מאמר מחקר

שיבוש במחסום המעי המתווך על ידי NEAT1 באמצעות קישור ל-miR-29b-3p בתאי Caco-2 שנפגעו מליפופוליסכריד

DOI:

10.3791/71021

⸱

14 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Heyuan Street Community Healthcare Center of Heilongjiang Province Daqing City Datong District, 2Department of Gastroenterology, The Second Hospital of Hebei Medical University, 3Department of Gastroenterology, Shanghai Pudong New Area People's Hospital, 4Department of organ Transplantation, Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Third Hospital of Shanxi Medical University, Tongji Shanxi Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה העריך את NEAT1 כסמן אבחנתי וכווסת של תפקוד לקוי של מחסום המעי בתסמונת המעי הרגיז עם דומיננטיות של שלשולים. NEAT1 היה מוגבר בסרום של חולים, נקשר ל-miR-29b-3p, והשבת ביטויו (knockdown) שיפרה את מדדי המחסום, האפופטוזיס והדלקת בתאי Caco-2 שנפגעו על ידי ליפופוליסכריד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפתוגנזה של תסמוימת המעי הרגיז עם שלשולים (IBS-D) אינה ברורה, והטיפולים הזמינים נותרו מוגבלים. מחקר זה ประevaluated את הערך האבחנתי של NEAT1 ב-IBS-D ובחן את מנגנון הבקרה הפוטנציאלי שלו. במחקר השתתפו סך הכל 116 חולים עם IBS-D ו-116 ביקורות בריאות. רמות של NEAT1 ו-miR-29b-3p בסרום נמדדו באמצעות RT-qPCR (תסבך שעתוק כמותי בזמן אמת), ועקומות ROC (מאפייני תפעול קולט) שימשו להערכת הערך האבחנתי. לצורך מחקרי המנגנון, הוקם מודל של תאי אפיתל של המעי מסוג Caco-2 שטופלו בליפופוליסכריד (LPS). חיוניות התאים נבחנה באמצעות בדיקת CCK-8 (ערכה לספירת תאים 8), אפופטוזה באמצעות ציטומטריית זרימה, שלמות המחסום באמצעות התנגדות חשמלית טרנס-אפיתלית (TEER), ורמות mRNA של ZO-1, occludin ו-claudin-2 באמצעות RT-qPCR. בדיקות DLR (דיווח דואלי-לוציפראז) ו-RIP (שיקוע אימונולוגי של RNA) שימשו לאימות קשר הקשירה בין NEAT1 ל-miR-29b-3p. NEAT1 הפגין ביטוי גבוה, ו-miR-29b-3p הפגין ביטוי נמוך בחולים עם IBS-D, ורמותיהם הראו מתאם שלילי חזק. השתקת NEAT1 העלתה את רמות miR-29b-3p, שיפרה את חיוניות התאים ואת ה-TEER, הפחיתה אפופטוזה, העלתה את רמות mRNA של ZO-1 ו-occludin, הפחיתה את רמות mRNA של claudin-2, והקלה על מדדים הקשורים לפגיעה במחסום בתאי Caco-2 שטופלו ב-LPS. יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך ש-NEAT1 בסרום הוא סמן ביולוגי מועמד ל-IBS-D וכיכולת ציר ה-NEAT1/miR-29b-3p להיות מעורבת בתפקוד לקוי של מחסום המעי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תסמונת המעי הרגיז עם שלשולים (IBS-D) היא הפרעה תפקודית נפוצה של מערכת העיכול המאופיינת בכאבי בטן, נפיחות בבטן ושינויים בהרגלי היציאות1. נכון להיום, המכניזם הפתופיזיולוגי של IBS-D לא הובהר במלואו2. שיטות הטיפול הן לרוב להקלה סימפטומטית, בעלות יעילות מוגבלת ושיעור הישנות גבוה3. מקובל להניח כי IBS-D כרוכה באינטראקציה של גורמים מרובים, כגון הפרה של ציר המוח-מעי, רגישות יתר ויסצרלית, דלקת מעיים בדרגה נמוכה וליקוי בתפקוד מחסום המעי4,5. למרות שקריטריונים אלו הפכו את האבחנה לסטנדרטית במידה מסוימת, הם סובייקטיביים ועשויים להוביל לעיכובים באבחנה או לסיווג שגוי, במיוחד כאשר תסמיני המטופל חופפים לאלה של מחלת מעי דלקתית או מחלות אורגניות אחרות. בפרקטיקה קלינית שגרתית, אין כיום סממנים ביולוגיים אובייקטיביים מתוקפים עבור IBS-D. לפיכך, חקירת מטרה מולקולרית חדשה שתוכל לשמש כאבחנתית ובעלת ערך טיפולי פוטנציאלי הפכה לצורך דחוף בתחום המחקר הנוכחי של IBS-D.

בשנים האחרונות, RNA לא מקודד ארוך (lncRNA), כמולקולה מרכזית בבקרה אפיגנטית, הפגין פוטנציאל רב כסמן אבחנתי וכמטרה טיפולית במגוון מחלות6,7. הגורם העיקרי ל-IBS-D הוא פגיעה בתפקוד מחסום המעי8. הרס של חלבוני צממתיים (tight junction proteins) מוביל ל"דליפה מעית", אשר בתורה מפעילה את התגובה החיסונית של הרירית9,10. הפעלת מערכת החיסון משחררת גורמים פרו-דלקתיים רבים העלולים לגרום לתפקוד לקוי של המעי על ידי הפעלת המערכת החיסונית-עצבית של המעי. מחקרים הצביעו על כך שחלק מה-lncRNAs יכולים לווסת את מחסום האפיתל של המעי11,12. דווח כי NEAT1 מועלה (upregulated) ברקמת הרירית של המעי הגס בחולים עם קוליטיס13. עיכוב של LncRNA NEAT1 יכול להקל על תפקוד לקוי בתאי אפיתל המעי (IECs) בקוליטיס כיבית14. עם זאת, פרופיל הביטוי של NEAT1 ב-IBS-D וערכו האבחנתי טרם נחקרו. יתרה מכך, ל-NEAT1 עשוי להיות פוטנציאל כסמן ביולוגי אבחנתי15. אם NEAT1 מבוטא באופן חריג בסרום של חולים עם IBS-D, הדבר עשוי להשלים את קריטריוני Rome IV הנוכחיים על ידי אספקת כלי אבחון מולקולרי. במקביל, פרופיל הביטוי של miRNA השתנה באופן משמעותי בחולים עם IBS. לדוגמה, ביטוי מופחת (downregulation) של miR-29b-3p נקשר לפתוגנזה של IBS16. עם זאת, מנגנוני הבקרה של השלב המוקדם (upstream) השולטים בביטוי של miR-29b-3p ב-IBS-D נותרו לא לחלוטין לא ממופות. בפרט, תפקידו של NEAT1 כ-RNA אנדוגני תחרותי (ceRNA) עבור miR-29b-3p בהקשר של IBS-D מעולם לא נחקר, למרות שמנגנון זה הוכח היטב במחלות אחרות17,18. יתר על כן, בעוד שמחקרים קודמים התמקדו בעיקר בביטוי ברמת הרקמה, הפוטנציאל של NEAT1 במחזור הדם כסמן סרום לא פולשני לאבחון IBS-D נותר לא ידוע לחלוטין.

אנו משערים כי lncRNA-NEAT1 עשוי להשתתף בויסות תפקוד מחסום המעי ב-IBS-D על ידי תפקוד כ-ceRNA הסופג את miR-29b-3p. בהתבסס על רקע המחקר שלעיל, מחקר זה שואף: (1) להעריך את רמות ה-NEAT1 וה-miR-29b-3p בסרום של חולי IBS-D ואת ערכם האבחנתי; (2) לתקף את אינטראקציית הקישור הישירה בין NEAT1 ל-miR-29b-3p; ו-(3) להבהיר את התפקיד התפקודי של ציר ה-NEAT1/miR-29b-3p בויסות שלם מחסום המעי ודלקת, תוך שימוש במודל תאי Caco-2 שטופלו ב-LPS.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גיוס מטופלים

כל המשתתפים סיפקו הסכמה מדעת בכתב לאחר שהבינו במלואם את תוכן המחקר. ועדת האתיקה של בית החולים Shanghai Pudong New Area People's Hospital בחנה ואישרה פרוטוקול מחקר זה (מס' 2024k007). גודל המדגם חושב באמצעות G*Power: הבדיקה שנבחרה הייתה t-test, והבדיקה הסטטיסטית תוכננה לזיהוי הבדלים בין שני מדגמים בלתי תלויים. עם גודל אפקט של d = 0.5, α = 0.05 ועוצמה של 0.9, חישוב זה הצביע על כך שיש לגייס לפחות 86 נבדקים בכל קבוצה. כדי להביא בחשבון נסיבות בלתי צפויות שעלולות לקרות במהלך הניסוי, גויסו 116 חולים בכל קבוצה. סך של 116 חולים עם IBS-D שביקרו בבית החולים Shanghai Pudong New Area People's Hospital בין יולי 2024 ליולי 2025 נכללו במחקר זה כקבוצת הניסוי. קריטריוני ההכללה היו: (1) IBS-D העונה על קריטריוני האבחנה של Rome IV; (2) קולונוסקופיה המעידה על היעדר נגעים אורגניים ברירית. קריטריוני הש excluded: (1) חולים עם מחלה דלקתית של המעיים (IBD), סרטן המעי הגס והחלחולת וכו'; (2) חולי סוכרת; (3) חולים עם היסטוריה רצנתי של ניתוח בבטן; ו-(4) חולים עם אי-ספיקה חמורה של הלב, הכבד או הכליות. במקביל, 116 מתנדבים בריאים שהתאימו למאפיינים הדמוגרפיים של החולים, כגון גיל ומין, גויסו כקבוצת הביקורת. בקרים בריאים אומתו כבעלי היעדר היסטוריה של מחלות גסטרו-אינטסטינליות כרוניות או תסמינים קליניים תואמים. חמישה מיליליטרים של דם ורידי פריפריאלי נשאבו מכל הנבדקים. לאחר מכן הועבר העל-נוזל למקרר בטמפרטורה נמוכה במיוחד של -80 °C לשימור בהקפאה לפני שלב מיצוי ה-RNA העוקב.

כל משתתף מילא שאלון למשך 10 ימים כדי לתעד את הביטויים הקליניים הבאים: (א) הערכת חומרת הכאב הבטני באמצעות סולם אנלוגי חזותי של 10 נקודות; (ב) תדירות הכאב הבטני במהלך תקופת הסקר (מספר הימים עם כאבים); (ג) תדירות יציאות (המספר המקסימלי של יציאות ליום); (ד) סולם בריסטול (Bristol Faecal Traits Scale) להערכת מאפייני הצואה. מצבם הרגשי של הנבדקים הוערך באמצעות סולם החרדה והדיכאון של בתי חולים (HADS).

תרביות תאים ומידול

תאי Caco-2 גודלו באופן שגרתי במצע Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) המכיל 10% fetal bovine serum (FBS) ו-1% penicillin–streptomycin, בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO₂. שורת התאים Caco-2 מבצעת דיפרנציאציה ספונטנית לשכבה חד-שכבתיות (monolayer) מקוטבת של תאים עם צומתים הדוקים (tight junctions) ומיקרוויליי, המציגה מאפיינים מורפולוגיים ותפקודיים הדומים לאלו של תאי אפיתל של מעי בוגרים. LPS מעורר תגובה דלקתית ומשבש את הצומתים ההדוקים באפיתל המעי, מה שמעלה את חדירות המעי – תהליך הדומה מאוד למאפיינים הפתולוגיים של IBS-D. יתרה מכך, בהתחשב בכך שתאי Caco-2 שעובדו ב-LPS שימשו באופן נרחב במחקרים קודמים19,20,21 למידול של דלקת ושיבוש של מחסום המעי הקשור ל-IBS, נבחר במחקר זה טיפול של תאי Caco-2 בליפופוליסכריד (LPS) כדי להקים מודל in vitro של IBS-D. כאשר התאים הגיעו לכ-80% התמסכות (confluence), מצע הגידול הוחלף במצע מלא המכיל 5 µg/ml LPS22, והתאים עברו גרייה למשך 24 h. תאים שגודלו באופן שגרתי ללא LPS שימשו כקבוצת הביקורת.

טרנספקציית תאים

כדי לחקור את תפקידיהם של NEAT1 ו-miR-29b-3p בתאי Caco-2, בוצעה טרנספקציה לתאי Caco-2. התאים חולקו לשש קבוצות באופן הבא: 1. קבוצת ביקורת (ללא טיפול); 2. קבוצת LPS; 3. קבוצת LPS + si-NC; 4. קבוצת LPS + si-NEAT1; 5. קבוצת LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC; ו-6. קבוצת LPS + si-NEAT1 + miR-29b-3p inhibitor. שני RNA קטנים מפריעים (si-NEAT1) המכוונים ל-NEAT1 תוכננו וסונתזו: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) ו-si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). רצף siRNA אקראי שאינו מכוון למטרה (si-NC) שימש כביקורת שלילית. במקביל, סונתזו גם המעכב (inhibitor) של miR-29b-3p והביקורת השלילית שלו. מעכב miR-29b-3p: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. ביקורת שלילית: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

תאי Caco-2 נזרעו בלוחות בעלי 24 בארות ועברו טרנספקציה כאשר התרביות הגיעו ל-60–70% התמזגות (confluence), בהתאם לפרוטוקול היצרן. בקצרה, 1.25 µL של siRNA הודללו ב-25 µL של מצע עם סרום מופחת כדי להגיע לריכוז סופי של 50 nM של siRNA. לצורך עיכוב miRNA, 2 µL של מעכב miR-29b-3p או של הבקרה השלילית שלו הודללו ב-25 µL של מצע עם סרום מופחת לריכוז סופי של 100 nM. בנפרד, 1.5 µL של סוכן הטרנספקציה ערבבו עם 25 µL של מצע עם סרום מופחת. לאחר מכן, ה-siRNA המדולל (או המעכב/הבקרה השלילית) ערבב עם סוכן הטרנספקציה המדולל ליצירת קומפלקס הטרנספקציה, אשר הוסף לטיפות לתאים. שישה שעות לאחר הטרנספקציה, תערובת הטרנספקציה הוחלפה במצע מלא טרי, והתאים תוחזקו למשך 48 h נוספות לפני ביצוע בדיקות תפקודיות. יעילות ה-Knockdown או העיכוב אומתה באמצעות RT-qPCR לפני המשך הניסויים.

PCR כמותי בזמן אמת עם שעתוק הפוך (RT-qPCR)

RNA כולל בודד מדגימות סרום ומתאי Caco-2 שהועברו את הטיפולים המצוינים. בקצרה, כל דגימה עברה ליזיס עם 1 mL של ריאגנט למיצוי RNA ושורשרה עם 200 µL של כלורופורם. לאחר צנטריפוגציה ב-12,000 × g למשך 15 דקות ב-4 °C, הועבר הפאזה המימית העליונה לפ tube חדש, ערבוב עם 500 µL של איזופרופנול, ונשמר ב-−20 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, הדגימות עברו צנטריפוגציה ב-12,000 × g למשך 10 דקות ב-4 °C. משקע ה-RNA שהתקבל נשטף פעמיים עם אתנול 75%, יובש באוויר והושעה מחדש ב-20 µL של מים נקיים מ-RNase. תפוקת ה-RNA ודרגת הניקיון נמדדו באמצעות מיקרו-ספקטרופוטומטר, ורק דגימות עם ערכי A260/A280 של 1.8–2.0 שימשו להמשך. ה-RNA עבר תעתוק הפוך ל-cDNA לפי פרוטוקול היצרן. לזיהוי של NEAT1, ZO-1, occludin, claudin-2, ו- GAPDH, נעשה שימוש ב-1 µg של RNA כולל עבור כל תגובת תעתוק הפוך בנפח 20 µL הכוללת 1× RT buffer, 0.5 mM dNTPs, 0.5 µM oligo(dT) primer, 200 U reverse transcriptase, ומים נקיים מ-RNase. התגובה בוצעה ב-37 °C למשך 15 דקות, ולאחריה אינאקטיבציה של האנזים ב-85 °C למשך 5 שניות.

ביצוע PCR כמותי בוצע באמצעות cDNA כתבנית, תוך שימוש במערכת real-time PCR מבוססת SYBR Green. רמות הביטוי של NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludin, ו- claudin-2 נמדדו באמצעות פריימרים ספציפיים לגנים. U6 שימש כגן הייחוס עבור miR-29b-3p, בעוד ש-GAPDH שימש לנורמליזציה של NEAT1 ושל גנים הקשורים לצומת מהודק (tight junction). הביטוי היחסי חושב באמצעות שיטת 2−ΔΔCt. רצפי הפריימרים מפורטים ב-טבלה 1.

בדיקת חיוניות תאים

תאי Caco-2 בשלב צמיחה לוגריתמי נזרעו בלוחיות 96-בארים בריכוז של 1 × 104 תאים לבאר. הוקמו קבוצת ביקורת ריקה (המכילה רק את מצע התרבית), קבוצת ביקורת (תאים ללא טיפול) וקבוצה ניסיונית (תאי Caco-2 תחת תנאי טיפול שונים), כאשר בכל קבוצה היו 5–6 בארים ככפילויות. התאים הוקצו לארבע נקודות זמן: 0, 24, 48 ו-72 h. עבור כל נקודת זמן הוכנה לוחית תרבית נפרדת כדי למנוע פתיחה חוזרת של האינקובטור במהלך המדידות. לאחר תקופת התרבית, התווספו 10 µL של תמיסת CCK-8 לכל באר, תוך הקפדה על מניעת היווצרות בועות. לאחר מכן, הוחזרה לוחית התרבית לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO₂ והודגרה בחושך למשך 2 h. הבליעה של כל באר נמדדה מיד ב-450 nm באמצעות קורא מיקרו-לוחיות. לבסוף, חיוניות התאים בוטאה כאחוזים.

בדיקה לאפופטוזיס של תאים

את רמת האפופטוזיס כימתו באמצעות ציטומטריה של זרימה לאחר צביעה ב-Annexin V-FITC/PI. תאי Caco-2 מכל קבוצת טיפול נאספו ונשטפו פעמיים ב-PBS קר מאוד. הסנטריפוגציה בוצעה ב-300 × g למשך 5 min ב-4 °C. משק התאים הושעה מחדש ב-100 µL של 1× binding buffer, ולאחר מכן נוספו באופן רצף 5 µL של Annexin V-FITC ו-5 µL של PI. לאחר ערבוב עדין, הדגימות דגרו למשך 15 min בטמפרטורת החדר בחשיפה מינימלית לאור. לאחר מכן, נוספו 300 µL של 1× binding buffer, והתסמין עורבב בזהירות לפני העברתו למבחנה של 5 mL עבור ציטומטריה של זרימה. הדגימות נותחו בציטומטריה של זרימה בתוך 1 h.

התנגדות חשמלית טרנס-אפיתליאלית (TEER)

החדירות הוערכה על ידי מדידת ערכי ה-TEER של תאי Caco-223. תאי Caco-2 הוחדרו לתאי Transwell ותורבדו במשך 21 ימים ליצירת שכבה אחת (monolayer) דחוסה. שישה חזרות ביולוגיות עצמאיות בוצעו תחת כל תנאי ניסויי, וכן בוצעו חמש חזרות טכניות תחת כל תנאי. לפני ואחרי הטיפול הניסויי, נמדדו ערכי ה-TEER של כל קבוצה באמצעות מד התנגדות טרנס-ממברנלית, תוך שימוש באלקטרודות שעורסטרו באתנול וויזן עם PBS. בקצרה, המוט הארוך של האלקטרודה הוטבל במצע התרבית הבזולטרלי, והמוט הקצר במצע התרבית האפיקלי, כדי למנוע מגע עם ממברנת המסנן. לאחר התייצבות, נקרא ערך ההתנגדות (Ω), והמדידות חזרו על עצמן עד לקבלת שלוש קריאות עקביות. התנגדותם של מסנני Transwell ריקים (ללא תאים) נמדדה תחת אותם תנאים, וערך זה הופחת מכל הקריאות הניסוייות. TEER (Ω·cm2) = (התנגדות הדגימה – התנגדות הריק) × שטח הממברנה האפקטיבי. הנתונים מוצגים כ: (קבוצה ניסויית/קבוצת ביקורת) × 100%.

בדיקת ELISA (סבסוב חיסוני קשור לאנזים)

העלים של תאי Caco-2 מקבוצות טיפול שונות נאספו לאחר 24 h של תרבית. רמות של ציטוקינים פרו-דלקתיים, הכוללים tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), ו-interleukin-1β (IL-1β), נמדדו באמצעות ריאגנטים מסחריים ל-ELISA בהתאם להוראות היצרן. הבדיקה בוצעה בקפדנות לפי ההוראות. הדגימות והסטנדרטים הוספו לבארים המצופות מראש בנוגדנים, ולאחר מכן עברו אינקובציה ושטיפה. לאחר מכן, הוסף נוגדן זיהוי ביוטינילי. לאחר אינקובציה ושטיפה נוספות, הוסף streptavidin המסומן ב-horseradish peroxidase. לבסוף, הוסף תסבסב TMB לצורך פיתוח הצבע, והתגובה הופסקה באמצעות תמיסת עצירה. הבליעה של כל באר נמדדה באופן מיידי ב-450 nm באמצעות קורא מיקרופלטה.

וסטרן בלוט (Western blot)

חלבונים בודדו מתאי Caco-2 לאחר הטיפולים המצוינים באמצעות בופר RIPA המכיל מעכבי פרוטאז. רמות החלבון נמדדו באמצעות בדיקת חומצה ביצינכונינית (BCA). עבור כל דגימה, נטענו 30 µg של חלבון לכל נתיב, הופרדו על ג'לים של 10% SDS-PAGE, והועברו לממברנות PVDF. הממברנות נחסמו ב-5% חלב דל שומן למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ולאחר מכן דגרו למשך לילה ב-4 °C עם נוגדנים נגד ZO-1 (1:1,000), occludin (1:500), claudin-2 (1:1,000) ו-GAPDH (1:5,000). לאחר שטיפה, דגרו את הממברנות עם נוגדנים שניים המשולבים עם HRP למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. פסים זוהו באמצעות כימילומינצנציה מוגברת (ECL), ועוצמת הפסים נותחה באמצעות ImageJ. GAPDH שימש כשליטת טעינה.

בדיקת דואל-לוסיפראז (DLR)

אתרי הקישור הפוטנציאליים של miR-29b-3p לרצף ה-NEAT1 נחזו באמצעות מאגר הנתונים ENCORI (https://rnasysu.com/encori/). לאחר מכן, מקטעי NEAT1 המכילים אתרי קישור מסוג wild-type (WT) או מוטנטים (MUT) שובטו אל תוך וקטור הדגימה pmirGLO. הפלסמיד הרקומיננטי שהוכן הועבר בטרנספקציה משותפת (co-transfected) לתאים יחד עם mimics של miR-29b-3p (Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) או מעכבים (inhibitors) והביקורות השליליות המתאימות להם (mimic NC, Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’). ארבעים ושמונה שעות לאחר הטרנספקציה, התאים נאספו, ופעילות הלוסיפרז של גחליליות (firefly luciferase) ושל רנילה (renilla luciferase) נקבעה באמצעות ריאגנט לגילוי לוסיפרז כפול (dual luciferase detection reagent). פעילות הלוסיפרז של רנילה שימשה כרפרנס פנימי לצורך סטנדרטיזציה.

בדיקת אימונו-שיקוע של RNA (RIP)

עבור בדיקת ה-RIP, תאי Caco-2 נאספו, נשטפו ב-PBS, והודגרו על קרח למשך 15 min ב-200 µL של RIP lysis buffer בתוספת מעכבי פרוטאז ו-RNase. ליזאטים של התאים סובבו בצנטריפוגה ב-16,000 × g למשך 10 min ב-4 °C, ו-10 µL מכל עליון נשמרו כביקורת קלט (input control). עבור אימונופרסיפיטציה, 40 µL של חרוזי Protein A/G מגנטיים סובבו יחד עם 5 µg של נוגדן anti-Ago2 או IgG רגיל ב-200 µL של RIP wash buffer למשך 30 min בטמפרטורת החדר. לאחר שלושה שטיפות עם 500 µL של RIP wash buffer, 100 µL מתליון החרוזים שולבו עם 100 µL של ליזאט, ה Bring לנפח סופי של 1 mL באמצעות RIP wash buffer, והודגרו למשך לילה ב-4 °C תחת סיבוב. לאחר מכן, החרוזים נשטפו חמש פעמים עם 500 µL של RIP wash buffer והושעו מחדש ב-150 µL מאותו באפר. עיכול החלבונים בוצע על ידי הוספת 15 µL של proteinase K (20 mg/mL) ו-15 µL של 10% SDS, ולאחריהם הדגרה ב-55 °C למשך 30 min עם ניעור. העליון נאסף, ו-RNA בודד באמצעות ריאגנט מיצוי והושקע למשך לילה. העשרה של NEAT1 ו-miR-29b-3p נבדקה לאחר מכן באמצעות RT-qPCR.

ניתוח לוקליזציה תת-תאית

תאי Caco-2 הופרדו לפרקציות גרעיניות וציטופלזמיות באמצעות ריאגנט להפרדת גרעין וציטופלזמה זמין מסחרית, בהתאם להוראות היצרן. RNA כולל הופק משני רכיבים אלו, והפצתו של NEAT1 בגרעין ובציטופלזמה נבדקה באמצעות RT-qPCR. כיול בוצע באמצעות U6 (בעיקר גרעיני) ו-mRNA של GAPDH (בעיקר ציטופלזמי) כאינדיקטורים ליעילות ההפרדה.

ניתוח סטטיסטי

עבור דגימות סרום קליניות, ניתוח עוצמה (t-test, d = 0.5, α = 0.05, power = 0.9) הצביע על כך שנדרש מינימום של 86 נבדקים לקבוצה. כדי להביא בחשבון נסיבות בלתי צפויות שעלולות להתרחש במהלך הניסוי, גויסו 116 חולים בכל קבוצה כדי לזהות הבדלים משמעותיים מבחינה קלינית. נורמליות הנתונים עבור משתנים רציפים הוערכה באמצעות מבחן Shapiro-Wilk. מכיוון שכל הנתונים הרציפים היו בעלי התפלגות נורמלית (P > 0.05), הוחלו ניתוחים פרמטריים. משתנים קטגוריאליים נותחו באמצעות מבחן chi-square. ניסויים מבוססי תאים כללו שש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות, עם חמש חזרות טכניות עבור כל חזרה ביולוגית. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. השוואות בין שתי קבוצות של משתנים רציפים בוצעו באמצעות Student’s t-test, בעוד שהשוואות בין קבוצות מרובות נותחו באמצעות one-way ANOVA ולאחריו מבחן Tukey’s post hoc. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ-P < 0.05.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביטוי של NEAT1 וערך אבחנתי

בהשוואה לקבוצת הביקורת הבריאה (HC), רמות הביטוי של NEAT1 בחולי IBS-D היו גבוהות באופן משמעותי (P < 0.0001; איור 1A). השטח תחת העקום (AUC) של NEAT1, כפי שמוצג בעקום מאפייני התפעול של המקלט (ROC), היה 0.867 (95% CI: 0.821–0.913). הספציפיות שלו הייתה 75.9%, בעוד הרגישות הייתה 84.5% (איור 1B). נתונים אלו מרמזים כי ביטוי חריג של NEAT1 בסרום של חולי IBS-D עשוי לשמש כסמן ביולוגי אבחנתי חדש למצב זה.

בנוסף, הושוו הנתונים הקליניים של המטופלים בקבוצות הבריאות ובקבוצת ה-IBS-D. התוצאות הראו שאין הבדלים משמעותיים בין שתי הקבוצות בגיל, במין או במאפיינים אחרים (P > 0.05). עם זאת, נמצאו הבדלים משמעותיים ב-HADS, בתדירות יציאות ובצורת הצואה (P < 0.0001, Table 2). באשר לתדירות הכאבים הבטניים, 69 מטופלים חוו תסמינים במשך ≥ 5 ימים, המהווים 59.48% מהמקרים. באשר לחומרת הכאבים הבטניים, ל-72 מטופלים היה ציון של ≥ 5, המהווים 62.07% (Table 2). משמעות הדבר היא שמטופלים עם IBS-D ניתנים להבחנה בבירור מקבוצת הביקורת על סמך תסמיניהם. בהינתן הקשר הקליני בין רמות גבוהות של NEAT1 לתסמיני IBS-D, חקרנו לאחר מכן את ההשפעה התפקודית של NEAT1 על שלמות מחסום המעי באמצעות מודל של תאי Caco-2 שטופלו ב-LPS.

השפעות של רמות נמוכות של NEAT1 על נזק למחסום המעי ותגובות דלקתיות בתאי Caco-2 שטופלו ב-LPS

כדי לדמות את הליקוי בתפקוד מחסום המעי ואת הדלקת ברמה נמוכה הנראים ב-IBS-D, טיפלנו תאי Caco-2 ב-LPS. כאשר LPS הוסף לתאים, רמות ה-NEAT1 עלו בהשוואה לקבוצת הביקורת. לאחר טרנספקציה עם si-NEAT1, רמת ה-NEAT1 פחתה באופן ניכר בהשוואה לקבוצת ה-LPS + si-NC (P < 0.0001, איור 2A). טיפול ב-LPS הפחית את חיוניות התאים והגביר את האפופטוזיס ביחס לקבוצת הביקורת. לאחר השתקת NEAT1, חיוניות התאים עלתה ושיעור האפופטוזיס פחת בהשוואה לקבוצת ה-LPS + si-NC (P < 0.001; איור 2B,C). לאחר השתקת NEAT1, ערכי ה-TEER שהופחתו על ידי LPS שוקמו באופן משמעותי (P < 0.0001, איור 2D). LPS הפחית את ביטוי ה-mRNA של ZO-1 ושל occludin והגביר את ביטוי ה-claudin-2 ביחס לביקורות, בעוד שהשתקת NEAT1 הפכה שינויים אלו (P < 0.001, איור 2E-G). טיפול ב-LPS יכול לעורר תגובה דלקתית בתאים. רמות הגורמים הפרו-דלקתיים TNF-α, IL-6, IL-8 ו-IL-1β בתאים היו גבוהות יותר מאשר בקבוצת הביקורת. לאחר השתקת NEAT1, תכני הגורמים הפרו-דלקתיים בתאים פחתו באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת ה-si-NC (P < 0.0001, איור 3A-D). נתון זה מרמז כי רמות נמוכות של NEAT1 מפחיתות את הליקוי בתפקוד מחסום המעי ואת התגובות הדלקתיות המושרות על ידי LPS, וכי NEAT1 עשוי לתרום להתקדמות ה-IBS-D.

קישור ישיר של NEAT1 והשפעות על miR-29b-3p בתאי Caco-2

בתאי Caco-2, NEAT1 נמצא בעיקר בציטופלזמה (איור 4A). אתרי הקישור של NEAT1 ו-miR-29b-3p נחזו באמצעות מאגר הנתונים ENCORI. על בסיס נתונים אלו, תכננו את הרצפים WT-NEAT1 ו-MUT-NEAT1 (איור 4B). תוצאות הניסוי ב-DLR הצביעו על כך ש-mimics של miR-29b-3p הפחיתו את הפעילות האנזימטית של WT-NEAT1 ביחס ל-mimic NC, בעוד שמעכביו הגבירו אותה ביחס ל-inhibitor NC. לעומת זאת, לאף אחד מהטיפולים לא הייתה השפעה על MUT-NEAT1 (P < 0.0001, איור 4C). בדיקת RIP גילתה ש- NEAT1 ו-miR-29b-3p היו שכיחים באופן משמעותי בפרקציית anti-Ago2 בהשוואה לקבוצת ה-anti-IgG, מה שמעיד על אינטראקציה ספציפית בין השניים (P < 0.0001, איור 4D). תוצאות אלו מעידות כי NEAT1 נקשר באופן ספציפי ל-miR-29b-3p. במקביל, רמת miR-29b-3p הייתה נמוכה באופן ניכר בחולי IBS-D בהשוואה לקבוצת ה-HC (P < 0.0001, איור 4E). ה-AUC של עקומת ה-ROC שלו היה 0.856 (95% CI: 0.808–0.905), עם רגישות של 89.7% וספציפיות של 71.6% (איור 4F). ניתוח מתאם של פירסון (Pearson's correlation analysis) גילה מתאם הפוך בין רמות NEAT1 לבין הביטוי של miR-29b-3p (r = -0.744, P < 0.0001, איור 4G).

השפעות של רמות נמוכות של NEAT1 על נזק למחסום המעי בתאי Caco-2 שטופלו ב-LPS ועל רמות miR-29b-3p

בתאי Caco-2 שטופלו ב-LPS, הביטוי של miR-29b-3p היה נמוך באופן ניכר בהשוואה לקבוצת הביקורת. טרנספקציה של si-NEAT1 העלתה את רמות ה-miR-29b-3p, בעוד שטרנספקציה של מעכב miR-29b-3p הפחיתה שוב את רמות ה-miR-29b-3p (P < 0.0001, איור 5A). השתקה (Knockdown) של NEAT1 העלתה את חיוניות התאים והפחיתה את האפופטוזיס, והשפעות אלו בוטלו על ידי מעכב miR-29b-3p (P < 0.01, איור 5B,C). הירידה ב-TEER המושרה על ידי LPS שוחזרה על ידי השתקת NEAT1, ושחזור זה נמנע שוב על ידי מעכב miR-29b-3p (P < 0.0001, איור 5D). טיפול ב-LPS הוביל לירידה בביטוי של mRNA של ZO-1 ואוקלודין (occludin) ולעלייה בביטוי של mRNA של קלאודין-2 (claudin-2) בהשוואה לקבוצת הביקורת. לאחר השתקת NEAT1, רמות ה-miR-29b-3p עלו, רמות ה-mRNA של ZO-1 ואוקלודין עלו, ורמות ה-mRNA של קלאודין-2 ירדו בהשוואה לקבוצת LPS + si-NC. לאחר עיכוב של miR-29b-3p, רמות ה-mRNA של ZO-1 ואוקלודין ירדו, ורמות ה-mRNA של קלאודין-2 עלו בהשוואה לקבוצת LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC (P < 0.001, איור 5E-G). NEAT1 (בעיקר הסוג הציטופלזמי NEAT1_1) פועל כספוג עבור miR-29b-3p. השתקה של NEAT1 משחררת את miR-29b-3p, ובכך מעלה בעקיפין את הביטוי של ZO-1 ואוקלודין ומורידה את הביטוי של קלאודין-2, דבר המקל על פגיעת המחסום המושרה על ידי LPS. תוצאות אלו מרמזות כי במודל זה, miR-29b-3p מווסת באופן חיובי את הביטוי של ZO-1 ואוקלודין ומווסת באופן שלילי את קלאודין-2, וכי ההשפעות של השתקת NEAT1 מתווכות, לפחות בחלקן, על ידי miR-29b-3p.

בנוסף, בחנו את רמות הביטוי של חלבוני הצומת המהודק באמצעות אנליזת western blot. כפי שמוצג ב-איור 5H, השתקה של NEAT1 העלתה את הביטוי של ZO-1 ו-occludin שהופחת על ידי LPS, ודיכאה את הביטוי של claudin-2 בהשוואה לקבוצת ה-LPS + si-NC. עם זאת, טרנספקציה משותפת עם מעכב miR-29b-3p החלישה את האפקט המגן של השתקת NEAT1 בהשוואה לקבוצת ה-LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC. תוצאות אלו תומכות במסקנה כי השתקה של NEAT1 משחזרת את ביטוי חלבוני הצומת המהודק, לפחות בחלקו על ידי ויסות חיובי (upregulating) של miR-29b-3p, ובכך משפרת את תפקוד מחסום המעי.

השפעות של רמות נמוכות של NEAT1 על דלקת במעי בתאי Caco-2 שטופלו ב-LPS ועל ביטוי של miR-29b-3p

בתאי Caco-2 שטופלו ב-LPS, ה-LPS עורר תגובה דלקתית. הרמות של הגורמים הפרו-דלקתיים TNF-α, IL-6, IL-8 ו-IL-1β היו גבוהות משמעותית מאשר בקבוצת הביקורת. לאחר knockdown של NEAT1, רמות ה-miR-29b-3p עלו, בעוד שרמות הגורמים הפרו-דלקתיים ירדו משמעותית בהשוואה ל-si-NC. לאחר עיכוב של miR-29b-3p, רמות הגורמים הדלקתיים עלו שוב (P < 0.0001, איור 6A-D). לכן, knockdown של NEAT1 מדכא את שחרור הציטוקינים הדלקתיים, לפחות באופן חלקי, על ידי ויסות חיובי של miR-29b-3p.

תוצאות אלו מצביעות על כך שרמות NEAT1 מוגברות באופן חריג בסרום של חולים עם IBS-D ושל NEAT1 יש AUC גבוה להבחנה בין חולים עם IBS-D לביקורות בריאות. מבחינה מכניסטית, NEAT1 נקשר ישירות ל-miR-29b-3p ומבודד אותו בציטופלזמה. במודלים תאיים ובניסויי הצלה פונקציונליים, knockdown של NEAT1 הגביר את ביטויו של miR-29b-3p, שיפר את הישרדות התאים ואת ה-TEER, הפחית אפופטוזיס והחליש את שחרורם של ציטוקינים פרו-דלקתיים. ממצאים אלו תומכים בהשערה ש-NEAT1 מווסת באופן שלילי את שלמות מחסום המעי על ידי עיכוב של miR-29b-3p, ומצביעים על כך שסימון NEAT1 כמטרה עשוי לספק אסטרטגיה אבחנתית וטיפולית פוטנציאלית עבור IBS-D.

זמינות נתונים:

הנתונים הגולמיים העומדים בבסיס האיורים והטבלאות מסופקים כקובץ משלים 1 (גיליון נתונים גולמיים) וקובץ משלים 2 (תמונות western blot לא ערוכות).

figure-results-1
איור 1. ביטוי וערך אבחנאי של NEAT1 בחולים עם IBS-D. (A) רמות ביטוי של NEAT1 בסרום של ביקורת בריאה (HC, n = 116) וחולים עם IBS-D (n = 116) שזוהו באמצעות RT-qPCR; (B) ניתוח עקומת ROC של NEAT1 להבחנה בין חולי IBS-D לביקורת בריאה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 116 לכל קבוצה). **** P < 0.0001. קיצורים: IBS-D = תסמונת המעי הרגיז עם שלשולים; ROC = מאפייני תפעול מקלט. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2. השפעת NEAT1 על נזק למחסום המעי המושרה על ידי LPS בתאי Caco-2. (A) טרנספקציה של si-NEAT1 מפחיתה את רמות NEAT1 המושרות על ידי LPS; (B) חיות תאים שנמדדה באמצעות מבחן CCK-8 ב- 0, 24, 48 ו-72 שעות. השתקה (Knockdown) של NEAT1 משפרת את חיות התאים; (C) שיעור אפופטוזיס שנקבע באמצעות ציטומטריה של זרימה עם צביעת Annexin V-FITC/PI. השתקת NEAT1 מפחיתה את שיעורי האפופטוזיס; (D) התנגדות חשמלית טרנס-אפיתליאלית (TEER) שנמדדה בשכבות מונולייר של Caco-2. עיכוב של NEAT1 מעלה את ה-TEER התאי; (E-G) רמות ביטוי של mRNA של (E) ZO-1, (F) occludin, ו-(G) claudin-2 שנמדדו ב-RT-qPCR. השתקת NEAT1 מעלה את ביטוי ה-mRNA של ZO-1 ו-occludin, ומפחיתה את רמות ה-mRNA של claudin-2. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD מששה ניסויים עצמאיים (n = 6 לקבוצה). *** P < 0.001; **** P < 0.0001, LPS בהשוואה לביקורת, LPS + si-NEAT1 בהשוואה ל-LPS + si-NC. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3. השפעת knockdown של NEAT1 על שחרור ציטוקינים פרו-דלקתיים המושרה על ידי LPS בתאי Caco-2. (A-D) ריכוזים של (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8, ו-(D) IL-1β בעילי תרביות תאים שנמדדו באמצעות ELISA. knockdown של NEAT1 מפחית את רמות ה-TNF-α, IL-6, IL-8 ו-IL-1β המושרים על ידי LPS. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD מששה ניסויים בלתי תלויים (n = 6 לכל קבוצה). **** P < 0.0001, LPS לעומת ביקורת, LPS + si-NEAT1 לעומת LPS + si-NC. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4. קישור ישיר של NEAT1 ואסוציאציה עם miR-29b-3p. (A) לוקליזציה תת-תאית של NEAT1 בתאי Caco-2 שנקבעה באמצעות פרקציונציה גרעין-ציטופלזמה (U6: בקרת גרעין, GAPDH: בקרת ציטופלזמה). NEAT1 ממוקם בעיקר בציטופלזמה; (B) רצפי קישור חזויים של WT ו-MUT עבור NEAT1 ל-miR-29b-3p ממאגר הנתונים ENCORI; (C) בדיקת DLR איששה את קשר הקישור בין NEAT1 ל-miR-29b-3p; (D) RIP אישש את קשר הקישור בין NEAT1 ל-miR-29b-3p. הנתונים ב-A, C, ו-D הם ממוצע ± SD מששה בדיקות עצמאיות (n = 6 לכל קבוצה). (E) רמות ביטוי של miR-29b-3p בסרום בביקורות בריאות (HC, n = 116) ובחולי IBS-D (n = 116); (F) עקומת ROC של miR-29b-3p להבחנה בין חולי IBS-D לביקורות בריאות; (G) ניתוח קורלציית פירסון בין רמות NEAT1 ל-miR-29b-3p בחולי IBS-D. נמצאה קורלציה שלילית בין NEAT1 לביטוי של miR-29b-3p (r = -0.744, P < 0.0001). הנתונים ב-E הם ממוצע ± SD (n = 116 לכל קבוצה). **** P < 0.0001. קיצורים: WT = wild type; MUT = mutant; DLR = dual-luciferase reporter; RIP = RNA immunoprecipitation. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

figure-results-5
איור 5. השפעות של knockdown של NEAT1 על תפקוד מחסום המעי בתאי Caco-2 שטופלו ב-LPS ועל miR-29b-3p. (A) Knockdown של NEAT1 מעלה את רמות ה-miR-29b-3p, בעוד שטרנספקציה עם מעכבי miR-29b-3p מפחיתה את ביטוי ה-miR-29b-3p. (B) חיוניות תאים שנמדדה באמצעותבדיקת CCK-8. רמות נמוכות של NEAT1 משפרות את חיוניות התאים על ידי העלאת miR-29b-3p; (C) שיעור אפופטוזיס שנקבע באמצעות ציטומטריה של זרימה. רמות נמוכות של NEAT1 מפחיתות את שיעור האפופטוזיס על ידי העלאת miR-29b-3p; (D) רמות נמוכות של NEAT1 מעלות את ה-TEER של התאים על ידי העלאת הרמה של miR-29b-3p; (E-G) ביטוי mRNA של (E) ZO-1, (F) occludin, ו-(G) claudin-2. רמות נמוכות של NEAT1 מעלות את הביטוי של ZO-1 ו-occludin ומפחיתות את ביטוי ה-mRNA של claudin-2 על ידי הגברת miR-29b-3p. (H) תמונות מייצגות של western blot המראות ביטוי חלבון של ZO-1, occludin, claudin-2, ו-GAPDH תחת תנאי הטיפול המצוינים. נתונים מוצגים כממוצע ± SD משישה ניסויים עצמאיים (n = 6 לקבוצה). ** P < 0.01; *** P < 0.001; **** P < 0.0001, LPS לעומת ביקורת, LPS + si-NEAT1 לעומת LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-inhibitor לעומת LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC. קיצורים: miR-inhibitor = מעכב miR-29b-3p; TEER = התנגדות חשמלית טרנס-אפיתליאלית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6. השפעות של knockdown של NEAT1 על דלקת בתאי Caco-2 שעובדו עם LPS ועל miR-29b-3p. (A-D) ריכוזים של (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8, ו-(D) IL-1β בעילי תרביות תאים שנמדדו באמצעות ELISA. רמות נמוכות של NEAT1 מפחיתות את התוכן של TNF-α, IL-6, IL-8 ו-IL-1β בעילי התאים על ידי הגברת miR-29b-3p. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD מששה ניסויים בלתי תלויים (n = 6 לכל קבוצה). **** P < 0.0001, LPS לעומת ביקורת, LPS + si-NEAT1 לעומת LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-inhibitor לעומת LPS + si-NEAT1 + inhibitor NC. קיצורים: miR-inhibitor = מעכב miR-29b-3p. נא ללחוץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

GenePrimer sequence
NEAT1 forward5’-GTGGCTGTTGGAGTCGGTAT-3’
NEAT1 reverse5’-TAACAAACCACGGTCCATGA-3’
ZO-1 forward5’-GCCGCTAAGAGCACAGCAA-3′
ZO-1 reverse5’-TCCCCACTCTGAAAATGAGGA-3’
Occludin forward5’-ATGGCAAAGTGAATGACAAGCGG-3’
Occludin reverse5’-CTGTAACGAGGCTGCCTGAAGT-3’
Claudin-2 forward5’-GTGACAGCAGTTGGCTTCTCCA-3’
Claudin-2 reverse5’-GGAGATTGCACTGGATGTCACC-3’
miR-29b-3p forward5’-GCTCTAGATCAGTTACAGAAAGACCACGA-3’
miR-29b-3p reverse5’-GCTCTAGATAGTGTCCATGCACGGACC-3’
GAPDH forward5’-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3’
GAPDH reverse5’-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3’
U6 forward5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’
U6 reverse5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’

טבלה 1: רצפי פריימרים.

מדדקבוצת ביקורת (N=116)קבוצת IBS-D (N=116)P
גיל, שנים
< 4063540.293
≥ 405362
מין
זכר64660.895
נקבה5250
עישון
לא58530.599
כן5863
שתיית אלכוהול
לא63580.599
כן5358
HADS, ציון
< 89626< 0.0001
≥ 82090
יציאות, מספר ליום
< 410351< 0.0001
≥ 41365
צורת צואה, מדד בריסטול
< 58725< 0.0001
≥ 52991
תדירות כאבי בטן, מספר ימים
< 5/47/
≥ 5/69
חומרת כאבי בטן, ציון
< 5/44/
≥ 5/72

טבלה 2: השוואה של מאפיינים דמוגרפיים וקליניים בין ביקורות בריאות לבין חולי IBS-D. הערכים מדווחים כמספר המשתתפים עבור כל קבוצה (n = 116/קבוצה). הבדלים בין הקבוצות הוערכו באמצעות מבחן חי-בריבוע. קיצורים: HADS = Hospital Anxiety and Depression Scale; IBS-D = תסמונת המעי הרגיז עם שלשולים.

קובץ משלים 1: נתונים גולמיים העומדים בבסיס האיורים והטבלאות. קובץ זה מכיל את הנתונים המספריים הגולמיים ששימשו ליצירת התוצאות הכמותיות המוצגות ב-איור 1, איור 2, איור 3, איור 4, איור 5, ו-איור 6, ואת הנתונים הדמוגרפיים/הקליניים המסוכמים ב-טבלה 2.אנא לחצו כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: תמונות וסטנרן בלוט (western blot) ללא עריכה. קובץ זה מכיל את תמונות הוסטנרן בלוט ללא עריכה עבור ZO-1, occludin, claudin-2 ו-GAPDH, המתאימות לפאנל הוסטנרן בלוט המייצג המוצג ב-איור 5H.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IBS-D היא הפרעה גסטרו-אינטסטנלית תפקודית נפוצה. המנגנון הפתולוגי שלה טרם הובהר במלואו. בשנים האחרונות, lncRNA, כמולקולות מפתח בוויסות אפיגנטי, הראו פוטנציאל רב בתחום האבחון והטיפול במחלות. LncRNA NEAT1 נחקר במגוון מחלות, כגון סרטן המעי הגס24, גליומה25, ואוטם בשריר הלב26. מחקרים מרובים הראו כי NEAT1 מעורב בוויסות תגובות דלקתיות13, שגשוג תאים27, ושלמות מחסום המעי28. עם זאת, הביטוי הספציפי של NEAT1 ב-IBS-D, ערכו הקליני והמנגנונים הרגולטוריים העומדים בבסיס IBS-D טרם נחקרו לעומק.

NEAT1 מוגבר במצבים דלקתיים שונים, כגון דלקת ריאות29, אוסטאוארטריטיס30, נזלת31 וספסיס32. תוצאותינו עולות בקנה אחד עם אלו שדווחו במחקרים אלו: ביטוי NEAT1 מוגבר באופן משמעותי בחולים עם IBS-D. הדבר מרמז כי הוא עשוי להיות קשור להופעת IBS-D. נכון להיום, האבחנה של IBS-D נשענת בעיקר על קריטריוני התסמינים של Rome IV, ואין סממנים ביולוגיים (biomarkers) מעבדתיים אובייקטיביים זמינים. למרות שקריטריונים אלו הוכחו כיעילים במחקר ובמסגרות קליניות רבות, הם עדיין סובלים ממגבלות, כולל סובייקטיביות, חפיפה של תסמינים עם מחלות אחרות ועיכובים באבחון. ניתוח נוסף של עקומת ROC מצביע על כך של-NEAT1 יש ערך אבחנתי טוב יחסית בחולים עם IBS-D. רמות ביטוי של NEAT1 בסרום מבדילות ביעילות בין חולי IBS-D לבין ביקורות בריאות, עם AUC של 0.867 ורגישות וסגוליות גבוהות. הדבר מרמז כי NEAT1 מבטיח ככלי להשלמת קריטריוני Rome IV לצורך אבחנה או כסממן אבחנתי חדש ל-IBS-D. לדוגמה, חולים המציגים כאבים כרוניים בבטן ושינויים בהרגלי היציאות ובעלי רמות NEAT1 מוגברות, עשויים להיבחן בביטחון רב יותר כאשר תוצאות הסממן הביולוגי נשקלות לצד קריטריוני Rome IV. דבר זה מקל על התחלה מוקדמת של טיפול ממוקד-תסמינים ומונע בדיקות פולשניות מיותרות. לעומת זאת, עבור חולים עם תוצאות סממן ביולוגי תקינות אך העומדים בקריטריוני Rome IV, נדרש ניטור צמוד יותר כדי לשלול מחלות אורגניות אחרות. לכן, שילוב של סממנים ביולוגיים אלו בפרקטיקה הקלינית צפוי לשפר את הדיוק והיעילות האבחנתית, אם כי עדיין נדרש תיקוף פרוספקטיבי במסגרות קליניות.

התסמינים הקליניים שחווים מטופלים עם IBS-D עשויים להיות קשורים לפגיעה בתפקוד מחסום המעי33. תפקוד זה מתווך בעיקר על ידי מבנה הצומת המהודק (TJ) בין תאי אפיתל המעי, כאשר לחלבוני ZO-1 ואוקלודין (occludin) תפקידים חשובים34,35. ZO-1 מעורב בשמירה על המחסום המכני ועל חדירות אפיתל הרירית36. אוקלודין אחראי בעיקר על יצירת צומתים מהודקים בין תאים, החיוניים לשמירה על תפקוד המחסום שלהם37. לחלבון הצומת המהודק קלאודין-2 (claudin-2) תפקיד חשוב ביצירת תעלות נקביים המעקפות את התאים, בין היתר38. במטופלים עם IBS-D, רמות ה-ZO-1 והאוקלודין מופחתות בדרך כלל, רמות הקלאודין-2 מוגברות, מחסום המעי פגום והחדירות מוגברת. מחקר זה מצא כי knockdown של NEAT1 העלה את ה-TEER של מודל התאים in vitro, מה שתומך בהשפעה פוגענית של NEAT1 על מחסום המעי במודל זה. ברמה המולקולרית, עיכוב ביטוי NEAT1 הוביל להתאוששות משמעותית ברמות ביטוי ה-mRNA של חלבוני הצומת המהודק המרכזיים ZO-1 ואוקלודין, בעוד שביטוי הקלאודין-2 פחת. הדבר מרמז כי NEAT1 עשוי לווסת באופן שלילי את ביטוי חלבוני הצומת המהודק, להפר את המחסום הפיזי של אפיתל המעי ולהגביר את חדירותו. בסופו של דבר, הדבר עלול להוביל לתופעה של "מעי דליף" (leaky gut). בנוסף, הדלקת ברמה נמוכה הנפוצה ב-IBS-D היא גורם חשוב המחמיר את נזקי המחסום39. מחקרים רבים אישרו כי lncRNAs יכולים לשמש כצמתי בקרה מרכזיים במסלולי איתות דלקתיים40. המחקר שלנו עולה בקנה אחד עם ממצאים אלו. Knockdown של NEAT1 מפחית באופן משמעותי את שחרורם של הציטוקינים הפרו-דלקתיים TNF-α, IL-6, IL-8 ו-IL-1β המושרים על ידי LPS. הדבר דומה מאוד לתפקידו של NEAT1 כ-lncRNA פרו-דלקתי במודלים דלקתיים אחרים, מה שמעיד כי ב-IBS-D עשוי להתקיים מעגל קסמים של דלקת-נזק למחסום-דלקת, שבו NEAT1 ממלא תפקיד חשוב.

מיקרו-RNA (miRNAs) הם מחלקה חשובה נוספת של גורמים המעורבים בבקרת מחלות. miR-29b-3p מובע ברמה נמוכה בתגובות דלקתיות תאיות שונות המושרות על ידי LPS41,42. בדומה לרוב המחקרים, מצאנו כי רמות miR-29b-3p היו מופחתות באופן ניכר בסרום של חולי IBS-D והראו מתאם שלילי חזק עם עלייה בביטוי של NEAT1. הראינו עוד כי NEAT1 נקשר באופן ישיר ל-miR-29b-3p וסופח אותו בציטופלזמה במודל זה. ניסוי הצלה תפקודי הראה עוד כי NEAT1 משפיע על החיוניות והאפופטוזיס של תאי Caco-2, וכן על רמות ה-mRNA של ZO-1, occludin, ו- claudin-2, לפחות באופן חלקי דרך miR-29b-3p, ובסופו של דבר משפיע על שלמות מחסום המעי. ראוי לציין כי הנתונים שלנו מצביעים על כך שבהקשר של תפקוד לקוי של מחסום המעי הקשור ל-IBS, רמות miR-29b-3p נמצאות במתאם חיובי עם רמות ZO-1 ו-occludin. ויסות חיובי זה עשוי להיות עקיף; לדוגמה, miR-29b-3p עשוי לדכא את השעתוק של חלבוני הצומת המהודק על ידי התמתקתו למדכקי השעתוק שלהם, ובכך להסיר את הדיכוי ולקדם את הביטוי של ZO-1 ו-occludin. השערה זו נתמכת גם על ידי מחקרים קודמים, שדיווחו כי miR-29b-3p ממלא תפקיד מגננ במצבים דלקתיים על ידי התמתקות לווסתים שליליים של תפקודי המחסום42.

עם זאת, הגנים מטרת, שבאמצעותם miR-29b-3p מווסת את ביטוי ה-mRNA של ZO-1 ואוקלודין (occludin), דורשים חקירה נוספת כדי להשלים את רשת ה-ceRNA, וזוהי מגבלה של המחקר הנוכחי שלנו. בנוסף, למחקרנו יש מגבלות נוספות: ראשית, זה היה מחקר רב-מרכזי בודד עם גודל מדגם קטן יחסית (נכללו רק 116 חולי IBS-D). הערך האבחנתי הקליני של NEAT1 עדיין דורש תיקוף נוסף באמצעות מחקרי עוקבה פרוספקטיביים רב-מרכזיים רחבי היקף. שנית, מחקר זה מבוסס בעיקר על ניתוח קשרים קליניים ומודלים של תאים in vitro. בעתיד, יהיה צורך במודלים של בעלי חיים כדי לאמת את תפקידו של ציר זה in vivo. שלישית, רשת גני המטרה הספציפיים במורד הזרם של miR-29b-3p המעורבים בפתוגנזה של IBS-D טרם הובהרה במלואה. מחקרים עתידיים צריכים להתמקד ב: (1) תיקוף הערך האבחנתי של NEAT1 ו-miR-29b-3p בחולי IBS-C ו-IBS-M; (2) בדיקת היעילות הטיפולית של התערבויות המכוונות ל-NEAT1 במודלים של בעלי חיים; ו-(3) הבהרת המנגנון המולקולרי המדויק שבאמצעותו miR-29b-3p מווסת חלבוני צומת מהדק (tight junction proteins). מאמצים אלו יסייעו לתרגום הקליני של ממצאינו.

לסיכום, NEAT1 מבוטא ברמה גבוהה בחולים עם IBS-D ובעל ערך אבחנתי טוב בקוהורט זה. רמות נמוכות של NEAT1 יכולות לקדם את חיוניות התאים, להפחית אפופטוזיס, להקל על נזקי מחסום המעי ולדכא תגובות דלקתיות על ידי הגברת רמות miR-29b-3p בתאי Caco-2 שעוברו ב-LPS. ציר ה-NEAT1/miR-29b-3p מספק נקודת מבט חדשה על המנגנונים הפתופיזיולוגיים המורכבים של IBS-D. NEAT1 עשוי לשמש כביומרקר אבחנתי פוטנציאלי ל-IBS-D, וציר ה-NEAT1/miR-29b-3p עשוי להוות מטרה טיפולית פוטנציאלית למצב זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פלטות 24 בארותCorningCLS3524לזריעת תאים
פלטות 96 בארותCorningCLS3599לזריעת תאים במבדקי CCK-8
ערכה לאפופטוזיס Annexin V-FITC/PIInvitrogenV13242לגילוי שיעורי אפופטוזיס
נוגדן מונוקלונלי Anti-AGO2Proteintech67934-1-Igלאימונופרסיפיטציה של קומפלקסי RNA הקשורים ל-Ago2
נוגדן Anti-Claudin-2Invitrogen32-5600נוגדן ראשוני, דילול 1:1000
נוגדן Anti-GAPDHCell Signaling Technology5174נוגדן ראשוני, דילול 1:5000; בקרת טעינה
נוגדן Anti-Human IgGProteintech10284-1-APמשמש כביקורת שלילית למבדק RIP
נוגדן Anti-OccludinAbcamab31721נוגדן ראשוני, דילול 1:500
נוגדן Anti-ZO-1Proteintech21773-1-APנוגדן ראשוני, דילול 1:1000
תאי Caco-2SUNNCELLSNL-068לבניית מודלים של מחסום אפיתל מעי
ערכת CCK-8SolarbioCA1210ערכה למבדק פרוליפרציה של תאים
כלורופורםSigma-AldrichC2432להפרדה פאזית במיצוי RNA
מדיום DMEMGibco11965092לתרבית תאים
ערכה למבדק דו-לוסיפראז (Dual-Luciferase Reporter Assay Kit)ThermoFisher16186לגילוי פעילות לוסיפראז
ערכת ELISA (עבור IL-1β)R&D SystemsDY201לגילוי חלבוני מטרה בתעשיות-על של תרבית תאים
ערכת ELISA (עבור IL-6)R&D SystemsD6050Bלגילוי חלבוני מטרה בתעשיות-על של תרבית תאים
ערכת ELISA (עבור IL-8)R&D SystemsNBP3-28022לגילוי חלבוני מטרה בתעשיות-על של תרבית תאים
ערכת ELISA (עבור TNF-α)R&D SystemsDTA00Dלגילוי חלבוני מטרה בתעשיות-על של תרבית תאים
מצע כימילומינצנציה משופרת (ECL)Thermo Fisher32106להדמיית פסי חלבון
אתנול (75%)Sigma-Aldrich459844לשטיפת משקע RNA
FBS (סרום עגל עדאי)Gibco10099141לתרבית תאים
ציטומטר זרימהBeckman CoulterB53002לגילוי שיעורי אפופטוזיס
נוגדנים משניים מצומדים ל-HRPCell Signaling Technology7074מזרזים יצירת אות כימילומינצנטי ממצעי ECL
איזופרופנולSigma-Aldrich1133502500להשקעת RNA
Lipofectamine 3000ThermoFisherL3000015ריאגנט טרנספקציה
ליפופוליסכריד (LPS)Sigma-AldrichL2880להשראת בניית מודל תאים
קורא מיקרופלטותBioTekEpoch 2לגילוי בליעה של דגימות בפלטות 96 בארות
מיקרו-ספקטרופוטומטר NanodropThermo ScientificND-2000Cלקביעת ריכוז וטוהר של RNA
חלב רזה מיובשCoolaberCN7861לחסימת ממברנות (תמיסה בריכוז 5%)
ערכת PARISThermo FisherAM1921לפרקציונציה גרעין-ציטופלזמה
פניצילין–סטRepartitionGibco15140122להגנה על צמיחת תאים מפני זיהום
ערכת Pierce BCA למדידת חלבוןThermo Fisher23225לקביעת ריכוזי חלבון
וקטור pmirGLO Dual-LuciferasePromegaE1330וקטור גן דוחה של לוסיפראז כפול
ערכת PrimeScript RT ReagentTakaraRR047Aלשעתוק הפוך של RNA ל-cDNA
ממברנת PVDFMilliporeIPVH00010להעברת חלבון לאחר SDS-PAGE
מכשיר PCR כמותי פלואורסצנטי בזמן אמתApplied Biosystems4365464לגילוי גנים מטרה
בופר ליזיס RIPA (עם מעכבי פרוטאז)Thermo Fisher89901למיצוי חלבון כולל מתאים
ערכה לאימונופרסיפיטציה של חלבונים קושרי RNASigma-Aldrich17-701מבדק אימונופרסיפיטציה של חלבונים קושרי RNA (RIP) באמצעות חרוזי מגנט Protein A/G
ריאגנטים ל-SDS-PAGE (ג'ל 10%)TargetMolC0189להפרדת חלבונים לפי משקל מולקולרי
תערובת SYBR Green master mixThermo Fisher4309155לשימוש בבדיקות PCR
מד TEER (מד וולט-אוהם)MilliporeMERS00002מד התנגדות טרנס-ממברנלית, למדידת שלמות שכבה בודדת
תאי TranswellCorning CostarCLS3413לתרבית מונו-שכבות של תאים ומדידת TEER
ריאגנט TRIzolInvitrogen15596026CNלמיצוי RNA כולל

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ren M, Ma J, Qu M. Network pharmacology integrated with molecular docking and molecular dynamics simulations to explore the mechanism of Shaoyao Gancao Tang in the treatment of asthma and irritable bowel syndrome. Medicine (Baltimore). 2024;103(50).
  2. Zhao C, Zhou X, Shi X. The influence of Nav1.9 channels on intestinal hyperpathia and dysmotility. Channels (Austin). 2023;17(1):2212350.
  3. Jiang J, et al. Effectiveness of Tong-Xie-Yao-Fang combined with Si-Ni-San for irritable bowel syndrome: a protocol for systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2021;100(11).
  4. Lenoir M, Wienke J, Fardao-Beyler F, Roese N. An 8-week course of Bifidobacterium longum 35624 is associated with a reduction in the symptoms of irritable bowel syndrome. Probiotics Antimicrob Proteins. 2025;17(1):315-27.
  5. Tao E, et al. Early life stress induces irritable bowel syndrome from childhood to adulthood in mice. Front Microbiol. 2023;14:1255525.
  6. Biswas S, et al. Expressions of serum lncRNAs in diabetic retinopathy: a potential diagnostic tool. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:851967.
  7. Li W, et al. Functional roles of non-coding RNAs in panvascular diseases. J Vis Exp. 2025;(226).
  8. Shin SY, et al. The effect of phloroglucinol in patients with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. J Neurogastroenterol Motil. 2020;26(1):117-27.
  9. Yang S, et al. Ginseng-derived nanoparticles alleviate inflammatory bowel disease via the TLR4/MAPK and p62/Nrf2/Keap1 pathways. J Nanobiotechnology. 2024;22(1):48.
  10. Zhang J, et al. Role of the gut microbiota in complications after ischemic stroke. Front Cell Infect Microbiol. 2024;14:1334581.
  11. Chen S, et al. The role of lncRNAs in regulating the intestinal mucosal mechanical barrier. Biomed Res Int. 2021;2021:2294942.
  12. Lu Q, et al. The role of long noncoding RNAs in intestinal health and diseases: a focus on the intestinal barrier. Biomolecules. 2023;13(11):1674.
  13. Li F, et al. Knockdown of long non-coding RNA NEAT1 relieves inflammation of ulcerative colitis by regulating the miR-603/FGF9 pathway. Exp Ther Med. 2022;23(2):131.
  14. Ni S, Liu Y, Zhong J, Shen Y. Inhibition of lncRNA NEAT1 alleviates intestinal epithelial cells dysfunction in ulcerative colitis by maintaining the homeostasis of the glucose metabolism through the miR-410-3p-LDHA axis. Bioengineered. 2022;13(4):8961-71.
  15. Aparicio P, et al. Serum lncRNAs NEAT1, PVT1 and H19 as novel biomarkers for sarcopenia diagnosis and treatment response. Noncoding RNA Res. 2025;14:166-76.
  16. Martínez C, et al. miR-16 and miR-125b are involved in barrier function dysregulation through the modulation of claudin-2 and cingulin expression in the jejunum in IBS with diarrhoea. Gut. 2017;66(9):1537-8.
  17. Che F, et al. Lnc NEAT1/miR-29b-3p/Sp1 form a positive feedback loop and modulate bortezomib resistance in human multiple myeloma cells. Eur J Pharmacol. 2021;891:173752.
  18. Zhang Y, et al. LncRNA NEAT1/miR-29b-3p/BMP1 axis promotes osteogenic differentiation in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Pathol Res Pract. 2019;215(3):525-31.
  19. Ludidi S, et al. The intestinal barrier in irritable bowel syndrome: subtype-specific effects of the systemic compartment in an in vitro model. PLoS One. 2015;10(5).
  20. Fan Z, et al. Investigation of the biomarkers and mechanism based on endoplasmic reticulum stress in irritable bowel syndrome. Arab J Gastroenterol. 2025;26(4):337-46.
  21. Zhang H, Xiong Z, He Y, Su H, Jiao Y. Cimifugin improves intestinal barrier dysfunction by upregulating SIRT1 to regulate the NRF2/HO-1 signaling pathway. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(3):2897-908.
  22. Zhang Y, et al. Decreased expression of microRNA-510 in intestinal tissue contributes to post-infectious irritable bowel syndrome via targeting PRDX1. Am J Transl Res. 2019;11(12):7385-97.
  23. Li BR, et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. J Vis Exp. 2018;(140).
  24. Zhang M, et al. The lncRNA NEAT1 activates Wnt/β-catenin signaling and promotes colorectal cancer progression via interacting with DDX5. J Hematol Oncol. 2018;11(1):113.
  25. Liang J, Liu C, Xu D, Xie K, Li A. LncRNA NEAT1 facilitates glioma progression via stabilizing PGK1. J Transl Med. 2022;20(1):80.
  26. Yu Q, et al. Silencing of lncRNA NEAT1 alleviates acute myocardial infarction by suppressing miR-450-5p/ACSL4-mediated ferroptosis. Exp Cell Res. 2024;442(2):114217.
  27. Gong Z, Zhang Y, Jiang Y, Chen P, Ji J. LncRNA NEAT1 targets miR-342-3p/CUL4B to inhibit the proliferation of cutaneous squamous cell carcinoma cells. J Oncol. 2022;2022:8145129.
  28. Han M, et al. LncRNA NEAT1 protects uremic toxin-induced intestinal epithelial barrier injury by regulating miR-122-5p/Occludin axis. PLoS One. 2025;20(5).
  29. Cui J, Wang J, Lv Y, Xu D. LncRNA NEAT1 regulates infantile pneumonia by sponging miR-146b. Mol Biotechnol. 2021;63(8):694-701.
  30. Xiao P, et al. LncRNA NEAT1 regulates chondrocyte proliferation and apoptosis via targeting miR-543/PLA2G4A axis. Hum Cell. 2021;34(1):60-75.
  31. Wu X, et al. Aberrant expressions of circulating lncRNA NEAT1 and microRNA-125a are linked with Th2 cells and symptom severity in pediatric allergic rhinitis. J Clin Lab Anal. 2022;36(3).
  32. Wang K, Liu Y, Chai Y. NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 axis regulates macrophage polarization and inflammation in sepsis models. J Vis Exp. 2026;(227).
  33. Tojo González R, et al. Síndrome de intestino irritable: papel de la microbiota y probióticos [Irritable bowel syndrome; gut microbiota and probiotic therapy]. Nutr Hosp. 2015;31(Suppl 1):83-8.
  34. Hwang HJ, et al. Ferulic acid as a protective antioxidant of human intestinal epithelial cells. Antioxidants (Basel). 2022;11(8):1448.
  35. Wu Y, et al. Probiotics (Lactobacillus plantarum HNU082) supplementation relieves ulcerative colitis by affecting intestinal barrier functions, immunity-related gene expression, gut microbiota, and metabolic pathways in mice. Microbiol Spectr. 2022;10(6).
  36. Kuo WT, et al. The tight junction protein ZO-1 is dispensable for barrier function but critical for effective mucosal repair. Gastroenterology. 2021;161(6):1924-39.
  37. Furuse M, et al. Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junctions. J Cell Biol. 1993;123(6 Pt 2):1777-88.
  38. Wang Z, et al. Binding of Trichinella spiralis C-type lectin with syndecan-1 on intestinal epithelial cells mediates larval invasion of intestinal epithelium. Vet Res. 2023;54(1):86.
  39. Kaya İslamoğlu ZG, Unal M, Küçük A. Atopic dermatitis in adults and irritable bowel syndrome: a cross-sectional study. Indian J Dermatol. 2019;64(5):355-9.
  40. Ma C, et al. LncRNA PTS-1 protects against osteoarthritis through the miR-8085/E2F2 axis. J Inflamm Res. 2025;18:347-66.
  41. Tong Y, Zhou Z, Tang J, Feng Q. miR-29b-3p inhibits the inflammation injury in human umbilical vein endothelial cells by regulating SEC23A. Biochem Genet. 2022;60(6):2000-14.
  42. Li Z, et al. miR-29b-3p protects cardiomyocytes against endotoxin-induced apoptosis and inflammatory response through targeting FOXO3A. Cell Signal. 2020;74:109716.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NEAT1IBS DRT qPCR

מאמרים קשורים