אצל חולי פגיעות חוט השדרה (SCI), העלאת האיזון של CASC11 קשורה לחומרת הפציעה. במבחנה, הירידה ב-CASC11 הקלה על אפופטוזיס ודלקת, מה שמרמז על קשר לציר miR-130b-5p/SPP1 . תוצאות אלו מצביעות על תפקידו הפוטנציאלי של CASC11 כמועמד לביומרקר בפתוגנזה של SCI.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר מחקר
* These authors contributed equally
אצל חולי פגיעות חוט השדרה (SCI), העלאת האיזון של CASC11 קשורה לחומרת הפציעה. במבחנה, הירידה ב-CASC11 הקלה על אפופטוזיס ודלקת, מה שמרמז על קשר לציר miR-130b-5p/SPP1 . תוצאות אלו מצביעות על תפקידו הפוטנציאלי של CASC11 כמועמד לביומרקר בפתוגנזה של SCI.
פגיעת חוט השדרה (SCI) היא טראומה חמורה במערכת העצבים המרכזית. מחקר זה, במרכז, תצפיתי ובחבתי , חקר את הפוטנציאל האבחוני של CASC11 ואת מנגנון הרגולציה האפשרי שלו ב-SCI באמצעות דגימות סרום קליניות ומודלים של תאים מונעים על ידי ליפופוליסכרידים. רמות CASC11, miR-130b-5p ו-SPP1 נמדדו באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (RT-qPCR). תפקודי התאים והקשרים המיקוד הוערכו באמצעות ערכת ספירת תאים-8 (CCK-8), ציטומטריית זרימה, ווסטרן בלוט, בדיקת אימונוסורבנט מקושרת באנזים (ELISA), דו-לוסיפראז דוח ובדיקות RNA (RIP). CASC11 התבטא מאוד ב-SCI והיה קשור לדלקת כסמן ביולוגי פוטנציאלי לאבחון. בתאי PC-12 שטופלו בליפופוליסכרידים (LPS), השתקת CASC11 הפחיתה את פעילות התאים המדוכאת, האפופטוזיס והדלקת, שהוחזרו על ידי מעכב miR-130b-5p. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-CASC11 קשור לחומרת ה-SCI, בעוד שנתוני ה-in vitro מצביעים על מעורבותו בתגובות דלקתיות ואפופטוטיות דרך ציר CASC11/miR-130b-5p/SPP1 . מחקר זה מוגבל בשל עיצובו המרכזי היחיד והיעדר אימות בתוך ה-vivo .
פגיעת חוט השדרה (SCI) מציינת הפרעה מערכתית זמנית או קבועה הנובעת מנזק לחוט השדרה הנגרם על ידי כוחות חיצוניים או מחלות, וגורמת לפגיעה בתפקודי מערכת העצבים המוטורית, החושית, הרפלקסית והאוטונומית 1,2. מטופלים נתקלים לעיתים קרובות בליקויים וסיבוכים תפקודיים פיזיים לאורך כל החיים, ומטילים סבל ונטל כבדים על אנשים ומשפחותיהם. האטיולוגיה של SCI מסווגת באופן כללי למקורות טראומטיים ולא-טראומטיים3. פציעות טראומטיות, הנובעות בעיקר משברים בעמוד השדרה הנגרמים מכוחות חיצוניים כגון תאונות דרכים, נפילות מגובה ותקריות ספורטיביות, מהוות אתגר הולך וגדל בניהול הקליני של SCI4. בינתיים, מפל הפציעה המשנית שמתחיל לאחר הפציעה הראשונית, במיוחד חוסר הוויסות של התגובה הדלקתית ואפופטוזיס הנוירוני, נחשבים לגורמים מרכזיים התורמים להידרדרות המתמשכת של התפקוד הנוירולוגי. מחקרים עדכניים הדגישו את התפקיד הקריטי של דלקת עצבית, רגנרציה והתאוששות תפקודית בפתופיזיולוגיה ובתיקון של SCI5. כתגובה משנית מרכזית, דלקת עצבית ממלאת תפקיד כפול בתהליך הפגיעה והתיקון ברקמות. בהתחשב ביכולת ההתחדשות המוגבלת של חוט השדרה הפגוע, נדרשת גישה טיפולית סינרגטית המשלבת טיפול אנטי-דלקתי, השתלת תאים, שיקום והתערבויות מולקולריות6. בעוד שפותחו מגוון אסטרטגיות אבחנתיות וטיפוליות ל-SCI, הפרקטיקה הקלינית הנוכחית מתבססת בעיקר על בדיקות דימות7. עם זאת, טכניקות אלו מוגבלות בשל הדרישות הגבוהות לציוד מתקדם, דרישות מוקדמות מחמירות למטופל, והוצאות כספיותמשמעותיות. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף ובלתי מסופק לסמן ביולוגי מעבדתי נוח, מדויק ולא פולשני. זיהוי סמן כזה יאפשר אבחון מוקדם של SCI מבלי לשבש את פרוטוקולי הטיפול המקובלים, ובכך יאפשר פיתוח התערבויות טיפוליות יעילות ובזמן אמת.
RNA ארוך טווח שאינו מקודד (lncRNA) מייצג קטגוריה עיקרית של מולקולות RNA פונקציונליות, שלמרות חוסר פוטנציאל קידוד חלבון, הן חלק בלתי נפרד ממגוון רחב של פונקציות ביולוגיות, כולל ויסות דלקת ואפופטוזיס. LncRNAs פועלים כספוגים מולקולריים למיקרו-RNA (miRNAs), ובכך מונעים ביעילות את הקישור ל-mRNA הממוקד ולהשתיקאותם. לדוגמה, lncRNA MAGI2-AS3 מתווך את miR-223-3p כדי להאיץ את החלמת השבר11. מיקוד ברשת lncRNA OIP5-AS1/miR-128-3p/Nrf2 מציג גישה טיפולית מבטיחה לשיפור ההתאוששות ב-SCI12. CASC11, המאופיין בתמלול של 872 bp הממוקם על כרומוזום 8q24.21, מזוהה כמולקולה עם ביטוי לא מוסדר בסוגי סרטן אנושיים שונים13. CASC11 מציג ביטוי חיובי אצל חולים עם אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר ויש לו את היכולת להבדיל בין אנשים מושפעים מאנשים בריאים לביקורת14. יתרה מזאת, CASC11 מציג דפוס עלייה דומה ופוטנציאל טיפולי דומה אצל מטופלים עם שברים15. בהתבסס על דיווחים אלו, CASC11 עשוי לווסת תגובות דלקתיות ופעילות תאים. למרות תובנות אלו, דפוס הביטוי והתפקיד הביולוגי של CASC11 ב-SCI נותרו בלתי ידועים לחלוטין. בהינתן שהיתר דלקתי ואפופטוזיס הם גורמים מרכזיים ל-SCI משניים, השענו כי CASC11 עשוי להיות סמן ביולוגי מועמד וגורם רגולטורי ב-SCI. מחקר זה חקר את הקשר הקליני והפוטנציאל הביומרקרי של CASC11 ב-SCI על ידי ניתוח קבוצות מטופלים ומודלים של תאים חוץ-גופיים (איור 1). יתרה מזאת, חקרנו מנגנון מולקולרי אפשרי של CASC11, כולל תפקידו הפוטנציאלי בוויסות התגובה הדלקתית לאחר SCI.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הרשמת מקצועות
מטופלים עם טראומה חוט שדרה חריפה (n = 300) שטופלו בבית החולים מינואר 2023 עד מאי 2025 נבחרו וסווגו לקבוצת פגיעת חוט השדרה המלאה (CSCI) (דרגה A, n = 98), קבוצת פציעת חוט השדרה הלא שלמה (ISCI) (דרגות B, C ו-D; n = 95), וקבוצת תפקוד נוירולוגי תקין (NNF) (דרגה E, n = 107) לפי סולם הפגיעה של איגוד פגיעות עמוד השדרה האמריקאי (סיווג AIS). עבור מטופלים בקבוצת NNF, ראיות רדיולוגיות ל-SCI, כגון בצקת, חבלה או דחיסה, אושרו באמצעות הדמיית תהודה מגנטית (MRI), אך לא הוכחו ליקויים חושיים או מוטוריים. עוד 90 משתתפים בריאים שגויסו באותה תקופה נבחרו כקבוצת הביקורת. קריטריוני ההכללה היו: (1) אבחון של SCI שאושרה בהדמיה (MRI או CT), בהתאם להנחיות הניהול הקליני16; (2) טראומה שנגרמה בתוך 24 שעות לפני האשפוז; ו-(3) משתתפים מבוגרים עם נתונים קליניים מלאים. קריטריוני החרגה היו: (1) היסטוריה של ניתוחים קודמים הקשורה לשבר או SCI; (2) מחלת עורקים כליליים חמורה או מחלת לב-ריאה משמעותית; (3) פגיעה חמורה וחריפה בגולגולת; ו-(4) גידולים ממאירים, מחלות לב-כלי דם/כלי דם מוחיים, או מחלות חיסוניות. האישור למחקר זה התקבל מוועדת האתיקה של בית החולים הרביעי של שנזן, והתקבלה הסכמה מדעת מהנבדקים. ההליכים ששימשו במחקר זה עמדו בעקרונות הצהרת הלסינקי.
אוסף דגימות
דגימות דם ורידי (5 מ"ל) נאספו מהמשתתפים בעת הקבלה באמצעות צינורות מפריד סרום בתוך 24 שעות לאחר הפציעה. הדם הורשה להתקרש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ואז צנטריפוגה ב-3,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. סרום הסופרנטנט הופרד בזהירות, הוכנס למיקרופונוריות ללא RNase, ואוחסן בטמפרטורה של -80°C עד לניתוח נוסף.
תרבית תאים והשראת LPS
תאי פיאוכרומוציטומה של עכברים (PC-12) ותאי מיקרוגליה של עכברים (BV-2) גודלו במדיום Eagle המותאם של Dulbecco, שהושלמו עם סרום בקר עוברי 10% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כדי לקבוע מודלים של פגיעות דלקתיות במבחנה , תאי PC-12 ו-BV-2 נחשפו לליפופוליסכרידים (LPS) בריכוזים של 0, 1, 5 ו-10 מיקרוגרם/מ"ל במשך 12 שעותו-17 שעות. כל ריכוז נבדק בשלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים.
RT-qPCR
סך ה-RNA בודד מהדגימות באמצעות פרוטוקול חילוץ פנול-כלורופורם, ואחריו השקיעה עם איזופרופנול. טוהר ה-RNA הוערך באמצעות ספקטרופוטומטריה, ודגימות עם יחס A260/280 ננומטר בטווח 1.8–2.1 שימשו לניתוח במורד הזרם. RNA הועתק הפוך ל-cDNA בהתאם לפרוטוקול ערכת השעתוק ההפוכה, וה-cDNA שהתקבל שימש כתבנית לתגובות RT-qPCR עם פרה-מיקס SYBR Green על מכשיר PCR. גליצראלדהיד 3-פוספט דה-הידרוגנאז (GAPDH) שימש כגן ייחוס ל-mRNA של CASC11 ו-SPP1 , ו-RNA גרעיני קטן (U6) שימש כגן ייחוס ל-miR-130b-5p. לדגימות סרום, סל-מיר-39 סינתטי הוזרק לסרום לפני חילוץ ה-RNA כדי לשלוט בשינויים בהתאוששות ה-RNA. הפריימרים היו כדלקמן: CASC11 קדימה 5'-ACCCTATGGAGAACCGAGAC-3' ואחורי 5'-GAGGACCAACTCAGTAGGAAT-3'; miR-130b-5p קדימה 5'-ATCCATGGTTGAGCTTCCCG-3' ואחורי 5'-TAGTGCAACCTCGTCAGAGC-3'; ו-SPP1 mRNA קדימה 5'-GTTAAACAGGCTGATTGG-3' ואחורי 5'-CATGGTCATCATCTTCA-3'. הביטוי חושב באמצעות שיטת 2-ΔΔCt . כל תגובת RT-qPCR בוצעה בשלושה שכפולים טכניים עם שלושה שכפולים ביולוגיים.
טרנספקציה
השתקת CASC11 (si-CASC11), miR-130b-5p מעתיק/מעכב, פלסמיד ביטוי יתר SPP1 (ov-SPP1) והבדיקות השליליות (NC) הוסנתזו והועברו לתאי PC-12 ו-BV-2 באמצעות תגובת טרנספקציה. יעילות הטרנספקציה הוערכה 48 שעות לאחר הטרנספקציה בשכפולים ביולוגיים משולשים.
בדיקת רבייה ואפופטוזיס
למבחן קיום התאים, תאים זרעו ללוחות של 96 בארות ב-5 ×-10 תאים בכל באר ותרבו במשך 24 שעות כדי לאפשר הצמדה. לאחר דגירה זו, 10 מיקרוליטר של תגובת CCK-8 הוזרקה לכל באר, ואחריה דגירה למשך 2 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הצפיפות האופטית נרשמה לאחר מכן ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט. לצורך זיהוי אפופטוזיס, תאים הופרדו עם טריפסין, נשטפו פעמיים עם תמיסת מלח עם בופר פוספט (PBS), והושעו בבופר קישור לריכוז סופי של 1 ×-106 תאים לבאר. לאחר מכן, 100 מיקרוליטר מהמתלה הונח בצינור ציטומטריה בזרימה של 5 מ"ל, ואחריו נוספו 5 מיקרוליטר Annexin V-FITC ותמיסת צביעה של 5 מיקרוליטר פרופידיום יודיד (PI). הדגימות ערבבו בעדינות ונשמרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מאור. בופר קישור נוסף לנפח נוסף סופי של 400 מיקרוליטר לכל צינור, ותאי אפופטוטיים נמדדו באמצעות ציטומטריית זרימה. כל התנאים נותחו באמצעות שלושה שכפולים טכניים בשלושה ניסויים ביולוגיים עצמאיים.
מבחן פעילות דו-לוסיפראז
היעדים במורד הזרם של CASC11 ו-miR-130b-5p נחזו באמצעות אתרי ביואינפורמטיקה (lncRNASNP2 ו-TargetScan). קטעים המכילים רצפים משלימים מסוג פראי (wt) או מוטנטי (mut) סונתזו ושוכפלו לוקטור דיווח דו-לוסיפראז לבניית פלסמידים wt ו-mut reporter. תאי PC-12 זרעו והועברו יחד עם miR-130b-5p מעתיק/מעכב ופלסמידים שנבנו wt/mut באמצעות תגובת טרנספקציה מבוססת שומן. לאחר 48 שעות, פעילות הלוציפראז נמדדה כדי להעריך את האינטראקציה. כל קבוצה כללה שלושה שכפולים טכניים ושלושה שכפולים ביולוגיים.
בדיקת אימונופרסיפיטציה של RNA (RIP)
ה-RIP בוצע באמצעות ערכת אימונופרציפיטציה לחלבון הקשור ל-RNA. התאים עברו ליזה עם בופר ליזיס ודגרו בנוגדן אנטי-Ago2 או נוגדן IgG תקין. קומפלקסים של חלבוני RNA הועשרו באמצעות חרוזים מגנטיים. לאחר השטיפה, חלבונים קשורים הוסרו, ו-RNA אימונופרציפיטציה בודד. רמות ההעשרה של CASC11 ו-miR-130b-5p נמדדו על ידי RT-qPCR. כל קבוצה כללה שלושה שכפולים טכניים ושלושה שכפולים ביולוגיים.
כתם מערבי
ליזטים של חלבון הוכנו מתאי PC-12 ו-BV-2 באמצעות בופר פירוק תאים, ותכולת החלבון הכוללת נמדדה באמצעות מבחן BCA. לכל דגימה, 30 מיקרוגרם חלבון הוטענו על ג'לים SDS-PAGE של 12% והועברו לממברנות PVDF לאחר הפרדה אלקטרופורטית. הממברנות נחסמו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בחלב דל שומן של 5% מדולל ב-TBST ולאחר מכן דגרו במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים נגד Bcl-2, Bax, קספאז-3 מפורק ו-GAPDH בדילול של 1:1,000. לאחר השטיפה, הממברנות נדגרו בנוגדנים משניים צמודים ל-HRP למשך שעה בטמפרטורת החדר. אותות החלבון נותחו באמצעות תוכנת ניתוח תמונות, וצפיפות הפסים שימשו להערכת הביטוי של חלבונים הקשורים לאפופטוזיס. ניסויי הכתם המערבי כללו שלושה שכפולים ביולוגיים, עם שלושה שכפולים טכניים לכל קבוצה.
אליסה
ריכוזי הציטוקינים הדלקתיים TNF-α, IL-1β ו-IL-6 בסרום המטופל ובסופרנטנטים של תאי PC-12 ו-BV-2 נמדדו באמצעות ערכות ELISA בהתאם להוראות היצרן. דגימות נדגרו בבארות מצופות מראש, ונוספו נוגדני גילוי להמשך דגירות. נוספו ודגרו קונצ'וגטים של אנזימים. לאחר השטיפה, נוספו מצעים להתפתחות הצבע, והתגובות הופסקו. הספיגה נמדדה ב-450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלט והומרה לריכוזי גורם דלקתי בהתאם לעקומה הסטנדרטית שסופקה. כל מבחן ELISA בוצע בשלושה עותקים טכניים על שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים.
ניתוח סטטיסטי
משתנים רציפים דווחו כסטיית תקן ממוצעת ± (SD), ומשתנים קטגוריים הוצגו כמספרים ואחוזים (n, %). השוואות בין שתי קבוצות בוצעו באמצעות מבחן t של סטודנט. בהשוואות שכללו יותר משתי קבוצות, הוחל ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA), ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי. היכולת של CASC11 להבחין בין קבוצות קליניות הוערכה באמצעות ניתוח עקומת ROC. אסוציאציות בין שני משתנים נבדקו באמצעות ניתוח קורלציה של פירסון. בניסויים מבוססי תאים, כל קבוצה הכילה שלושה שכפולים ביולוגיים עצמאיים, וכל מדידה חזרה על עצמה בשלושה שכפולים טכניים. המובהקות הסטטיסטית הוגדרה כ-P < 0.05.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
נתונים בסיסיים של הנבדקים
מאפייני הבסיס של מטופלים בקבוצות ביקורת, NNF, ISCI ו-CSCI מוצגים בטבלה 1. ניתוח סטטיסטי לא גילה הבדלים משמעותיים בין הקבוצות במשתנים, כגון מין, גיל, מדד מסת גוף (BMI), אטיולוגיה של הפציעה וזמן הפציעה (P > 0.05). נצפו הבדלים משמעותיים בין ארבע הקבוצות לאורך השהות, דרגת ASIA, וריכוזי פקטור הנמק של הגידול הציטוקינים הפרו-דלקתיים אלפא (TNF-α), אינטרלוקין-1בטא (IL-1β) ואינטרלוקין-6 (IL-6) (P
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
SCI הוא מצב הרסני של מערכת העצבים המרכזית, שגורם לעיתים קרובות לליקויים משמעותיים בתחושה, בשליטה מוטורית ותפקוד אוטונומי, ובכך מפחית משמעותית את איכות החיים של המטופל ואת התחזית לטווחארוך. מטופלים עשויים להופיע עם ליקוי תפקודי ואובדן חושים לאחר טראומה בעמוד השדרה, וניתן להשתמש בבדיקות דימות (כגון MRI) להערכת הופעת SCI19. הופעת SCI גורמת למפל פגיעות משניים מזיק, המאופיין בדלקת עצבית עזה, בצקת וחדירה לתאים דלקתיים. מפל זה, יחד עם הלחץ של כאב ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
לא רלוונטי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ערכת בדיקת חלבון BCA | Yeasen, סין | P0010 | |
| תמיסת CCK-8 | Sigma-Aldrich, ארה"ב | 96992 | |
| ווקטור דו-לוציפרז מדווח | Promega, ארה"ב | E133A | ווקטור pmirGLO |
| מדיום עגל מעוצב של דולבקו | ATCC, Manassas, VA, ארה"ב | 30-2002 | |
| ערכת ELISA עבור IL-1β | R&D Systems, ארה"ב | DY401 | |
| ערכת ELISA עבור IL-6 | R&D Systems, ארה"ב | HS600B | |
| ערכת ELISA עבור TNF-α | R&D Systems, ארה"ב | DTA00C | |
| סרום בקר עוברי | Gibco, Grand Island, NY, ארה"ב | 10099141 | |
| ציטומטר זרימה | BD FACSCalibur, ארה"ב | FACS101 | |
| תוכנת ניתוח תמונות | NIH, Bethesda, MD, ארה"ב | version 1.44p | תוכנת ImageJ |
| איזופרופנול | מפעל כימיקלים בייג'ינג, סין | 32064 | |
| חומר הדבקה מבוסס שומנים | Invitrogen, Carlsbad, CA, ארה"ב | L3000008 | Lipofectamine 3000 |
| ליפופוליסכריד | Sigma-Aldrich, ארה"ב | L2880 | |
| מאגר פירוק | Beyotime, סין | P0013D | מאגר RIPA |
| קורא מיקרו-לוחות | Reagen, סין | RNE90002 | |
| תאים PC-12 ו-BV-2 | ATCC, Manassas, ארה"ב | ||
| חומר ממיס פנול-כלורופורם | Thermo, ארה"ב | 15596026 | חומר ממיס Trizol |
| ערכת שכפול תעתוק הפוך | Takara, יפן | RR047A | ערכת PrimeScript RT |
| ערכת אימונופרסיפיטציה של חלבון RNA | Millipore, ארה"ב | 17-700 | ערכת Magna RIP |
| מיקרו-צינורות נטולי RNase | Axygen, Corning, NY, ארה"ב | MCT-150-C-S | |
| צינורות מפריד סרום | Terumo, טוקיו, יפן | VP-AS109K60 | |
| תוכנת ניתוח סטטיסטי | סן דייגו, ארה"ב | version 9.0 | GraphPad Prism |
| תערובת SYBR Green | Takara, יפן | RR420A | תערובת SYBR Premix Ex Taq |