שיבוש במחסום המעי המתווך על ידי NEAT1 באמצעות קישור ל-miR-29b-3p בתאי Caco-2 שנפגעו מליפופוליסכריד

ShuMin Jiang; Chunrong Ping; Xiaotong He; Guoyu Chen; Lingmei Feng; Jieru Ji; Yaya Gao

doi:10.3791/71021

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

שיבוש במחסום המעי המתווך על ידי NEAT1 באמצעות קישור ל-miR-29b-3p בתאי Caco-2 שנפגעו מליפופוליסכריד

119 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71021

⸱

14 באוגוסט 2026

ShuMin Jiang^*¹ , Chunrong Ping^*² , Xiaotong He³ , Guoyu Chen³ , Lingmei Feng³ , Jieru Ji³ , Yaya Gao⁴

¹Department of Internal Medicine, Heyuan Street Community Healthcare Center of Heilongjiang Province Daqing City Datong District, ²Department of Gastroenterology, The Second Hospital of Hebei Medical University, ³Department of Gastroenterology, Shanghai Pudong New Area People's Hospital, ⁴Department of organ Transplantation, Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Third Hospital of Shanxi Medical University, Tongji Shanxi Hospital

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה העריך את NEAT1 כסמן אבחנתי וכווסת של תפקוד לקוי של מחסום המעי בתסמונת המעי הרגיז עם דומיננטיות של שלשולים. NEAT1 היה מוגבר בסרום של חולים, נקשר ל-miR-29b-3p, והשבת ביטויו (knockdown) שיפרה את מדדי המחסום, האפופטוזיס והדלקת בתאי Caco-2 שנפגעו על ידי ליפופוליסכריד.

תקציר

הפתוגנזה של תסמוימת המעי הרגיז עם שלשולים (IBS-D) אינה ברורה, והטיפולים הזמינים נותרו מוגבלים. מחקר זה ประevaluated את הערך האבחנתי של NEAT1 ב-IBS-D ובחן את מנגנון הבקרה הפוטנציאלי שלו. במחקר השתתפו סך הכל 116 חולים עם IBS-D ו-116 ביקורות בריאות. רמות של NEAT1 ו-miR-29b-3p בסרום נמדדו באמצעות RT-qPCR (תסבך שעתוק כמותי בזמן אמת), ועקומות ROC (מאפייני תפעול קולט) שימשו להערכת הערך האבחנתי. לצורך מחקרי המנגנון, הוקם מודל של תאי אפיתל של המעי מסוג Caco-2 שטופלו בליפופוליסכריד (LPS). חיוניות התאים נבחנה באמצעות בדיקת CCK-8 (ערכה לספירת תאים 8), אפופטוזה באמצעות ציטומטריית זרימה, שלמות המחסום באמצעות התנגדות חשמלית טרנס-אפיתלית (TEER), ורמות mRNA של ZO-1, occludin ו-claudin-2 באמצעות RT-qPCR. בדיקות DLR (דיווח דואלי-לוציפראז) ו-RIP (שיקוע אימונולוגי של RNA) שימשו לאימות קשר הקשירה בין NEAT1 ל-miR-29b-3p. NEAT1 הפגין ביטוי גבוה, ו-miR-29b-3p הפגין ביטוי נמוך בחולים עם IBS-D, ורמותיהם הראו מתאם שלילי חזק. השתקת NEAT1 העלתה את רמות miR-29b-3p, שיפרה את חיוניות התאים ואת ה-TEER, הפחיתה אפופטוזה, העלתה את רמות mRNA של ZO-1 ו-occludin, הפחיתה את רמות mRNA של claudin-2, והקלה על מדדים הקשורים לפגיעה במחסום בתאי Caco-2 שטופלו ב-LPS. יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך ש-NEAT1 בסרום הוא סמן ביולוגי מועמד ל-IBS-D וכיכולת ציר ה-NEAT1/miR-29b-3p להיות מעורבת בתפקוד לקוי של מחסום המעי.

מבוא

תסמונת המעי הרגיז עם שלשולים (IBS-D) היא הפרעה תפקודית נפוצה של מערכת העיכול המאופיינת בכאבי בטן, נפיחות בבטן ושינויים בהרגלי היציאות¹. נכון להיום, המכניזם הפתופיזיולוגי של IBS-D לא הובהר במלואו². שיטות הטיפול הן לרוב להקלה סימפטומטית, בעלות יעילות מוגבלת ושיעור הישנות גבוה³. מקובל להניח כי IBS-D כרוכה באינטראקציה של גורמים מרובים, כגון הפרה של ציר המוח-מעי, רגישות יתר ויסצרלית, דלקת מעיים בדרגה נמוכה וליקוי בתפקוד מחסום המעי⁴^,⁵. למרות שקריטריונים אלו הפכו את האבחנה לסטנדרטית במידה מסוימת, הם סובייקטיביים ועשויים להוביל לעיכובים באבחנה או ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

גיוס מטופלים

כל המשתתפים סיפקו הסכמה מדעת בכתב לאחר שהבינו במלואם את תוכן המחקר. ועדת האתיקה של בית החולים Shanghai Pudong New Area People's Hospital בחנה ואישרה פרוטוקול מחקר זה (מס' 2024k007). גודל המדגם חושב באמצעות G*Power: הבדיקה שנבחרה הייתה t-test, והבדיקה הסטטיסטית תוכננה לזיהוי הבדלים בין שני מדגמים בלתי תלויים. עם גודל אפקט של d = 0.5, α = 0.05 ועוצמה של 0.9, חישוב זה הצביע על כך שיש לגייס לפחות 86 נבדקים בכל קבוצה. כדי להביא בחשבון נסיבות בלתי צפויות שעלולות לקרות במהלך הניסוי, גויסו 116 חולים בכל קבוצה. סך של 116 חולים עם IBS-D שביקרו בבית החולים Shanghai Pudong New Area People's Hospital בין יולי 2024 ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ביטוי של NEAT1 וערך אבחנתי

בהשוואה לקבוצת הביקורת הבריאה (HC), רמות הביטוי של NEAT1 בחולי IBS-D היו גבוהות באופן משמעותי (P < 0.0001; איור 1A). השטח תחת העקומה (AUC) של NEAT1, כפי שמוצג בעקומת מאפייני operating characteristic (ROC), היה 0.867 (95% CI: 0.821–0.913). הסגוליות שלו הייתה 75.9%, בעוד הרגישות הייתה 84.5% (איור 1B). נתונים אלו מרמזים כי ביטוי לא תקין של NEAT1 ב.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

IBS-D היא הפרעה גסטרו-אינטסטנלית תפקודית נפוצה. המנגנון הפתולוגי שלה טרם הובהר במלואו. בשנים האחרונות, lncRNA, כמולקולות מפתח בוויסות אפיגנטי, הראו פוטנציאל רב בתחום האבחון והטיפול במחלות. LncRNA NEAT1 נחקר במגוון מחלות, כגון סרטן המעי הגס²⁴, גליומה²⁵, ואוטם בשריר הלב²⁶. מחקרים מרובים הראו כי NEAT1 מעורב בוויסות תגובות דלקתיות¹³, שגשוג תאים²⁷, ושלמות מחסום המעי²⁸

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פלטות 24 בארות	Corning	CLS3524	לזריעת תאים
פלטות 96 בארות	Corning	CLS3599	לזריעת תאים במבדקי CCK-8
ערכה לאפופטוזיס Annexin V-FITC/PI	Invitrogen	V13242	לגילוי שיעורי אפופטוזיס
נוגדן מונוקלונלי Anti-AGO2	Proteintech	67934-1-Ig	לאימונופרסיפיטציה של קומפלקסי RNA הקשורים ל-Ago2
נוגדן Anti-Claudin-2	Invitrogen	32-5600	נוגדן ראשוני, דילול 1:1000
נוגדן Anti-GAPDH	Cell Signaling Technology	5174	נוגדן ראשוני, דילול 1:5000; בקרת טעינה
נוגדן Anti-Human IgG	Proteintech	10284-1-AP	משמש כביקורת שלילית למבדק RIP
נוגדן Anti-Occludin	Abcam	ab31721	נוגדן ראשוני, דילול 1:500
נוגדן Anti-ZO-1	Proteintech	21773-1-AP	נוגדן ראשוני, דילול 1:1000
תאי Caco-2	SUNNCELL	SNL-068	לבניית מודלים של מחסום אפיתל מעי
ערכת CCK-8	Solarbio	CA1210	ערכה למבדק פרוליפרציה של תאים
כלורופורם	Sigma-Aldrich	C2432	להפרדה פאזית במיצוי RNA
מדיום DMEM	Gibco	11965092	לתרבית תאים
ערכה למבדק דו-לוסיפראז (Dual-Luciferase Reporter Assay Kit)	ThermoFisher	16186	לגילוי פעילות לוסיפראז
ערכת ELISA (עבור IL-1β)	R&D Systems	DY201	לגילוי חלבוני מטרה בתעשיות-על של תרבית תאים
ערכת ELISA (עבור IL-6)	R&D Systems	D6050B	לגילוי חלבוני מטרה בתעשיות-על של תרבית תאים
ערכת ELISA (עבור IL-8)	R&D Systems	NBP3-28022	לגילוי חלבוני מטרה בתעשיות-על של תרבית תאים
ערכת ELISA (עבור TNF-α)	R&D Systems	DTA00D	לגילוי חלבוני מטרה בתעשיות-על של תרבית תאים
מצע כימילומינצנציה משופרת (ECL)	Thermo Fisher	32106	להדמיית פסי חלבון
אתנול (75%)	Sigma-Aldrich	459844	לשטיפת משקע RNA
FBS (סרום עגל עדאי)	Gibco	10099141	לתרבית תאים
ציטומטר זרימה	Beckman Coulter	B53002	לגילוי שיעורי אפופטוזיס
נוגדנים משניים מצומדים ל-HRP	Cell Signaling Technology	7074	מזרזים יצירת אות כימילומינצנטי ממצעי ECL
איזופרופנול	Sigma-Aldrich	1133502500	להשקעת RNA
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	ריאגנט טרנספקציה
ליפופוליסכריד (LPS)	Sigma-Aldrich	L2880	להשראת בניית מודל תאים
קורא מיקרופלטות	BioTek	Epoch 2	לגילוי בליעה של דגימות בפלטות 96 בארות
מיקרו-ספקטרופוטומטר Nanodrop	Thermo Scientific	ND-2000C	לקביעת ריכוז וטוהר של RNA
חלב רזה מיובש	Coolaber	CN7861	לחסימת ממברנות (תמיסה בריכוז 5%)
ערכת PARIS	Thermo Fisher	AM1921	לפרקציונציה גרעין-ציטופלזמה
פניצילין–סטRepartition	Gibco	15140122	להגנה על צמיחת תאים מפני זיהום
ערכת Pierce BCA למדידת חלבון	Thermo Fisher	23225	לקביעת ריכוזי חלבון
וקטור pmirGLO Dual-Luciferase	Promega	E1330	וקטור גן דוחה של לוסיפראז כפול
ערכת PrimeScript RT Reagent	Takara	RR047A	לשעתוק הפוך של RNA ל-cDNA
ממברנת PVDF	Millipore	IPVH00010	להעברת חלבון לאחר SDS-PAGE
מכשיר PCR כמותי פלואורסצנטי בזמן אמת	Applied Biosystems	4365464	לגילוי גנים מטרה
בופר ליזיס RIPA (עם מעכבי פרוטאז)	Thermo Fisher	89901	למיצוי חלבון כולל מתאים
ערכה לאימונופרסיפיטציה של חלבונים קושרי RNA	Sigma-Aldrich	17-701	מבדק אימונופרסיפיטציה של חלבונים קושרי RNA (RIP) באמצעות חרוזי מגנט Protein A/G
ריאגנטים ל-SDS-PAGE (ג'ל 10%)	TargetMol	C0189	להפרדת חלבונים לפי משקל מולקולרי
תערובת SYBR Green master mix	Thermo Fisher	4309155	לשימוש בבדיקות PCR
מד TEER (מד וולט-אוהם)	Millipore	MERS00002	מד התנגדות טרנס-ממברנלית, למדידת שלמות שכבה בודדת
תאי Transwell	Corning Costar	CLS3413	לתרבית מונו-שכבות של תאים ומדידת TEER
ריאגנט TRIzol	Invitrogen	15596026CN	למיצוי RNA כולל

מקורות

Ren M, Ma J, Qu M. Network pharmacology integrated with molecular docking and molecular dynamics simulations to explore the mechanism of Shaoyao Gancao Tang in the treatment of asthma and irritable bowel syndrome. Medicine (Baltimore). 2024;103(50).
Zhao C, Zhou X, Shi X. The influence of Nav1.9 channels on intestinal hyperpathia and dysmotility. Channels (Austin). 2023;17(1):2212350.
Jiang J, et al. Effectiveness of Tong-Xie-Yao-Fang combined with Si-Ni-San for irritable bowel syndrome: a protocol for systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2021;100(11).
L....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ביטוי NEAT1 נזק על ידי ליפופוליסכריד סמן ביולוגי ל-IBS-D RT-qPCR חיוניות תאים שלמות המחסום בדיקת אפופטוזיס