ביציות עכברים בבגרות במבחנה, הפריה ותרבות עוברים לפני ההשתלה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר הליכים לבשלות חוץ-גופית של ביציות עכברים, הפריה חוץ-גופית , ותרבות עוברים לשלב הבלסטוציסט.

תקציר

הבשלה במבחנה של ביציות בעכברים, בשילוב עם הפריה חובנית ותרבות עוברים שלאחר מכן, מאפשרת יצירת עוברים לפני ההשתלה בתנאים מוגדרים. הליכים אלו מסייעים לחקור את התפקודים הביולוגיים והמנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הבשלה, הפריה והתפתחות מוקדמת של עוברים. עם זאת, היישום המוצלח של גישה זו תלוי בטיפול זהיר בביציות ובזרע, בתנאי תרבית מתאימים, ובהערכה מדויקת של התקדמות ההתפתחות בכל שלב. כאן, אנו מתארים שיטות לבידוד קומפלקסים של קומולוס–ביצית לא בשלים (COCs) משחלות העכברים, הבשלה חוץ-גופית של ביציות, הפריה חוץ-גופית , ותרבות עוברים במבחנה עד לשלב הבלסטוציסט. הליכים אלו כוללים הכנה ואיזון של כלי מדיה ותרבית, בידוד ובחירת COCs לאחר ניתוח שחלות, איסוף זרע וקיבולו שלהם, ביצוע הפריה בתנאים סטנדרטיים, ולאחר מכן גידול עוברים להערכת התפתחות. ההתקדמות ההתפתחותית מוערכת באמצעות קריטריונים מורפולוגיים, כולל היווצרות פרוגרוקליאים זכריים ונקביים, פיצול לשלב שני התאים, והיווצרות בלסטוציסטות. פרוטוקול זה יכול להשתלב במחקרים של בשלת ביציות ותפקוד גורם אימה, ומספק כלי חשוב למחקר בסיסי בביולוגיה הרבייתית של יונקים.

מבוא

הבנת איכות הביציות וכישורי ההתפתחות חיונית להפריה מוצלחת^{ולהתפתחות} עוברית ^1,2. הבשלה של ביציות דורשת לא רק הפרדה מדויקת של כרומוזומים במהלך הבגרה הגרעינית, אלא גם הבשלה ציטופלזמטית, כולל הפצת האברונים והצטברות mRNA וחלבונים אימהיים³. התפתחות עוברית מוקדמת מתבססת על mRNA וחלבונים שמסופקים על ידי האם, והמאגרים האימהיים בביצית מקיימים התפתחות לפני ההשתלה. עם זאת, הזהויות והפונקציות של רבים מהרגולטורים האימהיים של עובריות יונקים נותרו לא מובנים במלואם⁴. לכן, נדרשים מחקרים שיטתיים נוספים כדי להבהיר את המנגנונים שמאחורי הבשלה, הפריה והתפתחות העוברים.

העכבר הוא מערכת מודלים נפוצה לחקר התפתחות עוברים לפני ההשתלה. בגרות חוץ-גופית (IVM) מתייחסת לאיסוף ביציות לא בשלות מהשחלה ולהתבגרותן בתנאי מעבדה מבוקרים⁵. בהמשך, הפריה חוץ-גופית (IVF) מאפשרת לדגור ביציות בוגרות יחד עם זרע קיבולי ליצירת זיגוטים למחקרי התפתחות עוברית מוקדמים. עם זאת, בהשוואה להפריה חוץ-גופית קונבנציונלית המשתמשת בביציות בוגרות ב-vivo, ביציות שמקורן ב-IVM לעיתים קרובות מציגים שיעורי הבשלה וההפריה נמוכים יותר ויכולת התפתחותית נמוכה יותר⁶. מגבלות אלו מיוחסות בעיקר לאסינכרוניות בין בגרות גרעינית לציטופלזמה בתנאי תרבית מבחנה . יתרה מזאת, יציבות הציר המיוטי בביצי עכבר רגישה לשינויים ב-pH ובטמפרטורה במהלך IVM, והפרעה בציר עשויה לתרום לעצירת הבגרות⁷. כתוצאה מכך, הירידה ביכולת של ביציות שמקורן ב-IVM נותרה מחסום מרכזי, המגביל ייצור עוברים יעיל למחקרים התפתחותיים ומכניים.

עוברים לפני ההשתלה בעכבר ניתן גם לקבל על ידי איסוף זיגוטים שמקורם ב-vivo וגידול שלהם במבחנה (IVC). זיגוטים שמקורם ב-vivo שנאספו מהביציות מספקים נקודת התחלה יחסית מסונכרנת לניסויים המתמקדים באירועים לאחר ההפריה⁸. עם זאת, בשירת הביציות והצטברות גורמים אימהיים מתרחשים לפני ההפריה ב-vivo; לכן, זיגוטים שמקורם ב-vivo פחות נוטים למניפולציה ניסיונית של תנאי הבגרות או מאגרי האם כדי להעריך את השפעתם על התפתחות עוברים מאוחרת^{יותר 4}. לכן, אופטימיזציה של פרוטוקולי IVM ו-IVF ואימוץ נהלי הפעלה סטנדרטיים עם בקרת איכות קפדנית (למשל, ניהול קפדני של טמפרטורה, pH ונהלי טיפול) הם חיוניים למזעור שונות הקשורה לפרוצדורות ולהגן על מיומנות התפתחות הביציות והעוברים.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול IVM–IVF–IVC המפרט הכנת מדיה, בידוד ובחירת COCs, פרוצדורות IVM ו-IVF, ותרבות עוברים במבחנה (איור 1). הפרוטוקול כולל נקודות ביקורת מעשיות, ספציפיות לשלב לבקרת איכות שגרתית, כולל אקסטרוזיה של הגוף הקוטבי הראשון (PB1), יצירת פרוגרעינים זכריים ונקביים (2PN), פיצול בין שני תאים, והיווצרות בלסטוציסט. פרוטוקול זה מאפשר יצירת עוברים טרום-השתלה ניתנים לשחזור ויעילים בתנאים מוגדרים, התומך במחקרים מכניים, אופטימיזציה של תרביות ויישומים בהמשך בביולוגיה התפתחותית ורבייתית.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדית של אוניברסיטת Northwest A&F, סין (מספר היתר: 20230503).

1. תחזוקת בעלי חיים

1. רכשו נקבות מסוג בר C57BL/6 וזכרים DBA/2 ושמרו אותן בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים (SPF), עם מחזור בהיר-חושך של 12 שעות בטמפרטורה של 20–22 מעלות צלזיוס ולחות של 55% ± 10%. ספק תזונה לרבייה והשתתף מים בחופשיות. עכברי בית זכרים בודדים (זכר אחד בכל כלוב).

2. הכנת מדיה

1. להכנת תמיסת PMSG בנפח 50 IU/mL, יש להמיס 5,000 IU לסרום גונדוטרופין (PMSG) ב-100 מ"ל של מי מלח סטריליים עם בופר פוספאט (PBS).
   הערה: יש לחלק את התמיסה למנות חד-פעמיות של 1 מ"ל ולשמור אותן בטמפרטורה של –20 מעלות צלזיוס. הפשיר כל אליקו בטמפרטורת החדר מיד לפני השימוש.
2. להכנת מדיום תרבית IVM, הוסף את המרכיבים שמופיעים בטבלה 1 ל-100 מ"ל מדיום בסיס מדיום 199 (M199). כוונו את ה-pH ל-7.3–7.4, ואז סננו את המדיום דרך פילטר של 0.22 מיקרון לבקבוקי מדיום סטריליים. סמנו את הבקבוק כ"IVM" עם ראשי תיבות, תאריך ייצור ותאריך תפוגה, ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד חודש.
3. להכנת תמיסת היאלורונידאז של 0.1% (עם V/V), יש להמיס 10 מ"ג היאלורונידאז ב-10 מ"ל של מדיום M2.
   הערה: יש לאחסן באליקואטים חד-פעמיים של 1 מ"ל בטמפרטורה של –20°C וחמם ל-37 °C לפני השימוש.

3. הכנת מנות (איור 2)

הערה: התאימו את מספר טיפות IVM, IVF ו-IVC לפי מספר ה-COCs והעוברים הצפויים, תוך שימוש ב-20–30 COCs לכל 100 מיקרוליטר טיפה ל-IVM ו-IVF ו-20–30 עוברים לכל 100 מיקרו-ליטר עבור תרבית עוברים.

1. הכינו מספר מתאים של צלחות איסוף ביציות בגודל 35 מ"מ, שכל אחת מכילה 2 מ"ל מדיום M2 בתוספת 0.2 מ"מ 3-איזובוטיל-1-מתילקסנתין (IBMX). השתמשו בצלחת אחת לניקור שחלות ואיסוף COC (צלחת אחת לשתי נקבות), ואחרת לשטיפת COCs. חימום הכלים ל-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
2. הכינו מנות IVM.
   1. בצלחת של 60 מ"מ, יש להכין חמש טיפות של 100 מיקרו ליטר של מדיום IVM לכביסה (לסמן את הכלי כ"IVM wash").
   2. בצלחת נפרדת של 60 מ"מ, יש להכין מספר טיפות של 100 מיקרוליטר של מדיום IVM לצורך הבשלה (תתייג את המנה כ"IVM").
   3. הוסיפו בזהירות מספיק שמן מינרלי כדי לכסות את הטיפות, ואיזונו את הכלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5%_CO2 למשך לפחות שעתיים לפני תחילת איסוף הביציות.
3. הכינו מנות הפריה חוץ-גופית.
   1. בצלחת של 60 מ"מ, יש להכין טיפה או שתיים של 300 מיקרוליטר של מדיום תרבית עוברים מאוזן מראש לשחרור זרע וקיפול (יש לסמן את המנה כ"קיצוניות זרע").
      הערה: הטיפה השנייה מוכנה כמרזרבה למקרים שבהם תנועתיות הזרע בטיפה הראשונה אינה מספקת, יש לאסוף דגימת זרע אפידידימלית חדשה ולקיבול, או שיש לכוון את ריכוז הזרע לפני ההפריה.
   2. הכינו שתי מנות נפרדות בקוטר 60 מ"מ, כל אחת מכילה חמש טיפות של 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית מאוזן מראש לכביסה (תייגו את הצלחת כ"שטיפת IVF").
      הערה: השתמשו בצלחת אחת של "שטיפת IVF" לשטיפת COCs שהושפעו על ידי IVM לפני ההפריה, והשתמשו בצלחת "שטיפת IVF" השנייה לשטיפת זיגוטים משוערים לאחר הדגירה המשותפת להסרת תאי קומולוס ושאריות זרע.
   3. בצלחת נפרדת של 60 מ"מ, יש להכין מספר טיפות של 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית עוברים מאוזן מראש להפריה (לסמן את המנה כ"IVF").
      הערה: מדיום תרבית עוברים מאוזן מראש משמש הן לקיבוציית זרע והן להפריה לשמירה על תנאים עקביים במהלך הכנת הזרע וההפריה.
   4. הוסיפו בזהירות מספיק שמן מינרלי לכסות את הטיפות, ואיזונו את הכלים בטמפרטורה של 37°C באינקובטור עם_CO2 של 5% למשך לפחות 12 שעות לפני תחילת תהליך קיבוציית הזרע.
4. הכינו מנות IVC.
   1. בצלחת של 60 מ"מ, הכינו חמש טיפות של 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית עוברים מאוזן מראש לשטיפת עוברים (תייגו את הצלחת כ"שטיפת IVC").
   2. בצלחת נפרדת של 60 מ"מ, הכינו מספר טיפות של 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית עוברים מאוזן מראש לתרבית עוברים (יש לתייג את המנה כ"IVC").
   3. הוסיפו בזהירות מספיק שמן מינרלי כדי לכסות את הטיפות, ואיזונו את הכלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5%_CO2 למשך לפחות 12 שעות לפני תחילת תרבית העוברים.

4. אוסף שחלות

1. נתנו 10 IU PMSG תוך-פריטונית לעכברים נקבות בגיל 8–10 שבועות C57BL/6.
2. ב-48 שעות לאחר הזרקת PMSG, יש להמתים את העכבר באמצעות פריקה צווארית ולמקם אותו על הגב. רסס את הבטן ב-70% אתנול כדי להרטיב את הפרווה ולמנוע כניסה לחלל הבטן.
3. באמצעות מספריים דקים לניתוח, יש לבצע חתך קטן בעור התחתון של הבטן ולפתוח בעדינות את העור בידיים עם כפפות כדי לחשוף את ממברנת הפריטונאלית.
4. פתח את ממברנת הפריטונאלית והזיז בעדינות את המעי הצידה. אתר את קרן הרחם ועקוב אחריה לכיוון השחלה. זהה את השחלה ליד הכליה, בדרך כלל סגורה על ידי כרית שומן.
5. השתמשו במספריים דקים כדי להפריד את השחלה מקרן הרחם, ולגזום רקמות חיבור ושומן עודפים.
6. העבירי מיד את השחלות למדיום M2 מחומם מראש בתוספת IBMX. חזור על ההליך כדי לאסוף את השחלה הנגדית ולהעביר אותה לאותה צלחת.
7. הנח את המנה תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ והמשך בניקוב זקיקים ואיסוף COCs.

5. איסוף COCs ותרבות

1. מתחת למיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ, יש לנקב בעדינות זקיקי אנטרון גלויים עם מחט מזרקת סטרילית לשחרור COCs במדיום M2.
   הערה: בעת איסוף ביציות בשלב GV, מעדיפים לנקב זקיקים אנטרוליים גדולים לעין על פני השטח של השחלה, שלרוב נראים בולטים וחצי-שקופים עם חלל אנטרי שקוף.
2. באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית משוכה דק, אספו את ה-COCs ששוחררו והעבירו לצלחת נקייה בקוטר 35 מ"מ המכילה מדיום M2 מחומם מראש בתוספת IBMX.
3. שטפו את ה-COCs בהעברה סדרתית לאזור נקי בצלחת 35 מ"מ לפי הצורך כדי להסיר תאי גרנולוזה מנותקים ופסולת רקמה, ולהשאיר פסולת בכל העברה (איור 3).
   הערה: השתמשו רק ב-COCs עם שלוש שכבות קומולוס קומפקטיות או יותר וציטופלזמה גרגורית אחידה ללא רווחים ברורים לשלבים^{הבאים 9,10}. ביציות GV מעוטרות וביציות GV סגורות חלקית בקומולוס אינן כלולות בפרוטוקול זה. בתנאי הניסוי שלנו, התקבלו בממוצע 26 COCs לא בוגרים לכל נקבה.
4. לאחר פינוי הפסולת, העבר את ה-COCs לכלי השטיפה של IVM ושוטף אותם בהעברה רציפה דרך חמש טיפות של 100 מיקרוליטר של מדיום שטיפה IVM.
   הערה: במהלך ההעברות, יש למזער את נפח ההעברה כדי למנוע זיהום צולב בין הטיפות.
5. העבירו את ה-COCs שנשטפו לטיפות של 100 מיקרוליטר של מדיום IVM (20–30 COCs לטיפה) ולתרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5%_CO2 למשך 14 שעות.
   הערה: איסוף, שטוף והעברת COCs למדיום IVM עם עיכוב מינימלי כדי לסייע בשמירה על פוטנציאל התפתחותי.
6. (אופציונלי) לאחר IVM, דגרו לזמן קצר את ה-COCs ב-1 מ"ג/מ"ל היאלורונידאז והפיפט אותם בעדינות שוב ושוב עם מיקרופיפטה עד שתאי הקומולוס מוסרים לחלוטין.
   הערה: הגבילו את החשיפה להיאלורונידאז ליותר מ-3 דקות, שכן חשיפה ממושכת עלולה לפגוע בביציות.
7. (אופציונלי) שטפו את הביציות הנקיות במדיום M2 טרי על במה מחוממת, ואז העריכו את הבשלה תחת מיקרוסקופ סטריאו.
8. (אופציונלי) ביציות עם גוף קוטבי ראשון מופרש נחשבים לבוגרים ובשלב המטאפאזה II (MII). חשב את קצב הבשלות כמספר הביציות עם גוף קוטבי ראשון מופרז חלקי מספר הביציות הכולל שגודלו.
   הערה: שלבים 5.6–5.8 משמשים להערכת בשלת הביציות לאחר IVM על ידי הסרת קבוצת הערכה ייעודית לפני ציון PB1. צעדים אלו אינם נדרשים ל-COCs שממשיכים ישירות להפריה חוץ-גופית.

6. איסוף והכנת זרע

הערה: סעיף זה מתאר את איסוף והקיבולת של זרע טרי. לפני ההפריה, יש לדגור את הזרע הטרי בתווך תרבית עוברים מאוזן מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לאפשר קיפול.

1. הורד עכבר זכר בוגר אחד עם DBA/2 (גיל 10–16 שבועות) והסר את אפידידימידים הזנביים שלו, תוך הימנעות מכמות שיותר של שומן, דם ונוזל רקמה (איור 4).
2. לכל זכר, העבירו את שני אפידידימידים הזנביים לטיפה של 300 מיקרוליטר של מדיום G-IVF מאוזן מראש לשחרור וקיפול זרע.
3. הקישו את ה-cauda epididymis באמצעות זוג מלקחיים, בצעו חמישה עד שבעה חתכים באפידידימיס עם מחט מזרקת סטרילית, וסוחטים בעדינות את הרקמה לשחרור זרע מרוכז.
   הערה: הערך את תנועתיות הזרע והמשך רק כאשר רוב הזרע מראה תנועתיות פרוגרסיבית (PR), המוגדרת כתנועה פעילה קדימה, ולא תנועתיות לא פרוגרסיבית (NP) או אי-תנועה¹¹.
4. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO₂ במשך שעה אחת כדי לאפשר קיבולת זרע.

7. הפריה חוץ-גופית

1. לאחר 14 שעות של IVM, שטפו את ה-COCs בהעברה רציפה דרך חמש טיפות של 100 מיקרוליטר של מדיום שטיפת IVF, ואז העבירו את ה-COCs השטופים לטיפות ההזרעה של IVF (20–30 COCs לכל טיפה של 100 מיקרוליטר).
2. דגרו מראש את צלחת ההפריה המכילה COCs בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5%_CO2 למשך 30 דקות לפני ההפריה.
3. לאחר קיבול, קבעו את ריכוז הזרע באמצעות המוסיטומטר.
4. בהתבסס על ריכוז הזרע, יש לחשב את נפח החיסון הנדרש ולהוסיף זרע קיבולי לכל טיפה IVF כדי להגיע לריכוז סופי של 4 ×^{10 5} –1 × 10⁶ זרע למ"ל.
   הערה: לאחר הוספת זרע, ודאו שיש זרע נייד בכל טיפת הפריה.
5. דגרו את צלחות ה-IVF המכילות COCs וזרע בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% CO₂ למשך 4–6 שעות.

8. תרבות עוברים

1. לאחר 4–6 שעות של דגירה, יש להשתמש בפיפטה זכוכית מסוג פסטר משוכה דק עם קוטר פנימי מעט גדול מהביצית כדי לשאוב זיגוטים משוערים בנפח מינימלי ולהעביר אותם לטיפות הכביסה של ה-IVF.
2. שטפו את הזיגוטות המשוערות על ידי העברה רציפה דרך חמש טיפות שטיפות IVF, תוך פיפסת עדינות בתוך כל טיפה כדי להסיר עודפי זרע ופסולת (איור 5).
3. העבר את הזיגוטים המשוערים השטופים לצלחת ה-IVC ושוטף אותם בהעברה רציפה דרך חמש טיפות שטיפות שטיפת תרבית עוברים מחוממות מראש, כדי למזער את העברת המדיום IVF.
4. הניחו את הזיגוטים המשוערים בטיפות תרבית עוברים במדיום ותרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO₂ (20–30 עוברים ל-100 מיקרוליטר).
5. ב-6–8 שעות לאחר ההפריה, העריך את ההפריה תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ על ידי בדיקת נוכחות פרונוקליאים זכריים ונקביים, והשליכו ביציות ששומרות רק על גוף קוטבי אחד ואינן מראות פרוגרעינים נראים לעין.
6. ב-24 שעות לאחר ההפריה, ספרו את מספר העוברים הדו-תאיים וחשבו את קצב שני התאים כ(עוברים דו-תאיים / ביציות מופריות).
7. לאחר הספירה, הסר והשליך את העוברים הלא נחתכים, והמשך בטיפוח העוברים הנותרים.
   הערה: בשלב זה, העוברים עשויים לעבור ויטריפיקציה, להעביר לנקבות המקבלות, או להישמר בתרבית עד שלב הבלסטוציסט.
8. המשיכו לגדל את העוברים באותם תנאי דגירה עד 96 שעות לאחר ההפריה (hpi). הערכת היווצרות הבלסטוציסטים ב-96 hpi בהתבסס על קריטריונים מורפולוגיים.
   הערה: לא נדרש שינוי בינוני נוסף בתקופה זו. בלסטוציסט תקין מזוהה על ידי נוכחות חלל בלסטוקואל גלוי, מסת תא פנימית מובחנת ושכבת טרופקטודרם שלמה.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול זה, COCs של עכבר עובדו ברצף דרך בגרות חוץ-גופית , הפריה חוץ-גופית , ולאחר מכן תרבית עוברים במבחנה , מה שהוביל ליצירת עוברים טרום-השתלה ניתנים לשחזור ולהתפתחות לשלב הבלסטוציסט בתנאים שתוארו. לאחר 14 שעות של IVM, ה-COCs בדרך כלל הראו התרחבות קומולוס ומורפולוגיית ביצית שלמה. הבשלה מיוטית של הביציות נמדדה על ידי פירוק קבוצת הערכה ייעודית לאחר IVM וציון אקסטרוזיה PB1 (איור 6A). בשלושה שכפולים עצמאיים, שיעורי האקסטרוזיה ...

דיון

פרוטוקול זה מספק הליך סטנדרטי לבשלות ביצית במבחנה, הפריה חוץ-גופית ותרבות חוץ-גופית באמצעות COCs לא בוגרים, המאפשר יצירה והערכה ניתנים לשחזור של עוברים לפני ההשתלה בשלב הבלסטוציסט בתנאים מוגדרים במבחנה. במחקרים רבים, תוצאות IVM רגישות להבדלים ספציפיים במעבדה במדיה, זמני דגירה וטיפול, מה שעלול להפחית את הכשירות ההתפתחותית לאחר IVM^12,13. יישום פרוטוקול IVM–IVF–IVC באמצעות COCs לא בשלים הניב שיעור...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
35 מ"מ צלחת פטרי	Thermo Fisher Scientific	150255
60 מ"מ צלחת פטרי	Thermo Fisher Scientific	150270
אלבומין בקטרי	Sigma-Aldrich	A8806
דיאטת רבייה (תערובת מזון מכרסמים)	Keao Xieli (בייג'ינג, סין)	N/A
חממת CO2	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 150i
D-גלוקוז	Sigma-Aldrich	G7021
צינור פסטר חד פעמי	Kimble	DWK63A53WT-1000EA
גורם גדילה אפידרמי	Gibco	PHG0313
מספריים חדים לניתוח	Sigma-Aldrich	S3146-1EA
מלקטות עם קצה דק	Rhino	SW14
הורמון מגרה זקיק	Millipore	869001
G-1 PLUS	Vitrolife	10128
G-IVF PLUS	Vitrolife	10136	תרבות עובר (מאוזנת מראש)
המוציטו-מטר	Millicell	MDH-4N1
היאלורונידאז	Sigma-Aldrich	H4274
IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthine)	Selleck	S5836
תחליף סרום KnockOut	Gibco	A3181501
L-ציסטאין	Sigma-Aldrich	C7352
הורמון גונדוטרופין לוטאיניזי	Millipore	869003
מדיום M2	Sigma-Aldrich	M7167
מדיום 199	Gibco	11150-059
מיקרופיפטה	Gilson	F167350
שמן מינרלי	Sigma-Aldrich	M8410
תמיסת פוספט מאזנת	Gibco	20012027
גונדוטרופין מסרום סוסה בהריון	מפעל הורמונים שני בנינגבו (נינגבו, סין)	N/A
נתרן פירובט	Sigma-Aldrich	P4562
מיקרוסקופ סטריאו	Olympus	SZX10
בקבוקונים מדיום סטרילי	Nalgene	46600-586
מחט מזרק סטרילית	BD Biosciences	309623	1 מ"ל, 27G1/2
יחידת מסנן מזרק	Millipore	SLGP033R
לוח תרמו	Tokai Hit	TPi-SZX2X