זיהוי רכיבים אנטי-שיתוק מוחין המיוקדים ל-AChE מ-Coptis chinensis באמצעות פילטרציה אולטרה-אפיניטית ואימות ניסויי

סיכום

מטרת מחקר זה הייתה לזהות את המרכיבים הפעילים המרכזיים של Coptis chinensis ולהבהיר את פעולתם בהתערבות שיתוק מוחין (CP) באמצעות פילטרציה אולטרה-זיקה ואימות ניסוי.

תקציר

מטרת מחקר זה הייתה לזהות את המרכיבים הפעילים המרכזיים של Coptis chinensis ולהבהיר את מנגנוני הפעולה שלו בהתערבות שיתוק מוחין (CP) באמצעות פילטרציה אולטרה-אופיניטית. באמצעות אצטילכולינסטראז (AChE) כמטרה, קופטיזין הוסר מהתמצית של C. chinensis כרכיב בעל יכולת הקשירה החזקה ביותר, שהפגין קצב קישור של 21.9% ופעילות מעכבת במבחנה משמעותית (IC₅₀ = 3.24 מיקרוגרם/מ"ל). סימולציות עגינה מולקולרית ודינמיקה מולקולרית הראו שקופטיזין יכול להיקשר באופן יציב לכיס הפעיל של AChE. בהמשך, נערכו ניסויי אימות על מודל חולדה יילודה של נזק מוחי היפוקסיבי-איסכמי (HIBD). התוצאות הראו כי התערבות בקופטיזין (10 מ"ג/ק"ג) שיפרה באופן משמעותי את ליקויי הלמידה והזיכרון המרחבי בבעלי החיים במודל, הגבירה את זרימת הדם המוחי בחצי הכדור הפגוע, הפחיתה נזק פתולוגי לרקמות מוח, ועיכבה את ההפעלה הלא תקינה של AChE במוח. לסיכום, מחקר זה שילב טכנולוגיית אולטרה-פילטרציה של אפיניטי ואישר שקופטיסין, שזוהה מתמצית C. chinensis, יכול לעכב AChE ולהפעיל השפעות נוירופרוטקטיביות ומשפרות זרימת דם מוחית. הוא משמש כבסיס חומרי מרכזי לשיפור ליקויים נוירולוגיים דמויי CP, ובכך מספק מולקולות מועמדות וראיות מדעיות לפיתוח תרופות קשורות.

מבוא

שיתוק מוחין (CP) הוא תסמונת קבועה הנגרמת מנזק לא מתקדם למוח המתפתח של עוברים או תינוקות, המאופיינת בעיקר בתפקוד מוטורי לקוי וחריגות יציבה. למרות שקיימות כיום מספר גישות טיפול קליניות ל-CP, עדיין קיימת מחסור בתרופות אידיאליות שיכולות לתקן באופן יסודי ליקויים נוירולוגיים עם מינימום תופעות לוואי. בניגוד לתרופות מסונתזות כימית, שבדרך כלל פועלות על מטרות בודדות ונושאות פוטנציאל רעילות גבוה יחסית, תרופות סיניות מסורתיות (TCM), עם יתרונותיהן של ויסות רב-רכיבי, רב-מטרתי והוליסטי, וכן פרופילי בטיחות חיוביים שהודגמו בפרקטיקה קלינית ארוכת טווח, מספקות תובנות חדשות ומאגר של מועמדים לתרופות לטיפול בהפרעות מוח מורכבות^1, 2,3,4,5,6. לכן, חקר רכיבים כימיים יעילים מאוד ובעלי רעילות נמוכה מ-TCM נושא חשיבות מדעית משמעותית וערך קליני⁷.

מבין המנגנונים הפתולוגיים המורכבים של שיתוק מוחין, תפקוד לקוי של מערכת העצבים הכולינרגית ממלא תפקיד מרכזי ^8,9. אצטילכולינאסטראז (AChE) הוא אנזים מרכזי ההידרוליזה של הנוירוטרנסמיטר אצטילכולין (ACh). פעילות מופרזת של אנזים זה מובילה לדלדול ACh, פוגעת בהעברת אותות כולינרגיים, ובכך מחמירה שליטה מוטורית ותפקודים קוגניטיביים לקויים. לכן, AChE הפך למטרה תרופתית חשובה ומבוססת היטב לפיתוח סוכנים נוירו-מגנים. עיכוב פעילות AChE להעלאת רמות ה-ACh בחריץ הסינפטי מוכר כאחת האסטרטגיות היעילות להקלה על ליקויים נוירולוגיים הקשורים ל-CPe. בהקשר של פגיעת מוח היפוקסית-איסכמית, הפרעה בהעברת העצבים הכולינרגית עלולה להחמיר עוד יותר את תפקוד העצבים, ובכך לתרום לליקויים מוטוריים וקוגניטיביים הרלוונטיים ל-CP. לכן, AChE נבחר במחקר זה לא רק כמטרה נוירופונקציונלית קלאסית, אלא גם כנקודת כניסה מכנית רלוונטית לסינון תרכובות ביואקטיביות עם השפעות אנטי-CP פוטנציאליות.

מחקרים מודרניים הראו שלצמחי מרפא יש טווח רחב של ערכי פעילות פרמקולוגית. כרפואה סינית מסורתית קלאסית לניקוי חום וייבוש לחות, קופטיס צ'יננסיס מהווה מערכת מורכבת השופעת באלקלואידים איזוקינולינים שונים. בנוסף לברברין המפורסם, הוא מכיל גם סדרה של רכיבים בעלי מבנים דומים ופעילויות פרמקולוגיות מגוונות, כגון קופטיזין, אפיברברין, פאלמטין וג'טרוריזין¹⁰. אלקלואידים אלו מהווים יחד את הבסיס החומרי להשפעות הפרמקולוגיות של C. chinensis. מחקרים קודמים הראו כי C. chinensis והאלקלואידים שלו מחזיקים בתכונות אנטי-דלקתיות, נוגדי חמצון ופוטנציאל נוירומגנטיות. עם זאת, לאור מערכת רכיבים כה מורכבת, שיטות מחקר מסורתיות קשות לזהות במהירות ובדיוק את הרכיבים הפעילים המרכזיים המכוונים ישירות ל-AChE, מה שמגביל מאוד את ההבהרה המעמיקה של המנגנונים העומדים בבסיס השפעות C. chinensis על פגיעת מוח¹¹.

בהשוואה לבידוד מונחה פעילות קונבנציונלי, שדורש בדרך כלל פרקציה חוזרת, בדיקות ביואקטיביות וטיהור, ועלול להוביל לאובדן או הזנחה של תרכובות בעלות שפע נמוך אך בעלות זיקה גבוהה, פילטרציה אולטרה-פילטרציה עם זיקה מאפשרת סינון מהיר של ליגנדים הקשרים למטרה ישירות מתערובות מורכבות. טכניקה זו מאפשרת "דיג" יעיל ומהיר של ליגנדים פעילים הנקשרים למטרות ספציפיות (למשל, AChE) ישירות מתמציות גולמיות רב-רכיביות של TCMs. היא מתאימה במיוחד למערכות עם מספר רכיבים אלקלואידיים, כגון C. chinensis, ומאפשרת זיהוי מדויק של רכיבים יעילים האינטראקטיביים ישירות עם המטרה מהתערובת המורכבת¹². בשילוב עם גישות חישוביות הכוללות עגינה מולקולרית וסימולציות דינמיקה מולקולרית, הוא יכול לחזות באופן אינטואיטיבי את מצב הקישר, סוגי האינטראקציה והיציבות המורכבת בין רכיבים לחלבוני המטרה ברמה האטומית, ובכך לספק ראיות תיאורטיות חזקות והסברים מכניים לתוצאות הסקר הניסויי¹³.

בהתבסס על הרקע לעיל, מחקר זה מציע את ההשערה המדעית הבאה: מבין האלקלואידים השונים הנמצאים ב-C. chinensis, קיימים רכיבים פעילים שיכולים לעכב את ה-AChE באופן ספציפי, ורכיבים אלו מהווים את הבסיס החומרי להשפעתו האפשרית נגד שיתוק מוחין. כדי לאמת השערה זו, שילבנו טכניקות סקר מודרניות עם שיטות אימות פרמקולוגיות: ראשית, תוך שימוש ב-AChE כמטרה, השתמשו בטכנולוגיית פילטרציה אולטרה-זיקה כדי לסנן במהירות מעכבים פוטנציאליים מהתמצית הרב-אלקלואידית של C. chinensis; בנוסף, נעשה שימוש בסימולציות עגינה מולקולרית ודינמיקה מולקולרית להבהרת מנגנון הקשר ברמה האטומית; לבסוף, נערכו ניסויים בבעלי חיים ב-vivo כדי לאמת את ההשפעות המשופרות של הרכיבים שנבדקו על ההתנהגות, הפתולוגיה של רקמת המוח ופעילות ה-AChE של חולדות עם CP.

פרוטוקול

כל ההליכים לרווחת בעלי חיים וניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה לרווחת בעלי חיים במעבדה של בית החולים הראשון של העם של זוני (מס' אתיקה 2025-2-362). במהלך תקופת הדוגמנות והטיפול, מצב הגוף של בעלי החיים וההישרדות נרשמו מדי יום.

הכנת תמצית C. chinensis
במחקר זה, נעשה שימוש במחלץ ממס מואץ להפקה מואצת של שבר n-בוטנול מחומרים רפואיים של C. chinensis . בסך הכול 1 גרם אבקה יבשה של C. chinensis נשקל במדויק והוכנס לתאי חילוץ של 40 מ"ל, בהתאמה. אטמי מתכת וממברנות סיבי זכוכית הונחו ברצף מעל ומתחת לתא החילוץ כדי לסנן את הדגימה, והדגימה נעטפה בחול קוורץ. במהלך תהליך החילוץ, הטמפרטורה והלחץ הוגדרו ל-90 מעלות צלזיוס ו-100 בר, בהתאמה. התמצית המואצת נאספה, וממס ההפקה התאדה לייבוש באמצעות אידוי סיבובי לקבלת תמציות יבשות מחלקים פולריים שונים. מתנול:מים (50:50, וולט/וולט) נבחר כממס לשיקום. התמצית סיננה דרך ממברנה מיקרונקבובית של 0.45 מיקרון ונשמרה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לפני גילוי הדגימה, נחקרה פעילות מעכבת של ממס הבנייה הריק על AChE. התוצאות הראו שההשפעה המעכבת שלו הייתה זניחה, מה שמעיד שבחירת הממס המחודש בניסוי זה לא תשפיע על תוצאות הניסוי.

בדיקת עיכוב אצטילכולינסטראז
הניסוי בוצע בלוח עם 96 בארות. ראשית, נוספה PBS, ואחריה דגימות AChE (0.1 U/mL) ו-C. chinensis ברצף. לאחר דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, נוספו תמיסת כרומוגנית של 5.5′-דיתיוביס (חומצה ניטרובנזואית 2) (DTNB) (2.5 מ"מ/מ"ל) ותת-מצע ATChI (10 מ"מ/מ"ל). התערובת נדגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות נוספות, והתגובה הסתיימה בהוספת 60 מיקרוליטר של 1% סודיום דודציל סולפט (SDS). הספיגה נמדדה ב-405 ננומטר. כל דגימה של C. chinensis הוגדרה עם 4 קבוצות: קבוצת ביקורת א': PBS (120 מיקרוליטר), תמיסת AChE (20 מיקרוליטר), תמיסת DTNB (40 מיקרוליטר), תמיסת ATChI (40 מיקרוליטר) ותמיסת SDS (60 מיקרוליטר) נוספו ברצף; קבוצת ביקורת ריקה b: PBS (120 מיקרוליטר), תמיסת DTNB (40 מיקרוליטר), תמיסת ATChI (40 מיקרוליטר), ותמיסת SDS (80 מיקרוליטר); קבוצת דגימה c: PBS (80 מיקרוליטר), תמצית C. chinensis (20 מיקרוליטר), תמיסת AChE (20 מיקרוליטר), תמיסת DTNB (40 מיקרוליטר), תמיסת ATChI (40 מיקרוליטר), ותמיסת SDS (60 מיקרוליטר); קבוצת דגימה ריקה d: PBS (100 מיקרוליטר), תמצית C. chinensis (20 מיקרוליטר), תמיסת DTNB (40 מיקרוליטר), תמיסת ATChI (40 מיקרוליטר), ותמיסת SDS (60 מיקרוליטר). הופרזין A שימש כבקרה חיובית בריכוז התחלתי של כ-2.5 מ"ג/מ"ל. הריכוז ההתחלתי של תמצית חלקי n-בוטנול היה כ-1 מ"ג/מ"ל. גם הופרזין A וגם הדגימות מדוללו עם גרדיאנט של 60%. קצב העיכוב חושב באמצעות הנוסחה הבאה: קצב העיכוב (%) = [1 - (c - d)/(a - b)] × 100%, כאשר a, b, c ו-d מייצגים את ערכי הספיגה של קבוצת ביקורת a, קבוצת ביקורת ריקה b, קבוצת דגימה c, וקבוצת דגימה ריקה d, בהתאמה.

קצב העיכוב בכל ריכוז שנבדק חושב באמצעות הנוסחה שתוארה לעיל. עקומות ריכוז–עיכוב נבנו לאחר מכן על ידי העתקת קצב העיכוב מול הלוגריתם של ריכוז התרכובות. ערכי IC20, IC50 ו-IC80 חושבו באמצעות התאמת רגרסיה לא ליניארית באמצעות תוכנת GraphPad Prism המבוססת על עקומות ריכוז–תגובה מותאמות, והוגדרו כריכוזים הנדרשים ליצירת עיכוב של 20%, 50% ו-80% של פעילות AChE, בהתאמה.

בדיקת אולטרה-פילטרציה בזיקה
בוצעה אולטרה-פילטרציה של אפיניות לסינון תרכובות הקשירה ל-AChE מתמצית C. chinensis . בקצרה, תמיסת AChE (0.1 U/mL ב-PBS, pH 7.4) שימשה כאנזים פעיל. בקרת האנזים המושבת הוכנה על ידי חימום אותה תמיסת AChE באמבט מים רותחים למשך 10 דקות. לכל תגובה, 200 מיקרוליטר של תמצית C. chinensis עורבבו עם 200 מיקרוליטר של תמיסת AChE פעילה או מושבתת ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, התערובת הועברה לצינור צנטריפוגה אולטרה-פילטרציה בהספק 30 קילו-דלטון וצונטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. קומפלקס האנזים-ליגנד שנשאר נשטף שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBS באותם תנאי צנטריפוגציה להסרת רכיבים לא קשורים. בהמשך, נוספו 200 מיקרוליטר של 90% מתנול כדי להתנתק ולשחרר את הליגנדים הקשורים ל-AChE, ולאחר מכן דגירה למשך 10 דקות וצנטריפוגה ב-12,000 × גרם למשך 10 דקות. האלואט נאסף, סינן ונותח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC). תרכובות שהועשרו בקבוצת האנזימים הפעילה ביחס לבקרת האנזים המושבת נחשבו לרכיבי קישור פוטנציאליים ל-AChE¹⁴.

ניתוח HPLC של מטבוליטים עיקריים של אלקלואידים
ניתוח כרומטוגרפי בוצע באמצעות מערכת HPLC המצוידת במשאבה רבעית, אוטוסמפלר, תנור עמוד וגלאי אולטרה סגול (UV-Vis). ההפרדה הושגה על עמוד כרומטוגרפי C18 (250 × 4.6 מ"מ, 5 מיקרון) שנשמר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. השלב הנייד כלל אצטוניטריל (A) ותמיסת ביקרבונט אמוניום בנפח 30 מ"מ/ליטר המכילה 0.7% אמוניה ו-0.25% טריאתילמין (B), שסופקה בקצב זרימה של 1.0 מ"ל לדקה. תוכנית שחרור השיפוע הייתה כדלקמן: 0–15 דקות, 90%–75% B; 15–25 דקות, 75%–70% B; 25–50 דקות, 70%–55% B. נפח ההזרקה היה 5 מיקרוליטר, וזיהוי UV בוצע ב-270 ננומטר.

לניתוח כמותי של האלקלואידים העיקריים ב-C. chinensis, כל דגימה (0.02 גרם) נשקלה במדויק והופקה אולטרסונית עם 10 מ"ל תמיסת חומצה כלורית-מתנול (1:100, v/v) למשך 30 דקות. לאחר הסינון, אובדן המשקל פוצה באותו ממס חילוץ למשקל המקורי, והתמיסה הסופית סיננה דרך ממברנה של 0.45 מיקרון לפני ניתוח HPLC. שמונה תקני ייחוס אותנטיים, כולל מגנופלורין, גלוצין, ג'טרוריזין, קולומבאמין, אפיברברין, קופטיזין, פאלמטין וברברין, נותחו תחת אותם תנאים כרומטוגרפיים. עקומות כיול נבנו עבור אנליטים אלו באמצעות פתרונות ייחוס. מכיוון שרמות השפע ותגובות הגלאי של שמונת האלקלואידים היו שונות במידה ניכרת, טווח הכיול של כל אנליט אופטימיזציה אישית בהתבסס על דוחות ספרות וניסויים ראשוניים, במקום ליישם שיטת דילול קיפול זהה על כל התרכובות. לכן, לא ציפו שיחסי הריכוז הגבוהים לנמוכים של הטווחים הליניאריים יהיו זהים בין שמונת האנליטים. גבולות הגילוי (LOD) וגבולות הכימות (LOQ) הוערכו ביחס אות לרעש של כ-3 ו-10, בהתאמה.

לצורך ניתוח אלואטות אולטרה-פילטרציה של אפיניטיות, הליגנדים שהתנתקו מ-AChE לאחר אולטרה-פילטרציה נאספו מניסויים חוזרים ורוכזו לפני ניתוח HPLC כדי להבטיח עוצמת אות מספקת לזיהוי. האלואטים המרוכזים נותחו לאחר מכן באמצעות אותם תנאי HPLC כפי שתוארו לעיל. השיאים הכרומטוגרפיים באלואטים הוקצו בהשוואה ממוקדת לשמונה תקני הייחוס האותנטיים ועם הפרופיל הכרומטוגרפי של תמצית C. chinensis שהושג בתנאים אנליטיים זהים. לכן, הניתוח הנוכחי לא נועד להבהרה מבנית חדשה של תרכובות לא ידועות, אלא לקביעה ממוקדת האם האלקלואידים העיקריים הידועים ב-C. chinensis מועשרים באנזים הפעיל ביחס לבקרה על האנזים המושבת.

בדיקת עגינה מולקולרית
במחקר הנוכחי, ניתוח העגינה התמקד בקופטיזין משום שהוא זוהה כרכיב הקישור ל-AChE המדורג ראשון על ידי אולטרה-פילטרציה אפיניטית, והראה גם את הפעילות המעכבת החזקה ביותר במבחנה בין האלקלואידים העיקריים. גבישי חלבון נאספו מבנק נתוני החלבונים (PDB). גבישי חלבון עם ליגנדים מתגבשים יחד נבחרו כקולטני העגינה הסופיים, וכל גבישי החלבון המטרה נגזרו מבני אדם. קובץ הקולטן נפתח באמצעות תוכנת PyMOL, וקבצי הקולטן והליגנד הופרדו ונשמרו; הקולטן נפתח באמצעות תוכנת MGLTools, ולאחר מכן הסרת מולקולות מים, הוספת אטומי ומימן ומטענים, מיזוג אטומי מימן לא-קוטביים, חישוב מטענים אטומיים מקומיים ועוד, ולאחר מכן נשמר בפורמט PDBQT; קובץ הליגנד נפתח באמצעות תוכנת MGLTools, נוספו אטומי מימן ומטענים, ונשמר כקובץ פורמט pdbqt; תיבת הרשת נפתחה, המרחק הוגדר ל-1.000, מספר נקודות הרשת נקבע, קואורדינטות הנקודות המרכזיות של הקופסה נבחרו לפי הליגנד הקו-קריסטליזצי, ונשמרו כקובץ GPF^15,16.

מבני רכיבי כימיה נאספו לראשונה ממסד הנתונים של SciFinder ונשמרו בפורמט cdx; כל מבנה תלת-ממדי מולקולרי הוצג באמצעות מודול ChemBio3D Ultra, בוצעה אופטימיזציה אנרגטית באמצעות שדה הכוח MM2, נשמרה בפורמט mol2, ופרמטרי המטען הוסרו. באמצעות AutoDock, קובץ פורמט mol2 נפתח באמצעות תוכנת MGLTools, אטומי מימן ומטענים נוספו לליגנטי, נצפו קשרים כימיים מסתובבים ונשמרו כקובץ פורמט pdbqt. מודל AutoDock Vina (גרסה 1.2.5) יושם לביצוע הערכת עגינה מולקולרית.

בדיקת סימולציה של דינמיקה מולקולרית
תוכנות Gaussian 16 ו-GaussView 6 שימשו לאופטימיזציה של מבנה הליגנד. לאחר ייבוא קובץ mol2 של מבנה הליגנד ל-GaussView 6, סוג המשימה הוגדר לאופטימיזציה, מצב המולקולה היעד נבחר כמצב יסוד, שיטת החישוב הייתה תורת פונקציונליות צפיפות (DFT), ריבוי הספין הוגדר כברירת מחדל ל-Default Spin, הפונקציונל שבו השתמשו היה B3LYP, מודל הממס היה IEFPCM, והממס היה מים. לאחר סיום אופטימיזציה של מבנה מולקולרי, Gaussian 16 שימש להמרת קובץ chk שנוצר לקובץ fch, אשר יובא לתוכנת Multiwfn לחישוב מטען ה-RESP של הליגנד.

לאחר חישוב החיוב של ה-RSP, קובץ ה-chg שנוצר יובא לתוכנת sobtop_1.0 (dev5) ליצירת קובץ הטופולוגיה של הליגנד הנדרש לסימולציה של דינמיקה מולקולרית. סימולציית הדינמיקה המולקולרית בוצעה באמצעות תוכנת GROMACS 2019.6 עם שדה כוח AMBER99. קבצי המבנה של מולקולת החלבון והמולקולה הקטנה יובאו לתוכנה, הוקם קופסת טריקלינית עם גבול מחזורי של 1.0 ננומטר, ומודל המים TIP3P שימש למילוי. שיטת Particle Mesh Ewald (PME) שימשה לחישוב אינטראקציות אלקטרוסטטיות ארוכות טווח, ופקודת gmx geion שימשה להכנסת מספר מתאים של יוני נתרן ויוני כלוריד לנטרול המטען של כל המערכת. הסימולציה בוצעה בטמפרטורה קבועה של 298 קלווין ולחץ אטמוספרי סטנדרטי של 100 קילופסקל. לצורך מזעור אנרגיה, יושמה שיטת הירידה התלולה ביותר (תלולה). הפקודות gmx grompp ו-gmx mdrrun שימשו לביצוע 10,000 צעדים של שיווי משקל NVT (אנסמבל איזותרמי-איזוכורי) ו-NPT (אנסמבל איזוברי), כאשר קבוע הקישור הטמפרטורה וקבוע הקישור הלחץ נקבעו ל-0.1 ps ו-0.5 ps, בהתאמה, ומשך סימולציית שיווי המשקל היה 100 ps. לאחר שהמערכת הגיעה לשווי משקל, צעד הזמן הוגדר ל-2 fs, ובוצעה סימולציה של דינמיקה מולקולרית של 10 ננו-שניות, כאשר נתוני המסלול נשמרו כל 2 ps. ריצת הייצור של 10 ננו-שניות נבחרה כאורך סימולציה חקר כדי לספק הערכה דינמית קצרה של קומפלקס קופטיסין–AChE מחוזק, ולא דגימה קונפורמציה ממצה. הגדרה זו שימשה להערכת האם הקומפלקס המחובר יכול לשמור על מצב קישור יציב יחסית לאורך זמן. פקודות gmx rms, gmx rmsf, gmx gyrate ו-gmx hbonds שימשו גם לחישוב השורש הממוצע בריבועי (RMSD), תנודות ריבוע ממוצע שורש (RMSF), רדיוס הסיבוב של החלבון, קשרי מימן ושטח פנים נגיש לממס. QTgrace שימשה להמחשת תוצאות.

אימות ניסוי בעלי חיים
נבחרו שמונה-עשר גורי חולדה בריאים (7 ימים לאחר הלידה) משני המינים. כל בעלי החיים הניסיוניים שוכנו במתקן ניסויים ספציפי ללא פתוגנים (SPF). מתקן זה היה מצויד במערכת מחסום קפדנית, שיכולה למנוע ביעילות פלישת מיקרואורגניזמים וטפילים. הפרמטרים הסביבתיים של חדר המגורים נוטרו ומוסדרו אוטומטית על ידי מערכת בקרה מרכזית: טמפרטורה 22 ± 2 מעלות צלזיוס, לחות יחסית 55% ± 10%, ומחזור אור של 12 שעות ו-12 שעות חושך. מודל חולדה יילודה של נזק מוחי היפוקסיבי-איסכמי (HIBD) ששונה בשיטת רייס-ואנוצ'י הקלאסית שימש לסימולציה של המאפיינים הפתולוגיים וההתנהגותיים של CP.

בקצרה, גורי העכברים ביום השביעי לאחר הלידה הורדמו עם 2–3% איזופלוראן לצורך השראת ו-1–2% לתחזוקה. לאחר הרדמה מספקת, בוצעה חתך צוואר הרחם במרכז הקו, והעורק הקרוטידי השמאלי השמאלי בודד בקפידה וקשור לצמיתות. החתך נתפר, והגורים הורשו להתאושש על כרית חימום למשך שעה. בהמשך, הגורים בקבוצות המודל והקופטיזין נחשפו להיפוקסיה בתא שהכיל 8% O₂ מאוזן עם 92% N₂ במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס, כדי לגרום לפגיעה מוחית היפוקסית-איסכמית. בעלי חיים שנופלו בשמה עברו את אותה הרדמה וחשיפה ניתוחית ללא קשירת קרוטיד או טיפול היפוקסיבי. לאחר היפוקסיה, הגורים הוחזרו לסמים שלהם ונבדקו מדי יום למצב כללי, הישרדות והתנהגות האכלה לאורך תקופת הניסוי.

העכברים הניסיוניים חולקו באקראי לשלוש קבוצות: קבוצת שמים: רק העורק הקרוטידי המשותף-שמאלי הופרד ללא קשירה או טיפול בהיפוקסיה, ונפח שווה של ממס ניתן לאחר הניתוח; קבוצת מודל: בוצע ניתוח מידול נזקי מוח היפוקסיים-איסכמיים, ונפח שווה של ממס ניתן לאחר הניתוח; קבוצת קופטיסין: לאחר המודל, קופטיזין (10 מ"ג/ק"ג) ניתן על ידי גוואג'. המינון של קופטיזין (10 מ"ג/ק"ג) נבחר כמנה ב-in vivo בהתבסס על מחקרים שדווחו בעבר ב-vivvo/פרמקוקינטיקה של קופטיזין¹⁷. התרופות ניתנו פעם ביום בשעה קבועה במשך 14 ימים רצופים של התערבות.

זיהוי אינדיקטורים של בעלי חיים
ציוד הבדיקה של מבוך המים של מוריס (MWM) כלל בריכת מים עגולה גדולה (קוטר של כ-150 ס"מ) עם רמזים ויזואליים ברורים על קיר הבריכה. מי הבריכה היו מסודרים ללבן חלבי אטום, וטמפרטורת המים נשלטה ב-23 ± 1 מעלות צלזיוס. פלטפורמה שקופה הונחה ברבע המטרה, טבולה 1–2 ס"מ מתחת לפני המים. ההכשרה התקיימה ארבע פעמים ביום: החיות הונחו למים הפונים לקיר הבריכה מארבע נקודות כניסה שונות על קיר הבריכה, והזמן הנדרש להן למצוא ולטפס על הפלטפורמה הנסתרת מהכניסה למים, כלומר "השהיה הבריחה". כל אימון הוגבל ל-60 שניות. אם החיה מצאה את הפלטפורמה בתוך 60 שניות, הורשה להישאר עליה במשך 15 שניות כדי לחזק את הזיכרון. אם לא נמצא, החיה הובלה בעדינות אל הרציף והורשה להישאר למשך 15 שניות. לאחר 7 ימי אימון, הפלטפורמה המוסתרת הוסרה. החיות הונחו למים מנקודת הכניסה מול הפלטפורמה המקורית ואפשרו לשחות בחופשיות במשך 60 שניות, ומסלול השחייה של בעלי החיים הוקלט באמצעות מערכת וידאו. באמצעות מבחן MWM נרשמו מדדים כמו השהיית בריחה ממוצעת, זמן שהייה ברבע היעד, ומספר החציונים מעל מיקום הפלטפורמה המקורית.

לצורך זיהוי הדמיית ניגודיות בלייזר (LSCI): לאחר ההרדמה, החולדות הוצמדו על מכשיר סטריאוטקסי, והגולגולת נחשפה ונשמרה לחה. מערכת הדמיית זרימת דם בלייזר ספקל שימשה לאיסוף רציף של תמונות גולמיות של נקודות במשך 30 שניות ישירות מעל הגולגולת. תוכנות מקצועיות שימשו להמרת ניגודיות הנקודות המשתנה במרחב-זמן למפת התפלגות של יחידת זרימת דם מוחית (PU). לצורך ניתוח כמותי, נבחר ROI קורטיקלי שמוגדר ידנית בתוך ההמיספרה האי-צדדית החשופה בכל תמונה בהתאם לאזור הפרפוזיה הקורטיקלית הרלוונטי לנגע ולסימני ציון אנטומיים נראים לעין, וערך הפרפוזיה הממוצע בתוך ROI זה שימש להשוואה בין קבוצות.

נאספו רקמות מוח, והוספה PBS מקוררת מראש בהתאם ליחס משקל-נפח. בוצעה הומוגניזציה מכנית על הקרח, ואחריה צנטריפוגציה בטמפרטורה של 8000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10–15 דקות, והסופרנטנט נאסף לבדיקה. רקמות המוח הוכנסו במהירות ל-4% פאראפורמלדהיד לקיבוע במשך יותר מ-24 שעות לשמירה על מורפולוגיית הרקמות. צביעת המטוקסילין-אאוזין (HE) בוצעה באמצעות פעולות כמו ייבוש, ניקוי והטמעת פרפין, ורמת הפגיעה המוחית נצפתה תחת מיקרוסקופ אופטי.

לצורך מדידת פעילות AChE, הקורטקס המוחי מההמיספרה הפגועה (איפסילטרלית) נאסף והוגן לפי הוראות היצרן. דגימות רקמה הומוגנו בבופר החילוץ וצנטריפוגה ב-8000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והסופרנטנט נאסף לניתוח. פעילות AChE נקבעה באמצעות ערכת בדיקה מסחרית לפעילות אצטילכולינסטראז (שיטת מיקרופלט/קולורימטריה). בדיקה זו מבוססת על הידרוליזה של אצטילכולין על ידי AChE, ולאחר מכן תגובה עם DTNB ליצירת מוצר כרומוגני, והספיגה נמדדה ב-412 ננומטר לחישוב פעילות האנזים. מכיוון שערכה זו היא מבחן קולורימטרי מבוסס פעילות אנזימטית ולא ערכת ELISA קונבנציונלית למדידת אנטיגן עם כימות אנזימים, טווח זיהוי סטנדרטי ורגישות אנליטית לא סופקו על ידי היצרן. במחקר הנוכחי, ערכי פעילות ה-AChE שנמדדו ברקמת הקורטקס היו בטווח של 25–80 ננומול/מינימון/מ"ג חלבון.

ניתוח סטטיסטי
כל הנתונים הניסיוניים הובעו כסטיית תקן ממוצעת ± (SD) ונותחו באמצעות תוכנת GraphPad Prism. השוואות בין קבוצות בוצעו באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של טוקי. במבחן מבוך המים של מוריס, תוצאות האימון הסופיות ופרמטרי ניסוי הגשוש נותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן ההשוואות המרובות של טוקי. ערך של P < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית¹⁸. הקורלציה בין זרימת דם מוחית ב-ROI לפעילות AChE בקורטקס המוחי המקבילי נותחה באמצעות ניתוח קורלציה של פירסון. ערך של P < 0.05 נחשב למובהק סטטיסטית.

תוצאות

ניתוח רכיבים כימיים בתמצית C. chinensis
האלקלואידים הם הרכיבים המצטברים העיקריים וגם הרכיבים הפעילים העיקריים של חומרים רפואיים של C. chinensis . במחקר זה נעשה שימוש בטכנולוגיית כרומטוגרפיה לניתוח הרכיבים הכימיים העיקריים ב-C. chinensis (איור 1A). כפי שמוצג בטבלה 1, כל שמונת האנליטים הראו ליניאריות טובה בטווחי הכיול שלהם. מכיוון שהתכולה ותגובות הגלאי של אלקלואידים אלו היו שונות במידה ניכרת, טווח...

דיון

כיום, פותחו שיטות וטכנולוגיות שונות למניעה וטיפול במחלות מוח 20,21,22. במחקר זה אומצה אסטרטגיה משולבת של סקר חוץ-גופית, סימולציה חישובית ואימות ב-vivo כדי להבהיר באופן שיטתי את הבסיס החומרי והמנגנון הרב-מטרתי של C. chinensis בשיפור תסמינים דמויי שיתוק מוחין הנגרמים על ידי HIBD. הממצא המרכזי הוא שקופטיזין, אלקלואיד אופייני ב-C. chinensis, ולא ברברין בעל התכולה ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)	CATO Research Chemicals Inc.	416046844	בדיקת עכבת אצטילכולינסטראז
אצטילכולינסטראז (AChE)	Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd	C1682	בדיקת עכבת אצטילכולינסטראז
אצטילתיאוכולין יודיד (ATChI)	Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd	1037408	בדיקת עכבת אצטילכולינסטראז
אטונטריל	Thermo Fisher Scientific Inc	1162577	שלב נייד בכרומטוגרפיה נוזלית
AutoDock Vina	AutoDock	גרסה 1.2.5
תקן ברברין	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	110713-201814	ניתוח הרכב כימי
תקן קולמבמין	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180712	ניתוח הרכב כימי
תקן קופטיסין	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180309	ניתוח הרכב כימי
E-916 מוציא תמצית מואץ	Büchi Labortechnik AG, Switzerland	E916-008	חילוץ שבר n-butanol
תקן אפיברברין	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180309	ניתוח הרכב כימי
חומצה פורמית	Thermo Fisher Scientific Inc	1270563	שלב נייד בכרומטוגרפיה נוזלית
GaussView 6	Gaussian	https://gaussian.com/gaussview6/
תקן גלאוקין	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180615	ניתוח הרכב כימי
תקן ג'טרוריזין	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180607	ניתוח הרכב כימי
תקן מגנופלורין	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180205	ניתוח הרכב כימי
מתנול	Thermo Fisher Scientific Inc	1162578	שלב נייד בכרומטוגרפיה נוזלית
ממברנה מיקרופורית	Millipore Filter Company	2139547	סינון תמציות
תקן פלמטין	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180226	ניתוח הרכב כימי
Prism	GraphPad	https://www.graphpad.com/
PyMOL	PyMOL	https://pymol.org/
נתרן קרבונט	Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd	15138805	בדיקת עכבת אצטילכולינסטראז
נתרן דודקיל סולפט (SDS)	Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd	11019349	בדיקת עכבת אצטילכולינסטראז