מערכת מיקרופלואידית למידול תפקוד לקוי של האנדותל תחת מאמץ גזירה פיזיולוגי פועם והיפרגליקמיה אוסצילטורית

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור והפעלה של מערכת מיקרופלואידית החושפת תאי אנדותל להיפרגליקמיה אוסצילטורית מסונכרנת ולמתח גזירה פועם. גישה זו מספקת מודל פיזיולוגי רלוונטי לחקר תפקוד לקוי של אנדותל סוכרתי. פרוטוקול זה מאפשר מדידה כמותית של לחץ חמצוני ותגובות תאי אנדותל.

Abstract

תפקוד לקוי באנדותל בסיבוכים וסקולריים סוכרתיים כולל אינטראקציות מורכבות בין הפרעות מטבוליות, במיוחד גלוקוז אוסצילטורי (OG) ולחץ גזירה פועם (PSS). למרות שגורמים אלו נחקרו בנפרד, מודלים קונבנציונליים מוגבלים לזרימה למינרית סטטית גבוהה או לזרימה למינרית פשוטה, וחסרים את היכולת לחקות את הקישור המשולב במרחב-זמן שנמצא בכלי דם סוכרתיים. באמצעות פלטפורמת מיקרופלואידיקה מתוכנתת, פרוטוקול זה מספק פלטפורמה חשובה לחקר ההשפעות המשולבות של היפרגליקמיה תנודתית מסונכרנת ו-PSS פיזיולוגי על תאי האנדותל. פרוטוקול זה נועד לדגם תפקוד לקוי של האנדותל בתנאים מטבוליים ומכניים פיזיולוגיים רלוונטיים. השימוש בשבב פולידימתילסילוקסן (PDMS) בשילוב עם מערכת בקרה מונעת לחץ מאפשר מודולציה מדויקת ועצמאית של גלי זרימה ופרופילי ריכוז גלוקוז. הנאמנות ההמודינמית של המערכת מאומתת באמצעות מהירות תמונת מיקרו-חלקיקים (Micro-PIV), בעוד שהתגובה התאית מאופיינת כמותית על ידי ניטור רמות סוגי החמצן התוך-תאי (ROS) וחיוניות התא. תוצאות מייצגות מראות כי PSS פיזיולוגי מפחית ביעילות את הפגיעה החמצונית הנגרמת על ידי OG. אפקט זה מודגם על ידי ירידה ברמות ROS תוך-תאיות ושיפור בחיוניות התאים בתנאי גירוי משולבים. בהתאם לשאלת המחקר, ניתן להתאים פרמטרים כמו דפוסי מאמץ גזירה, תדרי תנודות גלוקוז וגאומטריות ערוצים. שיטה זו משמשת ככלי רב-שימושי למחקרים מכניים של מסלולים מכנוביולוגיים ולסקר תרופות להתערבויות טיפוליות במחלות כלי דם סוכרתיות.

Introduction

תפקוד לקוי של האנדותל הוא אירוע קריטי מוקדם בהתפתחות סיבוכים וסקולריים סוכרתיים, המונעים הן על ידי הפרעות מטבוליות והן על ידי כוחות המודינמיים חריגים ^1,2. רמות ה-OG, ולא היפרגליקמיה ממושכת בלבד, מוכרות יותר ויותר כמגרימות עוצמתיות של לחץ חמצוני ואותות דלקתיים בתאי האנדותל, מה שמוביל לפגיעה וסקולרית ולפגיעה בהומאוסטזיס ^3,4,5. במקביל, לחץ גזירה המודינמי הוא גורם מרכזי לפנוטיפ האנדותליאלי, כאשר PSS בתנאי פעילות פיזיולוגית מקדם ייצור תחמוצת חנקן, הגנה נוגדת חמצון והגנה כלי דם ^6,7,8. לכן, הבנת ההשפעות המשולבות של היפרגליקמיה תנודתית וגירוי המודינמי חיונית להבהרת מנגנוני תפקוד לקוי של האנדותל.

מודלים קונבנציונליים במבחנה, שלעיתים מסתמכים על תנאי גלוקוז גבוהים סטטיים או זרימה למינרית פשוטה, אינם מצליחים לשחזר את האינטראקציה המורכבת והדינמית בין רמזים מטבוליים ומכניים הקיימים ב-vivo ^9,10,11. בעוד שמודלים של בעלי חיים לוכדים היבטים מערכתיים של סוכרת, הם חסרים את הרזולוציה התאיתית הנדרשת לניתוח איתות בתנאים מיקרו-סביבתיים מבוקרים¹². טכנולוגיית מיקרופלואידיק מציעה אלטרנטיבה יעילה, המספקת שליטה מדויקת במרחב-זמן של גירויים ביוכימיים וביומכניים בגאומטריות פיזיולוגיות רלוונטיות¹³, והובילה להתקדמות משמעותית בשנים האחרונות ביישומים ביו-רפואיים חדשניים^{שונים 14,15}. לדוגמה, צ'ן ואח^{' תכננו} מכשיר מיקרופלואידי עם מאמץ גזירה במרחב וזמן בדופן ואיתות ATP לחקר דינמיקת^Ca2+ תאי תוך-תאי של תאי אנדותל. יו ואח^' פיתחו מערכת שבב מיקרופלואידי המודינמי לזיהוי תגובות תאיות תחת שילובים שונים של PSS פיזיולוגי וריכוזי גלוקוז גבוהים. למרות שמערכות אלו שימשו לחקר תגובות אנדותליות למאמץ גזירה או להפרעות מטבוליות חד-גורמיות, מעטות הצליחו לשלב בהצלחה הן תנודות גלוקוז והן PSS בתוך מערכת אחת. לכן, פרוטוקול סטנדרטי וניתן לשחזור שמסנכרן את שני הגורמים בסביבה מיקרופלואידית מבוקרת עדיין חסר.

שיטה זו מתמודדת עם פער זה על ידי הקמת מערכת מיקרופלואידית שניתנת לשחזור המסוגלת לספק OG ו-PSS מקושרים. המטרה העיקרית של גישה זו היא למודל לחץ חמצוני, פגיעה בחיוניות התאים ותגובות מכנוביולוגיות הבסיסיות לתפקוד לקוי של האנדותל באופן פיזיולוגי רלוונטי. בניגוד לתרבות סטטית או לתאי פרפוזיה קונבנציונליים, גישה זו משפרת את המודלים הקיימים בכך שהיא מאפשרת מודולציה סימולטנית ומבוקרת של גירויים מטבוליים ומכניים, תוך קירבה רבה יותר למיקרו-סביבה הווסקולרית של סוכרת. יתרה מזאת, המערכת תואמת להדמיה של תאים חיים, ניטור בזמן אמת וניתוח מולקולרי, מה שהופך אותה למתאימה למגוון רחב של יישומים כולל מחקרים מכניים, מידול מחלות וסריקת תרופות לתפקוד ופציעות של האנדותל.

Protocol

הצהרת אתיקה:

הערה: כל המגבים, המכשירים והתוכנה המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים.

1. ייצור שבבים מיקרופלואידיים

1. השתמש בתוכנת עיצוב בעזרת מחשב (CAD) לעיצוב מבנה שבב המיקרופלואיד (רוחב x אורך x H = 2 מ"מ x 30 מ"מ x 0.1 מ"מ, איור 1A) וייצור את תבנית המאסטר SU-8 דרך חברה מסחרית.
2. ערבבו את סוכן הייבוש של PDMS ופולימר מוקדם ביחס של 10:1 לפי משקל בכוס ערבוב נקייה וערבבו ידנית בעוצמה במשך 5 דקות.
3. הניחו את המיכל בתא ואקום מתחת ל-0.08 מגה-פסקל למשך מינימום של 15 דקות כדי להסיר בועות אוויר שנלכדו במהלך תהליך הערבוב.
   הערה: כדי לזרז את הסרת הבועות ולמנוע הצפה, אוורור זמנית את התא ללחץ אטמוספרי כדי לפוצץ את הבועות הגדולות, ואז מיד הפעילו מחדש את הוואקום. חזור על מחזור האוורור הזה 2–3 פעמים עד שהתערובת הפכה לשקופה לחלוטין ונקייה מבועות מקרוסקופיות.
4. שפוך את ה-PDMS על הוופר שמונח בצלחת פטרי מזכוכית.
5. לאחר דה-גזים, ה-PDMS שפכו על הוופר במייבש למשך 15 דקות נוספות כדי להסיר בועות שעשויות להיווצר במהלך היציקה.
   הערה: אם מיקרו-בועות עקשניות נשארות לכודות ליד או בתוך מבני התבנית הראשית של SU-8, נשפו אותן בעדינות עד הקצה או פיצצו אותן באמצעות מפוח אוויר גומי ידני. הסרה מלאה של בועות אוויר היא קריטית למניעת פגמים מבניים בתעלות המיקרו.
6. הכניסו את צלחת הפטרי המכילה עובש ופולימר בתנור חם בטמפרטורה של 80°C למשך שעתיים.
   זהירות: השתמש בכפפות עמידות לחום בעת טיפול בחומרים חמים
7. קלף בזהירות את לוח הפולימר המוצק מהתבנית הראשית באמצעות סכין מנתח.
8. השתמש בכלי ניקוב ליבה (למשל, קוטר 1.2 מ"מ) ליצירת פתחי כניסה ויציאה בקצות התעלה המיועדים על לוח הפולימר.
9. נקה את כיסוי הזכוכית ואת הפנים המעוטרות של לוח הפולימר עם דבק דבק.
   נקודת הפסקה: לוחות ה-PDMS המקובשים והמנוקבים יכולים להיאחסן במיכל נקי (למשל, צלחת פטרי אטומה) בטמפרטורת החדר למשך מספר שבועות לפני טיפול פלזמה והדבקה.
10. טפל גם בלוח הפולימר וגם בכיסוי הזכוכית עם מנקה פלזמה בעוצמה של 65W מתחת לאוויר בחדר למשך 60 שניות.
11. יישר מיד את פני ערוץ הפולימר לצד המטופל של כיסוי הזכוכית.
12. לחץ בעדינות ליצירת תעלה מיקרופלואידית סגורה וקבועה.

2. הכנת תאי אנדותל וזריעה

1. הניחו את השבב המיקרופלואידי המחובר בבקבוק זכוכית בורוני מלא במים דה-יוניים ועקר על ידי אוטוקלב בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס ו-15 psi למשך 20 דקות.
   הערה: טבלו את השבב במים במהלך האוטוקלאב כדי לאזן את הלחץ ולמנוע עיוות של מיקרו-תעלות PDMS. זה גם מסייע בהסרת בועות אוויר כלואות ומכין את התעלות להכנסת נוזלים לאחר מכן.
   נקודת הפסקה: שבבי מיקרופלואיד מעוקרים יכולים להיאחסן בבטחה בבקבוק הזכוכית האטום בטמפרטורת החדר למשך מספר שבועות עד שנדרשו לזרעת תאים.
2. הניחו את השבב המעוקר בצלחת תרבית בקוטר 60 מ"מ מלאה בתערובת 1:1 של מלח בופר פוספט (PBS) ו-Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) של סוכר נמוך.
3. הכנס 100 מיקרוג·מ"^ל-1 פיברונקטין לתעלה באמצעות מזרק של 1 מ"ל ודוגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
   הערה: ודא שהשבב המיקרופלואידי ממוקם מתחת לרמת הנוזל. חבר את צינור המתאם למחט המזרק, מלא את הצינור בנוזל והכניס אותו מתחת לרמת הנוזל, חבר את הכניסה ואז מזריק כדי לוודא שלא ייכנסו בועות.
4. הוסף 24.5 מ"מ D-מניטול ל-DMEM נמוך גלוקוז (5.5mM גלוקוז) כדי להעלות את הלחץ האוסמוטי. הוסף 5 מ"מ גלוקוז D-ל-DMEM גבוה (25mM גלוקוז) ל-30 מ"מ גלוקוז סופי. יש להוסיף תרבית תרבית גלוקוז רגילה (NG) במידה בינונית ותרבית גבוהה (HG) עם תוספת של 20% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S), בהתאמה.
5. חמים 1× PBS, טריפסין, NG ו-HG באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. קצור את תאי האנדותל של וריד הטבור האנושי (HUVECs) מהצלחת התרבית בנקודת חיבור של 90%. נתק את התאים באמצעות תמיסת טריפסין-EDTA של 0.25% ודוגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. ספרו את התאים שנקטפו והתאימו את הריכוז ל-1 x 10⁶ תאים/מ"ל במדיום NG ובמדיום HG, בהתאמה.
6. הזרקת 100 מיקרוליטר מתליית התא ליציאת הכניסה של שבב מיקרופלואידי באמצעות מזרק בנפח 1 מ"ל, תוך שימוש במדיום NG לקבוצת הביקורת ובתווך HG לקבוצת הניסוי. הניחו שבבי מיקרופלואיד באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 48 שעות.
   הערה: אפשר לתאים להיצמד לפחות 4 שעות לפני המשך העיבוד. החליפו ידנית את שני מדיום התרביות כל שעתיים כדי לעורר היפרגליקמיה תנודתית במהלך שלב התרבית הסטטית. שמור על התאים על 5.5 מ"מ גלוקוז במהלך הלילה כדי לחקות את מצב ה-in vivo (איור 1B).

3. הגדרת גירוי דינמי

1. למלא שני מאגרים של 100 מ"ל במדיות תרביות NG ו-HG, בהתאמה, ולחבר אותם לערוצים המתאימים של מערכת בקרת הלחץ המתוכנתת.
2. חבר את המאגרים, את השסתום המגנטי התלת-כיווני הדו-מצב, ואת השבב המיקרופלואידי באמצעות צינורות סיליקון.
3. השתמש במחברים מנירוסטה בקוטר 1.3 מ"מ בזווית של 90° כדי לחבר את פתחי הכניסה והיציאה של שבב ה-PDMS לצינור.
   הערה: חטא את מאגרי ה-100 מ"ל, צינורות הסיליקון ומחברי הפלדה הנירוסטה באוטוקלאב בלחץ גבוה ובטמפרטורה גבוהה מראש.
4. חשב את קצב הזרימה (Q) הנדרש להשגת ה-PSS היעד (τ). השתמש בנוסחה τ = (6μQ)/(wh²), כאשר μ הצמיגות, w הוא רוחב הערוץ, ו-h הוא גובה התעלה.
5. קבע PSS פיזיולוגי יעד (τ = 10 ± 2 דין·ס"^מ-2, 1 הרץ), המתאים לקצב זרימה מחושב של 200 ± 40 מיקרוליטר^·דקה-1.
6. תכנת את משאבת האוויר הניתנת לתכנות ליצירת פונקציית גל סינוס לשמירה על ה-PSS. תכנת את בקר השסתום להחליף ערוצים כל 5 דקות כדי ליצור תנודת גלוקוז בגל ריבועי במהלך הגירוי הדינמי.
7. הפעל את מערכת המשאבה המתוכנתת כדי לספק את ה-OG וה-PSS המשולבים למשך סך של 30 דקות.

4. Micro-PIV לאימות שדה זרימה

1. הכינו את מדיום ה-NG וה-HG המכילים ריכוז נפח של 0.05% של מיקרוחלקיקים פלואורסצנטיים (1 מיקרומטר). ודא שהחלקיקים מפוזרים באופן שווה וללא הצטברות.
2. הניחו שבב מיקרופלואידי נקי וללא תאים (זהה לזה ששימש בניסויי התא) על הבמה של מיקרוסקופ הפלואורסצנציה הפוך.
3. חבר את כל הרכיבים במערכת (איור 1C).
   1. חבר את מקור הלחץ לבקר הלחץ.
   2. חבר את בקר הלחץ לבקר השסתומים, שמחובר למחשב לשליטה אוטומטית בגלי הלחץ.
   3. חבר את יציאות בקר הלחץ למאגרי HG ו-NG דרך קווי צינורות נפרדים.
   4. חבר את שני המאגרים לשסתום לחץ 3/2, שמחליף בין מדיום HG ל-NG בהתאם לפרוטוקול הגלוקוז האוסצילטורי המתוכנת.
   5. חבר את יציאת שסתום הלחץ של 3/2 לכניסה של שבב המיקרופלואיד דרך צינור.
   6. חבר את יציאת השבב המיקרופלואידי למאגר הפסולת.
   7. הנח את שבב המיקרופלואיד על שלב המיקרוסקופ להדמיה של תאים חיים לאורך כל הניסוי.
      הערה: ודאו שכל חיבורי הצינורות בטוחים וללא נזילות לפני תחילת הזרימה.
4. הפעל את המצלמה המהירה (הפועלת ב-15 הרץ במצב כפול פריים) לאחר שהזרימה יציבה כדי ללכוד זוגות תמונה רציפים של המיקרוחלקיקים הזורמים. הגדר את ההשהיה המדויקת בזמן (Δt) בין שתי המסגרות של כל זוג ל-80 מיקרו-שניות.
5. צלם תמונות עבור אזור עניין (ROI) בתוך הערוץ. בחר את התשואה במרכז מקטע התעלה הישר (איור 2A), במרחק שווה הן מהכניסה והן ליציאה, כדי להימנע מהשפעות קצה ולהבטיח מדידות זרימה מייצגות.
6. עבד את זוגות התמונות שנרכשו באמצעות תוכנת ניתוח PIV. השתמשו באלגוריתם מתאם צולב רב-מעברים אדפטיבי, שמתחיל בשטח חקירה התחלתי של 64 × 64 פיקסלים ומשפר לשטח סופי של 16 × 16 פיקסלים עם גודל צעד רשת של 8 × 8 פיקסלים, כדי לקבוע את וקטור ההעתקה (Δx) של החלקיקים בין שני המסגרות.
7. חשב את וקטור המהירות (v) לכל אזור חקירה באמצעות הנוסחה v = Δx / Δt.

5. רכישת נתונים

הערה: כמת את החיוניות והתפקוד של התאים באמצעות ערכת PI של Calcein-AM/Propidium Yodide (PI) וגלאי פלואורסצנטי של מתח חמצוני חי כדי לאמת את הנזק הנגרם מתנודות הגלוקוז ולהעריך את השפעת הגירוי המשותף (co-situlation).

1. כחיות תאים
   1. הכינו את פתרון העבודה Calcein-AM/PI לפי הוראות היצרן בנקודת הניסוי.
      אזהרה: PI הוא מוטגן ידוע וכחשוד כמסרטן שמשתלב ב-DNA. לטפל בזהירות רבה. לבש כפפות וידית בתוך סביבת עבודה בטוחה ייעודית.
   2. שטוף את הערוץ פעם אחת עם PBS והכנס את פתרון Calcein-AM/PI לתעלה. דגרו את המכשיר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2 למשך 30 דקות בחושך.
   3. לצלם מיד תמונות פלואורסצנטיות של התאים המוכתמים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך המצויד בעדשת אובייקטיב 10×. השתמש במסנן FITC (ירוק) ל-Calcein-AM ובפילטר TRITC או Rhodamine (אדום) ל-PI.
2. מדידת ROS תוך-תאי
   1. הכינו את תמיסת הפעולה של גלאי פלואורסצנטי למתח חמצוני של תאים חיים (ראו טבלת חומרים) בריכוז שנקבע על ידי היצרן (5 מיקרומון) ב-PBS.
      אזהרה: גלאי פלואורסצנטיים וממסים נפוצים (כגון DMSO) עלולים להיות רעילים ועלולים להקל על ספיגת חומרים מסוכנים דרך העור. לבש כפפות וידית בתוך סביבת עבודה בטוחה ייעודית.
   2. שוטף את התעלה שלוש פעמים עם PBS והכנס את תמיסת הגשוש הפלואורסצנטי של מתח חמצוני חי לתעלה. דגרו את השבב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 30 דקות בחושך.
   3. שטוף את הערוץ שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את הגשש הלא קשור. לצלם מיד תמונות פלואורסצנטיות באמצעות מסנן Far-Red (עירור 640 ננומטר, פליטה 665 ננומטר) דרך עדשת אובייקטיב 20×, תוך שמירה על אותם פרמטרי חשיפה לכל הקבוצות.
      הערה: עוצמת פלואורסצנציה מוגברת מצביעה על רמות ROS גבוהות יותר.

6. ניתוח נתונים

נקודת עצירה: לאחר שכל התמונות הפלואורסצנטיות הגולמיות ותמונות המצלמה המהירות-גבוהה נאספות ונשמרות בבטחה בכונן קשיח, ניתן להשהות את עיבוד התמונה, הניתוח הכמותי וההשוואות הסטטיסטיות שלאחר מכן.

1. כמת את כדאיות התאים
   1. פתח את תמונות Calcein-AM (ירוק) ו-PI (אדום) שנרכשו ב-ImageJ (ראו טבלת חומרים). כוונן ידנית את הסף לכל ערוץ כדי להבחין בין אותות פלואורסצנטיים לרקע. השתמש בפונקציית מונה התאים כדי לספור תאים פלואורסצנטיים, תוך התאמת גודל התא המינימלי בהתאם לגודל התא הנצפה, ולספור את מספר התאים החיים (N_חיים) ומתים (N_מתים) בשדות ראייה שונים.
      הערה: N_Live מתייחס למספר התאים הירוקים (החיוביים של Calcein-AM), N_Dead מתייחס למספר התאים החיוביים PI (אדומים).
   2. חשב את אחוז התאים החיים (N_Live / (N_Live + N_מת) x 100%) עבור כל מצב ניסויי באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני. חשב את הממוצע והסטיית התקן בין מספר תחומי ראייה באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי להשוואה בין קבוצות.
2. כמת ROS תוך-תאי
   1. גרור את תמונת הבחירה ב-ImageJ. קבעו את הסקאלה על ידי כיול גודל הפיקסל באמצעות מטא-דאטה של המיקרוסקופ (או רשת ייחוס ידועה): ניתוח | קבע קנה מידה.
   2. הסר אות רקע אחיד לא ספציפי מכל התמונה באמצעות פונקציית החיסור ברקע: תהליך | החסר רקע.
   3. כוון ידנית את סרגל הסף לסגמנט והגדר את אות ה-ROS התוך-תאי: תמונה | כוון | סף. לאחר שהסף נקבע, השתמש בניתוח | הגדר מדידות לבחור שטח וערך אפור ממוצע. קבע את גודל התא המינימלי בהתאם לגודל התא הנצפה ומדד את עוצמת האות הממוצעת במקטע בתוך ROI חד-שכבתי של התא: ניתוח | נתח חלקיקים.
   4. דווח על רמת ה-ROS עבור כל תנאי ניסוי כממוצעים של הערכים הנמדדים (למשל, עוצמה ממוצעת) שמקורם לפחות בשלושה שדות ראייה שנבחרו באקראי לכל שבב.
3. ביצוע השוואות סטטיסטיות
   1. הזן את התוצאות הכמותיות (אחוז כדאיות ועוצמת ממוצעת ROS) לתוכנות ניתוח נתונים וגרפים (ראו טבלת חומרים).
   2. קבעו את המשמעות הסטטיסטית על ידי השוואת קבוצות הניסוי לקבוצת הביקורת באמצעות ניתוח שונות דו-כיווני (ANOVA) ואחריו מבחן פוסט-הוק של טוקי, עם רמת מובהקות של p = 0.05. השתמש בתוכנה לביצוע הניתוח וליצור גרפים עם פסי שגיאה המייצגים סטיית תקן (SD).

Results

אימות מיקרו-PIV של שדה זרימה בתוך תעלת המיקרופלואיד
איור 1D מספק סקירה של הפלטפורמה המיקרופלואידית המשמשת לחקר תגובות אנדותליות לגירוי מטבולי ומכני מקושר. המערכת משלבת שבב מיקרופלואידי PDMS בעל ערוץ ישר עם מודול בקרת זרימה מונע לחץ, המאפשר יישום תנאי OG יחד עם PSS פיזיולוגי. אסטרטגיית החלפת שסתומים מתוכנתת שימשה ליצירת חילופי שסתומים תקופתיים בין מדיה NG ל-HG, בעוד שגלי זרימה פועמים סונכרו באמצעות ויסות לחץ מבוקרת מחשב.

Discussion

המערכת המיקרופלואידית המתוארת כאן מספקת פלטפורמה חזקה ורלוונטית פיזיולוגית לחקר ההשפעות המשולבות של OG ו-PSS על תפקוד תאי האנדותל. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא יכולתה לשלוט ולהפריד במדויק גירויים מכניים וביוכימיים בתוך מיקרוסביבה מוגדרת. בניגוד לתרביות סטטיות קונבנציונליות שחסרות כוחות המודינמיים או למודלים בעלי חיים שלעיתים מסתירים את איתות רמת התא 4,17,18,19, פרוטוקול זה מאפשר מודולציה עצמאית של דפוסי זרימה ופרופילי ריכוז גלוקו...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211052	Cell dissociation
1 mL syringe	Shanghai Zhengbang Medical Science Co., Ltd.	1mL	Inject fluid
60 mm culture dish	NEST Biotechnology Co., Ltd.	705001	Cell culture
90° angled stainless-steel connector	Luoyang Mayer Trading Co.,Ltd.	1.3 mm	Adapter sealing device
AutoCAD software	Autodesk	RRID:SCR_014981	Computer-aided design software
Boronized glass bottle	Hunan Aidete Scientific Instruments Co., Ltd.	Double-pass 100mL	reservoir
Calcein-AM/PI Kit	Beyotime	byt-c2015	Staining
Cell incubator	ESCO	Esco CelMate	Cell culture
CellROX Deep Red	Invitrogen	C10422	Staining
D-glucose	Sigma Aldrich	47249	Glucose
D-mannitol	Macklin	M813423	Balance osmotic pressure
DynamicStudio	Dantec Dynamics	V8.6	PIV analysis software
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	14190-094	Medium
Fibronectin	Sigma Aldrich	F-2006	Cell adhesion
Fluorescent microparticles	Thermo Scientific	G0100	Micro-PIV
Glass coverslip	Citotest Scientific Co.,Ltd.	#1	Microfluidic chip
High glucose DMEM	Solarbio	12100	Medium
High-speed camera	Dantec Dynamics	FlowSense EO	Micro-PIV
ImageJ	NIH	RRID:SCR_003070	Image processing software
Inverted fluorescence microscope	Olympus	IX73	Cell viability
Inverted fluorescence microscope	Olympus	IX83	Observation and acquisition
Low glucose DMEM	Solarbio	31600	Medium
Origin	OriginLab	RRID:SCR_014212	Data analysis and graphing software
PDMS	Dow lnc.	184	Microfluidic chip
Penicillin/streptomycin (P/S)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211092	Medium
Phosphate buffer saline (PBS)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211031	Cell culture
Plasma cleaner	Jiarun Wanfeng Technology Co., Ltd.	PC-6D	Microfluidic chip
Programmable pressure control system	Elvesys	OB1 MK4	Flow control
Silicone tube	Nanjing Runze Fluid Control Equipment Co., Ltd.	96410	1mm*3mm
SU-8 master mold	Boao Biology Group Co. Ltd.	N/A	Microfluidic chip
Valve controller	Elvesys	MUX Wire V3	Flow control