שיבוש במחסום המעי המתווך על ידי NEAT1 באמצעות קישור ל-miR-29b-3p בתאי Caco-2 שנפגעו מליפופוליסכריד

ShuMin Jiang; Chunrong Ping; Xiaotong He; Guoyu Chen; Lingmei Feng; Jieru Ji; Yaya Gao

doi:10.3791/71021

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

שיבוש במחסום המעי המתווך על ידי NEAT1 באמצעות קישור ל-miR-29b-3p בתאי Caco-2 שנפגעו מליפופוליסכריד

105 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71021

⸱

14 באוגוסט 2026

ShuMin Jiang^*¹ , Chunrong Ping^*² , Xiaotong He³ , Guoyu Chen³ , Lingmei Feng³ , Jieru Ji³ , Yaya Gao⁴

¹Department of Internal Medicine, Heyuan Street Community Healthcare Center of Heilongjiang Province Daqing City Datong District, ²Department of Gastroenterology, The Second Hospital of Hebei Medical University, ³Department of Gastroenterology, Shanghai Pudong New Area People's Hospital, ⁴Department of organ Transplantation, Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Third Hospital of Shanxi Medical University, Tongji Shanxi Hospital

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה העריך את NEAT1 כסמן אבחנתי וכווסת של תפקוד לקוי של מחסום המעי בתסמונת המעי הרגיז עם דומיננטיות של שלשולים. NEAT1 היה מוגבר בסרום של חולים, נקשר ל-miR-29b-3p, והשבת ביטויו (knockdown) שיפרה את מדדי המחסום, האפופטוזיס והדלקת בתאי Caco-2 שנפגעו על ידי ליפופוליסכריד.

תקציר

הפתוגנזה של תסמוימת המעי הרגיז עם שלשולים (IBS-D) אינה ברורה, והטיפולים הזמינים נותרו מוגבלים. מחקר זה ประevaluated את הערך האבחנתי של NEAT1 ב-IBS-D ובחן את מנגנון הבקרה הפוטנציאלי שלו. במחקר השתתפו סך הכל 116 חולים עם IBS-D ו-116 ביקורות בריאות. רמות של NEAT1 ו-miR-29b-3p בסרום נמדדו באמצעות RT-qPCR (תסבך שעתוק כמותי בזמן אמת), ועקומות ROC (מאפייני תפעול קולט) שימשו להערכת הערך האבחנתי. לצורך מחקרי המנגנון, הוקם מודל של תאי אפיתל של המעי מסוג Caco-2 שטופלו בליפופוליסכריד (LPS). חיוניות התאים נבחנה באמצעות בדיקת CCK-8 (ערכה לספירת תאים 8), אפופטוזה באמצעות ציטומטריית זרימה, שלמות המחסום באמצעות התנגדות חשמלית טרנס-אפיתלית (TEER), ורמות mRNA של ZO-1, occludin ו-claudin-2 באמצעות RT-qPCR. בדיקות DLR (דיווח דואלי-לוציפראז) ו-RIP (שיקוע אימונולוגי של RNA) שימשו לאימות קשר הקשירה בין NEAT1 ל-miR-29b-3p. NEAT1 הפגין ביטוי גבוה, ו-miR-29b-3p הפגין ביטוי נמוך בחולים עם IBS-D, ורמותיהם הראו מתאם שלילי חזק. השתקת NEAT1 העלתה את רמות miR-29b-3p, שיפרה את חיוניות התאים ואת ה-TEER, הפחיתה אפופטוזה, העלתה את רמות mRNA של ZO-1 ו-occludin, הפחיתה את רמות mRNA של claudin-2, והקלה על מדדים הקשורים לפגיעה במחסום בתאי Caco-2 שטופלו ב-LPS. יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך ש-NEAT1 בסרום הוא סמן ביולוגי מועמד ל-IBS-D וכיכולת ציר ה-NEAT1/miR-29b-3p להיות מעורבת בתפקוד לקוי של מחסום המעי.

מבוא

תסמונת המעי הרגיז עם שלשולים (IBS-D) היא הפרעה תפקודית נפוצה של מערכת העיכול המאופיינת בכאבי בטן, נפיחות בבטן ושינויים בהרגלי היציאות¹. נכון להיום, המכניזם הפתופיזיולוגי של IBS-D לא הובהר במלואו². שיטות הטיפול הן לרוב להקלה סימפטומטית, בעלות יעילות מוגבלת ושיעור הישנות גבוה³. מקובל להניח כי IBS-D כרוכה באינטראקציה של גורמים מרובים, כגון הפרה של ציר המוח-מעי, רגישות יתר ויסצרלית, דלקת מעיים בדרגה נמוכה וליקוי בתפקוד מחסום המעי⁴^,⁵. למרות שקריטריונים אלו הפכו את האבחנה לסטנדרטית במידה מסוימת, הם סובייקטיביים ועשויים להוביל לעיכובים באבחנה או לסיווג שגוי, במיוחד כאשר תסמיני המטופל חופפים לאלה של מחלת מעי דלקתית או מחלות אורגניות אחרות. בפרקטיקה קלינית שגרתית, אין כיום סממנים ביולוגיים אובייקטיביים מתוקפים עבור IBS-D. לפיכך, חקירת מטרה מולקולרית חדשה שתוכל לשמש כאבחנתית ובעלת ערך טיפולי פוטנציאלי הפכה לצורך דחוף בתחום המחקר הנוכחי של IBS-D.

בשנים האחרונות, RNA לא מקודד ארוך (lncRNA), כמולקולה מרכזית בבקרה אפיגנטית, הפגין פוטנציאל רב כסמן אבחנתי וכמטרה טיפולית במגוון מחלות⁶^,⁷. הגורם העיקרי ל-IBS-D הוא פגיעה בתפקוד מחסום המעי⁸. הרס של חלבוני צממתיים (tight junction proteins) מוביל ל"דליפה מעית", אשר בתורה מפעילה את התגובה החיסונית של הרירית⁹^,¹⁰. הפעלת מערכת החיסון משחררת גורמים פרו-דלקתיים רבים העלולים לגרום לתפקוד לקוי של המעי על ידי הפעלת המערכת החיסונית-עצבית של המעי. מחקרים הצביעו על כך שחלק מה-lncRNAs יכולים לווסת את מחסום האפיתל של המעי¹¹^,¹². דווח כי NEAT1 מועלה (upregulated) ברקמת הרירית של המעי הגס בחולים עם קוליטיס¹³. עיכוב של LncRNA NEAT1 יכול להקל על תפקוד לקוי בתאי אפיתל המעי (IECs) בקוליטיס כיבית¹⁴. עם זאת, פרופיל הביטוי של NEAT1 ב-IBS-D וערכו האבחנתי טרם נחקרו. יתרה מכך, ל-NEAT1 עשוי להיות פוטנציאל כסמן ביולוגי אבחנתי¹⁵. אם NEAT1 מבוטא באופן חריג בסרום של חולים עם IBS-D, הדבר עשוי להשלים את קריטריוני Rome IV הנוכחיים על ידי אספקת כלי אבחון מולקולרי. במקביל, פרופיל הביטוי של miRNA השתנה באופן משמעותי בחולים עם IBS. לדוגמה, ביטוי מופחת (downregulation) של miR-29b-3p נקשר לפתוגנזה של IBS¹⁶. עם זאת, מנגנוני הבקרה של השלב המוקדם (upstream) השולטים בביטוי של miR-29b-3p ב-IBS-D נותרו לא לחלוטין לא ממופות. בפרט, תפקידו של NEAT1 כ-RNA אנדוגני תחרותי (ceRNA) עבור miR-29b-3p בהקשר של IBS-D מעולם לא נחקר, למרות שמנגנון זה הוכח היטב במחלות אחרות¹⁷^,¹⁸. יתר על כן, בעוד שמחקרים קודמים התמקדו בעיקר בביטוי ברמת הרקמה, הפוטנציאל של NEAT1 במחזור הדם כסמן סרום לא פולשני לאבחון IBS-D נותר לא ידוע לחלוטין.

אנו משערים כי lncRNA-NEAT1 עשוי להשתתף בויסות תפקוד מחסום המעי ב-IBS-D על ידי תפקוד כ-ceRNA הסופג את miR-29b-3p. בהתבסס על רקע המחקר שלעיל, מחקר זה שואף: (1) להעריך את רמות ה-NEAT1 וה-miR-29b-3p בסרום של חולי IBS-D ואת ערכם האבחנתי; (2) לתקף את אינטראקציית הקישור הישירה בין NEAT1 ל-miR-29b-3p; ו-(3) להבהיר את התפקיד התפקודי של ציר ה-NEAT1/miR-29b-3p בויסות שלם מחסום המעי ודלקת, תוך שימוש במודל תאי Caco-2 שטופלו ב-LPS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

גיוס מטופלים

כל המשתתפים סיפקו הסכמה מדעת בכתב לאחר שהבינו במלואם את תוכן המחקר. ועדת האתיקה של בית החולים Shanghai Pudong New Area People's Hospital בחנה ואישרה פרוטוקול מחקר זה (מס' 2024k007). גודל המדגם חושב באמצעות G*Power: הבדיקה שנבחרה הייתה t-test, והבדיקה הסטטיסטית תוכננה לזיהוי הבדלים בין שני מדגמים בלתי תלויים. עם גודל אפקט של d = 0.5, α = 0.05 ועוצמה של 0.9, חישוב זה הצביע על כך שיש לגייס לפחות 86 נבדקים בכל קבוצה. כדי להביא בחשבון נסיבות בלתי צפויות שעלולות לקרות במהלך הניסוי, גויסו 116 חולים בכל קבוצה. סך של 116 חולים עם IBS-D שביקרו בבית החולים Shanghai Pudong New Area People's Hospital בין יולי 2024 ליולי 2025 נכללו במחקר זה כקבוצת הניסוי. קריטריוני ההכללה היו: (1) IBS-D העונה על קריטריוני האבחנה של Rome IV; (2) קולונוסקופיה המעידה על היעדר נגעים אורגניים ברירית. קריטריוני הש excluded: (1) חולים עם מחלה דלקתית של המעיים (IBD), סרטן המעי הגס והחלחולת וכו'; (2) חולי סוכרת; (3) חולים עם היסטוריה רצנתי של ניתוח בבטן; ו-(4) חולים עם אי-ספיקה חמורה של הלב, הכבד או הכליות. במקביל, 116 מתנדבים בריאים שהתאימו למאפיינים הדמוגרפיים של החולים, כגון גיל ומין, גויסו כקבוצת הביקורת. בקרים בריאים אומתו כבעלי היעדר היסטוריה של מחלות גסטרו-אינטסטינליות כרוניות או תסמינים קליניים תואמים. חמישה מיליליטרים של דם ורידי פריפריאלי נשאבו מכל הנבדקים. לאחר מכן הועבר העל-נוזל למקרר בטמפרטורה נמוכה במיוחד של -80 °C לשימור בהקפאה לפני שלב מיצוי ה-RNA העוקב.

כל משתתף מילא שאלון למשך 10 ימים כדי לתעד את הביטויים הקליניים הבאים: (א) הערכת חומרת הכאב הבטני באמצעות סולם אנלוגי חזותי של 10 נקודות; (ב) תדירות הכאב הבטני במהלך תקופת הסקר (מספר הימים עם כאבים); (ג) תדירות יציאות (המספר המקסימלי של יציאות ליום); (ד) סולם בריסטול (Bristol Faecal Traits Scale) להערכת מאפייני הצואה. מצבם הרגשי של הנבדקים הוערך באמצעות סולם החרדה והדיכאון של בתי חולים (HADS).

תרביות תאים ומידול

תאי Caco-2 גודלו באופן שגרתי במצע Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) המכיל 10% fetal bovine serum (FBS) ו-1% penicillin–streptomycin, בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO₂. שורת התאים Caco-2 מבצעת דיפרנציאציה ספונטנית לשכבה חד-שכבתיות (monolayer) מקוטבת של תאים עם צומתים הדוקים (tight junctions) ומיקרוויליי, המציגה מאפיינים מורפולוגיים ותפקודיים הדומים לאלו של תאי אפיתל של מעי בוגרים. LPS מעורר תגובה דלקתית ומשבש את הצומתים ההדוקים באפיתל המעי, מה שמעלה את חדירות המעי – תהליך הדומה מאוד למאפיינים הפתולוגיים של IBS-D. יתרה מכך, בהתחשב בכך שתאי Caco-2 שעובדו ב-LPS שימשו באופן נרחב במחקרים קודמים¹⁹^,²⁰^,²¹ למידול של דלקת ושיבוש של מחסום המעי הקשור ל-IBS, נבחר במחקר זה טיפול של תאי Caco-2 בליפופוליסכריד (LPS) כדי להקים מודל in vitro של IBS-D. כאשר התאים הגיעו לכ-80% התמסכות (confluence), מצע הגידול הוחלף במצע מלא המכיל 5 µg/ml LPS²², והתאים עברו גרייה למשך 24 h. תאים שגודלו באופן שגרתי ללא LPS שימשו כקבוצת הביקורת.

טרנספקציית תאים

כדי לחקור את תפקידיהם של NEAT1 ו-miR-29b-3p בתאי Caco-2, בוצעה טרנספקציה לתאי Caco-2. התאים חולקו לשש קבוצות באופן הבא: 1. קבוצת ביקורת (ללא טיפול); 2. קבוצת LPS; 3. קבוצת LPS + si-NC; 4. קבוצת LPS + si-NEAT1; 5. קבוצת LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC; ו-6. קבוצת LPS + si-NEAT1 + miR-29b-3p inhibitor. שני RNA קטנים מפריעים (si-NEAT1) המכוונים ל-NEAT1 תוכננו וסונתזו: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) ו-si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). רצף siRNA אקראי שאינו מכוון למטרה (si-NC) שימש כביקורת שלילית. במקביל, סונתזו גם המעכב (inhibitor) של miR-29b-3p והביקורת השלילית שלו. מעכב miR-29b-3p: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. ביקורת שלילית: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

תאי Caco-2 נזרעו בלוחות בעלי 24 בארות ועברו טרנספקציה כאשר התרביות הגיעו ל-60–70% התמזגות (confluence), בהתאם לפרוטוקול היצרן. בקצרה, 1.25 µL של siRNA הודללו ב-25 µL של מצע עם סרום מופחת כדי להגיע לריכוז סופי של 50 nM של siRNA. לצורך עיכוב miRNA, 2 µL של מעכב miR-29b-3p או של הבקרה השלילית שלו הודללו ב-25 µL של מצע עם סרום מופחת לריכוז סופי של 100 nM. בנפרד, 1.5 µL של סוכן הטרנספקציה ערבבו עם 25 µL של מצע עם סרום מופחת. לאחר מכן, ה-siRNA המדולל (או המעכב/הבקרה השלילית) ערבב עם סוכן הטרנספקציה המדולל ליצירת קומפלקס הטרנספקציה, אשר הוסף לטיפות לתאים. שישה שעות לאחר הטרנספקציה, תערובת הטרנספקציה הוחלפה במצע מלא טרי, והתאים תוחזקו למשך 48 h נוספות לפני ביצוע בדיקות תפקודיות. יעילות ה-Knockdown או העיכוב אומתה באמצעות RT-qPCR לפני המשך הניסויים.

PCR כמותי בזמן אמת עם שעתוק הפוך (RT-qPCR)

RNA כולל בודד מדגימות סרום ומתאי Caco-2 שהועברו את הטיפולים המצוינים. בקצרה, כל דגימה עברה ליזיס עם 1 mL של ריאגנט למיצוי RNA ושורשרה עם 200 µL של כלורופורם. לאחר צנטריפוגציה ב-12,000 × g למשך 15 דקות ב-4 °C, הועבר הפאזה המימית העליונה לפ tube חדש, ערבוב עם 500 µL של איזופרופנול, ונשמר ב-−20 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, הדגימות עברו צנטריפוגציה ב-12,000 × g למשך 10 דקות ב-4 °C. משקע ה-RNA שהתקבל נשטף פעמיים עם אתנול 75%, יובש באוויר והושעה מחדש ב-20 µL של מים נקיים מ-RNase. תפוקת ה-RNA ודרגת הניקיון נמדדו באמצעות מיקרו-ספקטרופוטומטר, ורק דגימות עם ערכי A₂₆₀/A₂₈₀ של 1.8–2.0 שימשו להמשך. ה-RNA עבר תעתוק הפוך ל-cDNA לפי פרוטוקול היצרן. לזיהוי של NEAT1, ZO-1, occludin, claudin-2, ו- GAPDH, נעשה שימוש ב-1 µg של RNA כולל עבור כל תגובת תעתוק הפוך בנפח 20 µL הכוללת 1× RT buffer, 0.5 mM dNTPs, 0.5 µM oligo(dT) primer, 200 U reverse transcriptase, ומים נקיים מ-RNase. התגובה בוצעה ב-37 °C למשך 15 דקות, ולאחריה אינאקטיבציה של האנזים ב-85 °C למשך 5 שניות.

ביצוע PCR כמותי בוצע באמצעות cDNA כתבנית, תוך שימוש במערכת real-time PCR מבוססת SYBR Green. רמות הביטוי של NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludin, ו- claudin-2 נמדדו באמצעות פריימרים ספציפיים לגנים. U6 שימש כגן הייחוס עבור miR-29b-3p, בעוד ש-GAPDH שימש לנורמליזציה של NEAT1 ושל גנים הקשורים לצומת מהודק (tight junction). הביטוי היחסי חושב באמצעות שיטת 2−ΔΔCt. רצפי הפריימרים מפורטים ב-טבלה 1.

בדיקת חיוניות תאים

תאי Caco-2 בשלב צמיחה לוגריתמי נזרעו בלוחיות 96-בארים בריכוז של 1 × 10⁴ תאים לבאר. הוקמו קבוצת ביקורת ריקה (המכילה רק את מצע התרבית), קבוצת ביקורת (תאים ללא טיפול) וקבוצה ניסיונית (תאי Caco-2 תחת תנאי טיפול שונים), כאשר בכל קבוצה היו 5–6 בארים ככפילויות. התאים הוקצו לארבע נקודות זמן: 0, 24, 48 ו-72 h. עבור כל נקודת זמן הוכנה לוחית תרבית נפרדת כדי למנוע פתיחה חוזרת של האינקובטור במהלך המדידות. לאחר תקופת התרבית, התווספו 10 µL של תמיסת CCK-8 לכל באר, תוך הקפדה על מניעת היווצרות בועות. לאחר מכן, הוחזרה לוחית התרבית לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO₂ והודגרה בחושך למשך 2 h. הבליעה של כל באר נמדדה מיד ב-450 nm באמצעות קורא מיקרו-לוחיות. לבסוף, חיוניות התאים בוטאה כאחוזים.

בדיקה לאפופטוזיס של תאים

את רמת האפופטוזיס כימתו באמצעות ציטומטריה של זרימה לאחר צביעה ב-Annexin V-FITC/PI. תאי Caco-2 מכל קבוצת טיפול נאספו ונשטפו פעמיים ב-PBS קר מאוד. הסנטריפוגציה בוצעה ב-300 × g למשך 5 min ב-4 °C. משק התאים הושעה מחדש ב-100 µL של 1× binding buffer, ולאחר מכן נוספו באופן רצף 5 µL של Annexin V-FITC ו-5 µL של PI. לאחר ערבוב עדין, הדגימות דגרו למשך 15 min בטמפרטורת החדר בחשיפה מינימלית לאור. לאחר מכן, נוספו 300 µL של 1× binding buffer, והתסמין עורבב בזהירות לפני העברתו למבחנה של 5 mL עבור ציטומטריה של זרימה. הדגימות נותחו בציטומטריה של זרימה בתוך 1 h.

התנגדות חשמלית טרנס-אפיתליאלית (TEER)

החדירות הוערכה על ידי מדידת ערכי ה-TEER של תאי Caco-2²³. תאי Caco-2 הוחדרו לתאי Transwell ותורבדו במשך 21 ימים ליצירת שכבה אחת (monolayer) דחוסה. שישה חזרות ביולוגיות עצמאיות בוצעו תחת כל תנאי ניסויי, וכן בוצעו חמש חזרות טכניות תחת כל תנאי. לפני ואחרי הטיפול הניסויי, נמדדו ערכי ה-TEER של כל קבוצה באמצעות מד התנגדות טרנס-ממברנלית, תוך שימוש באלקטרודות שעורסטרו באתנול וויזן עם PBS. בקצרה, המוט הארוך של האלקטרודה הוטבל במצע התרבית הבזולטרלי, והמוט הקצר במצע התרבית האפיקלי, כדי למנוע מגע עם ממברנת המסנן. לאחר התייצבות, נקרא ערך ההתנגדות (Ω), והמדידות חזרו על עצמן עד לקבלת שלוש קריאות עקביות. התנגדותם של מסנני Transwell ריקים (ללא תאים) נמדדה תחת אותם תנאים, וערך זה הופחת מכל הקריאות הניסוייות. TEER (Ω·cm²) = (התנגדות הדגימה – התנגדות הריק) × שטח הממברנה האפקטיבי. הנתונים מוצגים כ: (קבוצה ניסויית/קבוצת ביקורת) × 100%.

בדיקת ELISA (סבסוב חיסוני קשור לאנזים)

העלים של תאי Caco-2 מקבוצות טיפול שונות נאספו לאחר 24 h של תרבית. רמות של ציטוקינים פרו-דלקתיים, הכוללים tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), ו-interleukin-1β (IL-1β), נמדדו באמצעות ריאגנטים מסחריים ל-ELISA בהתאם להוראות היצרן. הבדיקה בוצעה בקפדנות לפי ההוראות. הדגימות והסטנדרטים הוספו לבארים המצופות מראש בנוגדנים, ולאחר מכן עברו אינקובציה ושטיפה. לאחר מכן, הוסף נוגדן זיהוי ביוטינילי. לאחר אינקובציה ושטיפה נוספות, הוסף streptavidin המסומן ב-horseradish peroxidase. לבסוף, הוסף תסבסב TMB לצורך פיתוח הצבע, והתגובה הופסקה באמצעות תמיסת עצירה. הבליעה של כל באר נמדדה באופן מיידי ב-450 nm באמצעות קורא מיקרופלטה.

וסטרן בלוט (Western blot)

חלבונים בודדו מתאי Caco-2 לאחר הטיפולים המצוינים באמצעות בופר RIPA המכיל מעכבי פרוטאז. רמות החלבון נמדדו באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונינית (BCA). עבור כל דגימה, נטענו 30 µg של חלבון לכל נתיב, הופרדו על ג'לים של 10% SDS-PAGE, והועברו לממברנות PVDF. הממברנות נחסמו ב-5% חלב דל שומן למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ולאחר מכן דגרו למשך לילה ב-4 °C עם נוגדנים נגד ZO-1 (1:1,000), occludin (1:500), claudin-2 (1:1,000) ו-GAPDH (1:5,000). לאחר שטיפה, דגרו את הממברנות עם נוגדנים שניים המשולבים עם HRP למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. פסים זוהו באמצעות כימילומינצנציה מוגברת (ECL), ועוצמת הפסים נותחה באמצעות ImageJ. GAPDH שימש כשליטת טעינה.

בדיקת דואל-לוסיפראז (DLR)

אתרי הקישור הפוטנציאליים של miR-29b-3p לרצף ה-NEAT1 נחזו באמצעות מאגר הנתונים ENCORI (https://rnasysu.com/encori/). לאחר מכן, מקטעי NEAT1 המכילים אתרי קישור מסוג wild-type (WT) או מוטנטים (MUT) שובטו אל תוך וקטור הדגימה pmirGLO. הפלסמיד הרקומיננטי שהוכן הועבר בטרנספקציה משותפת (co-transfected) לתאים יחד עם mimics של miR-29b-3p (Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) או מעכבים (inhibitors) והביקורות השליליות המתאימות להם (mimic NC, Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’). ארבעים ושמונה שעות לאחר הטרנספקציה, התאים נאספו, ופעילות הלוסיפרז של גחליליות (firefly luciferase) ושל רנילה (renilla luciferase) נקבעה באמצעות ריאגנט לגילוי לוסיפרז כפול (dual luciferase detection reagent). פעילות הלוסיפרז של רנילה שימשה כרפרנס פנימי לצורך סטנדרטיזציה.

בדיקת אימונו-שיקוע של RNA (RIP)

עבור בדיקת ה-RIP, תאי Caco-2 נאספו, נשטפו ב-PBS, והודגרו על קרח למשך 15 min ב-200 µL של RIP lysis buffer בתוספת מעכבי פרוטאז ו-RNase. ליזאטים של התאים סובבו בצנטריפוגה ב-16,000 × g למשך 10 min ב-4 °C, ו-10 µL מכל עליון נשמרו כביקורת קלט (input control). עבור אימונופרסיפיטציה, 40 µL של חרוזי Protein A/G מגנטיים סובבו יחד עם 5 µg של נוגדן anti-Ago2 או IgG רגיל ב-200 µL של RIP wash buffer למשך 30 min בטמפרטורת החדר. לאחר שלושה שטיפות עם 500 µL של RIP wash buffer, 100 µL מתליון החרוזים שולבו עם 100 µL של ליזאט, ה Bring לנפח סופי של 1 mL באמצעות RIP wash buffer, והודגרו למשך לילה ב-4 °C תחת סיבוב. לאחר מכן, החרוזים נשטפו חמש פעמים עם 500 µL של RIP wash buffer והושעו מחדש ב-150 µL מאותו באפר. עיכול החלבונים בוצע על ידי הוספת 15 µL של proteinase K (20 mg/mL) ו-15 µL של 10% SDS, ולאחריהם הדגרה ב-55 °C למשך 30 min עם ניעור. העליון נאסף, ו-RNA בודד באמצעות ריאגנט מיצוי והושקע למשך לילה. העשרה של NEAT1 ו-miR-29b-3p נבדקה לאחר מכן באמצעות RT-qPCR.

ניתוח לוקליזציה תת-תאית

תאי Caco-2 הופרדו לפרקציות גרעיניות וציטופלזמיות באמצעות ריאגנט להפרדת גרעין וציטופלזמה זמין מסחרית, בהתאם להוראות היצרן. RNA כולל הופק משני רכיבים אלו, והפצתו של NEAT1 בגרעין ובציטופלזמה נבדקה באמצעות RT-qPCR. כיול בוצע באמצעות U6 (בעיקר גרעיני) ו-mRNA של GAPDH (בעיקר ציטופלזמי) כאינדיקטורים ליעילות ההפרדה.

ניתוח סטטיסטי

עבור דגימות סרום קליניות, ניתוח עוצמה (t-test, d = 0.5, α = 0.05, power = 0.9) הצביע על כך שנדרש מינימום של 86 נבדקים לקבוצה. כדי להביא בחשבון נסיבות בלתי צפויות שעלולות להתרחש במהלך הניסוי, גויסו 116 חולים בכל קבוצה כדי לזהות הבדלים משמעותיים מבחינה קלינית. נורמליות הנתונים עבור משתנים רציפים הוערכה באמצעות מבחן Shapiro-Wilk. מכיוון שכל הנתונים הרציפים היו בעלי התפלגות נורמלית (P > 0.05), הוחלו ניתוחים פרמטריים. משתנים קטגוריאליים נותחו באמצעות מבחן chi-square. ניסויים מבוססי תאים כללו שש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות, עם חמש חזרות טכניות עבור כל חזרה ביולוגית. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. השוואות בין שתי קבוצות של משתנים רציפים בוצעו באמצעות Student’s t-test, בעוד שהשוואות בין קבוצות מרובות נותחו באמצעות one-way ANOVA ולאחריו מבחן Tukey’s post hoc. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ-P < 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ביטוי של NEAT1 וערך אבחנתי

בהשוואה לקבוצת הביקורת הבריאה (HC), רמות הביטוי של NEAT1 בחולי IBS-D היו גבוהות באופן משמעותי (P < 0.0001; איור 1A). השטח תחת העקומה (AUC) של NEAT1, כפי שמוצג בעקומת מאפייני operating characteristic (ROC), היה 0.867 (95% CI: 0.821–0.913). הסגוליות שלו הייתה 75.9%, בעוד הרגישות הייתה 84.5% (איור 1B). נתונים אלו מרמזים כי ביטוי לא תקין של NEAT1 ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

IBS-D היא הפרעה גסטרו-אינטסטנלית תפקודית נפוצה. המנגנון הפתולוגי שלה טרם הובהר במלואו. בשנים האחרונות, lncRNA, כמולקולות מפתח בוויסות אפיגנטי, הראו פוטנציאל רב בתחום האבחון והטיפול במחלות. LncRNA NEAT1 נחקר במגוון מחלות, כגון סרטן המעי הגס²⁴, גליומה²⁵, ואוטם בשריר הלב²⁶. מחקרים מרובים הראו כי NEAT1 מעורב בוויסות תגובות דלקתיות¹³, שגשוג תאים²⁷, ושלמות מחסום המעי²⁸

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פלטות 24 בארות	Corning	CLS3524	לזריעת תאים
פלטות 96 בארות	Corning	CLS3599	לזריעת תאים במבדקי CCK-8
ערכה לאפופטוזיס Annexin V-FITC/PI	Invitrogen	V13242	לגילוי שיעורי אפופטוזיס
נוגדן מונוקלונלי Anti-AGO2	Proteintech	67934-1-Ig	לאימונופרסיפיטציה של קומפלקסי RNA הקשורים ל-Ago2
נוגדן Anti-Claudin-2	Invitrogen	32-5600	נוגדן ראשוני, דילול 1:1000
נוגדן Anti-GAPDH	Cell Signaling Technology	5174	נוגדן ראשוני, דילול 1:5000; בקרת טעינה
נוגדן Anti-Human IgG	Proteintech	10284-1-AP	משמש כביקורת שלילית למבדק RIP
נוגדן Anti-Occludin	Abcam	ab31721	נוגדן ראשוני, דילול 1:500
נוגדן Anti-ZO-1	Proteintech	21773-1-AP	נוגדן ראשוני, דילול 1:1000
תאי Caco-2	SUNNCELL	SNL-068	לבניית מודלים של מחסום אפיתל מעי
ערכת CCK-8	Solarbio	CA1210	ערכה למבדק פרוליפרציה של תאים
כלורופורם	Sigma-Aldrich	C2432	להפרדה פאזית במיצוי RNA
מדיום DMEM	Gibco	11965092	לתרבית תאים
ערכה למבדק דו-לוסיפראז (Dual-Luciferase Reporter Assay Kit)	ThermoFisher	16186	לגילוי פעילות לוסיפראז
ערכת ELISA (עבור IL-1β)	R&D Systems	DY201	לגילוי חלבוני מטרה בתעשיות-על של תרבית תאים
ערכת ELISA (עבור IL-6)	R&D Systems	D6050B	לגילוי חלבוני מטרה בתעשיות-על של תרבית תאים
ערכת ELISA (עבור IL-8)	R&D Systems	NBP3-28022	לגילוי חלבוני מטרה בתעשיות-על של תרבית תאים
ערכת ELISA (עבור TNF-α)	R&D Systems	DTA00D	לגילוי חלבוני מטרה בתעשיות-על של תרבית תאים
מצע כימילומינצנציה משופרת (ECL)	Thermo Fisher	32106	להדמיית פסי חלבון
אתנול (75%)	Sigma-Aldrich	459844	לשטיפת משקע RNA
FBS (סרום עגל עדאי)	Gibco	10099141	לתרבית תאים
ציטומטר זרימה	Beckman Coulter	B53002	לגילוי שיעורי אפופטוזיס
נוגדנים משניים מצומדים ל-HRP	Cell Signaling Technology	7074	מזרזים יצירת אות כימילומינצנטי ממצעי ECL
איזופרופנול	Sigma-Aldrich	1133502500	להשקעת RNA
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	ריאגנט טרנספקציה
ליפופוליסכריד (LPS)	Sigma-Aldrich	L2880	להשראת בניית מודל תאים
קורא מיקרופלטות	BioTek	Epoch 2	לגילוי בליעה של דגימות בפלטות 96 בארות
מיקרו-ספקטרופוטומטר Nanodrop	Thermo Scientific	ND-2000C	לקביעת ריכוז וטוהר של RNA
חלב רזה מיובש	Coolaber	CN7861	לחסימת ממברנות (תמיסה בריכוז 5%)
ערכת PARIS	Thermo Fisher	AM1921	לפרקציונציה גרעין-ציטופלזמה
פניצילין–סטRepartition	Gibco	15140122	להגנה על צמיחת תאים מפני זיהום
ערכת Pierce BCA למדידת חלבון	Thermo Fisher	23225	לקביעת ריכוזי חלבון
וקטור pmirGLO Dual-Luciferase	Promega	E1330	וקטור גן דוחה של לוסיפראז כפול
ערכת PrimeScript RT Reagent	Takara	RR047A	לשעתוק הפוך של RNA ל-cDNA
ממברנת PVDF	Millipore	IPVH00010	להעברת חלבון לאחר SDS-PAGE
מכשיר PCR כמותי פלואורסצנטי בזמן אמת	Applied Biosystems	4365464	לגילוי גנים מטרה
בופר ליזיס RIPA (עם מעכבי פרוטאז)	Thermo Fisher	89901	למיצוי חלבון כולל מתאים
ערכה לאימונופרסיפיטציה של חלבונים קושרי RNA	Sigma-Aldrich	17-701	מבדק אימונופרסיפיטציה של חלבונים קושרי RNA (RIP) באמצעות חרוזי מגנט Protein A/G
ריאגנטים ל-SDS-PAGE (ג'ל 10%)	TargetMol	C0189	להפרדת חלבונים לפי משקל מולקולרי
תערובת SYBR Green master mix	Thermo Fisher	4309155	לשימוש בבדיקות PCR
מד TEER (מד וולט-אוהם)	Millipore	MERS00002	מד התנגדות טרנס-ממברנלית, למדידת שלמות שכבה בודדת
תאי Transwell	Corning Costar	CLS3413	לתרבית מונו-שכבות של תאים ומדידת TEER
ריאגנט TRIzol	Invitrogen	15596026CN	למיצוי RNA כולל

מקורות

Ren M, Ma J, Qu M. Network pharmacology integrated with molecular docking and molecular dynamics simulations to explore the mechanism of Shaoyao Gancao Tang in the treatment of asthma and irritable bowel syndrome. Medicine (Baltimore). 2024;103(50).
Zhao C, Zhou X, Shi X. The influence of Nav1.9 channels on intestinal hyperpathia and dysmotility. Channels (Austin). 2023;17(1):2212350.
Jiang J, et al. Effectiveness of Tong-Xie-Yao-Fang combined with Si-Ni-San for irritable bowel syndrome: a protocol for systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2021;100(11).
Lenoir M, Wienke J, Fardao-Beyler F, Roese N. An 8-week course of Bifidobacterium longum 35624 is associated with a reduction in the symptoms of irritable bowel syndrome. Probiotics Antimicrob Proteins. 2025;17(1):315-27.
Tao E, et al. Early life stress induces irritable bowel syndrome from childhood to adulthood in mice. Front Microbiol. 2023;14:1255525.
Biswas S, et al. Expressions of serum lncRNAs in diabetic retinopathy: a potential diagnostic tool. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:851967.
Li W, et al. Functional roles of non-coding RNAs in panvascular diseases. J Vis Exp. 2025;(226).
Shin SY, et al. The effect of phloroglucinol in patients with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. J Neurogastroenterol Motil. 2020;26(1):117-27.
Yang S, et al. Ginseng-derived nanoparticles alleviate inflammatory bowel disease via the TLR4/MAPK and p62/Nrf2/Keap1 pathways. J Nanobiotechnology. 2024;22(1):48.
Zhang J, et al. Role of the gut microbiota in complications after ischemic stroke. Front Cell Infect Microbiol. 2024;14:1334581.
Chen S, et al. The role of lncRNAs in regulating the intestinal mucosal mechanical barrier. Biomed Res Int. 2021;2021:2294942.
Lu Q, et al. The role of long noncoding RNAs in intestinal health and diseases: a focus on the intestinal barrier. Biomolecules. 2023;13(11):1674.
Li F, et al. Knockdown of long non-coding RNA NEAT1 relieves inflammation of ulcerative colitis by regulating the miR-603/FGF9 pathway. Exp Ther Med. 2022;23(2):131.
Ni S, Liu Y, Zhong J, Shen Y. Inhibition of lncRNA NEAT1 alleviates intestinal epithelial cells dysfunction in ulcerative colitis by maintaining the homeostasis of the glucose metabolism through the miR-410-3p-LDHA axis. Bioengineered. 2022;13(4):8961-71.
Aparicio P, et al. Serum lncRNAs NEAT1, PVT1 and H19 as novel biomarkers for sarcopenia diagnosis and treatment response. Noncoding RNA Res. 2025;14:166-76.
Martínez C, et al. miR-16 and miR-125b are involved in barrier function dysregulation through the modulation of claudin-2 and cingulin expression in the jejunum in IBS with diarrhoea. Gut. 2017;66(9):1537-8.
Che F, et al. Lnc NEAT1/miR-29b-3p/Sp1 form a positive feedback loop and modulate bortezomib resistance in human multiple myeloma cells. Eur J Pharmacol. 2021;891:173752.
Zhang Y, et al. LncRNA NEAT1/miR-29b-3p/BMP1 axis promotes osteogenic differentiation in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Pathol Res Pract. 2019;215(3):525-31.
Ludidi S, et al. The intestinal barrier in irritable bowel syndrome: subtype-specific effects of the systemic compartment in an in vitro model. PLoS One. 2015;10(5).
Fan Z, et al. Investigation of the biomarkers and mechanism based on endoplasmic reticulum stress in irritable bowel syndrome. Arab J Gastroenterol. 2025;26(4):337-46.
Zhang H, Xiong Z, He Y, Su H, Jiao Y. Cimifugin improves intestinal barrier dysfunction by upregulating SIRT1 to regulate the NRF2/HO-1 signaling pathway. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(3):2897-908.
Zhang Y, et al. Decreased expression of microRNA-510 in intestinal tissue contributes to post-infectious irritable bowel syndrome via targeting PRDX1. Am J Transl Res. 2019;11(12):7385-97.
Li BR, et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. J Vis Exp. 2018;(140).
Zhang M, et al. The lncRNA NEAT1 activates Wnt/β-catenin signaling and promotes colorectal cancer progression via interacting with DDX5. J Hematol Oncol. 2018;11(1):113.
Liang J, Liu C, Xu D, Xie K, Li A. LncRNA NEAT1 facilitates glioma progression via stabilizing PGK1. J Transl Med. 2022;20(1):80.
Yu Q, et al. Silencing of lncRNA NEAT1 alleviates acute myocardial infarction by suppressing miR-450-5p/ACSL4-mediated ferroptosis. Exp Cell Res. 2024;442(2):114217.
Gong Z, Zhang Y, Jiang Y, Chen P, Ji J. LncRNA NEAT1 targets miR-342-3p/CUL4B to inhibit the proliferation of cutaneous squamous cell carcinoma cells. J Oncol. 2022;2022:8145129.
Han M, et al. LncRNA NEAT1 protects uremic toxin-induced intestinal epithelial barrier injury by regulating miR-122-5p/Occludin axis. PLoS One. 2025;20(5).
Cui J, Wang J, Lv Y, Xu D. LncRNA NEAT1 regulates infantile pneumonia by sponging miR-146b. Mol Biotechnol. 2021;63(8):694-701.
Xiao P, et al. LncRNA NEAT1 regulates chondrocyte proliferation and apoptosis via targeting miR-543/PLA2G4A axis. Hum Cell. 2021;34(1):60-75.
Wu X, et al. Aberrant expressions of circulating lncRNA NEAT1 and microRNA-125a are linked with Th2 cells and symptom severity in pediatric allergic rhinitis. J Clin Lab Anal. 2022;36(3).
Wang K, Liu Y, Chai Y. NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 axis regulates macrophage polarization and inflammation in sepsis models. J Vis Exp. 2026;(227).
Tojo González R, et al. Síndrome de intestino irritable: papel de la microbiota y probióticos [Irritable bowel syndrome; gut microbiota and probiotic therapy]. Nutr Hosp. 2015;31(Suppl 1):83-8.
Hwang HJ, et al. Ferulic acid as a protective antioxidant of human intestinal epithelial cells. Antioxidants (Basel). 2022;11(8):1448.
Wu Y, et al. Probiotics (Lactobacillus plantarum HNU082) supplementation relieves ulcerative colitis by affecting intestinal barrier functions, immunity-related gene expression, gut microbiota, and metabolic pathways in mice. Microbiol Spectr. 2022;10(6).
Kuo WT, et al. The tight junction protein ZO-1 is dispensable for barrier function but critical for effective mucosal repair. Gastroenterology. 2021;161(6):1924-39.
Furuse M, et al. Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junctions. J Cell Biol. 1993;123(6 Pt 2):1777-88.
Wang Z, et al. Binding of Trichinella spiralis C-type lectin with syndecan-1 on intestinal epithelial cells mediates larval invasion of intestinal epithelium. Vet Res. 2023;54(1):86.
Kaya İslamoğlu ZG, Unal M, Küçük A. Atopic dermatitis in adults and irritable bowel syndrome: a cross-sectional study. Indian J Dermatol. 2019;64(5):355-9.
Ma C, et al. LncRNA PTS-1 protects against osteoarthritis through the miR-8085/E2F2 axis. J Inflamm Res. 2025;18:347-66.
Tong Y, Zhou Z, Tang J, Feng Q. miR-29b-3p inhibits the inflammation injury in human umbilical vein endothelial cells by regulating SEC23A. Biochem Genet. 2022;60(6):2000-14.
Li Z, et al. miR-29b-3p protects cardiomyocytes against endotoxin-induced apoptosis and inflammatory response through targeting FOXO3A. Cell Signal. 2020;74:109716.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

NEAT1 IBS D RT qPCR