אלגוריתם ניתוח צורה מכמת את המורפולוגיה המרחבית וההקשר של תרבית תאים דו-ממדית לתלת-ממדית לצורך כימות חדש של פנוטיפים

Summary

מאמר זה מסביר כיצד ניתן לכמת תכונות מורפולוגיות חדשות בתאים ואורגנואידים באמצעות טרנספורמציית הקואורדינטות הקוטבריות הדחוסות (LCPC), אלגוריתם מרחבי שאוסף תכונות שמדדים מסורתיים כמו שטח, נפח ושטח פנים אינם יכולים. נדונות שיטות עבודה מומלצות לכיוון צורה ויישור הצורה.

Abstract

מחקרים רבים הראו כי הפנוטיפ המורפולוגי של תא או אורגנואיד קשור לרגישותו לסוכנים אנטי-סרטניים. עם זאת, שיטות מסורתיות למדידת פנוטיפ מסתמכות על מדדים מרחביים כמו שטח, נפח, היקף ועוצמת אות, שפועלים אך מוגבלים. גישות אלו אינן יכולות למדוד תכונות קריטיות רבות של הקשר מרחבי, כגון כיראליות, תכונה של יד שמאל וימין. לא ניתן להשתמש בנפח כדי לרשום כיראליות כי לנעליים השמאלית והימנית יש את אותו עוצמה. למרות שההקשר המרחבי בצורת ציר הכירליות, כיוון הכבידה והקוטביות הוא אינטואיטיבי לבני אדם, המדדים המסורתיים בהם השתמשו ביולוגים תאיים, פתולוגים, רדיולוגים ואנשי למידת מכונה עד כה אינם יכולים ללכוד את הרעיונות הבסיסיים הללו. המרת הקואורדינטות הפולריות הדחוסות (LCPC) היא אלגוריתם חדשני שיכול ללכוד הקשר מרחבי שאין כמותו של מדד אחר. טרנספורמציית LCPC מתרגמת קווי מתאר דו-ממדיים (דו-ממדיים) לגל סינוסואידלי בדיד על ידי הצבת מערכת רשת שעוקבת אחרי נקודות החיתוך בין קווי המתאר לקווי הרשת. הוא הופך את הקונטור לרצף של זוגות של קואורדינטות בדידות, כאשר הקואורדינטה הבלתי תלויה (קואורדינטת x) מתאימה למיקומים עוקבים במרחב דו-ממדי. כל קואורדינטה תלויה (קואורדינטת y) מורכבת מהמרחק בין חיתוך קווי המתאר וקו הרשת למקור או קו הבסיס של מערכת הרשת. בצורת גל סינוסואידי בדיד, הטרנספורמציה פורייה המהירה מוחלת על הנתונים. בדרך זו, צורות התאים בתרבות תאים דו-ממדית ותלת-ממדית מיוצגות באופן שיטתי ורב-ממדי, מה שמאפשר סטרטיפיקציה כמותית חזקה שתחשוף תובנות לגבי עמידות לטיפול.

Introduction

תרבית אורגנואידים תלת-ממדית (3D) הוכיחה את עצמה כעדיפה על תרבית תאים דו-ממדית (2D) במחקות ביולוגיה בחיים ^1,2. אורגנואידים הפכו לבלתי נפרדים במחקר סרטן לסינון טיפולים יעילים ולהשגת תובנות על התקדמות המחלה 3,4,5,6. בעוד שידוע בביולוגיה של סרטן שהבדלים במורפולוגיה קשורים להתנהגות ביולוגית מובחנת של תאים ורקמות, התחום נשען על מדדי צורה מסורתיים שמוגבלים בהיקפו. מחקר זה מתאר אלגוריתם מרחבי חדשני שמכמת באופן אובייקטיבי תכונות מורפולוגיות עדינות בדיוק חסר תקדים, ועולה על גישות מסורתיות כמו שטח, נפח ושטח משטח.

הטרנספורמציה הקואורדינטית הפולרית הדחוסת (LCPC) הומצאה כדי לתאר באופן אובייקטיבי וכמותי מורפולוגיות מורכבות הנצפות בהיסטופותולוגיה של רקמות, במטרה לשפר את דירוג^פוליפי המעי הגס. הרצון להרחיב את הגישה הזו כדי ללכוד תכונות מרחביות מבוססות MRI מקרוסקופיות בפתולוגיות מוח, כגון הפרעה דו-קוטבית ומחלת אלצהיימר, הוביל להרחבות שהעמיקו אותה אף יותר. מחקר זה מתאר את הפרוטוקול שלב אחר שלב ואת שיטות העבודה המומלצות ליישום שתי גרסאות של טרנספורמציית LCPC: מערכת הרשת המקבילה ומערכת הרשת הרדיאלית, שלתיהן יש סקריפטים בקוד פתוח וסרטוני הדרכה.

מלבד שיטות גיאומטריות מסורתיות, קיימות הפשטות רבות שהיו יעילות למדידת צורות מורכבות של תאים ואיברים. אלה כוללים מדידת אקסצנטריות, סטייה, ניגודיות וקורטוזיס, יחד עם רגעי זרניקה ללכידת מעגליות, אסימטריה, אי-סדירות קצוות ומבנה קווי מתאר גלובלי ^8,9,10. ניתוח פרקטלי היה גם שימושי לצמצום קווי המתאר המרוכבים לערכים סקלריים, כמו ממד פרקטלי, שמודד עד כמה הקוטור לא סדיר, ולקונריות, שמודדת כיצד פערים לא סדירים נראים בהטרוגניות בקונטור^11,12. למדידת מרקם, שיטת מטריצת ההופעה המשולבת ברמה אפורה (GLCM) פופולרית למדידת ניגודיות, אנרגיה, הומוגניות, קורלציה ואנטרופיה^13,14. למרות שכל השיטות הללו מועילות, אף אחת מהן לא נועדה ללכוד הקשר מרחבי, כמו כיוון הכבידה, יד שמאל מול ימין, או מיקום מבנה התמיכה המרכזי שמשפיע על כיוון שינוי הצורה. יתרה מזאת, רבים מהם מייצרים ערך סקלרי יחיד או רק קומץ ערכים סקלריים לייצוג מידע מרחבי, ולכן המחקרים המצוטטים משתמשים בהם לעיתים קרובות בשילוב כדי להעריך צורות מורכבות.

טרנספורמציית LCPC תוכננה לייצר תכונות רבות ממדידה אחת ולאפשר הוספת סימנים מרחביים שמקודדים הקשר מרחבי לצורה, כמו כיוון הכבידה. השיטה הקרובה ביותר לטרנספורמציית LCPC⁷ פורסמה שנה לאחר¹⁵, וחולקת את אותו רעיון מרכזי כנקודת התחלה: יישום טרנספורם פורייה על קווי המתאר של התאים כדי למדוד צורה בצורת ספקטרום תדרים. עם זאת, טרנספורמציית ה-LCPC פותחה באופן עצמאי לשימוש באמצעות מערכות רשת נפרדות שנועדו לשמש יחד עם ידע על ההקשר המרחבי מחוץ לצורה הנמדדת. יתרה מזאת, ממציא טרנספורמציית LCPC מסביר בכתב יד זה כי ספקטרום התדרים המתקבל מכיל כמויות עצומות של מידע מרחבי נסתר. קובץ משלים 1 מכיל דיון נרחב בהקשרים מרחביים בביולוגיה שלרוב מתעלמים מהם כאשר משתמשים בשיטות המצוטטים, וכיצד ניתן ליישם את טרנספורמציית LCPC כדי ללכוד הקשר זה. לקוראים שנתוני הצורה שלהם לא מראים הבדל בין קבוצות ביקורת לקבוצות ניסוי, בין אם העיניים שלהם רואות הבדל בצורות, או שנתוני הצורה שלהם מראים הבדל קטן מאוד, למרות שהם חושדים שצריך להיות הבדל גדול יותר, כדאי לנסות את טרנספורמציית LCPC.

טרנספורמציית LCPC מספקת רמת דיוק חסרת תקדים במדידת מידע מרחבי, משום שהיא מייצגת צורות בממדים מרובים. בניגוד לשיטות מסורתיות, כמו שטח ונפח, שמניבות רק ערך סקלרי אחד לכל צורה (כלומר, 25^{ס"מ רבוע}), תוצאות טרנספורמציית LCPC יכולות להניב מספר אינדקסים, שכל אחד מהם מתאם להיבט מורפולוגי שונה של הצורה (כלומר, עיגול לעומת חדות פינות, חלקות לעומת משוננות של הקצוות). טרנספורמציית LCPC מתארת צורה דו-ממדית על ידי שכבת רשת של קווים ישרים החוצים את קווי המתאר שלה. לכל מערכת רשת יש מוצא (איור 1) או קו בסיס (איור 2) ממנו ניתן למדוד מרחק ליניארי. עיין באיורים 1B ו-2B לתרשימי זרימה פשוטים המתארים את האלגוריתם. כל נקודת חיתוך בין קווי הרשת לקווי המתאר של הצורה מזוהה. המרחק של כל חיתוך מחושב ביחס לקו הבסיס או למקור. בדרך זו, טרנספורמציית LCPC ממירה צורות דו-ממדיות לסדרה של זוגות קואורדינטות x-y עוקבים. קואורדינטת ה-x מייצגת את מיקום קו הרשת מאפס לאינסוף, בעוד קואורדינטת ה-y מייצגת את המרחק בין החיתוך לקו הבסיס או המוצא. בצורה זו, שהיא גל סינוסואידי בדיד, מוחל טרנספורם פורייה מהיר (FFT) להמרת הנתונים מ"תחום המיקום" לתחום התדר. אם קואורדינטת ה-x מייצגת זמן, אז "תחום המיקום" יהיה שקול ל"תחום הזמן" ביישומים הסטנדרטיים של FFT.

בעוד שמערכת הרשת הרדיאלית מודדת את המרחק של כל חיתוך ממוצא הרשת הרדיאלית (איור 1A), מערכת הרשת המקבילה תמיד מודדת את מרחק החיתוכים בהתייחסות לקו דמיוני משמאל לצורה (איור 2A). הסקריפט בקוד פתוח קובע את מיקום הקו המדומה הזה על ידי מציאת הפיקסל השמאלי ביותר של הקונטור ואז הזזת 10 פיקסלים שמאלה למיקום זה. כאן, קואורדינטת ה-x של מיקום זה הופכת לקו הייחוס שממנו מחושבים כל החיתוכים. כלל 10 הפיקסלים הזה הוא שרירותי, אך זו הסיבה שכל קווי המתאר שמנותחים על ידי סקריפט הקוד הפתוח למערכת הרשת המקבילה חייבים להכיל לפחות 15 פיקסלים של רווח לבן בכל ארבעת הצדדים.

בצורות דו-ממדיות עם קפלים או שכבות מרובות, קווי רשת עשויים לחצות את הקונטור יותר מפעם אחת. במקרה זה, מרחקי כל החיתוכים לאורך קו רשת מסוכמים לערך אחד. לכן, לכל קו רשת יש רק קואורדינטת x אחת וקואורדינטת y אחת. סכום זה מיוצג על ידי המונח "דחוס" בשם טרנספורמציית LCPC. העיבוד של צורה דו-ממדית לא ליניארית לגל סינוסואידי בדיד מיוצג על ידי המונח "ליניארי" בשם האלגוריתם. לבסוף, המונח "קואורדינטות פולריות" מופיע בשם האלגוריתם, משום שמערכת הרשת הראשונה שנוצרה הייתה רשת רדיאלית של 180 מעלות של קואורדינטות קוטביות⁷. גם לאחר שהבינו שהקואורדינטות הקוטביות והקרטזיות ניתנות להחלפה, שם האלגוריתם נשמר כפי שהוא. סעיף התודה מתאר את הסיבות האישיות שהניעו את ההמצאה וההרחבה של טרנספורמציית LCPC.

פרוטוקול 1 היה הרצף לקבלת הנתונים המוצגים באיור 3B, בעוד שפרוטוקול 2 היה הרצף לקבלת הנתונים המוצגים באיור 3C–D. השלבים בפרוטוקולים אלו מיושמים בסקריפטי פייתון נפרדים הזמינים במאגר GitHub "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶. פרוטוקול 1 הוא דוגמה לשלבי קדם-עיבוד ליצירת "צורה טהורה" כהכנה לטרנספורמציית LCPC. פרוטוקול 2 הוא דוגמה לשלבי קדם-עיבוד למדידת צורות "בקנה מידה", כלומר בקנה המידה המקוריים שלהן יחסית זה לזה.

ניתן לבצע סגמנטציה ידנית בתוכנות עיבוד תמונה, כמו Preview של Mac או Paint של מיקרוסופט, או באמצעות שיטות מבוססות סף. אם עושים זאת ידנית, יש לבחור אחד מארבעת הצבעים הבאים: כחול, ירוק, ורוד/מג'נטה או אדום. מאגר GitHub שנקרא "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶ מכיל תיקייה בשם "סקריפטים של חילוץ צבע". תיקייה זו מכילה ארבעה קבצי Jupyter Notebook עם קוד פייתון שמחלצים את ארבעת הצבעים שהוזכרו קודם וממירים אותם למסכות כחולות על רקע לבן. תהליך זה יכול להתבצע גם על ידי סף צבע המתאר בתוכנת עיבוד תמונה כמו Fiji/ImageJ. לתמונות שמכילות קווי מתאר עם גבולות נוגעים או קצוות חופפים (למשל, דיאגרמת ון), יש להפריד אותן באמצעות תוכנת עיבוד תמונה, כך שיהפכו לאובייקטים עצמאיים בתמונת המסכה המורכבת המכילה קווי מתאר אורגנואידים מרובים. זה לא חל על תמונות שמכילות רק אורגנואיד אחד או על מספר אורגנואידים שאינם נוגעים זה בזה.

Protocol

התאים האנושיים הראשוניים ששימשו במחקר זה הושגו וגודלו תחת אישורי אתיקה ונהלי הסכמה מדעת שדווחו^{קודם לכן 17}. התמונות המוצגות כאן נוצרו מתרביות תאים מאושרות ופורסמו לראשונה. דגימות רקמה נאספו בבית החולים בריגהם וומן ובאוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו לפי פרוטוקולים שאושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) ממטופלים שנתנו הסכמה מדעת לשימוש מחקרי ברקמות שלהם, כפי שתואר קודם¹⁷. לא בוצע איסוף דגימות אנושיות נוספות למחקר זה.

1. חילוץ הצורה הטהורה של קווי המתאר האורגניים הדו-ממדיים עבור טרנספורמציית LCPC

1. חלקו את הקצה החיצוני של כל אורגנואיד באמצעות כל תוכנת עיבוד תמונה, כמו Paint של מיקרוסופט, Preview של MacOS, או Fiji/ImageJ.
2. הוציא את קווי המתאר של האורגנואידים כמסכות פתוחות בצורת קווים כחולים על רקע לבן.
3. בודדו כל קווי מתאר כחולים על קנבס לבן משלו.
   הערה: שלב זה נחוץ רק אם תמונה מכילה יותר מקוטור אחד.
4. חתוך כל קווי מתאר כך שיהיה שוליים של פיקסל אחד בכל ארבעת צידי האובייקט הכחול.
5. הוסף 100 פיקסלים של רווח לבן בכל ארבעת הצדדים כדי ליצור שוליים חדשים.
6. סובב את העצמים כך שהאורך הפנימי הארוך ביותר יהיה אופקי.
   הערה: שלב זה הופך את הקו הפנימי הארוך ביותר בתוך כל אובייקט לרוחב האובייקט. ישנם שני תסריטים זמינים למטרה זו. לצורות סגורות, השתמש במחברת Jupyter בשם "Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb". לצורות פתוחות או צורות עם מספר רכיבים, השתמש במחברת Jupyter בשם "Rotate Green Line_v3.ipynb". לכלי Rotate Green Line יש מדריך וידאו שמקושר בקובץ ReadMe שנמצא באותה תיקייה כמו קובץ .ipynb.
7. חתוך כל תמונה כך שיהיה שוליים של פיקסל אחד בכל ארבעת הצדדים של האובייקט הכחול.
   הערה: זה זהה לשלב 1.4. המטרה של החיתוך הפעם, עם זאת, היא שהשלב הבא בשינוי גודל יקנה את גודל כל הקנבס, לא רק את האובייקט הכחול שבו. לכן, על ידי הפיכת האובייקט הכחול כמעט לאותו רוחב וגובה כמו הקנבס עצמו, שינוי גודל הקנבס לרוחב 400 פיקסלים גם משנה את גודל האובייקט לכמעט 400 פיקסלים. יש מחברת Jupyter בשם "Trim margin to 1-pixel border.ipynb".
8. שנו את רוחב הקנבס של כל תמונה ל-400 פיקסלים, תוך הגבלת יחס הגובה-רוחב.
   הערה: שלב זה גורם לכל אובייקט להיות באותו רוחב. הגבלת יחס הגובה-רוחב מונעת עיוות של האובייקט במהלך שינוי הגודל. קיים Jupyter Notebook בשם "Resize width to 400 pixels but constrain ratio.ipynb".
9. הוסף 100 פיקסלים של רווח לבן בכל ארבעת הצדדים כדי ליצור שוליים חדשים.
10. סובבו כל תמונה ב-90 מעלות בכיוון השעון או נגד כיוון השעון כדי להפוך את האורך הפנימי הארוך ביותר לאנכי, בהתאם לבחירה בכל התמונות.
    הערה: ברצף הנ"ל, צורה טהורה מתקבלת על ידי יישום רציף של שלבים 1.6, 1.7, 1.8 ו-1.9. הוספת מרווח מרווחים בשלב 1.9 נדרשת כדי למנוע שגיאות בסקריפטי הטרנספורמציה של LCPC שיבוצעו בהמשך, אך אינה מעורבת בהפקת הצורה הטהורה. משתמשים המעוניינים למדוד צורות "בקנה מידה בקנה מידה" אינם חייבים לבצע את שלבים 1.6, 1.7 ו-1.8 ברצף הנ"ל, אך עדיין עליהם לעבד מראש את תמונות המסכה כדי להגיע לכיוון אופטימלי לפני יישום טרנספורמציית LCPC.
11. בצע את טרנספורמציית LCPC על כל קו מתאר. השתמש בסקריפטים של פייתון שסופקו עבור שיטת הרשת הרדיאלית¹⁸ או שיטת הרשת המקבילה¹⁹.

2. הפקת צורה בקנה מידה של קווי מתאר אורגנואידים דו-ממדיים עבור טרנספורמציית LCPC

הערה: שיטת שלב אחר שלב לחילוץ הצורה בקנה מידה של אובייקטים דומה לזו של חילוץ צורה טהורה בפרוטוקול 1 לעיל. השלבים נקראים זהים בשני הפרוטוקולים לנוחות ההתאמה. אנא עיין בהערות בפרוטוקול 1 עבור כל שלב. ההבדל העיקרי בין צורה טהורה לצורה בקנה מידה הוא שצורה בקנה מידה לא דורשת שלבים 1.6, 1.7 ו-1.8, שהם שלבי שינוי הגודל.

1. חלקו את הקצה החיצוני של כל אורגנואיד. השתמש בגישה חישובית או עשה זאת ידנית באמצעות תוכנת עריכת תמונות בסיסית, כמו Paint של מיקרוסופט, Preview של MacOS, או Fiji/ImageJ.
2. הוציא את קווי המתאר של האורגנואידים כמסכות פתוחות שהם קווים כחולים על בד לבן. השתמש ב-Fiji/ImageJ לחילוץ מסכות או בסקריפט פייתון^{שסופק 16}.
3. בודדו כל קווי מתאר כחולים על קנבס לבן משלו. השתמש ב-Fiji/ImageJ לחילוץ מסכות או בסקריפט פייתון^{שסופק 16}.
4. חתוך כל קווי מתאר כך שיהיה שוליים של פיקסל אחד בכל ארבעת צידי האובייקט הכחול. השתמש ב-Fiji/ImageJ או בסקריפט Python שסופק¹⁶.
5. הוסף 100 פיקסלים של רווח לבן בכל ארבעת הצדדים כדי ליצור שוליים חדשים. השתמש ב-Fiji/ImageJ או בסקריפט Python שסופק¹⁶.
6. סובב כל קווי מתאר כך שהקו הפנימי הארוך ביותר שלו יהיה אנכי. השתמש ב-Fiji/ImageJ או בסקריפט Python שסופק¹⁶.
7. בצע את טרנספורמציית LCPC על כל קו מתאר. השתמש בסקריפטים של פייתון שסופקו עבור שיטת הרשת הרדיאלית¹⁸ או שיטת הרשת המקבילה¹⁹.

Results

טרנספורמציית הרשת הרדיאלית LCPC המיושמת על אורגנואידים של סרטן השד

אורגנואידים תלת-ממדיים וגידולים יכולים לאמץ מגוון צורות, שחלקן שונות באופן ברור מהעין האנושית, אף על פי שמדדים מסורתיים מציבים הבדלים סטטיסטיים זئيרים. מצד שני, אורגנואידים יכולים גם להציג צורות שנראות הטרוגניות, ולכן לא משמעותיות, לעין האנושית, ומסתירות מורפולוגיות עדינות שמופיעות שוב ושוב המייצגות תת-סוגים מובחנים. אורגנואידים ראשוניים של שד אנושיים הופקו ממטופלות וגודלו בתלת-ממד בהתאם לפרוטוקול שפורסם קודם^לכן 17,20,21. איור 3A מציג שלוש קטגוריות מורפולוגיות הנגישות בהתבסס על בדיקה ויזואלית: פנוטיפ ציסטי, פנוטיפ פוליציסטי, ופנוטיפ פוליציסטי צפוף. איור 3B מראה כי קווי המתאר החיצוניים של אורגנואידים אלו חולקו ידנית וצורתם הטהורה הופקה, מה שמבטל את השפעת הגודל על צורתם. מכיוון שהקווים היו מעגליים מטבעם, הוחל טרנספורמציית LCPC ברשת רדיאלית על הצורות הטהורות, ואחריה PCA. יש לשים לב שהקווים המונחים על איור 3B סובבו כך שהקו הפנימי הארוך ביותר הוא אנכי, כלומר הכיוונים שלהם אינם זהים לאלו שבתמונות המקור. איור 3B מציג גרף נקודות של שני הרכיבים העיקריים הראשונים (PCs), ואשכול K-means זיהה שלושה אשכולות: 0, 1 ו-2. ציוני סילואט (SS) אישרו את קיומם הסביר של שני אשכולות נפרדים בין אשכולות 0 מול 1 (SS = 0.68) ואשכולות 1 נגד 2 (SS = 0.69), תוך הצבעה על הפרדה חלשה בין אשכולות 0 מול 2 (SS = 0.27). למרות ציון הצללית החלש בין אשכולות 0 ו-2, תיוג נקודות הנתונים עם הצורה הטהורה של כל נקודת נתונים מצדיק כי אשכול 2 מייצג את הפנוטיפ המובחן ביותר: קווי מתאר אסימטריים מאוד, לא מעגליים (עובי הקונטרים אינו משנה במקרה זה).

בעוד שצורה טהורה מבטלת את השפעת הגודל על הצורה, דבר שאינו אפשרי במדידת שטח ונפח, מדידת קווי המתאר האורגנואידיים בקנה מידה גדול גם חושפת תובנות מעניינות. איור 3C מציג גרף נקודות תלת-ממדיות של שלושת המחשבים הראשונים, הנובע מהטרנספורמציה של LCPC ברשת רדיאלית שבוצעה על קווי מתאר כאשר הם חולקו מהתמונות ללא שינוי גודל. גישה זו משמעותה שהטרנספורמציה של LCPC מודדת הן את הצורה והן את גודל האורגנואידים בו-זמנית. איור 3C מראה כי האורגנידים הפוליציסטיים והצפופים פחות צפופים ביחס לאורגנואידים הציסטיים. כדי לכמת את ההרחבה הזו, איור 3D מציג את הפיזור של כל פנוטיפ במרחב ה-PCA המשותף שלו. המרחק הממוצע בין K-nearest (KNND) מחושב עבור כל פנוטיפ, מה שתומך בהערכה ויזואלית של ירידה בצפיפות הנקודות שעוברות מאורגנואידים ציסטיים (KNND = 1.061) לאורגנידים פוליציסטיים (KNND = 1.575) ועד לאורגנואידים פוליציסטיים צפופים (KNND = 2.247); ירידה בצפיפות הנקודות יכולה גם להתפרש כהטרוגניות מורפולוגית מוגברת של קווי המתאר החיצוניים. לבסוף, להשוואה בין טרנספורמציית LCPC למטריקה המסורתית של שטח, איור 3E מראה כי למרות שיש מובהקות סטטיסטית בין שטח אורגנואידים ציסטיים לעומת אורגנואידים פוליציסטיים צפופים (p = 0.016, מבחן סכום דירוג וילקוקסון), אין אינדיקציה על בסיס שטח לכך שיש שלוש קבוצות מורפולוגיות מובחנות בין הפנוטיפים כפי שזוהו על ידי אשכולות K-means לאחר ניתוח LCPC צורה טהורה (איור 3B) או שיש הטרוגניות מורפולוגית הולכת וגדלה כפי שמודגם בניתוח LCPC בקנה מידה רחב (איור 3C–D). איור 3E מציג פיזור הולך ופוחת של נקודות הנתונים הנעות מציסטיקה לפוליציסטית ועד לאורגנואידים פוליציסטיים צפופים, שזה ההפך ממה שנצפה בניתוח LCPC בקנה מידה רחב (איור 3C), ומדגיש שהמידע המרחבי שנקלט על ידי טרנספורמציית LCPC שונה מהשטח שנלכד.

אותה גישה חלה על צורות דו-ממדיות בודדות באיור 3, ואיור משלים 1 חלה גם על קווי המתאר של תאים בתרבות תאים דו-ממדית: תאים בודדים (כגון תאי דם אדומים) או אשכולות תאים (כמו בבדיקות פאפ צוואר הרחם). מחקרי פיילוט לכל אחד מהמקרים הללו מתוארים בסרטונים: ניתוח צורה של אורגנואידים במוח שמפגינים דרגות שונות של קיפול בקונטור החיצוני^{שלהם 22}; ניתוח צורה של נאדיות ריאות במקום, ניתן ליישם את אותם עקרונות בניתוח תרבית תאים דו-ממדיים²³; ניתוח צורה של רקמת צוואר הרחם ממריחות פאפ שבהן גם קווי המתאר של הגרעין וגם של ממברנת התא מכומתים בו-זמנית באמצעות טרנספורמציית LCPC²⁴ ברשת הרדיאלית; ניתוח צורה של תאי דם אדומים שנדבקו במלריה ותאים סמוכים לתאים נגועים אך אינם נגועים בעצמם²⁵; ניתוח צורה של תאי דם אדומים המושפעים ממחלת תאי הדם החרמשיים²⁶.

מערכת הרשת המקבילה למדידת צפיפות או מרקם כאינדקס של מידע מרחבי

מידע מרחבי כולל יותר מהמושגים הרגילים של צורה, כמו ריבוע, עיגול ועקמומיות, כי הוא כולל מושגים כמו מרקם וצפיפות. רשתות צינוריות מורכבות, כמו כלי דם, או רשתות מתפצלות, כמו סיבים ציטוסקלטיים, אינן מתאימות למושג הצורה באותו מובן כמו האינטואיציה שלנו המבוססת על גאומטריה לגבי צורות, כמו מעגלים ופוליגונים. עם זאת, צפיפות ומרקם הם מושגים שימושיים מאוד של מידע מרחבי להבנת המבנה והתפקוד של תאים, אורגנואידים וגידולים. בטיפול כיצד לכמת רשתות מורכבות בהדמיית פלואורסצנציה, ביולוגים של תאים מודדים תכונות כמו עוצמת האות הממוצעת בתוך תמונה או אחוז השטח הכולל של התמונה שמכיל אות. גישות אלו מכירות בכך שיש מידע מרחבי יותר ממה שמתואר במונחים של מוטיבים גיאומטריים.

דפוס רשתות כלי הדם בתוך רקמות, גידולים ואיברים על שבב אינו מוגדר בקלות על ידי מוטיבים גיאומטריים מסורתיים, אך הוא נהנה מהפרשנות כמרקם וצפיפות. שיקום כלי דם בהתפתחות גידולים ועמידות לטיפול הוא מאפיין מבוסס היטב של סרטן (נבדק^ב-27). חתכים היסטופתולוגיים של 458 גידולים נוירובלסטיים ראשוניים נותחו²⁸, ואפיינו את הצפיפות, הגודל והצורה של כל כלי הדם והמקטעים הווסקולריים. הם מצאו כי כלי הדם היו גדולים יותר, נפוצים יותר ובעלי צורה לא סדירה יותר בגידולים של מטופלים עם גורמים פרוגנוסטיים גרועים בהשוואה לגידולי הקבוצה המועדפת. מעניין לציין כי מונח בשם "כלי דם שעטפו אשכולות גידול" (VETC)²⁹ נטבע כדי לתאר דפוס של כלי דם המקיפים אשכולות של גידולים קטנים בתוך קרצינומה כבדית גדולה יותר וקשורים לשיעורי גרורות וחזרות גבוהים יותר. אותה קבוצה שטבעה את המונח קבעה מאוחר יותר כי קרצינומה כבדית חיובית ל-VETC קשורה לתגובה חיובית לטיפול במעכב הקינאז סורפניב³⁰. לכן, היכולת לכמת דפוסי כלי דם חיונית לתחזית ולהבנת מנגנוני העמידות.

לכימות רשתות צפופות של צינורות, איים וענפים, מערכת הרשת המקבילה של טרנספורמציית LCPC שימושית למדידת מה שניתן לכנות צפיפות טקסטורה, במקום צורה. כדוגמה לאופן שבו טרנספורמציית LCPC ברשת המקבילה יכולה לעשות זאת, איור 4A מציג דפוסי מיקרו-כלי דם קרדיאליים ממחקר על כלי דם לבבי³¹: לעין בלתי, הבחנה אובייקטיבית וכמותית בין האזורים המאוטמים לאזורים המרוחקים מאתר הפציעה היא קשה מאוד. על ידי הוצאת מסכת כלי הדם (איור 4A שלב 1) ויישום טרנספורמציית LCPC ברשת המקבילה, ניתן להבחין בהבדלים כמותיים. ראשית, כדי לשפר את ניקיון הנתונים, כל תמונה נחתכה במעגל בקוטר אחיד, שממוקם במרכז התמונה הריבועית (איור 4A שלב 2), מה שמבטיח שלכל תמונה יהיו אותו גובה ורוחב ללא קשר לסיבובים. לאחר מכן, התמונות החתוכות מסובבות כך שציר הכלים הראשי (חצים כפולים אדומים באיור 4A שלב 1) הוא אנכי (איור 4A שלב 3). לאחר מכן, קו כחול מוחל על היקף התמונה כדי להבטיח שגם תמונות עם דפוסי כלי דם דלילים יהיו באותו קוטר במונחים של פיקסלים כחולים (איור 4A שלב 4). שלבים 3 ו-4 בוצעו באמצעות תוכנת Fiji/ImageJ (v2.14.0). לבסוף, מופעל טרנספורמציית LCPC ברשת מקבילה (איור 4A שלב 5). ניתוח התוצאות באמצעות PCA והצגת שלושת ה-PCs הראשונים מגלה שהאזורים המאוחדים מתקבצים בנפרד מהאזורים המרוחקים (איור 4B). חישובי מרחק המפר (CD) מכמתים את הדפוסים הוויזואליים המוצגים בגרפים. ביום אחד לאחר הפציעה, האתר האוטמי מציג דפוס כלי דם שרחוק יותר מהמצב הבסיסי (בסיסי לעומת 1Day_infarct: CD = 83.89) מאשר האתר הלא פגוע (בסיסי לעומת 1Day_remote: CD = 53.95). ביום אחד לאחר הפציעה, האתר המרוחק הלא-פצוע קרוב יותר לאתר הפגוע (1Day_remote לעומת 1Day_infarcxt: CD = 34.48) מאשר למצב הבסיסי. לאחר 3 ימים לאחר הפציעה, דפוסי כלי הדם של האתר הפגוע והאתר המרוחק הלא פגוע מציגים סטייה דרסטית מהמצב הבסיסי ומהמצב הבסיסי ומזה מזה (Basal לעומת 3Days_Infarct: CD = 240.63; בסיס מול 3Days_Remote: CD = 67.28; 3Days_Remote לעומת 3Days_Infarct: CD = 168.35). מעניין מאוד, שבשבעה ימים לאחר הפציעה, דפוסי כלי הדם של האתר הפגוע והאתר המרוחק הלא-פצוע תופסים מרחב תלת-ממדי שהוא בערך אורתוגונלי למצב הבסיסי, בעוד שהם מיושרים זה עם זה במרחק קרוב יותר מאשר ביום אחד לאחר הפציעה (CD = 24.76 ליום 7 לעומת 34.48 ביום 1). הנתונים מצביעים על שני דברים: (1) ככל שתהליך ההחלמה, דפוס כלי הדם של האתר הפגוע והאתר המרוחק הלא-פגוע מאמץ דפוסים המובחנים מהמצב הבסיסי; (2) תוכנית השיקום שמופעלת באתר הפגוע גם גורמת לשינויים מורפולוגיים דומים באתרים המרוחקים הלא-פצועים המשויכים להם.

כהפניה לגמישות של טרנספורמציית LCPC, חושבו המדדים המסורתיים של אחוז שטח (איור 5A) והיקף כולל (איור 5B) של כלי הדם. בעוד שהשטח וההיקף חושפים שינויים בין נקודות במסלול הזמן, הם אינם מספקים כימות קוהרנטי של סידורים מרחביים מובחנים של כלי שיט שונים. השטח וההיקף הם הפשטות שיכולות לייצג סידורי כלי דם שונים ולכן אינם מלמדים כיצד הסידור המרחבי של כלי הדם משתנה לאורך תנאי הטיפול ובמהלך הזמן. עם n = 3 לכל קבוצה, מבחן t ומבחן וילקוקסון אינם אמינים. ה-Cliff's Delta הוא לא פרמטרי ועובד היטב כדי להראות שינוי בגודל האפקט. ההבדל העיקרי שמתגלה במדידת אחוז שטח כלי הדם הוא בין המצב הבסיסי לבין נקודות הזמן של 7 הימים; לגבי היקף כלי הדם הכולל, ההבדלים הם בין מצב בסיסי לעומת יום אחד ומצב בסיסי לעומת 7 ימים. עם זאת, השטח וההיקף אינם מספקים אינדיקציה להבדלים בין האתרים המאוטמים לבין האתרים המרוחקים הלא פגועים, דבר מפתיע מאוד בהתחשב בכך שהאתר המאוחד נפגע בכוונה. כאן מתגלה הרב-גוניות של טרנספורמציית LCPC בהשוואה למדדים מסורתיים. עבור כל דגימה, תוצאות ה-FFT כחלק מטרנספורמציית LCPC מייצרות סט של גדלים המשויכים לקבוצת תדרים. ניתן לממוצע את הגודל של כל תיבת תדר ואז להשוואה בין קבוצות הטיפול (איור משלים 1). זה מאפשר הערכה פשוטה של אילו תיבות תדר מציגות את ההבדלים הגדולים ביותר בין קבוצות הטיפול. איור 5C מציג שישה מיכלים שמציגים הבדלים ברורים בגודל האפקט בין קבוצות טיפול שונות, במיוחד בין האתרים המאוטמים לבין האתרים המרוחקים שאינם פגועים, אשר האזור וההיקף שצוינו לא היו בהם הבדל. הערכים הבלתי תלויים בששת המיכלים הללו מספקים אינדקסים מרובים שמראים הבדלים כמותיים בין תנאי הטיפול. מעניין לציין שהדפוס בין הקבוצות עבור Bin 1 של תוצאות הטרנספורמציה של LCPC דומה לתוצאה שהתקבלה ממדידת ההיקף הכולל. המדדים האחרים, לעומת זאת, חושפים הבדלים כמותיים המוסתרים הן בשטח והן בהיקף. אינדקסים ייחודיים למצב הבסיסי: Bin 49, Bin 56, Bin 21. מדדים ייחודיים בין קבוצות יום 1: Bin 1, Bin 6, Bin 49. אינדקסים ייחודיים לקבוצות יום 3: Bin 6, Bin 112, Bin 49. מדדים ייחודיים לקבוצות יום 7: Bin 6, Bin 49, Bin 112. נתונים אלו מדגישים את הרב-גוניות והדיוק של טרנספורמציית LCPC לעומת הגישות המסורתיות של שטח והיקף.

איור 1: תיאור מערכת הרשת הרדיאלית של טרנספורמציית LCPC. (א) שלב 1: הצורה המעניינת מחולקת ומופקת כמסכה כחולה. שלב 2: קופסת הגבלה (המכונה גם המלבן הקטן ביותר שמכסה ונוגע באובייקט מכל ארבעת הצדדים) נקבעת למסכה. מערכת של קווי רשת רדיאליים שמקורם במרכז תיבת הגבול מונחת על המסכה. ההחלטה לבחור את מרכז תיבת הגבול במקום מרכז האובייקט כמקור הייתה שרירותית. שלב 3: המרחק של כל חיתוך בין קו רשת לצורה מחושב ביחס למקור. קווי רשת שיש להם יותר מחליפה אחת מסכמים את כל מרחקי החיתוך לערך אחד עבור אותו קו רשת. שלב 4: ה-FFT מיושם כדי להמיר את הנתונים משלב 3 לגרף תדר, ייצוג סטטי רב-ממדי (שלב 5) של הצורה בשלב 1. שלב 6: ניתן ליצור ערך סקלרי מתוך שלב 5 באמצעות אינדקס. ראו איור 10 לדיון על סוגי אינדקסים לחישוב. (B) תרשים זרימה המציג תיאור פשוט של שלבי טרנספורמציית LCPC עבור מערכת הרשת הרדיאלית. (ג) דוגמאות לנושאי צורה שלגביהם מערכת הרשת הרדיאלית אופטימלית. הצורות צוירו ב-Microsoft PowerPoint. תמונות אלו נוצרו על ידי מחברים ואינן דורשות רישיון פרסום או הרשאות זכויות יוצרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 2: תיאור מערכת הרשת המקבילה של טרנספורמציית LCPC. (A) שלב 1: הצורה המעניינת מחולקת ידנית ומופקת כמסכה בינארית. שלב 2: מערכת רשת מקבילה מונחת על הצורה, שמסובבת כך שהבסיס אופקי. שלב 3: המרחק של כל חיתוך בין קו רשת לצורה מחושב ביחס לקו הבסיס. קווי רשת שיש להם יותר מחליפה אחת מסכמים את כל מרחקי החיתוך לערך אחד עבור אותו קו רשת. שלב 4: ה-FFT מיושם כדי להמיר את הנתונים משלב 3 לגרף תדר, ייצוג סטטי רב-ממדי של הצורה בשלב 1. שלב 6: ניתן ליצור ערך סקלרי מתוך שלב 5 באמצעות אינדקס. ראו איור 10 לדיון על סוגי אינדקסים לחישוב. (B) תרשים זרימה המספק תיאור פשוט של שלבי ההמרה של LCPC עבור מערכת הרשת המקבילית. (ג) דוגמאות לנושאי צורה שעבורם מערכת הרשת המקבילה אופטימלית. הצורות צוירו ב-Microsoft PowerPoint. תמונות אלו נוצרו על ידי מחברים ואינן דורשות רישיון פרסום או הרשאות זכויות יוצרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3: טרנספורמציית LCPC מזהה באופן אובייקטיבי תת-סוגים מורפולוגיים של אורגנואידים של סרטן השד. (א) אורגנידים ראשוניים של שד אנושיים נגזרו כפי שדווח קודם 17,20,21 וכפי שמתואר בתיק המשלים 1. ניתן היה לצפות ולסווג שלושה פנוטיפים בהתבסס על בדיקה ויזואלית: ציסטי, פוליציסטי, ופוליציסטיק צפוף. פס קנה מידה = 50 מיקרון. (B) קווי המתאר החיצוניים של האורגנואידים חולקו ידנית (איור משלים 2; קריטריונים מתוארים בתיק המשלים 1), והצורה הטהורה של קווי המתאר הללו התקבלה. יש לשים לב שהקווים המתארים בדיאגרמה מסובבים כך שהקו הפנימי הארוך ביותר הוא אנכי; לכן, הם אינם תואמים את הנטייה המקורית שלהם. לאחר מכן הוחל טרנספורמציית LCPC ברשת רדיאלית, והתוצאות נותחו באמצעות PCA. קיבוץ K-means זיהה שלושה אשכולות (0, 1 ו-2), וציוני סילואט (SS) חושבו כדי לאשר את קיומם. אשכול 0 מול 1, SS: 0.68; אשכול 0 מול 2, SS: 0.27; אשכול 1 מול 2, SS: 0.69. (ג) קווי המתאר החיצוניים של האורגנואידים נמדדו גם באמצעות טרנספורמציית הרשת הרדיאלית LCPC על צורותיהם בקנה מידה, כלומר הצורות כפי שהן מופיעות בתמונות יחסית זו לזו, ללא שינוי גודל. הטבעת מוגדלת כדי להראות את האריזה הרופפת יותר של אורגנידים פוליציסטיים וצפופים בהשוואה לאורגנואידים ציסטיים. עבור B ו-C: ירוק = ציסטי, סגול = פוליציסטי, צהוב = פוליציסטי צפוף. (D) שלושת ערכי ה-PC הראשונים מוצגים עבור כל פנוטיפ בנפרד, וה-KNND הממוצע מחושב כך שהפנוטיפ הציסטי דחוס בצפיפות הגבוהה ביותר, בעוד שהפנוטיפים הפוליציסטיים והצפופים מציגים פחות צפיפות (כלומר יותר הטרוגניות). למרות שהן מוצגות בנפרד, שלושת הפנוטיפים חולקים את אותו מרחב PCA. עבור הפנוטיפ הציסטיק, ממוצע ה-KNND חושב מהאינסט משום שהחריגים הנמצאים רק בפנוטיפ זה מעוותים את החישוב. KNNDs ממוצעים: ציסטי, 1.061; פוליציסטי, 1.575; פוליציסטיק צפוף, 2.247. (E) גרפים קופסה של שטח האורגנואידים מראים פיזור הולך ופוחת של נקודות הנתונים מאורגנידים ציסטיים לפוליציסטיים ואורגנידים פוליציסטיים צפופים, שזה ההפך ממה שנצפה בניתוח LCPC בקנה מידה (איור 3C), ומדגיש שהמידע המרחבי שנלכד על ידי טרנספורמציית LCPC שונה ממה שהאזור לוכד. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 4: מדידת צפיפות טקסטורה באמצעות טרנספורמציית LCPC ברשת המקבילה. (A) פוטומיקרוגרפים של מיקרו-כלי דם ברקמת הלב הושגו בעבר במחקר אחר^31,32. התמונות אינן משוחזרות ממחקרים אלו כשלעצמן; אלא הם מייצגים תצוגות חדשות שנוצרו מאותו מאגר נתונים מקורי של דימות תלת-ממדי שדווח³¹ וסופק על ידי Gkontra. למרות שמאגר הנתונים פורסם בעבר, התמונות הספציפיות המוצגות כאן פורסמו לראשונה. תמונות מהאתרים המרוחקים שלא נפגעו בכל נקודת זמן אינן מוצגות. שלב 1: נוצרת מסכה דו-ממדית, ונקבע ציר היישור הכללי של כלי השיט (חץ כפול אדום). שלב 2: מתקבל אזור עגול במרכז נקודת האמצע של התמונה כדי לכפות על כל תמונה להיות באותו גובה לאחר שהן מסובבות בדרגות שונות בשלב הבא (סיבוב תמונות מרובעות במידות משתנות ישנו את גובה התמונה בהתאם למידת הסיבוב). שלב 3: כל תמונה מסובבת כך שציר היישור הכללי שנקבע בשלב 1 הוא אנכי. שלב 4: מסגרת כחולה אחידה מוחלת סביב כל תמונה כדי להבטיח שלכל תמונה יש קוטר זהה, מכיוון שתמונות עם צפיפות דלילה עלולות להיות קצרות יותר (לדוגמה: ראו "7 ימים לאחר אוטם שריר הלב" בשלב 3). שלב 5: מופעל טרנספורמציית LCPC ברשת מקבילה. (B) גרפים נקודתיים של שלושת ה-PC הראשונים של הפלט מהטרנספורם LCPC ברשת המקבילה (סגול: מצב בסיסי, ירוק: אתר מאוטם, צהוב: אתר לא פגוע מרוחק מהאתר המאוחד). ראו את סעיף התוצאות לחישובי מרחק חווים בכל נקודת זמן בין שלושת התנאים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 5: טרנספורמציית LCPC מודדת תכונות מוסתרות באזור ובהיקף. לצורך השוואה למדדי צורה מסורתיים, נמדדו (א) אחוז השטח ו-(ב) ההיקף הכולל של רשתות כלי הדם. (C) כדי להראות את הדיוק שניתן להשיג מתוצאת טרנספורמציית LCPC, הושווה ערך מיכלי התדר הבודדים הנוצרים מה-FFT (איור משלים 1). שישה תדרים נבחרו כאינדקסים לכימות אובייקטיבי של הבדלים בין קבוצות הטיפול. בכל הלוחות, בשל גודל המדגם המוגבל של כל קבוצה (n = 3), חושב ה-Cliff's Delta הלא-פרמטרי לגודל האפקט במקום ערך p ממבחן סכום הדירוג של וילקוקסון. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: חשיבות כיוון הצורות באופן שיטתי להפקת נתונים נקיים. (א) דוגמה לצורות זהות שהן תמונות מראה זו של זו, וכיצד מערכת הרשת המקבילה קובעת את הכיוון הייחודי שלהן, ולכן תפיק תוצאות שונות. (ב) דוגמה לאיך להפוך את צורה 2 אופקית, כך שהכיוון שלה תואם כעת לצורה 1 והופך להשוואה הוגנת יותר לצורה 1. בתצורה זו, טרנספורמציית LCPC ברשת מקבילה מניבה את אותן תוצאות הן עבור צורה 1 והן עבור צורה 2. שינוי הכיוון הזה צריך להיעשות רק אם אין הקשר מרחבי שמרמז שלא לשנות את צורה 2. (ג) דוגמה לארבע וריאציות של עצמים שנראים כמו המספר "3", כאשר חלקם פונים לכיוון הלא נכון. (ד) דוגמה לאופן שבו ניתן לכוון כל אובייקט כדי למקסם את ניקיון הנתונים שיתקבל מהטרנספורמציית LCPC ברשת המקבילה. (ה) דוגמה למדידת הבליטה הרחבה יותר של הפריטים בלוח C בהתבסס על אותם כללי כיוון כמו בלוח D. (ו) דוגמה למדידת הנורות הגדולות של הפריטים בלוח C תוך שמירה על הקשר היישור שלהם כפי שבלוח D. המניע בשמירת כללי היישור בפאנל D הוא לנתח את תרומת המידע המרחבי בבליטה הרחבה יותר ביחס לתרומת הבליטה הצרה בתוך כללים אלו. ראו איור משלים 3 עבור ספקטרום ה-FFT הקשור ל-C–F. התמונות ב-A–B הן אייקונים מתוך Microsoft PowerPoint. הצורות ב-C-F צוירו ב-Microsoft PowerPoint. תמונות אלו נוצרו על ידי מחברים ואינן דורשות רישיון פרסום או הרשאות זכויות יוצרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 7: חוסר היכולת של מדדי צורה מסורתיים לרשום הקשר ברור. (א) סדרת סימני הבדיקה זהה לצורה אך גדלה משמאל לימין. בסדרה זו, השטח של כל סימן שונה בעוד שמושג הצורה נשאר זהה: כלומר, הם נשארים באותו סגנון של סימני וי. (ב) ריבוע מסובב סביב מרכזו ב-45 מעלות עד שמושג הצורה שלו הופך למה שבני אדם מכנים יהלום. בעוד שמושג הצורה של ריבוע שונה מאוד מזה של יהלום, הסיבובים שבין לבין מתפרשים באופן סובייקטיבי כ"ריבועים מוטים" או "יהלומים מוטים". טרנספורמציית LCPC יכולה למדוד באופן אובייקטיבי ומדויק את ההבדל בכל שלב בסדרה זו. הצורות צוירו ב-Microsoft PowerPoint. תמונות אלו נוצרו על ידי מחברים ואינן דורשות רישיון פרסום או הרשאות זכויות יוצרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 8: הסבר על צורה טהורה לעומת צורה בקנה מידה. מדידת עצמים "בקנה מידה" פירושה מדידת צורת האובייקטים לפי גודלם המקורי יחסית זה לזה. "צורה טהורה", לעומת זאת, פירושה מדידת צורתם של אובייקטים שונים בקנה מידה דומה, מה שמבטל את השפעת הגודל על הצורה. חשוב למצוא דרך אובייקטיבית לשנות את גודל האובייקטים המושווים. הקו הפנימי הארוך ביותר הוא לעיתים בחירה אופטימלית (שלב 1). שני האובייקטים מסובבים כך שהקו הפנימי הארוך ביותר הוא אופקי (שלב 2). במקרה זה, שני האובייקטים גם מסובבים כך שהצד החדור פונה כלפי מטה. לאחר מכן, רוחב כל אובייקט, שכעת הוא אותו גודל כמו הקו הפנימי הארוך ביותר של כל אובייקט, משתנה לרוחב של 400 פיקסלים, תוך הגבלת יחס הגובה-רוחב כדי למנוע עיוות של האובייקטים (שלב 3). לבסוף, ניתן לסובב את האובייקטים ששנו בגודלם ב-90 מעלות (שלב 4) (במקרה זה, נגד כיוון השעון) לפני יישום טרנספורמציית LCPC. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 9: דוגמה לסמנים מרחביים למחקר סרטן. (א) דוגמה היפותטית של תאים הנודדים בתרבות דו-ממדית על ידי הרחבת הלמליפודיות שלהם לכיוון נדידה. בהקשר של מורפולוגיה נדידה של תאי אפיתל, כיוון קווי המתאר של כל תא כך שהקו הפנימי הארוך ביותר המתיישר עם ציר ההגירה יהיה אנכי, הוא ההגיוני ביותר ללכידת ההקשר המרחבי. (ב) דוגמאות היפותטיות לגידולים או נגעים טרום-סרטניים שגדלים בתוך מעטפת שאינה משנה צורה. הנגע גדל מגבעול, שהוא מבנה התמיכה המרכזי. כאשר הנגע גדל או מתכווץ, הקונטור שלו נע לעבר או הרחק מהדופן הפנימית של המעטפת. הקווים המקווקווים מייצגים דרך רציונלית ואובייקטיבית להגדיר כמה מהעטיפה יש לעקוב (קו כתום), כך שלא יתווסף מעט מדי או יותר מדי מידע נוסף. (ג) אפשרות 1 מציגה את טרנספורמציית LCPC ברשת המקבילה המופעלת על קווי המתאר של הנגעים ללא הקשר למיקום העטיפה. אפשרות 2 מראה את אותו הדבר, אך כוללת את ההקשר המרחבי של מיקום המעטפת. לדוגמה, הנקודות האדומות מייצגות חיתוכים בין קו הרשת (חץ שחור, קו ירוק) לבין קו המתאר. אפשרות 2 גורמת לכך שכל רשת יוצרת חיתוך רביעי שאינו קיים באפשרות 1, מה שמוסיף כמותית הקשר מרחבי לתוצאה באפשרות 2 שאינה קיימת כלל באפשרות 1. הצורות צוירו ב-Microsoft PowerPoint. תמונות אלו נוצרו על ידי מחברים ואינן דורשות רישיון פרסום או הרשאות זכויות יוצרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 10: תוצאות FFT היפותטיות ואינדקסים נפוצים שניתן להסיק מהן. (A) מוצג תרשים התדירות הנובע מ-FFT של שתי צורות היפותטיות. מכיוון שהעוצמות ב-Bin 3 ו-Bin 4 מציגות את המגמה ההפוכה, יחס בין שני המיכלים הללו יהיה אינדקס טוב שמייצג את ההבדל בין שתי הצורות הללו. הקווים המקווקוויים האדומים והירוקים מייצגים תאי תדרים נוספים שניתן להשתמש בהם כדי לגזור אינדקסים טובים. (B) היסטוגרמה של שתי צורות היפותטיות שפרופילי ה-FFT שלהן מציגים מגמה יורדת מדרגתית כייצוג של ההבדלים המורפולוגיים שלהן. (ג) היסטוגרמה של שתי צורות היפותטיות שפרופילי ה-FFT שלהן שונים ביותר באזור המרכזי לאורך מרחב תיבות התדר. (ד) דוגמאות לתכונות מורפולוגיות היפותטיות שעשויות להניב אינדקסים המתואמים לנוכחותם. הצורות צוירו ב-Microsoft PowerPoint. תמונות אלו נוצרו על ידי מחברים ואינן דורשות רישיון פרסום או הרשאות זכויות יוצרים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור משלים 1: גרפים של קופסה-ויסקר השווים את הגדלים של תיבות תדר שונות לאורך תוצאות טרנספורמציית LCPC של רשתות כלי דם. טרנספורמציית LCPC של רשתות כלי הדם המוצגת באיורים 4 ו-5 מניבה סט של תאי תדר וגודלם המייצגים כל תמונה. גרפים של קופסה-שפם של הגדלים בכל מיכל משמשים להשוואה בין כל קבוצות הטיפול, וזיהוי איזה מיכל משמש כמדד לשכבת המרקם-צפיפות הנמדדת באמצעות טרנספורמציית LCPC. כל גרף קופסה-שפם מורכב מ-n = 3 תמונות עצמאיות. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 2: דוגמה לאורגנואידים של גידול שד מקוטעים. אורגנואידים חולקו ידנית על ידי מומחה שמגדל אותם באופן שגרתי וצופה בהם במיקרוסקופיה. איור זה מציג דוגמאות לקווי מתאר אורגנואידים מקוטעים. מד הסקאלה לכל התמונות המיקרוסקופיות הוא 50 מיקרון. התאים האנושיים הראשוניים ששימשו במחקר זה הושגו וגודלו תחת אישורי אתיקה ונהלי הסכמה מדעת, שדווחו²¹. התמונות המוצגות כאן נגזרות מתרביות תאים מאושרות ופורסמו לראשונה. לא בוצע איסוף דגימות אנושיות נוספות. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

איור משלים 3: ספקטרום FFT לצורות באיור 6. תוצאות ה-FFT של הצורות באיור 6 מוצגות כאן כדי שהקוראים יוכלו להבין את השפעת שינוי כיוון הצורה על המידע המרחבי שלהם. העמודה השמאלית של הגרפים כוללת צירי y לא משתנים, בעוד שהעמודה הימנית כוללת צירים מקוצרים כך שניתן להמחיש את ערכי הבין הקטנים יותר. (א) ספקטרום מהרשת המקבילה LCPC עוברת טרנספורמציה של ארבע הצורות באיור 6C כפי שהן מוצגות, כלומר אין שינוי יישור. (ב) ספקטרום מהטרנספורמציית LCPC ברשת המקבילה של הצורות באיור 6D, אשר עברו כיוון מחדש כפי שמתואר בטקסט. (C) ספקטרום מהטרנספורמציית LCPC של הרשת המקבילה של צורות באיור 6E. (ד) ספקטרום מהטרנספורמציית LCPC של הרשת המקבילה של צורות באיור 6F להשוואה לאלו שבאיור 6E. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

תיק משלים 1: פרטים נרחבים על שיטות עבודה מומלצות לטרנספורמציית LCPC. קובץ משלים זה מספק דיון נרחב על שיטות עבודה מומלצות והערות מתודולוגיות נוספות. המתווה של המסמך הוא כדלקמן: סעיף 1 - הקשר מרחבי ששטח, נפח, היקף ומחוספסות אינם יכולים לתפוס. סעיף 2 - שיטות עבודה מומלצות לשימוש בטרנספורם LCPC ופרשנות תוצאות. סעיף 3 - הבנת הקוטביות הטבועה בטבע כדי למקסם את טרנספורמציית LCPC. סעיף 4 - פירוש ספקטרום FFT הנובע מהמרת LCPC. סעיף 5 - כיצד לכוון צורות לפני מדידתן באמצעות טרנספורמציית LCPC. סעיף 6 - מה זה "צורה טהורה" לעומת "בצורת בקנה מידה"? סעיף 7 - הערות מתודולוגיות על שיטות סטטיסטיות. סעיף 8 - הערות מתודולוגיות על תרבית תאים וחלוקת אורגנידים. סעיף 9 - פרמטרים של ה-FFT עבור מי שמקודד את טרנספורמציית LCPC שלו. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

Discussion

כמו בכל כלי חישוב, איכות הפלט תלויה בשאלה האם הקלטים עומדים בכללים הצפויים שסביבם הכלי תוכנן. יש לעקוב אחרי הכללים הבאים ולהשתמש בהם כבדיקות בקרת איכות בעת שימוש בסקריפטי פייתון שסופקו. ראשית, ודא שהמסכות הפתוחות הן קווים כחולים על רקע לבן. כחול היה החלטה שרירותית ואין לה משמעות, אך הסקריפטים שמבצעים את טרנספורמציית LCPC נכתבו כדי לחפש פיקסלים כחולים על רקע לבן. שנית, אל תריץ את סקריפטי הטרנספורמציה של LCPC על תמונות שיש להן פחות מ-10 פיקסלים של רווח לבן בכל ארבעת הצדדים. ראו את הסרטון הזה להסבר מדוע: "פרמטר עובי השוליים - איך להכין קווי מתאר צורה"³³. שלישית, הסקריפט מניח שקווי המתאר של האובייקט שלך הם פיקסלים כחולים על רקע לבן. עובי הקו צריך להיות בין 5–10 פיקסלים. ראו את הסרטון הזה להסבר מדוע: "פרמטר עובי הקו - איך להכין קווי מתאר" ³⁴. רביעית, אל תריץ את סקריפטי הטרנספורמציה של LCPC על תמונות ריקות. זה יגרום לשגיאה בסקריפט. חמישית, אל תריץ את סקריפטי הטרנספורמציה של LCPC על תמונות שמורכבות רק מנקודה קטנה של פסולת. זה יגרום לשגיאה כי מערכת הרשת עשויה לא לזהות את הנקודה ולכן לנסות לנתח תמונה ריקה. שישית, אל תריץ את סקריפטי הטרנספורמציה של LCPC על תמונות שמכילות נקודות של פסולת לא רצויה. הפסולת תשנה את גובה ורוחב עצם המסכה הפתוחה וכך תגרום לתוצאות לא מדויקות. שביעית, צפו בסרטון הזה כדי להבין מדוע חשוב להבין את קנה המידה של האובייקטים שלכם לפני שאתם מנתחים אותם באמצעות טרנספורמציית LCPC: "פרמטר הקנה מידה - איך להכין מתארים לצורה"³⁵.

אחד ההיבטים המדהימים ביותר של טרנספורמציית LCPC הוא היכולת שלו ללכוד הקשר מרחבי. הביולוגיה מלאה בהקשר מרחבי שהוא חיוני להבנת הטבע. לדוגמה, לתאי אפיתל יש קוטביות אפיקלית-בסיסית 36,37,38,39. יתרה מזאת, כיוון הכבידה, שמשתנה בתנאי מיקרו-כבידה, משפיע משמעותית הן על פיזיולוגיית האסטרונאוטים^40,41 והן על מורפולוגיית תאי הסרטן 42,43,44. לבסוף, פרניאופלזיה ונאופלזיה במקום יכולים לגדול ללומנים דרך גבעול המשמש כמבנה התמיכה המרכזי, ומספק גישה לאספקת הדם. לכן, כאשר הנגעים הללו נסוגים, הם נסוגים גם מחלל הלומינל וגם לכיוון הגבעול^45,46. מכיוון שהוא תוכנן לכך, טרנספורמציית LCPC רגישה מאוד להקשר מרחבי ולכן יכולה להכניס הטרוגניות נוספת אם המשתמש לא נזהר. איור 6 מתאר כיצד לכוון צורות באופן שיטתי לפני יישום טרנספורמציית LCPC. איור 7 מתאר כיצד גאומטריה מסורתית אינה יכולה למדוד מושגי צורה שהם מובנים מאליהם לבני אדם. איור 8 מספק דיאגרמה המדגימה את ההבדל בין מדידת צורה טהורה לבין צורה בקנה מידה. איור 9 מתאר כי הקשר מרחבי לעיתים קרובות מתעלמים ממנו כאשר מכימות צורות בתרבות דו-ממדית, היסטולוגיה ופרוסות דו-ממדיות מהדמיה תלת-ממדית. יש לשים לב שעקב מגבלות מקום, תיק משלים 1 מכיל דיון נרחב באיור 6 ואיור 7 בסעיף 5, ובאיור 8 ואיור 9 בסעיף 6.

מכיוון שה-FFT מייצר נתונים ספקטרליים רב-ממדיים, חשוב שהמשתמש יתרגל לגזור אינדקסים מדפוסים חוזרים בספקטרום. למרות שכתב יד זה מתייחס לטרנספורמציית LCPC ככוללת את שלב יישום ה-FFT, הטרנספורם בפועל של LCPC מתרחש לפני שלב ה-FFT (איור 1A–B שלב 4, איור 2A–B שלב 3). עם זאת, יישום ה-FFT חושף תובנות אובייקטיביות ושיטתיות מהתחום התדר של פלט הטרנספורמציה של LCPC. לכן, טרנספורמציית LCPC לא תהיה יעילה כל כך ללא הכללת ה-FFT כשלב הסופי. בטרנספורמציית LCPC, ה-FFT יוצר סדרה של מיכלים וגדליהם, כולם ייצוג סטטי רב-ממדי של קלט הקונטור בשלב 1. אנלוגיה לייצוג סטטי רב-ממדי של מידע היא מספר טלפון בן תשע ספרות המייצג את ערוץ התקשורת הטלפוני של אדם בארצות הברית. למרות שהם מסורבלים בהשוואה לייצוגי ערכים סקלריים של צורות (כמו 85 ס"מ אורך, רוחב 56 מעלות וכו'), נתונים רב-ממדיים מכילים הרבה יותר מידע להפקת תובנות. איור 10 מציג מספר דפוסים ספקטרליים שנצפו בעת יישום טרנספורמציית LCPC וכיצד ניתן לגזור מהם אינדקסים. סעיף 4 בתיק המשלים 1 דן באיור 10 בהרחבה רבה יותר.

תחום התדר של טרנספורמציית LCPC חושף תכונות אובייקטיביות וכמותיות של צורה דו-ממדית שהעין לא אינה יכולה לתפוס בקלות. הבדלים עדינים מאוד בעקמומיות, משוננות ועיקולים ניתנים לכימות בצורה משמעותית. עם זאת, לאחר זיהוי תת-הסוגים המורפולוגיים בשיטה זו, ניתן לראות נושאים ויזואליים מובחנים המתואמים עם ההבדלים הכמותיים. תכונה זו הופכת את טרנספורמציית LCPC לניתנת לפרשנות כשיטת חילוץ מידע מרחבי למודלים של למידת מכונה (ML) והופכת את מודלי הלמידת המכונה עצמם ליותר ניתנים לפענוח. בעוד שרשתות עצביות הן שיטה חזקה של למידת מכה, תוצאותיהן לעיתים קרובות אינן ניתנות לפרשנות לבני אדם, וזהו בעיה משמעותית בתחום הבינה המלאכותית הרפואית (AI). רופאים מהססים להשתמש במודל למידת מכונה להחלטות קליניות אם הם לא מבינים מדוע המודל מקבל החלטות גרועות. יתרה מזאת, אם אף אדם לא מבין מדוע או כיצד מודל קיבל החלטה מוטה, תיקון זה הופך לבלתי פתיר.

כדאי להוסיף לדיון על מדידת צפיפות המרקמים (איורים 4 ו-5) שהעין האנושית מתבלבלת בקלות מאשליות אופטיות או דפוסים לא מסודרים. סידור אקראי של דפוסים מורכבים מתפרש לעיתים קרובות כאקראי, לא מדיד, או לא ראוי למדידה. טרנספורמציית LCPC יכולה למדוד הבדלים אובייקטיביים וכמותיים שניתן לשחזר בדפוסים שנראים אקראיים. עם זאת, אלא אם המשתמש מאומן לא להטעות על ידי דפוסים כאוטיים ובלתי מסודרים בטבע שמתחזים לאקראיות, לא ייעשה ניסיון למדוד את ההפרעה כדי לחשוף דפוסים צפויים. דפוסים צפויים הם אינדיקציה ברורה לכך שהמערכת אינה אקראית לחלוטין. טרנספורמציית LCPC הומצאה במטרה למדוד צורות ששונות במעט או שונות באופן בלתי נתפס מהעין הבלתי. מכיוון שמורפולוגיות רבות בטבע מציגות הבדלים קטנים שנראים יותר כמו הטרוגניות כאוטית חסרת משמעות מאשר תת-סוגים צפויים של אי-סדר – שכל אחד מהם מתאם לפונקציות ביולוגיות שונות – פותחה מסגרת מושגית "ארבעת השלבים" הבאה לשימוש בשילוב עם טרנספורמציית LCPC. ראשית, התנגדו לרעיון שמערכת שנראית מורכבת היא אקראית. שנית, נקרא להטרוגניות הכאוטית "אי-סדר" ואז למצוא סוג של סדר שיכול לשמש כתנאי ייחוס רציונלי. השערו שההפרעה סוטה מההפניה. שלישית, למצוא דרך למדוד באופן אובייקטיבי את הדפוס שהוא ההתייחסות, כמו טרנספורמציית LCPC. רביעית, יישמו את אותה שיטה אובייקטיבית למדידת מה נחשב לאי-סדר במערכת.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	Used the NearestNeighbors function within the sklearn.neighbors package
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	Used cKDTree function within scipy.spatial package
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Created an implementation of Cliff's Delta via the Python language
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	Was mentinoed as a potential useful tool for manual segmentation, but not used in this study
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	Used the PCA function with the sklearn.decomposition package
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook