מאמר שיטה

פלטפורמה מיקרופלואידית לחקר משקעים מיקרוביאליים של תחמוצות מתכת במדיה נקבובית

243 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71047

⸱

12 ביוני 2026

 ,  ,  , 
1Department of Civil and Environmental Engineering, University of California, Davis, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis, 3Energy Geosciences Division, Earth and Environmental Sciences Area, Lawrence Berkeley National Laboratory

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג מערכת מיקרופלואידית לחקר השקיעה המיקרוביאלית של מינרלי תחמוצת מנגן. היווצרות ביומינרלים נמדדת במקום באמצעות מיקרוסקופיה אופטית וניתוח תמונות. גישה זו ניתנת להתאמה לחקר השקיעות של מינרלים ביוגניים צבעוניים אחרים בסביבות נקבוביות.

תקציר

מיקרואורגניזמים בדרך כלל משקעים ננו-חלקיקי תחמוצת מתכת בקרקעות, משקעים ומדיה נקבובית רלוונטית לסביבה. עם זאת, היווצרות ותגובתיות תחמוצות מנגן (Mn) וברזל (Fe) נותרות מאופיינות בצורה לקויה בסביבות פיזיקליות מורכבות. בעוד שמערכות מעבדה יכולות לשלב מדיה נקבובית כמצע, הן דורשות דגימה הרסנית ואינן ניתנות לניתוח בקנה מידה נקבובי. לכן, האופי הדינמי אך הבלתי נגיש של מדיום נקבובי דורש יכולת לפענח משקעים מינרליים מתווכים מיקרוביאליים במקום ובזמן אמת. כדי לסגור פער זה, פותחה פלטפורמה מיקרופלואידית להערכת משקעים מיקרוביאליים של תחמוצות מתכת במרחב נקבוביות במודל. פלטפורמה זו מאומתת עם החיידק Pseudomonas putida GB-1 המחמצן Mn. התפתחות ביופילם ומשקעי תחמוצת Mn נלווים תחת זרימה רציפה באמצעות מיקרוסקופיית צבע בהיר בזמן-לפס. אלגוריתם חיסור תמונה משולב לאחר מכן עם מדידות מסה בנקודת קצה כדי להעריך את קצב השקיעת תחמוצת ה-Mn. גישה זו מספקת כלי לבדיקה שיטתית כיצד המשקעים המיקרוביאליים של תחמוצות מתכת משתנים בתגובה לתנאים פיזיים וכימיים משתנים.

מבוא

מינרלי תחמוצת מתכת ממלאים תפקיד קריטי במחזור הביוגאוכימי1. תחמוצות מנגן (Mn) וברזל (Fe) טעונות שלילית ב-pH ניטרלי סביב וסופגות בקלות מתכות קטיוניות 2,3,4,5,6,7,8, ומווסתות זמינות מיקרונוטריינטים וניידות מזהמים בריזוספירה ובאזור ההיפוראי. מינרלים אלו משפיעים על היציבות וההתדרדרות של חומר אורגני 9,10,11,12, וקובעים את קליטת הפחמן על ידי צמחים ומיקרובים בקרקע. במערכות מהונדסות (למשל, מסנני טיהור מים, ביצות בנויות), משקעי תחמוצת מתכת מנוצלים ישירות להסרת Mn או Fe ולשיקוי מזהמים מתרחשים במקביל 13,14,15,16,17. תחמוצות המתכת הללו מזוהות לפי צבעיהן האופייניים, הנעים מאוכרה ועד חום כהה ושחור18,19.

השקיעה של תחמוצות מתכת מתאפשרת בדרך כלל על ידי מיקרואורגניזמים בתהליך הידוע כביומינרליזציה 20,21,22. חיידקים ופטריות מחמצנים רבים של Mn מסנתזים אוקסידאזות ומולטי-קופ ופרוקסידאזות שמזרזות העברת אלקטרונים מ-Mn(II) ל-Mn(III) ו-Mn(IV) בתנאים אירוביים, וכתוצאה מכך משקעים של מינרלים תחמוצת דמויי בירנסיט Mn(III, IV) 2,23,24. בנוסף, חיידקים מחמצנים ברזל שונים מחמצנים אנזימטית Fe(II) ל-Fe(III) בסביבות סביבתיות ניטרליות או חומציות מוגבלות בחמצן, ומייצרים תחמוצות Fe(II, III) (אוקסיהידר)אוקסידות, כולל פריהידריט ומגנטיט 25,26,27,28. מינרלים ביוגניים אלו משקעים בסמוך למשטחי תאים ומצטברים על פולימרים חוץ-תאיים, מעטפות ומבנים תאיים נוספים, ויוצרים הרכבות מיכא-מינרלים 2,23,25,27,29,30.

למרות הנוכחות הנפוצה של ביומינרליזציה של Mn וFe בסביבות מורכבות, חסרות תובנות בקנה מידה נקבובית. מרחבי הנקבוביות הם הטרוגניים מבחינה מבנית, מציגים זרימת נוזלים מועדפת והעברה לא אחידה של מגיבים שמכתיבים את התפלגות התגובות הביוגאוכימיות 31,32,33,34,35. יתרה מזאת, פעילות מיקרוביאלית עשויה ליצור גרדיאנטים גיאוכימיים מקומיים המעודדים או מגבילים את הביומינרליזציה, בעוד שתנודות בכימיה של נוזלי הנקבוביות (למשל, pH, חמצן מומס, פוטנציאל רדוקס) עשויות להגביר את משקעי המינרלים או להקל על המסה34,35. מחקרים על ביומינרליזציה של Mn וFe מסתמכים בדרך כלל על תנאי אצווה מעורבים היטב 30,36,37,38,39,40 או עמודות 41,42,43,44 כדי לכמת את קינטיקת החמצון או לאפיין משקעים ביומינרליים. עם זאת, ניסויים אצווה חסרים את ההטרוגניות המרחבית הטבועה במערכות נקבוביות. עמודות המכילות מדיה גרנולרית דחוסה מספקות ארכיטקטורה פיזיקלית רלוונטית אך מוגבלות בשימושן מכיוון שהן דורשות דגימה הרסנית בנקודות זמן סטטיות, מה שעוצר את התקדמות הניסוי ומונע תצפיות בקנה מידה נקבוביות לא מופרע. לכן, נדרשות גישות ניסוייות חדשות לחקירת השקיעה המיקרוביאלית של תחמוצות מתכת במדיה נקבובית.

מערכות מיקרופלואידיות הן כלי לחקר תגובות ביוגיאוכימיות במקום ובזמן אמת. כורים מיקרופלואידיים יכולים להיות מייצרים במהירות ובעלות נמוכה עם גיאומטריות ניתנות לשחזור והתאמה אישית, המדמותמדיה נקבובית טבעית או אידיאלית. המכשירים המתקבלים שקופים אופטית, ומאפשרים הדמיה וכימות לא הרסניים של תהליכים בקנה מידה נקבוביים, כולל יצירת ביופילם 46,47,48,49, התפתחות נקודות חמות 50,51, משקעים של מתכות אביוטיות52,53, וביומינרליזציה של קלציט 34,54,55,56. בנוסף, מערכות מיקרופלואידיות מאפשרות למשתמשים לשלוט ולשנות באופן שיטתי את תנאי הגבול, כולל ריכוז מתכות, נוכחות או היעדר חמצן מומס, וקצב זרימת נוזלים. לבסוף, בהתאם לחומר המצע של הכור, ניתן לבצע מדידות ישירות של אינטראקציות מיקרוב-מינרל-נוזל באמצעות ספקטרוסקופיית רנטגן, רמאן או אינפרא-אדום57. פיתוח פלטפורמה מבוססת מיקרופלואידיקה כזו לחקר השקיעת מיקרוביאלים של תחמוצות מתכת מספק אפוא דרך למחקר חדשני על היווצרות ותגובתיות של שלבי מינרלים של Mn או Fe שמניעים מחזור פחמן, חומרים מזינים ומזהמים בסביבות נקבוביות.

עבודה זו משתמשת בביומינרליזציה של Mn כמחקר מקרה לכימות השקיעה המיקרוביאלית של תחמוצות מתכת בסביבה דינמית ונקבובית. הפרוטוקול הבא מדגים כיצד לייצר ולחסן כור מיקרופלואידי ב-Pseudomonas putida GB-1, חיידק מודל הידוע במחמצן Mn(II) ל-Mn(III, IV) בשלב הצמיחה הסטטישלו 58,59. באמצעות מערכת בקרת זרימה מבוססת לחץ, מדיום גדילה עשיר בחומרים מזינים ותמיסת מלח מינימלית מוזרקים ברצף כדי לקדם יצירת ביופילם ולעודד משקעים של תחמוצת מגניון, בהתאמה. תמונות צבע בהירות ברזולוציה גבוהה של מרחב הנקבוביות המיקרופלואידי נאספות במרווחי זמן קבועים, ולוכדות את ניגוד הצבע בין ביופילמים של P. putida GB-1 לבין תחמוצות Mn מצטברות. בסיום כל ניסוי, כל תחמוצות ה-Mn הכלולות בכור מתעכלות, והמסה הכוללת נמדדת באמצעות ספקטרומטריית מסה פלזמה מקושרת אינדוקטיבית (ICP-MS). קצב המשקעים של Mn אוקסיד מוערך כפונקציה של הזמן על ידי שילוב מדידות מסה בקצה עם אלגוריתם חיסור תמונה. תהליך עבודה זה יכול להיות מותאם בקלות לחקר אורגניזמים אחרים או תהליכי שקיעת תחמוצת מתכת בתנאים סביבתיים מגוונים.

פרוטוקול

הערה: פרוטוקול זה עושה מספר הנחות לגבי הידע הרקע של המשתמשים והכלים הזמינים שלהם. ראשית, המשתמשים צריכים להיות בעלי גישה לחדר נקי ולהכיר את נהלי הפוטוליתוגרפיה לייצור תבנית מיקרופלואידית או לרכוש תבנית מסחרית. לאחר מכן, המשתמשים צריכים להכיר שיטות מיקרוביולוגיות בסיסיות, כגון שימוש בטכניקה אספטית, הכנת תמיסות מקוריות וצלחות פסים. המשתמשים זקוקים גם לגישה לאוטוקלאב, מיקרוצנטריפוגה, אינקובטור רעידות וספקטרומטר מסה. לבסוף, המשתמשים צריכים להיות מיומנים במיקרוסקופיה אופטית ובניתוח תמונות.

1. ייצור והרכבה של כור מיקרופלואידי

הערה: הכורים המיקרופלואידיים המשמשים בפרוטוקול זה תוכננו ב-AutoCAD עם גאומטריית גרעיני חול שהותאמה מוונג ואחרים. כל תבנית מייצרת שישה תעלות שכפול עם מרווח נקבוביות של 15 מ"מ × 10 מ"מ, נקבוביות של 0.41 ונפח נקבוביות של 2.3 מיקרוליטר. למעט טיפול בפלזמה, הכורים מיוצרים בארון זרימה למינרי לשמירה על סביבה דלת אבק.

  1. יציקו את תעלות המיקרופלואיד בפולידימתילסילוקסן (PDMS) באמצעות ליתוגרפיה רכה.
    1. בכוס פלסטיק, יש לשקול את בסיס האלסטומר ואת חומר ההתקשות ביחס של 10:1 (כאן, 25 גרם ו-2.5 גרם, בהתאמה).
    2. בעזרת סכין פלסטיק, ערבבו היטב את בסיס האלסטומר ואת חומר ההייבוש במשך 10 דקות.
    3. הסר גזים מה-PDMS בכוס באמצעות מייבש ואקום למשך שעה אחת כדי להסיר בועות אוויר.
    4. שפוך את ה-PDMS לתוך התבנית ופתח גזים למשך 30 דקות כדי להסיר שאריות אוויר.
    5. מניחים את התבנית על פלטה חמה והתקשו במשך 3 שעות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס.
    6. לאחר התייבשות והתקררות, השתמשו בסקלפל כדי לחתוך את ה-PDMS ולקלף אותו מהתבנית.
    7. על מחצלת חיתוך, חתכו את ששת התעלות המיקרופלואידיות עם להב גילוח, והשאירו 2–3 מ"מ סביב קצה כל ערוץ. נקבעו חורי כניסה ויציאה בכל תעלה עם מחורר ביופסיה.
    8. כסו את שני צידי כל תעלה מיקרופלואידית ברצועת סרט שקוף כדי למנוע הצטברות אבק ואחסנו בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ.
  2. יום אחד לפני הניסוי, הרכיבו את הכור המיקרופלואידי הסופי עם פלזמת אוויר.
    1. הסר את הסרט השקוף מתעלה מיקרופלואידית אחת, ואז שטוף את ה-PDMS וכיסוי זכוכית עם 70% אתנול וייבש עם חנקן דחוס.
      אזהרה: אתנול דליק. לטפל ולאחסן בהתאם לגיליון הבטיחות.
    2. הניחו את תעלת המיקרופלואיד והכיסוי הפוך למעלה במנקה פלזמה. פנה את התא למשך דקה אחת, ואז מרח פלזמה לדקה אחת (18 W ו-~0.5 טור).
    3. הסר את ערוץ המיקרופלואיד ואת הכיסוי ממנקה הפלזמה והנח את המכסה על ה-PDMS, תוך נקישה עדינה כדי להבטיח הדבקה. אחסן את הכור המורכב בצלחת פטרי 100 מ"מ ללילה.

2. מערכת בקרת זרימה מיקרופלואידית

הערה: מערכת מודולרית של Elveflow משמשת להקל על הזרקת נוזלים סדרתית עם הפרעות מינימליות ללחץ ולקצב הזרימה. רכיבי המערכת כוללים מדחס אוויר, בקר זרימה, שסתום הפצה, חיישן זרימה, מתקן מאגר נוזלים (לצינורות קוניים של 15 מ"ל), ותוכנת Elveflow Smart Interface (ESI) (איור 1). מערכות בקרת זרימה נוספות, כגון משאבות מזרק, יכולות לשמש הן במצבי אינפוזייה או במצב משיכה, עם מזרקים או מאגרים ייעודיים לכל תמיסה משפיעה ושסתום מפצל בנפח מת נמוך כדי להקל על הזרקת נוזל רציפה דרך קו צינור יחיד. עם זאת, יש לנקוט זהירות עם משאבות מזרק כדי למזער תנודות לחץ שעלולות להזיז ביופילמים.

figure-protocol-1
איור 1: מערכת בקרת זרימה וגאומטריית כור מיקרופלואידי. המערכת הניסיונית כוללת בקר זרימה: (1) שמחובר באמצעות צינור פנאומטי, (2) למדף מיכל נוזלים, (3), שסתום הפצה למתן הזרקה רציפה של מדיום גדילה (GMMn) ותמיסת מלח (SSMn), (4), חיישן זרימה (5) המחובר לבקר הזרימה כדי לספק משוב בזמן אמת והתאמת זרימה, (6), צינור PEEK בקוטר פנימי קטן ליצירת התנגדות נוזלית, (7), מלכודת בועות (8) במעלה הזרם של הכור המיקרופלואידי (9). סכמת מערכת לא בקנה מידה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

  1. הגדר וכייל את כל החומרה לפי הוראות היצרן.
    הערה: מתקן מאגר הנוזלים, שסתום ההפצה וחיישן הזרימה מותקנים בתוך אינקובטור מיקרוסקופ מותאם אישית כדי לשמור על הניסוי ב-30 מעלות צלזיוס.
  2. כוון את רגולטור הלחץ של מדחס האוויר ל-3 בר וחבר את יציאת מדחס האוויר לכניסת בקר הזרימה באמצעות צינור פוליאוריתן פנאומטי.
  3. חבר מסנן הידרופובי ליציאת בקר הזרימה כדי למנוע זרימת נוזל חוזרת, ואז חבר את בקר הזרימה לשני פתחי כניסה במתקן מאגר הנוזלים עם צינור פוליאת'ר פוליאתרן פנאומטי באמצעות סעפה ומתאם דוקרניים.
  4. חבר את מתקן מיכל הנוזלים, שסתום ההפצה וחיישן הזרימה עם הצינור כך, באמצעות חיבורי פלנג'לס לקוטר חיצוני בקוטר 1/16 אינץ' אלא אם צוין אחרת.
    1. חבר שני פתחי יציאה של מדף מיכל הנוזלים לשני פתחי הכניסה הראשונים של שסתום ההפצה עם 80 ס"מ של צינור פנימי בקוטר 1/32 אינץ' (ID) פוליטטראפלואורואתילן (PTFE).
    2. חבר את יציאת שסתום ההפצה ליציאת הכניסה של חיישן הזרימה באמצעות צינור PTFE ID בגודל 500 מיקרון 15 ס"מ וחיבור מתאמ.
    3. חבר 60 ס"מ של צינור PEEK של 63.5 מיקרון של פוליאתר אתר ID (PEEK) ליציאת החיישן באמצעות חיבור מתאמ.
      הערה: בניסויים הדורשים קצבי זרימה שונים, כווננו את אורך צינור ה-PEEK לפי הצורך כדי לספק התנגדות נוזלית מספקת ליציבות זרימה.
    4. חבר את צינור ה-PEEK ל-10 ס"מ של צינור PTFE ID בגודל 500 מיקרון באמצעות חיבור איחוד.
    5. חבר את צינור ה-PTFE ליציאת הכניסה של מלכודת בועות מיקרופלואידית המצוידת במסנן ממברנה PTFE (גודל נקבוביות ~10 מיקרון).
    6. חבר 75 ס"מ של צינור PTFE ID בגודל 200 מיקרון ליציאת יציאת מלכודת הבועות כדי ליצור לחץ אחורי להסרת בועות יעילה. צינור זה יתחבר לחור הכניסה של כור המיקרופלואיד.
  5. לפני כל ניסוי, יש לחטא את מערכת בקרת הזרימה כאשר כל הצינורות והחומרה מחוברים על ידי שטיפת תמיסת אקונומיקה של 1% למשך פי שלוש נפח המערכת (~4 שעות לכל קו צינור ב-7.0 מיקרוליטר·דקה-1), ואחריה מים סטריליים וטהורים במיוחד למשך אותו זמן.
  6. בין הניסויים, נקה את מערכת בקרת הזרימה כך.
    1. שטוף את שסתום ההפצה וחיישן הזרימה על ידי שטיפת 100% איזופרופנול ומים סטריליים וטהורים במיוחד כדי למנוע הצטברות שאריות או משקעים.
      אזהרה: איזופרופנול דליק. לטפל ולאחסן בהתאם לגיליון הבטיחות.
    2. אוטוקלב למלכודת הבועות.
    3. החלפת מסנן ממברנת מלכודת בועות וצינור PTFE ID בגודל 200 מיקרומטר לאחר כל ניסוי כדי למנוע סתימות (מסנן ממברנה) או קולוניזציה חיידקית (צינור).

3. מדיה ניסיונית ופתרונות

  1. הכינו מדיום נוזלי של ציר לוריה (LB, הנוסחה של מילר) על ידי אוטוקלבינג של אבקת 2.5% LB במים אולטרה-טהורים בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לפלטות אגר LB, יש להשתמש באוטוקלב ב-2.5% אבקת LB ו-1.5% אגר במים אולטרה-טהורים בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ואז לשפוך לפלטות פטרי בגודל 100 מ"מ (~20 מ"ל לצלחת) ולמקר עד שהן מוצקות.
  2. מתמיסות סטריליציה במסנן המוכנות עם האגודה האמריקאית לכימיה (ACS) או ממגבים בדרגת בקטריולוגיה במים אולטרה-טהורים, ניתן לייצר 30 מ"ל מכל אחד מהבאים. תמיסת מלח והרכב מדיום הגידול מותאמים מ-Gehin ואחרים.
    1. הכינו תמיסת מלח ללא Mn(II) (SS0): 0.4 mM CaCl2·2H2O, 0.25 mM MgSO4·7H2O, 0.25 mM Na2HPO4·2H2O, 0.15 mM KH2PO4, 1:2 Fe(III)-EDTA (20 מיקרומום FeCl3·6H2O ו-40 מיקרומום EDTA מותאם ל-pH 6.5 עם 1M NaOH), בופר HEPES של 10 מ"מ (מותאם ל-pH 7.0 עם 1M NaOH), 5 מ"מ (NH4)2SO4, ומתכות עקבות (40 ננומטר CuSO4·5H2O, 273 ננומטר ZnSO4·7H2O, 84 ננומטר CoCl2·6H2O, 53.7 ננומטר Na2MoO 4·2H2O) במים סטריליים אולטרה-טהורים.
    2. הכינו תמיסת מלח עם Mn(II) (SSMn): זהה ל-SS0 עם 50 מיקרומום MnCl2·4H2O מוסף.
    3. הכין מדיום גידול ללא Mn(II) (GM0): זהה ל-SS0 עם 1.5 גרם· תמצית שמרים L-1 ו-1.5 גרם· L-1 חומצה קסמינו נוספת.
    4. הכינו מדיום גידול עם Mn(II) (GMMn): זההל-GM 0 עם 50 מיקרומו MnCl2·4H2O נוסף.
      אזהרה: תמיסות מלח ומדיום גידול מכילים מתכות עם סיכונים בריאותיים וסביבתיים כאחד. לטפל ולאחסן לפי גיליונות הבטיחות.
  3. הכינו תמיסה חומצית המכילה 40 מ"מ חומצה אוקסלית דיהידראט ו-2% חומצה חנקתית במים אולטרה-טהורים לעיכול תחמוצות המלוניות בתוך הכור המיקרופלואידי.
    זהירות: חומצה אוקסלית דיהידראט וחומצה חנקתית הם קורוזיביים, וחומצה חנקתית היא מחמצן חזק. לטפל ולאחסן לפי גיליונות הבטיחות.
  4. הכינו תמיסה של 1% חומצה חנקתית במים אולטרה-טהורים לדילול דגימת ICP-MS.

4. גידול חיידקים

הערה: גידול חיידקים מתבצע בטכניקה אספטית על שולחן העבודה באמצעות מבער בונזן. החומרים סטריליים אלא אם צוין אחרת. משך הדגירה ייחודי ל-P. putida GB-1 וייתכן שיש להזדקם למיקרואורגניזמים אחרים.

  1. ממלאי של -80°C, פס P. putida GB-1 על פלטת אגר LB. דגור את הצלחת במשך כ-20 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס כדי לאפשר צמיחת מושבות חיידקים.
  2. בערב שלפני הניסוי, הוסיפו 10 מ"ל מדיום LB לצינור קוני של 50 מ"ל והחרינו במושבה אחת של פלטה. דגרו את טרום-תרבות ה-LB בדגמת שייקר בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד למשך 16 שעות כדי להגיע לשלב הנייח.
  3. לאחר 16 שעות של דגירה, יש להוסיף 1 מ"ל של טרום-תרבות LB לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל וצנטריפוגה לצנטריפוגה למשך דקה ב-8,000 x גרם כדי לפרוק את החיידקים.
  4. שטפו את האליקו שלוש פעמים כדי להסיר את המדיום הנוזלי של LB על ידי השלכת הסופרנאנט, השעיית כדור התא ב-1 מ"ל של SS0, וצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-8,000 x g. החזירו את הכדור האחרון ל-1 מ"ל SS0.
  5. מדוד את הצפיפות האופטית (OD 600) של מתלה התא השטוף בקובטה לא סטרילית באמצעות מד צפיפות תאים. ה-ODהצפוי 600 עבור P. putida GB-1 הוא 3.6–3.8 בשלב זה, ולכן נדרשת לפחות דילול פי 5 ב-SS0 .
  6. החסן 20 מ"ל GM0 עם מתלה תא שטוף ל-OD600 של 0.01 בבקבוק Erlenmeyer בנפח 50 מ"ל. דגרו ב-30 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד במשך 6 שעות כדי להגיע לשלב האקספוננציאלי הבינוני.

5. ניסוי ביומינרליזציה

  1. בבוקר הניסוי, הכינו את מערכת בקרת הזרימה.
    1. חממו מראש את חממת המיקרוסקופ ל-30 מעלות צלזיוס.
    2. שפוך 10 מ"ל שלGM Mn ו-SS Mn לשני צינורות חרוטיים של 15 מ"ל וחבר את הצינורות למדף מיכל הנוזלים. שטף את SSMn בערך פי שלושה מנפח המערכת (~4 שעות ב-7.0 מיקרוליטר·דקה-1), ואחריוGM Mn לאותו זמן.
  2. הרווי את הכור המיקרופלואידי המוכן 5 שעות לאחר חיסון התרבית האקספוננציאלית האמצעית.
    הערה: רוויה וחיסון בכורים מתבצעים בטכניקה אספטית על השולחן באמצעות מבער בונזן. החומרים סטריליים אלא אם צוין אחרת.
    1. דה-גז מהכור במייבש ואקום למשך 20 דקות.
    2. בזמן שהכור מתפרק, יש לשאוב 1–2 מ"ל של SS0 לתוך מזרק פלסטיק של 3 מ"ל, ואז לחבר מחט קהה ו-20 ס"מ של צינור ID Tygon בקוטר 0.02 אינץ'. לחץ על הבוכנה עד שהצינור רווי לחלוטין.
    3. הסר את הכור מהמייבש, ואז חבר את הצינור לחור היציאה של הכור באמצעות פינצטה בזווית והרווי ידנית את הכור עם המזרק עד שנוצרת טיפה בחור הכניסה של הכור.
    4. חבר 20 ס"מ של צינור Tygon ID בגודל 0.02 אינץ' לחור הכניסה של הכור. המשך לשחרר SSMn אל הכור עד שכל בועות האוויר מוסרות (200–300 מיקרוליטר).
  3. הכינו את חיסון הכור וחסן את הריאקטור המיקרופלוידי.
    1. הסר את התרבית האקספוננציאלית האמצעית מדגם השייקר 6 שעות לאחר החיסון ומדוד אתה-OD 600. ה-OD600 הצפוי הוא 1.6–1.8 בשלב זה, ולכן מומלץ דילול ארבע-פי ב-SS0 .
    2. דילל את התרבית האקספוננציאלית האמצעית ב-2 מ"ל SSMn ל-OD600 התחלתי של 0.005 בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל. הפוך את הצינור כמה פעמים כדי לערבב.
    3. הניחו את צינור כניסת הכור בצינור המיקרוצנטריפוגה, כדי להבטיח שטיפה של נוזל נוגעת באינקולום כדי למנוע כניסת אוויר לצינור. סגרו חלקית את צינור המיקרוצנטריפוגה ובטחו את המכסה עם סרט דבק כדי למנוע זיהום.
    4. משכו 4–5 מ"ל SSMn לתוך מזרק זכוכית אטום גז בנפח 5 מ"ל כדי להרטיב את הקנה, ואז משחררים עד ש-0.5 מ"ל נשאר במזרק. טען את המזרק למשאבת מזרק.
    5. הסר את המחט ממזרק הפלסטיק וחבר אותה למזרק הזכוכית, תוך זהירות שלא ללכוד אוויר במרכז המחט.
    6. החריקו את הכור באמצעות משאבת המזרק על ידי משיכת האינוקולום לתוך הכור למשך 20 דקות בקצב זרימה של 8.33 מיקרוליטר·דקה-1 (~70 נפחי נקבוביות).
    7. לאחר החיסון, כבה את משאבת המזרק ואפשר לחיידקים לשקוע ולהיצמד למשך שעה ללא זרימה.
    8. אחרי שעה, מוציא את המזרק ממשאבת המזרק אך השאיר אותו מחובר לצינור היציאה.
  4. חבר את הכור המיקרופלואידי המחוסן למערכת בקרת הזרימה.
    1. העבר את הכור והמזרק מהספסל אל האינקובטור של המיקרוסקופ.
    2. בשלב המיקרוסקופ, הסר את צינור הכניסה מהכור.
    3. לחץ בעדינות על הבוכנה של המזרק כדי ליצור טיפה בחור הכניסה של הכור.
    4. כופף ידנית את צינור ה-PTFE ממערכת בקרת הזרימה בזווית ישרה (~1 ס"מ מקצה הצינור) כך שיתחבר בניצב לפני השטח של ה-PDMS, מה שממזער כוחות רוחביים וחדירת אוויר לחור הכניסה של הכור.
    5. טבלו את קצה צינור ה-PTFE בתמיסה של 1% פוליאתילן גליקול דיאקרילט (PEG-DA) כדי להרטיב את החלק החיצוני של הצינור ההידרופובי. ודא טיפה שלGM Mn בסוף צינור ה-PTFE, וחבר את הצינור לחור הכניסה של הכור.
    6. נתק את המזרק והנח את צינור היציאה בצינור מיקרוצנטריפוגה לא סטרילי בגודל 5 מ"ל כדי לאסוף את שפכת הכור.
    7. הגדר את קצב הזרימה ל-1.33 מיקרוליטר·דקה-1 בתוכנת מערכת בקרת הזרימה. הקים תוכנית לאספקתMn מהונדס ל-15 שעות (~500 נפחי נקבוביות) לקידום יצירת ביופילם, ואחריה SSMn ל-28.5 שעות (~1,000 נפחי נקבוביות) כדי לגרום לביומינרליזציה של Mn.
  5. התקן את הכור המיקרופלואידי בתוך שלב המיקרוסקופ.
    הערה: מערכת הקרנה אולטרה-סגולת (UVC) מותאמת אישית המחוברת לשלב המיקרוסקופ משמשת למניעת צמיחה לא רצויה של חיידקים ומשקעים מינרליים מחוץ למרחב הנקבוביות המיקרופלואידי (איור 2). עיצוב זה מותאם מרמוס ואח' 60 וניתן לשלוט בו באמצעות תוכנית אוטומטית. ראו Fadely ואח' 61 לפרטים.
    1. הניחו מסגרת דגימה מתחת לכור ליציבות, ואז התקינו את המסגרת והכור בקשיחות בכניסת הבמה, כדי להבטיח שהם משותקים לחלוטין.
    2. הדביקו את צינור ה-PTFE לתוך הבמה עם חתיכת סרט כדי למנוע מהצינור להתנתק מפתח כניסת הכור.
    3. יישר את זרועות ה-UVC למרחק של 3 מ"מ מקצה הנקבובית בצד הכניסה ו-2 מ"מ בצד היציאה כדי למזער פיזור נזק של אור אולטרה סגול וביופילם בתוך חלל הנקבוביות.
      הערה: יישור נכון של UVC יגרום להצטברות ביומסה מועטה או ללא כלל באזור כניסת הכור (איור 3A). יישור זרועות ה-UVC רחוק מדי מקצה הכניסה של חלל הנקבוביות (איור 3B) או היעדר הקרנה (איור 3C) גורמים למשקעים מינרליים במעלה הזרם של חלל הנקבוביות.
    4. הגדר תוכנית להקרנת כורים. לטפל באזור הכניסה והיציאה של הכור במשך 5 דקות ב-t = 0 שעות כדי לנטרל חיידקים שהופקדו במהלך החיסון, ואז לטפל באזור היציאה רק במשך 5 דקות ב-t = 17.5 שעות כדי לנטרל את הביופילמים שנותרו.

figure-protocol-2
איור 2: מערכת הקרנה אולטרה-סגול-C (UVC) מותאמת אישית לכורים מיקרופלואידיים. (A). תצוגה עליונה של המערכת המותקנת על שלב המיקרוסקופ, המציגה זרועות פוזות (כחולות) עם מערכי דיודה פולטת אור UVC (LED) מחוברות (מלבנים צהובים) וכור מיקרופלואידי המותקן על מסגרת דגימה (מלבן אפור קטן). (ב). תצוגה תחתונה של המערכת המציגה נורות LED של UVC (ריבועים בצבע חום) מוטמעים בזרועות הניתנות לתנועה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-protocol-3
איור 3: השפעת הקרנת UVC על אזור כניסת הכור המיקרופלואידי. (A). אזור כניסת הכור עם טיפול UVC של 5 דקות ב-t = 0 שעה המראה יישור נכון להסרה מלאה של ביופילמים לא רצויים. (B). אזור כניסת הכור עם מערך UVC לא מיושר כראוי, שהשאיר ביופילמים שאריתיים בחור הכניסה ומחוץ למרחב הנקבוביות, מה שאפשר לתחמוצות Mn לשקוע במעלה הזרם. (C). אזור כניסת הכור ללא טיפול UVC, מה שמוביל לצמיחה נרחבת של ביופילם ומשקעים מינרליים. הצללה אפורה מגדירה את מרחב הנקבוביות. פס המשקל הוא 2 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות הזו.

6. מיקרוסקופ טיים-לאפס אופטי

הערה: מיקרוסקופ אפיפלואורסצנציה הפוך Nikon Ti2 Eclipse המצויד במצלמה דיגיטלית (2304 x 2304 פיקסלים לשדה ראייה), מנוע אור לבן, 4x אובייקטיביות (1.62 מיקרומטר·פיקסל-1) ותוכנת NIS Elements משמש להדמיית שדה בהיר בצבע. מיקרוסקופים אופטיים נוספים המסוגלים להדמיית צבע מתאימים גם הם. השימוש בהדמיית צבע משפר את הרגישות למס תחמוצת Mn נמוך. אם אוטומציה עם טיים-לאפס אינה אפשרות, משתמשים יכולים לאסוף תמונות ידנית ולעבד אותן לאחר מכן כסדרת זמן.

  1. לתמונות באיכות גבוהה, בצע את שלבי היישור והתיקון הבאים:
    1. כדי להבטיח תאורה אחידה, יש לכוון ידנית את יישור Köhler לפי הוראות היצרן.
    2. אופטימיזציה של תאורת השדות הבהירים כדי למנוע רוויה נמוכה או יתר (משטח פיוז'ן > צבע > בהירות אוטומטית ו-Fusion Pad > צבע > לבן אוטומטי).
      הערה: הכי טוב לאופטם את תאורת שדה הבהיר רק פעם אחת על כור שכבר מכיל ביופילמים ותחמוצות Mn, ואז להחיל את אותו זמן חשיפה ואיזון צבע בכל הניסויים הבאים להארה עקבית. כאן משתמשים בתאורה של 5 מילישניות עם אדום ב-97.58%, ירוק ב-44.76%, וכחול ב-100%.
    3. כדי למנוע תופעות תפירה בעת צילום תפורים של חלל הנקבוביות המיקרופלואידיות, יש ליישם תיקון הצללה (רכוש > פאנל תיקון הצללה).
  2. הגדר את הקואורדינטה המרכזית של התמונה התפורה (רכישת ND > XY).
  3. הגדר את אזור סריקת התמונה הרקורה (כאן, 5 על 4 שדות תצוגה) והחלו חפיפה של 1% (רכישת ND > תמונה גדולה).
  4. הגדר רכישת תמונות בצבע בהיר עם מטרה 4x (רכישת ND > λ).
  5. הגדר את תדר ההדמיה במרווחים של 1 שעה ל-15 שעות (שלב גדילה) ו-0.5 שעות ל-28.5 שעות (שלב המינרליזציה) (רכישת ND > זמן), ואז הפעל את תוכנית הטיימלאפס.
    הערה: משך שלבי הגדילה והמינרליזציה ייחודי ל-P. putida GB-1 וניתן לכוונתו לפי הצורך עבור מיקרואורגניזמים אחרים.
  6. כאשר הניסוי מסתיים, ייצא את התמונות כפורמט קובץ תמונה מתויג (TIFF) (פאנל מאקרו > ייצוא תמונות ל-TIFF).

7. עיכול חומצי ומדידת מסה של Mn

הערה: ICP-MS משמש למדידת מסה של Mn שנשמרת בכור המיקרופלואידי, אך מכשירים אחרים, כגון ספקטרומטרים לפליטה אופטית (ICP-OES), גם הם מקובלים. אם אין מכשור אנליטי זמין, ניתן לשלוח דגימות מעוכלות בחומצה למעבדה מסחרית.

  1. בסיום הניסוי, הסר את הכור מהכניסה של שלב המיקרוסקופ ונתק את צינור הכניסה והיציאה.
  2. משוך 1.5 מ"ל של תמיסת חומצה למזרק זכוכית אטום לגז בנפח 5 מ"ל (נפרד ממזרק החיסון). חבר מחט קהה ו-20 ס"מ של צינור PTFE ID בגודל 1/32 אינץ' למזרק ומשחרר חומצה ידנית עד שנוצרת טיפה בקצה הצינור.
  3. על השולחן, העמיסו את המזרק למשאבת מזרק וחברו את הצינור לחור הכניסה של הכור, תוך זהירות שלא ללכוד בועות אוויר, שעלולות למנוע מהתמיסה החומצית לחדור לכל הנקבוביות. חבר 30 ס"מ של צינור PTFE ID בגודל 1/32 אינץ' לחור היציאה של הכור ומניח את קצה צינור היציאה בתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בקוטר 2 מ"ל.
  4. הזרקו תמיסת חומצה לתוך הכור למשך 10 דקות בקצב זרימה של 100 מיקרוליטר·דקה-1.
  5. לאחר הזרקת תמיסת חומצה, נתק את מחט הקצה הקהה ממזרק הזכוכית. מלא מזרק פלסטיק בנפח 10 מ"ל באוויר וחבר למחט הקהה, ואז משחרר ידנית את כל האוויר במזרק כדי לנקז את החומצה שנותרה מהכור ומהצינור לצינור המיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל.
    הערה: בעוד שנפח קטן של תמיסת חומצה עשוי להישאר לכוד בתוך חלל הנקבוביות לאחר הזרקת האוויר, הוא זניח יחסית לנפח הכולל שהוזרק. משתמשים העובדים בגאומטריות עם נקבוביות נמוכה עשויים לשקול לשטוף נפחים נוספים של אוויר כדי להסיר שכבות נוזלים וחומצה שאריתית מנקבוביות מחוברות בצורה לקויה.
  6. מדלל את הדגימה המעוכלת בחומצה חנקתית 1% לפי טווח כיול ICP-MS. כאן, הכן דילול פי 100 (נפח כולל של 5 מ"ל) בצינור קוני של 15 מ"ל.
  7. מדוד את ריכוז ה-Mn בדגימה מדוללת עם ICP-MS. תקן את הריכוז הנמדד עם מקדם הדילול ונפח הדגימה הכולל כדי לקבוע את מסת המיליון שנשמרת בכור.

8. ניתוח תמונות

הערה: MATLAB מומלץ בשל פונקציות מובנות לניתוח תמונות, הכלולות בטקסט. עם זאת, כלים אחרים כמו ספריות ניתוח התמונות של ImageJ או Python יכולים גם הם לשמש לביצוע ניתוחים דומים. שלבי ניתוח תמונה מרכזיים מוצגים באיור 4. כל סקריפטי ניתוח התמונה מסופקים כקבצים משלימים (קובץ משלים 1, קובץ משלים 2, ותיק משלים 3).

figure-protocol-4
איור 4: תהליך חיסור תמונה לבידוד משקעי Mn oxide. מתמונות צבע בהירות בזמן-לאפס, זוהתה תמונת ייחוס (tref) (1) כדי להסיר את עוצמת הביופילמים הסטצינריים של השלב הבסיסי מכל תמונות נקודת הזמן הבאה (tn) (2). נוצרו מסכות בינאריות של כל tn (3) והוכפלו גם ב-tref (4) וגם ב-tn (5) המתאים כדי ללכוד את היקף הביופילם-ביומינרל. לבסוף, ה-tn המוסווה הופנו מהטרף המסכה (6). המטריצות המתוקנות בעוצמה מתקבלות כמותות את הירידה בעוצמה (a.u.) הנובעת מהצטברות תחמוצת Mn בכל פיקסל. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

  1. טען TIFF ברזולוציה גבוהה של גיאומטריית מרחב הנקבוביות המיקרופלואידי (מיוצאת מ-AutoCAD) לתוך מרחב העבודה לשימוש כמסכת גרעין (לא קריאה).
  2. יישר ורשם את תמונות הצבע הבהיר כדי ליישם את מסכת הגרעין בצורה יעילה.
    1. יצר בינארי רישום של תמונת נקודת הזמן הראשונה (t = 0 h).
      1. טען את ה-color brightfield TIFF לתוך מרחב העבודה (לא נקרא).
      2. חתכו את התמונה מעט גדולה יותר מגודל מרווח הנקבוביות (החתכה).
      3. חדד את התמונה כדי לשפר את רזולוציית גבולות הגרעיניים (imsharpen).
      4. ביניאריזציה של התמונה באמצעות סף אדפטיבי שמעדיף תכונות כהות (rgb2gray, adaptthresh עם קוטביות קדמית = "כהה" ורגישות מותאמת לפי הצורך, אימבינריזציה, אי-משלים).
      5. מלא את גרגרי הבינארי של רישום המתקבל כדי ליצור תכונות מוצקות (מילוי ב"חורים" שצוינו). שימו לב שלא כל הדגנים עשויים להיות מלאים.
      6. שחוק את הבינארי של הרישום לפי הצורך כדי להסיר רעש רקע, ואז להרחיב כדי להחליף פיקסלים שאבדו בקצוות הגרעין (imerode, imdilate).
    2. השתמש באלגוריתם רישום של שינוי תכונות בקנה מידה (SIFT) כדי לחשב את מטריצת הטרנספורמציה הנדרשת ליישור בינארי הרישום למסכת הגרעין (DetectSIFTFeatures, extractFeatures, matchFeatures, estgeotform2d עם סוג טרנספורמציה = "אפין").
    3. החלו את מטריצת הטרנספורמציה הזו על הבינארי של הרישום ותמונת נקודת הזמן הראשונה, ואז הניחו אותם עם מסכת הגרעין כדי להעריך התאמה (imwarp, imshowpair).
    4. אם יישור לקוי נמשך לאחר רישום SIFT, יש להחיל רישום מקומי לפי הצורך (cpselect, fitgeotform2d עם סוג טרנספורמציה = "lwm", imwarp).
    5. גזום את מסכת התמונה והגריין הרשומה לפי הצורך כדי להסיר ארטיפקטים ברישום בקצוות המטריצה, ואז לשנות את הגודל לממדי מרחב הנקבוביות (15 מ"מ x 10 מ"מ) (אימקרופ, שינוי גודל).
    6. ללאה דרך כל תמונות הצבע הבהיר כדי להחיל את אותה רישום (אי-וורפ).
  3. זיהוי ויזואלי של תמונת ייחוס (tref, לוח 1 באיור 4) כאשר הביופילמים נכנסים לשלב סטציונרי, שנקבע כחוסר תנועה מתמשכת או גדילה (כאן, t = 18.5 שעות).
  4. ביניאריזציה של כל תמונת נקודת זמן (tn, פאנל 2 באיור 4) (rgb2gray, adaptthresh עם קוטביות קדמית = "כהה" ורגישות מותאמת לפי הצורך, אימבינריזציה, אי-משלמת) כך שמכלולי ביופילם-ביומינרלים = 1 וגרגרים ונקבוביות ריקות = 0. הכפל כל מסכת נקודת זמן במסכת הגרעין ההפוכה (אי-משלים) כדי להסיר גבולות גרעינים שנותרו.
  5. הכפל את tn במסכת נקודת הזמן המתאימה (לוח 3 באיור 4) כדי לבודד את אזור הביופילם-ביומינרל הרלוונטי (פאנל 5 באיור 4), ואז כפל את tref בכל מסכת נקודת זמן כדי לבודד את אותו אזור (פאנל 4 באיור 4).
  6. מחסר את כל tn מוסווהמה-t ref המוסווה כדי לכמת את הירידה בעוצמת הפיקסלים הקשורה להצטברות תחמוצת Mn בכל נקודת זמן (הפחתה), ואז להמיר למטריצות מתוקנות עוצמה מורכבות (rgb2gray, לוח 6 באיור 4).
  7. כדי להעריך את התפלגות המינרלים במרחב הנקבוביות (a.u.), סכום לאורך העמודות (סכום עם ממד = 1) של כל מטריצה מתוקנת עוצמה.
  8. כדי להעריך את קצב השקיעת תחמוצת ה-Mn לאורך זמן (μg·h-1):
    1. סכום כל מטריצה מתוקנת עוצמה (סכום עם ממד = "כל") כדי לכמת את העוצמה המתוקנת הכוללת בכל נקודת זמן.
    2. חלק את העוצמה המתוקנת הכוללת בכל נקודת זמן בעוצמה המתוקנת הכוללת בנקודת הזמן הסופית כך שנקודת הזמן הסופית = 1 וכל הערכים הקודמים יהיו חלקיים. שינוי קנה מידה למיקרוגרם על ידי הכפלה במסת ה-Mn שנמדדה באמצעות ICP-MS.
    3. קחו את הנגזרת ביחס לזמן על ידי חלוקת העלייה במסה (μg) בין נקודות זמן רציפה (diff) בפרק הזמן בין תמונות (0.5 שעה).

תוצאות

פרוטוקול זה מספק פלטפורמה ניסיונית להדמיה מקוטעת של יצירת ביופילם וביומינרליזציה של Mn בפתרון מרחבי-זמן. תמונות צבעוניות בהירות הראו כי ביופילמים של P. putida GB-1 התפזרו באופן אחיד במרחב הנקבוביות המיקרופלואידי ב-t = 18.5 שעות לפני תחילת השקיעת תחמוצת Mn (איור 5A). בהמשך, תחמוצות Mn הצטברו באופן מועדף בצד הכניסה של חלל הנקבוביות הקרוב ביותר למקור ההשפעה Mn(II) (איור 5B). ההבדל בין תמונת הייחוס לנקודות הזמן הבאות חשף את התרומה המבודדת של משקעי תחמוצת המלוניות לעוצמת התמונה הכוללת (איור 5C) ואיפשר כימות של הגרדיאנט הנצף בקנה מידה הכור בהצטברות מינרלים (איור 5D). בקנה מידה של ביופילם, גישת חיסור התמונה הזו תפסה את השקיעה ההדרגתית של תחמוצות Mn על משטחי ביופילם והצטברות מינרלים בקצוות הביופילמים במגע עם נוזל נקבוביות (איור 6).

הפרוטוקול מספק בנוסף תהליך להערכת הקינטיקה של משקעי תחמוצת Mn מהסטת תמונה ומדידות ICP-MS. כורי מיקרופלואיד משולשים הכילו 4.29 ± 0.22 מיקרוגרם Mn בנקודת הזמן הניסיונית הסופית. עיכול החומצה של תכולת הכור אומת בעבר באמצעות מדידות מבוססות סינכרוטרון של מסת תחמוצת המנגינה ונמצא כי השגיאה של פחות מ-18%61. לכן, המטריצות המתוקנות בעוצמה הותאמו מחדש למסה הסופית הזו. קצב המשקעים המשוער של תחמוצת מגני היה לא מונוטוני, ועלה בחדות בין t = 19.5 שעה ל-t = 21 שעות, לפני שהגיע לשיא ב-0.29 ± 0.04 מיקרוג·שע והאט בהדרגה עד t = 43.5 שעות (איור 7). יש לציין כי חישוב הקצב הזה אינו מתחשב באף תחמוצת ננו-חלקיקים של Mn מתחת לרזולוציה של המיקרוסקופ האופטי או בכל מסה של תחמוצת שאבדה עקב הובלה לאורך זמן הניסוי, שצפויה להיות מינימלית. לכן, גישה זו מנצלת טכניקות מיקרוסקופיה נגישות להערכת מגמות זמניות חצי-כמותיות בקינטיקת הביומינרליזציה.

figure-results-1
איור 5: התפלגות בקנה מידה של ביופילמים ותחמוצות Mn בקנה מידה של כורים. (A). תמונת שדה בהיר צבעוני של ביופילמים P. putida GB-1 בתוך מרחב הנקבוביות המיקרופלואידי בתחילת השלב הנייח (t = 18.5 h,t ref). (B). תמונת שדה בהיר צבעוני של משקעי Mn oxide על וסביב ביופילמים P. putida GB-1 בנקודת זמן ניסיונית סופית (t = 43.5 שעות). (C). מטריצה מתוקנת בעוצמה של הצטברות מינרלים בנקודת הזמן הניסיונית הסופית (t = 43.5 שעה), כאשר הגרגרים מוצגים באפור והנקבוביות בלבן. פס המשקל הוא 1 מ"מ (D). התפלגות מרחבית חד-ממדית של עוצמה מתוקנת כוללת מהכניסה (שמאל) לצד היציאה (ימין) של מרחב הנקבוביות (t = 43.5 שעות). הקו המוצק מייצג ממוצע נע של 1 מ"מ לאורך מרווח הנקבוביות מהכניסה ליציאה, בממוצע על פני ניסויים משולשים, והצללה מייצגת את סטיית התקן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 6: הצטברות תחמוצת Mn בקנה מידה ביופילם. (א). בחר תמונות צבע בהירות של ביופילמים מייצגים P. putida GB-1. תחמוצות מנגן היו ניתנות לזיהוי תחילה כשינוי צבע מאפור לחום על משטחי ביופילם (מוצגים ב-t = 20 שעות ו-t = 21 שעות) ולאחר מכן כהצטברות של משקעים חומים כהים בקצוות הביופילם (מוצגים ב-t = 33 שעות ו-t = 43 שעות). (ב). מטריצות מתוקנות עוצמה של הצטברות מינרלים עם גרגרים באפור כהה, נקבוביות בלבן, וביופילמים מתחתיים באפור בהיר. פס המשקל הוא 150 מיקרון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הצורה.

figure-results-3
איור 7: הערכת קצב המשקעים של תחמוצת Mn לאורך זמן. הקצב (μg·h-1) נמדד על ידי שינוי גודל העוצמה המתוקנת הכוללת בכל נקודת זמן לנקודת קצה המסה Mn שנמדדה ב-ICP-MS, ואז לקיחת הנגזרת ביחס לזמן. סמנים מייצגים את ממוצע הניסויים המשולשים, והצללה מייצגת את סטיית התקן (תקן). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

תיק משלים 1: Step1_ImageRegistrationאנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

תיק משלים 2: Step2_ImageSubtractionאנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

תיק משלים 3: Step3_Figures.m.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

פלטפורמה ניסיונית זו מציעה הזדמנויות ייחודיות לחקירת דינמיקה מרחבית-זמנית של תהליכים ביוגאוכימיים בסביבות נקבוביות נטולות ארטיפקטים המונעים רכישת נתונים באיכות גבוהה. גישה זו מתאימה במיוחד לביומינרליזציה של Mn ו-Fe, שמייצרות משקעים מינרליים עם גוונים אופייניים של אוכר, חום ושחור שניתן לפצל בקלות באמצעות מיקרוסקופיה אופטית וניתוח תמונה. באמצעות ביומינרליזציה של Mn כמחקר מקרה, ניתן להעריך דפוסים וקצבי משקעים מינרליים במקום ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

מספר היבטים של פרוטוקול זה אפשרו איסוף מדידות שכפוליות של טרנספורמציות ביוגיאוכימיות. ראשית, שימוש בשסתום הזרקה רציף עם נפח מת נמוך אפשר ניסויים עם נוזלים מרובים מבלי להפריע לביופילמים במרחב הנקבוביות המיקרופלואידי. הגדרה זו שמרה על התפלגות הביופילם המרחבית הראשונית על ידי מניעת עליות לחץ שעלולות להוביל להחלפה או הזזת ביופילמים בעת החלפת נוזלים מוזרקים, דבר שעשוי להתרחש במכשירים אחרים כמו משאבות מזרק. רכיב זה מעניק למשתמש את הגמישות להתאים את התנאים הגיאוכימיים המוטלים על המיקרואורגניזמים המקומיים. לבסוף, מכיוון שהוא שומר על התפוצה הראשונית של ביופילם, מערכת זו מאפשרת למשתמש לבדוק באופן שיטתי כיצד מורפולוגיות ביופילם שונות או כמויות ביומסה משפיעות על התפלגות וקצב השקיעה של תחמוצת המיליון.

שנית, הפחתת היווצרות וחדירת בועות למרחב הנקבוביות המיקרופלואידי אפשרה ניסויים רב-יומיים שתפסו את הזמנים הרלוונטיים סביבתית של ביומינרליזציה של מונו. בועות, בעיה נפוצה ולעיתים בלתי נמנעת בניסויים ארוכים מעל טמפרטורתהחדר 62,63, עלולות לפצל ולחסום נקבוביות בודדות, לשנות את זרימת הנוזלים ולהפריע להתקדמות התגובה. כדי למנוע לכידת בועות במרחב הנקבוביות, הכור היה רווי לחלוטין לפני החיסון. כדי למזער הכנסת בועות דרך מערכת בקרת הזרימה, הוגדר חממת המיקרוסקופ ל-30 מעלות צלזיוס זמן רב לפני הניסוי, ונשפכו נפחים רבים של תמיסת השפעה לפני חיבור הכור המחוסנ. שלב זה הסיר אוויר לכוד מהצינורות ומהחיבורים והפחית את הסיכון לפליטת נוזלים במהלך הניסוי. מלכודת בועות שולבה גם במערכת בקרת הזרימה ללכידת בועות שאריות, עם צינור PTFE ID באורך 200 מיקרון שמחובר ליציאת המלכודת כדי להגדיל את ההתנגדות ולשפר את יעילות הסרת הבועות. לבסוף, כדי למנוע לכידת אוויר או דליפה בממשק בין צינור ההשפעה לחור כניסת הכור, כל החיבורים נעשו בטיפות נוזל משני קצות הצינור והחור המחורר, צינור ה-PTFE ההידרופובי צופה ב-1% PEG-DA, וקצה הצינור שהוכנס נשמר בניצב לפני השטח של ה-PDMS לאורך כל הניסוי.

שלישית, שילוב מערכת הקרנת UVC מותאמת אישית בפלטפורמת הניסוי שמרה על תנאי גבול גאוכימי מוגדרים והגבילה את הביומינרליזציה של Mn במרחב הנקבוביות המיקרופלואידי. ניסויים פיילוט הראו כי ביופילמים חיצוניים באזור כניסת הכור השקיעו תחמוצות Mn במעלה הזרם במרחב הנקבוביות, מה שהגביל את זמינות Mn(II) במורד הזרם. הקרנה קצרה של אזורי הכניסה והיציאה של הכור עם יישור נכון לאחר תקופת ההתיישבות ללא זרימה, מנעה התפתחות ביופילם מכל חיידק שהושקע בתחילה. זרימת נוזל חד-כיוונית רציפה מנעה התיישבות מחדש באזור כניסת הכור לאחר טיפול ראשוני ב-UVC. הקרנת אזור יציאת הכור ב-t = 17.5 שעות לפני תחילת הפאזה הנייחית והשקיעה הנראית של תחמוצת Mn צמצמה את כמות הצטברות המינרלים במורד הזרם של חלל הנקבוביות. דבר זה אפשר השוואה ישירה של נתוני תמונת שדה בהיר צבעוני עם מסה של Mn שנערכה ונמדדה באמצעות ICP-MS.

השילוב של חיסור תמונה ומדידות מסה בנקודת הקצה סיפק שיטה חצי-כמותית להערכת הקינטיקה של משקעי תחמוצת מגני במקום. עם זאת, חשוב לציין שעוצמת הפיקסלים מפסיקה להיות פרופורציונלית ישירות למסת תחמוצת המיליון בצפיפות מינרלית גבוהה מאוד, בשל רגישות מוגבלת של המצלמה לצבעים כהים61. ניתן לשפר את הערכת ההתנהגות הלא-ליניארית הזו על ידי עיכול דגימות חומצה בנקודות זמן מוגדרות והשוואת המסה המעוכלת למסה המקורית שנקבעה לפי נקודת הזמן הניסיונית הסופית. אם נדרשת כימות מדויק של מסת המינרלים, משתמשים יכולים לפתח עקומת כיול באמצעות דגימות מינרלים בעוצמה ומסה ידועים, כפי שהודגם בעבר ב-Fadely ואח' 61, או לבצע מדידות ישירות עם פלואורסצנציה מבוססת סינכרוטרון בקרני רנטגן.

הפלטפורמה המיקרופלואידית המוצגת כאן יכולה לשמש לחקר תהליכי ביומינרליזציה במגוון רחב של תנאים סביבתיים. בעוד שניסויים מייצגים אופטימיזציה עבור P. putida GB-1, ניתן להשתמש במערך זה לבדיקה שיטתית של מגוון כימיות של תמיסות השפעה (למשל, ריכוז Mn או Fe, מקור פחמן, נוכחות מתכות מקבילות), קצבי זרימה, טמפרטורות או נוכחות של קונסורציום מיקרוביאלי. תנאים חומציים או סובוקסיים מסוימים, כמו אלו המתאימים לחיידקים מחמצנים ברזל, יכולים להיות מדומים על ידי הפחתת ה-pH המשפיע או ציפוי ה-PDMS בפולימר חסין חמצן. ניתן לקבל תובנות על בקרות מיקרוביאליות בביומינרליזציה על ידי יישום זני מיזוג גנים מדווחים ומעקב אחר הפלואורסצנציה האופטית המתקבלת59,64. כורים מיקרופלואידיים יכולים להיות מתוכננים מחדש כדי לדמות מגוון סביבות נקבוביות על ידי שינוי התפלגות גודל החלקיקים, צורת החלקיקים או הנקבוביות, או על ידי פונקציונליזציה של ה-PDMS לחיקוי מטען פני השטח של חלקיקי חימר או חומר אורגני טבעי. עם שינויים נוספים (למשל, החלפת תת-כור הזכוכית בפלסטיק), כורים יכולים לתמוך במדידות ספקטרוסקופיות ישירות של מצב חמצון מתכות, מינרלוגיה, קשרים אורגנו-מינרליים, או ספיחה או שותפות של מתכות משניות. לבסוף, ניתן להרחיב את הפלטפורמה הניסיונית הזו כדי לחקור משקעים של ביומינרלים מתכתיים אחרים (כגון פוספטים, פחמתים, סולפידים), בתנאי שהתכונות האופטיות שלהם מובחנות מספיק כדי לאפשר סגמנטציה של התמונה. לכן, פרוטוקול זה מציע מסגרת לחקר מקיף של ביומינרליזציה ואינטראקציות בין מיקרובים-מינרלים-נוזלים בסביבות נקבוביות רלוונטיות.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

הפרויקט נתמך על ידי מרכז הקרן הלאומית למדע של ארה"ב לגיאוטכניקה ביולוגית בהשראת ביולוגיה (ERC-1449501), הקרן הלאומית למדע השווייצרית (200021_188546), וקרן המדע הלאומית של ארה"ב (MCA-2322428, EAR-1847689, DMR-2003849). חלק מהמחקר נערך במרכז UC Davis לייצור ננו ומיקרו (CNM2). אנו מודים לסטיבן לוסרו ול-UC Davis Tech Foundry על עיצוב וייצור חממת המיקרוסקופ ומערכת ההקרנה UVC. אנו מודים גם לד"ר יוזה וואנג וד"ר ג'ייסון דה-ג'ונג על סיפוק הגיאומטריה הנקבובית של המדיום המשמש לייצור כורים מיקרופלואידיים, ולד"ר ארונימה בהאטצ'רג'י, ד"ר נואה גושי, ד"ר גרגורי גירארדי וד"ר היהיון קים על דיונים ו/או הכשרה בפוטוליתוגרפיה ורכה. לבסוף, אנו מודים לד"ר גייטן גהין, ד"ר טוניה קוהל, ד"ר פיליפו מיילה וד"ר צ'ארלס גראדי על דיונים חשובים בעיצוב ניסויי וניתוח תמונה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
התאמת מתאם (Elveflow, 6-40 עד 1/4-28)Darwin MicrofluidicsLVF-KFI-08משמש לממשק בין חיישן זרימה לחיבורים ללא אוגן.
אגר (Fisher BioReagents)Fisher ScientificBP9744משמש למזיגת צלחות לגרידה של מלאי קפוא.
מדחס אוויר (Jun-Air)ElveflowKCP-110משמש לחיץ של בקר זרימה.
סולפט אמוניום ((NH4)2SO4, CAS: 7783-20-2)Sigma-AldrichA4915משמש לתווך ניסויים ותמיסות ניסויים.
מלקטות זוויתיותTDI International7-SAמשמש לחיבור צינורות לכור מיקרו-נוזלי.
תוכנת AutoCADAutodesk --משמשת לתכנון גיאומטריה של כור מיקרו-נוזלי.
אוטוקלבSteris--משמש לעיקור חומרים ונוזלים. 
מאזנייםMettler ToledoME2002Tמשמש לשקלול בסיס אלסטומר PDMS וסוכן ריפוי.
מתאם מחודד (1/4-28 מסתובב למחודד 3/32-in)ElveflowKFI-06משמש לחיבור צינורות פוליאתר פוליאוריטן למנפיל ולמדף מאגר נוזלים.
אגרוף ביופסיה (Rapid-Core, קוטר 1.2 מ"מ)Darwin MicrofluidicsPT-T983-12-25משמש לנקב חורים לכניסה/יציאה בערוצי מיקרו-נוזלים PDMS. 
לבנה (Chlorox)ULINES-19719משמש לעיקור מערכת בקרת זרימה. מדולל ל-1% במים נקיים במיוחד.
מחט עם קצה מעוגל (Jensen Global, 21-מדד)QSourceJG21-10HPX-J004משמש לחיבור צינורות למזרקים. מעוקר על ידי אוטוקלב במשך 30 דקות.
מבער בונסןHumboldtH-5970משמש לשמירה על סביבת עבודה ניסויית סטרילית.
סידן כלורידי דיהידרט (CaCl2·2H2O, Fisher Chemical, CAS: 10035-04-8)Fisher ScientificC79משמש לתווך ניסויים ותמיסות ניסויים.
חומצת קסמינו (Fisher BioReagents, פפטון מקייזין חומצי)Fisher ScientificBP1424משמש לתווך ניסויים.
מד צפיפות תאים (WPA Biowave CO8000)Avantor490005-906משמש למדידת OD600 של תרביות חיידקים. 
סרט שקוף (Scotch Magic)ULINES-10223משמש למניעת הדבקת אבק לערוצי מיקרו-נוזלים PDMS.
כלוריד קובלט(II) הקסה-הידרט (CoCl2·6H2O, CAS: 7791-13-1)Sigma-Aldrich255599משמש לתווך ניסויים ותמיסות ניסויים.
חנקן דחוסAirgasNIUHP300משמש לייבוש רכיבי כור מיקרו-נוזלי.
צינור חרוטי (Falcon, נפח 15 מ"ל, פוליפרופילן)Fisher Scientific14-959-49Bמשמש לפתרונות זרימה ודוגמאות ICP-MS. סטרילי מראש.
צינור חרוטי (Falcon, נפח 50 מ"ל, פוליפרופילן)Fisher Scientific14-432-22משמש לתרבית LB מוקדמת. סטרילי מראש.
סולפט נחושת(II) פנטה-הידרט (CuSO4·5H2O, CAS: 7758-99-8)Sigma-AldrichC8027משמש לתווך ניסויים ותמיסות ניסויים.
מתקן חיתוךULINES-18543משמש לחיתוך ערוצי מיקרו-נוזלים PDMS ולנקב חורים לכניסה/יציאה.
מכלול קוואט (Fisherbrand, נפח 1.5 מ"ל, פוליסטירן)Fisher Scientific 14-955-127משמש למדידת OD600 של תרביות חיידקים. 
מצלמה דיגיטלית (Hamamatsu ORCA-Fusion)Nikon77054115משמשת להדמיה צבעונית בזמן אמת של ניסויים מיקרו-נוזליים.
שסתום חלוקה (MUX)ElveflowMUX-D-12משמש להזרקה רציפה של מספר נוזלים.
תוכנת Elveflow Smart Interface (ESI)Elveflow --משמשת לבקרת קצב זרימה/לחץ משוב בין בקר זרימה לחיישן זרימה ולביצוע החלפת שסתום חלוקה.
בקבוק ארלנמאייר (Fisherbrand, נפח 50 מ"ל)Fisher ScientificFB50050משמש לתרבית אקספוננציאלית בינונית. סטרילי מראש

מקורות

  1. Scheinost, A. C., Singh, B., Goss, M. J., Oliver, M. Metal oxides. Encyclopedia of soils in the environment. , (2023).
  2. Tebo, B. M., et al. Biogenic manganese oxides: properties and mechanisms of formation. Annu Rev Earth Planet Sci. 32, 287-328 (2004).
  3. Droz, B., Dumas, N., Duckworth, O. W., Peña, J. A comparison of the sorption reactivity of bacteriogenic and mycogenic Mn oxide nanoparticles. Environ Sci Technol. 49, 4200-4208 (2015).
  4. Holguera, J. G., Etui, I. D., Jensen, L. H. S., Peña, J. Contaminant loading and competitive access of Pb, Zn and Mn(III) to vacancy sites in biogenic MnO₂. Chem Geol. 502, 76-87 (2018).
  5. Peña, J., et al. Mechanisms of nickel sorption by a bacteriogenic birnessite. Geochim Cosmochim Acta. 74, 3076-3089 (2010).
  6. Toner, B., Manceau, A., Webb, S. M., Sposito, G. Zinc sorption to biogenic hexagonal-birnessite particles within a hydrated bacterial biofilm. Geochim Cosmochim Acta. 70, 27-43 (2006).
  7. Castro, L., Blázquez, M. L., González, F., Muñoz, J. A., Ballester, A. Heavy metal adsorption using biogenic iron compounds. Hydrometallurgy. 179, 44-51 (2018).
  8. Whitaker, A. H., Duckworth, O. W. Cu, Pb, and Zn sorption to biogenic iron (oxyhydr)oxides formed in circumneutral environments. Soil Syst. 2, 18 (2018).
  9. Brüggenwirth, L., et al. Interactions of manganese oxides with natural dissolved organic matter: implications for soil organic carbon cycling. Geochim Cosmochim Acta. 366, 182-200 (2024).
  10. Li, H., Santos, F., Butler, K., Herndon, E. A critical review on the multiple roles of manganese in stabilizing and destabilizing soil organic matter. Environ Sci Technol. 55, 12136-12152 (2021).
  11. Li, Q., Hu, W., Li, L., Li, Y. Interactions between organic matter and Fe oxides at soil micro-interfaces: quantification, associations, and influencing factors. Sci Total Environ. 855, 158710 (2023).
  12. Song, X., et al. Towards a better understanding of the role of Fe cycling in soil for carbon stabilization and degradation. Carbon Res. 1, 5 (2022).
  13. Hennebel, T., De Gusseme, B., Boon, N., Verstraete, W. Biogenic metals in advanced water treatment. Trends Biotechnol. 27, 90-98 (2009).
  14. Marsidi, N., Abu Hasan, H., Sheikh Abdullah, S. R. A review of biological aerated filters for iron and manganese ions removal in water treatment. J Water Process Eng. 23, 1-12 (2018).
  15. Li, Y., Xu, Z., Ma, H., Hursthouse, A. S. Removal of manganese(II) from acid mine wastewater: a review. Water. 11, 2493 (2019).
  16. Li, S., et al. Biomineralization mediated by iron-oxidizing microorganisms. Minerals. 15, 868 (2025).
  17. Skousen, J., et al. Review of passive systems for acid mine drainage treatment. Mine Water Environ. 36, 133-153 (2017).
  18. Post, J. E. Manganese oxide minerals: crystal structures and economic and environmental significance. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 3447-3454 (1999).
  19. Cornell, R. M., Schwertmann, U. . The iron oxides: structure, properties, reactions, occurrences and uses. , (2003).
  20. Cosmidis, J., Benzerara, K. Why do microbes make minerals?. C R Geosci. 354, 1-39 (2022).
  21. Ehrlich, H., Bailey, E., Wysokowski, M., Jesionowski, T. Forced biomineralization: a review. Biomimetics. 6, 46 (2021).
  22. Hoffmann, T. D., Reeksting, B. J., Gebhard, S. Bacteria-induced mineral precipitation: a mechanistic review. Microbiology. 167, 001049 (2021).
  23. Hansel, C. M., Learman, D. R., Ehrlich, H. L., Newman, D. K., Kappler, A. Geomicrobiology of manganese. Ehrlich's geomicrobiology. , (2015).
  24. Tebo, B. M., Johnson, H. A., McCarthy, J. K., Templeton, A. S. Geomicrobiology of manganese(II) oxidation. Trends Microbiol. 13, 421-428 (2005).
  25. Kappler, A., Emerson, D., Gralnick, J. A., Roden, E. E., Muehe, E. M., Ehrlich, H. L., Newman, D. K., Kappler, A. Geomicrobiology of iron. Ehrlich's geomicrobiology. , (2015).
  26. Emerson, D., Fleming, E. J., McBeth, J. M. Iron-oxidizing bacteria: an environmental and genomic perspective. Annu Rev Microbiol. 64, 561-583 (2010).
  27. Fortin, D., Langley, S. Formation and occurrence of biogenic iron-rich minerals. Earth Sci Rev. 72, 1-19 (2005).
  28. Konhauser, K. O. Bacterial iron biomineralisation in nature. FEMS Microbiol Rev. 20, 315-326 (1997).
  29. Toner, B., et al. Spatially resolved characterization of biogenic manganese oxide production. Appl Environ Microbiol. 71, 1300-1310 (2005).
  30. Miot, J., et al. Extracellular iron biomineralization by photoautotrophic bacteria. Appl Environ Microbiol. 75, 5586-5591 (2009).
  31. Bottero, S., Storck, T., Heimovaara, T. J., van Loosdrecht, M. C. M., Enzien, M. V., et al. Biofilm development and the dynamics of preferential flow paths in porous media. Biofouling. 29, 1069-1086 (2013).
  32. Dentz, M., Le Borgne, T., Englert, A., Bijeljic, B. Mixing, spreading and reaction in heterogeneous media: a brief review. J Contam Hydrol. 120-121, 1-17 (2011).
  33. Gerke, H. H. Preferential flow descriptions for structured soils. J Plant Nutr Soil Sci. 169, 382-400 (2006).
  34. Jimenez-Martinez, J., Nguyen, J., Or, D. Controlling pore-scale processes to tame subsurface biomineralization. Rev Environ Sci Biotechnol. 21, 27-52 (2022).
  35. Or, D., Smets, B. F., Wraith, J. M., Dechesne, A., Friedman, S. P. Physical constraints affecting bacterial habitats and activity in unsaturated porous media: a review. Adv Water Resour. 30, 1505-1527 (2007).
  36. Toyoda, K., Tebo, B. M. The effect of Ca2+ ions and ionic strength on Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. SG-1. Geochim Cosmochim Acta. 101, 1-11 (2013).
  37. Toyoda, K., Tebo, B. M. Kinetics of Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. SG-1. Geochim Cosmochim Acta. 189, 58-69 (2016).
  38. Learman, D. R., Wankel, S. D., Webb, S. M., Martinez, N., Madden, A. S., et al. Coupled biotic–abiotic Mn(II) oxidation pathway mediates the formation and structural evolution of biogenic Mn oxides. Geochim Cosmochim Acta. 75, 6048-6063 (2011).
  39. Bargar, J. R., et al. Biotic and abiotic products of Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. strain SG-1. Am Mineral. 90, 143-154 (2005).
  40. Mao, Q., Qin, W., Yan, B., Luo, L. Ferrous iron oxidation efficiency and kinetics by indigenous iron-oxidizing bacteria in acid mine drainage. Environ Technol Innov. 36, 103785 (2024).
  41. Farnsworth, C. E., Voegelin, A., Hering, J. G. Manganese oxidation induced by water table fluctuations in a sand column. Environ Sci Technol. 46, 277-284 (2012).
  42. Haukelidsaeter, S., et al. Efficient chemical and microbial removal of iron and manganese in a rapid sand filter and impact of regular backwash. Appl Geochem. 162, 105904 (2024).
  43. Li, C., et al. Immobilization of iron- and manganese-oxidizing bacteria with a biofilm-forming bacterium for effective removal of iron and manganese from groundwater. Bioresour Technol. 220, 76-84 (2016).
  44. Breda, I. L., Søborg, D. A., Ramsay, L., Roslev, P. Manganese removal processes during start-up of inoculated and non-inoculated drinking water biofilters. Water Qual Res J. 54, 47-56 (2019).
  45. Zhu, X., Wang, K., Yan, H., Liu, C., Zhu, X., et al. Microfluidics as an emerging platform for exploring soil environmental processes: a critical review. Environ Sci Technol. 56, 711-731 (2022).
  46. Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., de Anna, P., Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. ISME J. 13, 1700-1710 (2019).
  47. Aufrecht, J. A., Fowlkes, J. D., Bible, A. N., Morrell-Falvey, J., Doktycz, M. J., et al. Pore-scale hydrodynamics influence the spatial evolution of bacterial biofilms in a microfluidic porous network. PLoS ONE. 14, e0218316 (2019).
  48. Kurz, D. L., et al. Competition between growth and shear stress drives intermittency in preferential flow paths in porous medium biofilms. Proc Natl Acad Sci U S A. 119, e2122202119 (2022).
  49. Kurz, D. L., Secchi, E., Stocker, R., Jimenez-Martinez, J. Morphogenesis of biofilms in porous media and control on hydrodynamics. Environ Sci Technol. 57, 5666-5677 (2023).
  50. Borer, B., Tecon, R., Or, D. Spatial organization of bacterial populations in response to oxygen and carbon counter-gradients in pore networks. Nat Commun. 9, 769 (2018).
  51. Ceriotti, G., Borisov, S. M., Berg, J. S., de Anna, P. Morphology and size of bacterial colonies control anoxic microenvironment formation in porous media. Environ Sci Technol. 56, 17471-17480 (2022).
  52. Park, S., Anggraini, T. M., Chung, J., Kang, P. K., Lee, S. Microfluidic pore model study of precipitates induced by pore-scale mixing of an iron sulfate solution with simulated groundwater. Chemosphere. 271, 129857 (2021).
  53. Wielinski, J., et al. Spatiotemporal mineral phase evolution and arsenic retention in microfluidic models of zerovalent iron-based water treatment. Environ Sci Technol. 56, 13696-13708 (2022).
  54. Elmaloglou, A., et al. Microfluidic study in a meter-long reactive path reveals how structural heterogeneity shapes MICP-induced biocementation. Sci Rep. 12, 19553 (2022).
  55. Wang, Y., Soga, K., DeJong, J. T., Kabla, A. J. A microfluidic chip and its use in characterising particle-scale behaviour of microbial-induced calcium carbonate precipitation. Géotechnique. 69, 1086-1094 (2019).
  56. Wang, Y., et al. Microscale investigations of temperature-dependent microbially induced carbonate precipitation in the range 4–50 °C. Acta Geotech. 18, 2239-2261 (2023).
  57. Pucetaite, M., Ohlsson, P., Persson, P., Hammer, E. Shining new light into soil systems: spectroscopy in microfluidic soil chips reveals microbial biogeochemistry. Soil Biol Biochem. 153, 108078 (2021).
  58. Geszvain, K., McCarthy, J. K., Tebo, B. M. Elimination of manganese(II,III) oxidation in Pseudomonas putida GB-1 by a double knockout of two putative multicopper oxidase genes. Appl Environ Microbiol. 79, 357-366 (2013).
  59. Gehin, G., et al. Population-level control of two manganese oxidases expands the niche for bacterial manganese biomineralization. NPJ Biofilms Microbiomes. 11, 1-12 (2025).
  60. Ramos, G., Toulouze, C., Rima, M., Liot, O., Duru, P., et al. Ultraviolet control of bacterial biofilms in microfluidic chips. Biomicrofluidics. 17, 024107 (2023).
  61. Fadely, E. C., et al. Enhanced manganese oxidation at the biofilm–fluid interface drives pore-scale patterns in mineral precipitation. Environ Sci Technol. 60, 654-663 (2026).
  62. Lochovsky, C., Yasotharan, S., Günther, A. Bubbles no more: in-plane trapping and removal of bubbles in microfluidic devices. Lab Chip. 12, 595-601 (2012).
  63. Pereiro, I., Khartchenko, A. F., Petrini, L., Kaigala, G. V. Nip the bubble in the bud: a guide to avoid gas nucleation in microfluidics. Lab Chip. 19, 2296-2314 (2019).
  64. Gehin, G., et al. Pseudomonas putida coordinates the expression of two manganese oxidases and optimizes manganese oxide precipitation in response to aqueous Mn(II). Environ Sci Technol. 59, 13777-13786 (2025).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Pseudomonas Putida
פלטפורמה מיקרופלואידית לחקר משקעים מיקרוביאליים של תחמוצות מתכת במדיה נקבובית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.