוגת ספקטרוגרמת האות במערכת ההקלטה כדי לוודא שאין הפרעות בקו חשמל ושהרעש הנגרם מארכיפקטים בתנועה מצטמצם. ארטיפקטים גדולים בתנועה עשויים להעיד על כשל של הברגים וקיבוע חוטי הארקה במהלך ניתוח ההשרשה.
   2. ודאו שאותות רחב-פס ו-LFP נבחרים בתוכנת ההקלטה, ועקוב אחרי כל רעש שמתרחש במהלך ההקלטה.
4. בצע הקלטה בסיסית.
   1. הרדמה קצרה עם איזופלוראן (בתוך 60 שניות); חבר את ה-optrode לקו ההקלטה דרך מתאם.
   2. הנח את העכבר בסביבה דמוית כלוב ביתי להקלטה, ואפשר 10 דקות להתרגל לאחר ההתעוררות.
   3. בצע הקלטה במקביל למבחן חוזק האחיזה, והעכבר נדרש למשוך את מוט הבדיקה פעם בדקה למשך 5 דקות.
   4. ודא שבדיקות התנהגות מסומנות בדיוק במערכות פוטומטריה מרובות ערוצים וסיבים כדי לאפשר יישור נתונים (איור 1D).
5. הקם מודל פוטותרומבוטית.
   1. יש להזריק תמיסת צבע רוז בנגל 1.5% תוך-פריטונית (i.p.) במינון של 10–20 מ"ג/ק"ג, והמתן 5 דקות עד שהצבע יתפשט דרך כלי הדם הקורטיקליים.
      אזהרה: רוז בנגל הוא צבע לאור. להגן על המגיב מאור סביבתי חזק. לבש כפפות והגנה על העיניים בעת הטיפול.
   2. הרדימו את העכבר באיזופלוראן לפי אותם פרמטרים של השראה ותחזוקה שתוארו קודם.
   3. כאשר העכבר נמצא במישור הרדמה עמוק ומתוחזק באמצעות מסכת הרדמה, יש לחבר את הגשוש האופטי של האופטרוד למקור הלייזר.
   4. השרה איסכמיה מוקדית על ידי העברת קרן לייזר של 530 ננומטר בעוצמה של 15 מיליוואט דרך האופטרוד המושתל למשך 5–8 דקות.
      אזהרה: לייזר 530 ננומטר בהספק של 15 מיליוואט הוא מסוכן. כל החוקרים חייבים להרכיב מגן עיניים בטיחותי בלייזר. לעולם אל תסתכל ישירות לקצה הסיבים בזמן פוטותרומבוזיס.
6. בצע הקלטות לאחר שבץ.
   1. הנח את העכבר על משטח מחומם לשחזור. כאשר העכבר ער לחלוטין (בדרך כלל בתוך 10 דקות), התחילו את ההקלטה החריפה הראשונה לאחר השבץ.
   2. יש לחזור על הקלטה יומית למעקב צמוד אחר התקדמות המחלה.
7. לבצע מניפולציה אופטוגנטית.
   1. בנוסף להקלטת אותות סידן ופליטת קרן הלייזר לצורך השראה איסכמית, האופטרוד מסוגל גם לספק גירוי אופטוגנטי, כפי שמוצג בתוצאות מייצגות (איור 4).
   2. חבר את האופטרוד למגרה לייזר אופטוגנטי עם אורך גל ועוצמה מתאימים (במקרה זה, הוא 488 ננומטר, 10 מיליוואט, 5 דקות ל-opto-vTrap), והפעל את המגרה לביצוע מניפולציה אופטוגנטית.

5. צינור ניתוח נתונים מולטימודלי

הערה: סעיף זה מפרט את תהליך הניתוח לעיבוד נתוני האלקטרופיזיולוגיה הרב-ערוצית (מיון קוצים), אותות סידן אסטרוציטיים (חישוב ΔF/F), והיישור החוצה-מודאלי של שני זרמי הנתונים. תוכנות נדרשות: Plexon Offline Sorter (תוכנת מיון קוצים לא מקוונת), NeuroExplorer (תוכנת ניתוח נתונים עצביים), ותוכנת ניתוח RWD OFR (פוטומטריה סיבית).

1. מיון קוצים נוירונליים (מערכת פלקסון):
   1. ייבא את קבצי ה-.pl2 הגולמיים לתוכנת מיון הקוצים הלא מקוונת. החלו מסנן פס דיגיטלי גבוה (<300 הרץ) כדי לבודד פעילות קפיצות בתדר גבוה.
   2. קבע סף מתח (בדרך כלל -5 סטיות תקן של הרעש) כדי לזהות קפיצות פוטנציאליות.
   3. לאחר סינון ידני וביטול גלי רעש, השתמשו בפונקציית הסריקה בתוכנת מיון הקוצים הלא מקוונת כדי לבצע ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) לקבץ גלי גל ולסרוק אשכולות נוירונים שונים²⁴.
   4. בדוק את ההיסטוגרמות של מרווח בין-קוצים (ISI). ודא שלכל "יחידה בודדת" יש שיעור הפרת ISI של <1% (המשקף את תקופת העמידות). שיעור הפרת ה-ISI מוצג בפינה השמאלית העליונה של כל יחידה בתוכנת מיון הקוצים הלא מקוונת.
   5. ייצא את חותמות הזמן הממוינות לתוכנת ניתוח הנתונים העצביים. השתמשו בהיסטוגרמות קצב ובפונקציית היסטוגרמות פרי-אירועים לעומת זמן בתוכנת ניתוח הנתונים העצביים ליצירת היסטוגרמות קצב והיסטוגרמות זמן פרי-גירוי (PSTH).
   6. הוציא את אורך הגל הממוצע וקצב הירי הממוצע של כל יחידה מחלק הסטטיסטיקה בתוכנת ניתוח נתונים עצביים לניתוח נוסף.
2. עיבוד אותות סידן אסטרוציטי (תוכנת ניתוח פוטומטריה סיבית)
   1. פתח את נתוני הפלואורסצנציה הגולמיים (ערוץ 470 ננומטר לאות וערוץ 410 ננומטר לבקרת תנועה) בתוכנת הניתוח.
   2. בחלק הקדם-עיבוד של מערכת פוטומטריית הסיבים, יש לבצע 410 ננומטר כבקרה לתיקון תנועה, להגדיר את מקדם ההחלקה ל-8, ולבחור ב-PLS Fit כתיקון בסיס.
   3. חשב את השינוי בפלואורסצנציה (ΔF/F) באמצעות הנוסחה²⁵:
      
   4. לבצע ניתוח אותות סידן של אסטרוציטים בהתבסס על חותמות זמן של אירועים, חילוץ נתוני סביב האירוע לצורך המחשה (למשל, מפות חום ועקבות ממוצעים), וחישוב השטח מתחת לעקומה (AUC).
3. קורלציה מסונכרנת בין אסטרוציטים לנוירון
   1. יישר קפיצות נוירונליות ואותות סידן באסטרוציטים באמצעות חותמת הזמן של אירוע התנהגותי משותף כזמן אפס.
   2. לאחר חילוץ נתוני סביב האירועים, יישר את שני זרמי הנתונים לאפס הזמן המשותף הזה והצג את הקורלציה בין אסטרוציטים לנוירון (איור 3).

תוצאות

ציר זמן ניסיוני

איור 1 מסכם את ציר הזמן הניסיוני ואת נקודות הציון הכירורגיות המרכזיות. מרווח של שלושה שבועות בין הזרקת וירוס להשתלת אופטרודה הוא קריטי להשגת ביטוי תקין של GCaMP6s, ויש לאמת אותות סידן אסטרוציטי חזקים על ידי בדיקת עקבות פוטומטריית סיבים במהלך תקופת התיעוד הבסיסית לפני השראה לשבץ.

אימות רב-ממדי של מידול פוטוטרומבוטי

ההשראה של אי...

דיון

הפרוטוקול המשולב המתואר כאן מציג התקדמות משמעותית בחקר האינטראקציות בין אסטרוציטים לנוירון במהלך התקדמות שבץ איסכמי. על ידי שילוב אינדוקציה פוטותרומבוטית עם ניטור אופטו-אלקטרופיזיולוגי בזמן אמת ומניפולציה אופטוגנטית, שיטה זו מגשרת ביעילות על הפער בין תחילת שבץ לבין תצפית על ארגון מחדש ברמת המעגל של נוירונים ואסטרוציטים. עבודות עדכניות של בויס ואחרים הדגימו את היתכנות שילוב של פוטומטריה סיבית ואלקטרופיזיולוגיה במהלך שבץ בעכברים המתנהגים בחופשיות, מה שמאשר את ערך הגישות הרב-מודליות בהקשר ז...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2% TTC Staining Solution	Solarbio	G3005
Agorose	Biosharp	BS081
Body Temperature Maintenance System / Homeothermic Monitor	RWD life Science	69002
Cranial Screws	Zhongke Huida	23092007
Data Acquisition and Analysis Software(Fiber photometry)	RWD life Science	ORFs
Data Acquisition and Analysis Software(Multi-channel electrophysiology)	Plexon	PlexControl, Offline Sorter, Neuroexplorer
Digital laboratory stereotactic frame	RWD life Science	68804
Forcep	FST	11252-00	Forcep diameter 0.005 mm ´ 0.025 mm
Laser power meter	Sanwa	LP10
Laser Speckle Blood Flow Imaging System	Pericam AB	Pericam PSI NR
Mice	Risemice	C57BL/6J
Miniature handheld cranial drill	RWD life Science	78001
Mouse Viral Micro-injector	RWD life Science	68025
Optrode	Customized	Kedou	Customized with 16 tungsten electrode surrounding 1 optical fiber
Prism	GraphPad	5.01 version
R studio	Posit	version 4.4.1
rAAV-GfaABC1D-GCaMP6s	BrainVTA	PT-2560	Astrocyte-specific calcium indicator
rAAV-GfaABC1D-opto-vTrap	BrainCase	BC-2446	Astrocyte-specific optogenetic viral vector
Rose Bengal Dye	Sigma-Aldrich	198250	Photosensitive dye for thrombus induction/Sigma-Aldrich
Trolley-mounted anesthesia workstation	RWD life Science	R520	Anesthesia machine for controllable inhalation anesthesia for mice