ייצור וטיהור רקומביננטי של הידרופובין SC16 מאשריציה קולי ומעקב אחר ההרכבה העצמית שלו באמצעות בדיקות פלואורסצנציה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את ייצור וטיהור הרקומביננטים של הידרופובין SC16 מ-Escherichia coli ומספק בדיקות מבוססות פלואורסצנציה לניטור ההרכבה העצמית שלו.

תקציר

הידרופובינים הם חלבונים אמפיפתיים קטנים שמתאספים בעצמם בממשקים הידרופוביים-הידרופיליים ליצירת ציפויים עמידים למים מעל נבגים פטרייתיים. הידרופובינים מחלקה I יוצרים "רודלטים" יציבים במיוחד המכילים מבנים מסודרים דמויי אמילואידים שמצפים משטחים. כימיה יוצאת דופן זו מעניקה להם יישומים פוטנציאליים בהעברת תרופות, ייצוב קצף, אמולסיפיקציה ושינוי משטח. כדי לייצר הידרופובינים, יש צורך בפרוטוקולים מקיפים ובעלי תפוקה גבוהה ממערכות ביטוי פשוטות. יתרה מזאת, יש לספק שיטות נוחות לאפיון תפקוד ההידרופובין לאחר ייצור וטיהור רקומביננטי. כאן אנו מתארים פרוטוקולים לייצור ואפיון של SC16, הידרופובין מסוג IB המיוצר על ידי הפטרייה Schizophyllum commune, שניתן לבטא מחדש ב-Escherichia coli ולאחר מכן לטוהר בתנאים טבעיים שאינם מפחיתים. זה כולל טרנספורמציה של פלסמיד ביטוי המקודד SC16 עם חלבון מיזוג בקצה N ל-E. coli, השראת ביטוי חלבונים, ניתוק תאים בתנאים טבעיים, כרומטוגרפיה של זיקה ופיצול פרוטאז לבידוד ההידרופובין בתפוקות של ≥5 מ"ג. ההרכבה העצמית של SC16 יכולה להיות מנוטרת באמצעות בדיקות מבוססות פלואורסצנציה בנקודת קצה או קינטיות באמצעות תיאופלבין T. שני המבחנים כוללים דגירה של SC16 עם ערבוב ממושך לקידום הרכבה עצמית בממשקי אוויר-מים, ומפוטרים באמצעות מדידות פלואורסצנציה. יחד, גישות אלו מספקות פרוטוקולים פשוטים יותר לטיהור SC16 ולניטור ההרכבה העצמית שלו, וניתן להרחיב אותם למערכות נוספות הכוללות הרכבה עצמית דומה של חלבונים.

מבוא

הידרופובינים הם חלבונים אמפיפתיים פעילים על פני השטח שמופרשים על ידי פטריות שמתאספות בעצמן בממשקים הידרופוביים-הידרופיליים (למשל, ממשקי אוויר-מים על מבנים פטרייתיים). בטבע, תפקידם הוא לצפות נבגים וגופי פרי ^1,2, להפוך אותם לעמידים למים, למנוע הצפת תעלות אוויר ולהקל על פיזור¹. בשל הכימיה הייחודית של פני השטח, להידרופובינים יש יישומים תעשייתיים מגוונים, כולל ציפויים להגדלת תאימות ביו-תאימות של שתלים ותותבות ^3,4,5, סורפקטנטים ביוקומפטיביים למשלוח תרופות וטיפולים רפואיים 6,7,8,9,10, ומועמדים ללכידת ננופלסטיק¹¹.

ניתן לחלק הידרופובינים למחלקה I ומחלקה II, ששניהם מורכבים בעצמם בממשקים הידרופוביים–הידרופיליים, כולל אוויר–מים, שמן–מים 12,13,14, ופלסטיק–מים 15,16,17. מאפיין מגדיר של הידרופובינים מחלקה I הוא שהם יוצרים מבני "רודלט" יציבים מאוד בממשקים, המכילים תכונות מסודרות דמויות אמילואידים (עשירות β יריעה)¹⁸, מה שהופך אותם למתאימים במיוחד ליישומים של שינוי או הגנה על פני השטח. לעומת זאת, הידרופובינים מסוג II אינם יוצרים מבנים דמויי אמילואידים אלא יוצרים שכבות שניתן להפריד בקלות ^1,18. מעניין לציין שקיימת גם מחלקה שלישית של הידרופובינים, עם תכונות מבניות שנשמרו ממחלקה I ו-II^18,19. עקב ההבדלים הללו, ניטור ההרכבה העצמית של הידרופובינים חשוב לסיווג ולהערכת הקיפול והתפקוד הנכונים של הידרופובינים המיוצרים ברקומביננט.

הרכבה עצמית של הידרופובינים ניתנת למעקב בקלות בשיטות פלואורומטריות באמצעות צבעי קישור אמילואידים כמו תיאופלבין T (ThT), הנקשר למבני β חוצה הקיימים באמילואידים²⁰. ThT מכיל קשר קוולנטי יחיד שמפריד בין שתי טבעות ארומטיות שמסתובבות בדרך כלל בחופשיות. בעת קשירה למבנים חוצי-β, הסיבוב הזה מוגבל, מה שמוביל לפלואורסצנציה²⁰. בגלל הפלואורסצנציה הסלקטיבית שלו, ThT משמש באופן נרחב לניטור הרכבה עצמית של הידרופובינים במשקי אוויר-מים 21,22,23,24,25,26,27,28. בדיקות ThT מספקות מידע קינטי תלוי זמן על הרכבה עצמית של הידרופובין 23,27,28, ומציעות יתרונות על פני טכניקות כמו מיקרוסקופיית כוח אטום (AFM) ומדידות זווית מגע, שהן בעלות קצב תפוקה נמוך ופחות מתאימות לניתוח תלוי זמן. בנוסף, ThT מפגין שיפור פלואורסצנציה חזק במבני β חוצה קשר, עם פלואורסצנציה מינימלית בצורתו החופשית²⁰. תכונות אלו הופכות את בדיקות ThT לשיטות פשוטות ורגישות למעקב אחר הרכבה עצמית של הידרופובינים, שניתן לשלב אותן בטכניקות מבניות אינטנסיביות יותר.

בהתחשב במגוון היישומים של הידרופובינים, יש צורך בפרוטוקולים נגישים לניטור ההרכבה העצמית שלהם. באופן ספציפי, הפרוטוקול הנוכחי מספק מסגרת לאופטימיזציה של טיהור ואפיון פונקציונלי של הידרופובינים רקומביננטיים. בעבר, מוריס וסונדה (2013) הציגו פרוטוקולים לביטוי רקומביננטי באשריכיה קולי, טיהור וניטור מבוסס ThT של הרכבה עצמית של הידרופובין²¹. עבודה זו מרחיבה שיטות אלו על ידי תיאור הליך מותאם לטיהור ההידרופובין SC16. SC16 הוא הידרופובין מחלקה I (מקומונת Schizophyllum) שניתן לטהר בקלות מ-E. coli מבלי לדרוש דה-דנטורציה, הפחתה או חמצון מחדש של קשרי דיסולפיד. חלבון SC16 המתקבל הוא פונקציונלי, כפי שמודגם על ידי בדיקות הרכבה עצמית מבוססות ThT בנקודת קצה וקינטיות המנטרות את היווצרות המוטות. מטרת מאמר זה היא לפרט פרוטוקול מקיף ויעיל לייצור רקומביננטים, טיהור ובדיקות תפקודיות מבוססות ThT של ההידרופובין מסוג IB SC16.

פרוטוקול

מחקר זה אינו כולל משתתפים אנושיים, בעלי חוליות או דגימת רקמות. לכן, לא נדרשה אישור אתי.

1. ביטוי של הידרופובין SC16 באי-קולי

1. טרנספורם תאי E. coli ששפל T7 אקספרס באמצעות הלם חום ב-42°C למשך 45 שניות באמצעות פלסמיד ביטוי pET-21 המקודד דומיין B1 מתויג הקסאהיסטידין של חלבון G המותח ל-SC16 (H-GB1-SC16).
   הערה: תאי Shuffle T7 Express נבחרו בשל יכולתם לקדם יצירת קשר דיסולפיד נכון²⁹. הפלסמיד H-GB1-SC16 יכול להיווצר באמצעות שיבוט אנזימי הגבלה כפי שתואר קודם³⁰.
2. החרינו 2 מ"ל של מרק ליזוגני (LB) המכיל 100 מיקרוגרם מ"^ל-1 אמפיצילין עם מושבה אחת. דגרו לילה בטמפרטורה של 37°C עם ניעור.
3. החסן 1 ליטר LB (בבקבוק עגול עם תחתית עגולה בנפח 2.8 ליטר) עם 1 מ"ל של תרבית הלילה. גדלו את התרבית בטמפרטורה של 37°C עם רעידות (~120–135 סל"ד, מסלול מעגלי של 19 מ"מ) עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מגיעה ל-0.6 ± 0.1.
4. הוסף איזופרופיל-β-D-1-תיוגלאקטופירנוסיד לריכוז סופי של 0.5 מ"מ כדי לעורר ביטוי של H-GB1-SC16. דגרו לילה בטמפרטורה של 20°C עם ניעור.
   הערה: טמפרטורה זו נבחרה כדי להפחית את הסיכון להיווצרות גוף הכללה ולקיפול לא תקין³¹.
5. קצור את התאים בצנטריפוגציה ב-4000 × גרם למשך 20 דקות. תשפוך את הסופרנטנט.
   נקודת הפסקה: אחסן את כדור התא בטמפרטורה של −20°C עד 3 שבועות לפני המשך לטיהור. הימנעו ממחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים.

2. טיהור הידרופובין SC16

1. החזירו את כדור התא ל-30 מ"ל של בופר ליזיס (20 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane [Tris], pH 8, 250 mM NaCl).
2. לעבור את התאים על ידי דגירה של התעלה באמבט מים בטמפרטורה של 80°C למשך 15 דקות. ערבבו בעדינות כל 5 דקות במהלך הדגירה.
   הערה: שלב זה תלוי ביציבות החום של SC16 וייתכן שלא יתאים לחלבונים אחרים.
   אזהרה: השתמש בכפפות עמידות לחום בעת טיפול בצינורות ובאמבטיות מים בטמפרטורה של 80°C. הימנעו מהתזת נוזל חם במהלך הערבוב והסרת הצינורות.
3. צנטריפוגה את התא ליזאט ב-25,000 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4°C. טען את הסופרנטנט על עמוד כבידה המכיל שרף IMAC (כרומטוגרפיית זיקה מתכותית (IMAC) במשקל 2–3 מ"ל Ni 2⁺-טעון.
4. שטפו את העמודה עם בופר ליזיס המכיל 30 מ"מ אימידזול. חלבון אלוט המשתמש ב-10 מ"ל בופר ליזיס המכיל 300 מ"מ אימידזול.
5. דיאליזציה של החלק המוחלף מול 1 ליטר של בופר המכיל טריס (pH 8; 20 מ"מ) ו-NaCl (50 מ"מ) למשך 3 שעות באמצעות צינור דיאליזה חיתוך במשקל מולקולרי של 3500 kDa, תוך ערבוב ב-100 סל"ד.
   הערה: מהירות הערבוב במהלך דיאליזה עשויה להשתנות בהתאם להגדרה (למשל, נפח הצינור וגיאומטריית הבקבוק). ערבבו במהירות המינימלית הנדרשת כדי לגרום לסיבוב עדין של שקית הדיאליזה.
6. הוסיפו פרוטאז תרומבין (20 U mg⁻¹ חלבון פיוז'ן) ישירות לשקית הדיאליזה (נפח תגובה כולל של 10 מ"ל) כדי לחתוך את חלבון המיזוג. החלף את הבופר.
   נקודת הפסקה: לאחר הוספת פרוטאז והחלפת הבופר, המשך הדיאליזה ללילה בטמפרטורה של 4°C. המשך את הטיהור למחרת. אמת את השלמת החיתוך על ידי SDS-PAGE (צפו להיעלמות פס ~18 kDa והופעת רצועות ב-~10 ו-~8 kDa).
7. טענו מחדש את הדגימה המסודרת לעמודת IMAC טעונה^{ב-Ni 2}⁺. שטיפה ואלוט עם כ-12 מ"ל בופר כל אחד המכיל 30 מ"מ ו-300 מ"מ אימידזול, בהתאמה.
8. לנתח שברים שנאספו באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט–פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) בתנאי חיזור (באמצעות β-מרקפטואנול בבופר העומס). זהה את SC16 לפי נוכחות רצועה בשבר השטיפה במשקל המולקולרי הצפוי (~10 קילו-דלטון). דיאליזציה של חלק השטיפה המכיל את SC16 במלואו מול ליטר 1 בופר המכיל טריס (pH 8; 20 מ"מ) ו-NaCl (50 מ"מ) למשך 3 שעות כדי להסיר אימידזול שאריתי.
   הערה: SC16 מזוהה בדרך כלל בשבר השטיפה, בעוד ש-H-GB1 מועשר בדרך כלל ב-eluate. ייתכן שגם כמות קטנה של שאריות SC16 באלואאט.
9. כמת את SC16 בשיטה מועדפת (למשל, ניתוח חומצות אמינו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, מבחן ברדפורד, או ספיגה ב-280 ננומטר). בשיטה זו, צפויים תפוקות של ≥5 מ"ג SC16 לליטר תרבית.
   הערה: הקבוצה שלנו מכמת באופן שגרתי את SC16 על ידי ספיגה ב-280 ננומטר באמצעות מקדם הכחדה צפוי של 3480 M⁻¹ ס^{"מ−1 32} זוהי השיטה המועדפת לכימות SC16 בשל פשטותה.
10. איסוף דגימות במהלך הטיהור לניתוח SDS-PAGE.

3. בדיקת פלואורסצנציה בנקודת קצה של ההרכבה העצמית של SC16

1. הכינו תערובות תגובות משולשות המכילות 50 מיקרוגרם ^mL−1 SC16, 50 mM NaCl, ו-20 mM כל אחת מ-2-(N-מורפולינו)אתנסולפוניק חומצה (MES), טריס ופוספט נתרן. הכינו בופר מלאי מראש המכיל MES, טריס ונתרן פוספט, מותאם ל-pH סופי של 6.5 על ידי הוספת HCl מרוכז או 1 M NaOH. הוסף חלבון ו-NaCl מיד לפני תחילת הבדיקה.
   הערה: ניתן להכין בקרות בשלב זה. לדוגמה, כלול בקרות חיוביות המכילים SC16 שאינם עוברים סיבוב מקצה על קצה ובקרות שליליות המכילות רק בופר. ריכוזי SC16 של 25–100 מיקרוגרם מיליטר⁻¹ נבדקו, כאשר התוצאות היו העקביות ביותר ב-50 מיקרוגרם מיליטר⁻¹. אופטימיזציה של פרמטר זה לפי הצורך.
2. העבר את התערובות לצינורות של 2–5 מ"ל.
   הערה: ודא שצינור הדגימה מלא עד 50% קיבולת כדי לאפשר ערבוב נכון בעת היפוך.
3. סובב את הצינורות מקצה לצד לצד ב-20 סל"ד ל-2 שעות. העבר 100 מיקרוליטר מכל דגימה לפלטת שחורה אטומה עם תחתית אטומה עם בארות עגולות בסגנון ארובה.
4. הוסיפו ThT מסונן לריכוז סופי של 20 מיקרומום לכל הדגימות.
5. כוון את קורא המיקרופלט לאורכי גל של עירור ופליטה בטווח המתאים לפלואורסצנציה^ThT 33,34,35,36. הגדר את הרווח ל-55 ואת זמן האינטגרציה ל-20 מיקרושניות. מדוד את עוצמת הפלואורסצנציה עבור כל דגימה מיד לאחר תקופת הסיבוב של 2 שעות.
   הערה: המקסימום המדווח של ההתרגשות והפליטה של ThT הוא 450 ננומטר ו-490 ננומטר³⁷, בהתאמה. ניסוי זה השתמש בערכי עירור ופליטה של 438 ו-494 ננומטר, בהתאמה, בהתבסס על זמינות מסנן אופטי. סיבוב קצה על קצה בוצע באמצעות מכשיר סיבוב מתוכנן.

4. בדיקת פלואורסצנציה קינטית של SC16 להרכבה עצמית

1. הכינו תערובות תגובה משולשות של 100 מיקרוליטר בלוח שחור עם 96 בארים.
2. כולל 50 מיקרוגרם ^mL−1 SC16, 50 mM NaCl, 20 מיקרומום ThT מסונן, ו-20 mM כל אחד MES, Tris ונתרן פוספט. הכינו בקרים שליליים המכילים רק ThT ו-buffer (ללא SC16).
3. כוונו את ה-pH של הבופר (המכיל Tris, MES ונתרן פוספט) ל-5.5, 6.5, 7.5 או 8.5 באמצעות HCl מרוכז או 1 M NaOH לפני הוספת SC16 ו-ThT. מערכת הבופר המעורבת מאפשרת התאמת pH מבלי לשנות את זהות המאגר.
4. הכניסו את הפלטה לקורא המיקרופלט.
5. הגדר את אורכי הגל של העירור והפליטה בטווח המתאים לפלואורסצנציה ThT 33,34,35,36.
6. תכנת את הקורא למדידות מחזוריות כל 70 שניות.
7. כולל 60 שניות של רעידות במסלול במהירות 432 סל"ד, ואחריהן תקופת מנוחה של 10 שניות לכל מחזור.
8. הגדר את זמן האינטגרציה ל-20 מיקרושניות ואת הרווח ל-55.
9. הריץ את הבדיקה במשך 120 מחזורים כדי לעקוב אחרי שינויים בפלואורסצנציה במשך שעתיים של רעידות.
   הערה: ודא שנבחר ברעידת מסלול; רעידה ליניארית עשויה להניב תוצאות הרכבה עצמית לא עקבית או לא אופטימלית.

תוצאות

איור 1 מציג ג'ל SDS-PAGE צבוע בקומאסי המנטר את טיהור SC16. הקודים מייצגים סמן (M), לפני האינדוקציה (B), אחרי האינדוקציה (A), שבר מסיס (S), זרימה-דרך (F), שטיפה (W), אלואט (E) ודיאליזציה (D). ב-Iluate הראשון של IMAC, רצועה עם משקל מולקולרי מוערך של ~18 kDa תואמת לחלבון H-GB1-SC16 לפני פיצול הטרומבין. לאחר חיתוך עם תרומבין, אין חלבון בשבר הזרימה השני של IMAC, ויש פס ~10kDa המתאים ל-SC16 בשטיפה. ב-IMAC השני יש שאריות של SC16 וחלבון קטן יותר בגודל ~8 kDa התואם ל-H-GB1. SC16 מטוהר שימש לאחר מכן לבדיקות הרכבה עצמית בנקודת קצה וקינטית. תוצאות אלו מאשרות טיהור מוצלח של SC16, כפי שמעידים נוכחות רצועת המשקל המולקולרי הצפויה והפרדת שותף המיזוג H-GB1 לאחר חיתוך תרומבין.

איור 1. ניתוח SDS-PAGE של טיהור SC16 עבור ההפרדה הראשונה (לפני חיתוך הטרומבין) והשנייה (לאחר חיתוך הטרומבין) של IMAC. מוצג סמן משקל מולקולרי (M), יחד עם דגימות שנאספו לפני האינדוקציה (B), לאחר האינדוקציה (A), הסופרנטנטנט של פירוק התא (S), זרימה דרך (F), שטיפה (W) וחלקי אלואט (E), וכן הדגימה המפורטת (D). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

מבחן ה-ThT בנקודת הסיום של ההרכבה העצמית של SC16 שהוצגה בטבלה 1 מגלה עלייה פי 11 בעוצמת הפלואורסצנציה של ThT לאחר שעתיים של סיבוב על הספסל בהשוואה לבקרות המכילה חלבון שלא סובבו. באופן דומה, איננו מבחינים בשינוי משמעותי בעוצמת הפלואורסצנציה בעת סיבוב דגימות הבופר. עלייה זו בפלואורסצנציה של ThT בעת ערבוב SC16 מייצגת את היווצרות גיליונות β דמויי אמילואידים המעידים על הרכבה עצמית של SC16^24,25. תוצאות אלו מראות כי הבדיקה המבוססת על פלואורסצנציה המתוארת עוקבת ביעילות אחר ההרכבה העצמית של SC16 בתנאים שנבדקו.

דוגמה	ThT פלואורסצנציה (נחשב ± SD)
SC16 ללא סיבוב	2679 ± 177
SC16 לאחר סיבוב	30315 ± 2141
בופר לאחר סיבוב	665 ± 888

טבלה 1. מדידות פלואורסצנציה ThT נאספו לאחר סיבוב סופי של דגימות SC16. דגימות SC16 (50 מיקרוגרם מ"^ל) או דגרו ללא ערבוב או עברו סיבוב למשך 2 שעות. ThT (20 מיקרומון) נוסף לפני מדידות הפלואורסצנציה. פלואורסצנציה נמדדה באורכי גל של עירור ופליטה של 438 ו-494 ננומטר, בהתאמה, ומדווחת כספירות גולמיות. הערכים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD).

מבחן ההרכבה העצמית הקינטית של SC16 כאשר הוא מערער בזיכרונות שונים במשך מספר שעות מוצג באיור 2. עקומות הרכבה עצמית קינטיות בצורת S טיפוסיות לפיברילציה אמילואידית כוללות תקופות טיפוסיות של השהייה, גדילה ומישור³⁸. עבור SC16, לא נצפתה תקופת השהייה משמעותית במהלך הקריאות הראשוניות, אם כי התנהגות זו תועדה עבור הידרופובינים אחרים, כגון EAS^21,23. עקומות ההרכבה העצמית עבור כל pH הן דומות, עם שיפועים חיוביים חזקים התואמים להיווצרות רודלט. לאחר כ-20 דקות של ערבוב, עוצמת הפלואורסצנציה מתיישבת ואז יורדת בהדרגה. בדגימות ביקורת ללא SC16, אין שינויים משמעותיים בפלואורסצנציה לאורך כל הניסוי.

איור 2. עקומות ההרכבה העצמית של SC16 נמדדו באמצעות מבחן פלואורסצנציה קינטי של ThT. SC16 הוכן ב-50 מיקרוגרם mL⁻¹ בבופר רב-רכיבי המכיל 20 מיקרומום ThT, 50 mM NaCl, 20 mM נתרן פוספט, 20 mM MES ו-20 mM טריס. המדידות נערכו לאחר 60 שניות של רעידות מסלוליות ותקופת מנוחה של 10 שניות. ציר ה-x מייצג את זמן הרעידה (סה"כ 2 שעות). הפלואורסצנציה נמדדה באמצעות אורכי גל של עירור ופליטה של 438 ננומטר ו-494 ננומטר, בהתאמה, ומדווחת כספירות × 10⁻³. פסי שגיאה מייצגים סטיית תקן (n = 3). הפאנלים מתאימים ל-pH 5.5 (למעלה משמאל), 6.5 (למעלה מימין), 7.5 (למטה משמאל) ו-8.5 (למטה מימין). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

איור 3 מציג דוגמה לתוצאות תת-אופטימליות במבחן ההרכבה העצמית הקינטית. במקרה זה, הבדיקה הושלמה כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול, למעט שימוש בהגדרת רעידה "ליניארית" במקום הגדרת הרעידה ה"מסלולית".

איור 3. דוגמה לנתוני הרכבה עצמית קינטית תת-אופטימלית של SC16 שהושגו באמצעות מבחן הפלואורסצנציה הקינטי ThT. במקרה זה, הרעידה בוצעה באמצעות הגדרה ליניארית במקום רעידה מסלולית. הדגימות הוכנו כפי שתואר באיור 2. המדידות נלקחו לאחר 60 שניות של רעידות ליניאריות ותקופת מנוחה של 10 שניות. ציר ה-x מייצג את זמן הרעידה (סה"כ 2 שעות). פלואורסצנציה נמדדה באמצעות אורכי גל עירור ופליטה של 438 ננומטר ו-494 ננומטר, בהתאמה, ומדווחת כספירות × 10⁻³. פסי שגיאה מייצגים סטיית תקן (n = 3). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

כאן, אנו מסכמים פרוטוקולים לביטוי וטיהור ההידרופובין SC16, וכן לבדיקות פלואורסצנציה בתפוקה נמוכה וגבוהה של הרכבה עצמית של SC16, שלכל אחד מהם יתרונות וחסרונות ייחודיים. זרימות עבודה אלו יכולות להיות מיושמות במערכות קשורות לניטור הרכבה עצמית של חלבונים. בפרוטוקול זה, החום משמש לפירוק תאים לפני טיהור SC16, בניגוד לרוב הפרוטוקולים שמשתמשים בשיטות מסורתיות יותר לפירוק E. coli. מצאנו כי H-GB1-SC16 הוא מסיס ועמיד בחום עד 80°C, וכי פירוק חום משמש כשלב ניקוי ראשוני של דגימות על ידי הפקעת פרוטאזות לא יציבות חום וחלבונים מזהמים אחרים בתוך הליזאט³⁹ של התא. עם זאת, SC16 מייצג מקרה מיוחד, שכן הידרופובינים מתבטאים לעיתים קרובות באופן בלתי פתיר בגופים הכללה 12,21,40. כאשר הם מבוטאים כגופים משולבים, בדרך כלל נדרשים תנאי דנטטורציה, ואחריהם קיפול מחדש באמצעות פרוטוקולים קיימים 21,40,41.

בפרוטוקול זה, SDS-PAGE משמש להערכת טיהור SC16 בכל שלב, כולל כדור התא לפני ואחרי ההשראה, השבר המסיס לאחר פירוק התא, וכל חלקי העמודה שלאחר מכן. דבר זה מוצג באיור 1; עם זאת, בהשוואה ל-H-GB1, התחום המתאים ל-SC16 יחסית חלש. מצאנו שעבור הידרופובינים רבים, כולל SC16, השגת צביעת קומאסי עקבית ואינטנסיבית היא אתגר. SC16 מופיע בדרך כלל כרצועה בעוצמה בינונית כאשר משתמשים ב-β-מרקפטואנול כסוכן חיזור (איור 1). במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך בצביעת כסף כדי להמחיש הידרופובינים בצורה ברורה יותר.

ניתן להשתמש במבחני פלואורסצנציה בנקודת קצה וקינטיקה לניטור ההרכבה העצמית של SC16. מבחן הנקודה הסופית ThT הוא יתרון כי הוא מספק הערכה מהירה ופשוטה של ההרכבה העצמית. בנוסף לעלייה בפלואורסצנציה לאחר 2 שעות של סיבוב על הספסל, ההרכבה העצמית מלווה לעיתים קרובות בערפול לבן נראה לעין בצינור התגובה. מבחן זה משתמש ברוטטור פשוט לשולחן לערבוב, שמפחית שחיקה על רכיבי קורא המיקרופלט. מניסיוננו, מבחן זה אינו רגיש יחסית לפרמטרים אינסטרומנטליים, כמו הגדרות ניעור בקורא מיקרופלט.

מבחן ה-ThT הקינטי מספק מידע מפורט יותר על ההרכבה העצמית. לדוגמה, ההרכבה העצמית של SC16 אינה תלויה באופן משמעותי בתנאי בופר²⁴, אם כי נצפה שונות גדולה יותר בין השכפולים בערכי pH גבוהים יותר. עם זאת, התנהגות זו אינה אוניברסלית בקרב הידרופובינים, וגורמים כמו ריכוז מלח, pH 24,27,42, ותוספים (כגון חומרי ניקוי או אלכוהולים) ידועים כמשפיעים על ההרכבה העצמית של הידרופובין ^27,28. לדוגמה, ההידרופובין SLH4 מציג הרכבה עצמית יעילה יותר בחוזק יוני נמוך ו-pH^{נמוך 24}, בעוד שההרכבה עצמית של HFBII דווחה כבלתי תלויה ב-pH ובריכוז אלקטרוליטים⁴², בדומה ל-SC16. מחקרים נוספים קישרו את השפעות התוספים על היווצרות רודלט לשינויים במתח הפנים^27,28. בהינתן הבדלים אלו, חשוב לשקול את הרכב הבופר וה-pH לכל מערכת ולנטר את השפעתם על עקומת ההרכבה העצמית, כולל אזורי שלב ההשהייה, הצמיחה והפלטו.

מגבלה חשובה היא שמבחן ה-ThT הקינטי רגיש מאוד לפרמטרים האינסטרומנטליים של קורא המיקרופלטה ויכול להשתנות בין מכשירים. לדוגמה, הבדל משמעותי בהרכבה עצמית של SC16 נצפה בין הגדרות הרעידות המסלוליות (תנועה מעגלית) לבין ליניאריות (הלוך ושוב) (איור 2 ואיור 3, בהתאמה). בעוד שבדיקות מבוססות ThT מספקות שיטה יעילה למידול הרכבה עצמית של הידרופובינים, יש להן מגבלות מובנות בשל סלקטיביות משתנה, העלולה להוביל לאותות חיוביים שגויים או שליליים שגויים⁴³. בנוסף, פיזור אור מאגרגטים הידרופובינים עשוי להשפיע על עוצמת פלואורסצנציה^{נמדדת 44}, ולהפחית את דיוק המדידה. דילול הדגימה והקטנת אורך המסלול עשויים לסייע בהפחתת השפעות אלו.

הפרוטוקולים המסוכמים כאן מספקים שיטות יעילות לטיהור ומעקב אחר ההרכבה העצמית של SC16. מבחן נקודת הקצה הוא פשוט ופחות תלוי במכשירים, בעוד שהבדיקה הקינטית מספקת מידע מפורט בזמן, אם כי עם רגישות רבה יותר לפרמטרים אינסטרומנטליים. פרוטוקול זה מתאר גישה פשוטה לטיהור SC16 ועשוי להיות רלוונטי גם להידרופובינים אחרים המקופלים כראוי המובעים ב-E. coli. למרות שלבדיקות ThT המתוארות יש מגבלות מובנות, הן מספקות מידע הרכבה עצמית תלוי זמן בהשוואה לטכניקות כמו AFM או מדידות זווית מגע בלבד. זרימות עבודה אלו ניתנות להתאמה לחלבונים קשורים ורלוונטיות במיוחד ליישומים בפיתוח ביומטריאלים, אספקת תרופות ותחומים נוספים שבהם חשוב להבין את ההרכבה העצמית של חלבונים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	145224-94-8	רכיב מאגר עבור ניסויי הרכבה עצמית
5 mL round bottom polystyrene tube	Falcon	352054	משמש לניסויי הרכבה עצמית בתפוקה נמוכה
96-well black polystyrene microplate	Grenier	655076	משמש למדידות פלואורסצנציה בקורא מיקרופלטות
Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) solution (40%)	BioShop	ACR004.500	משמש להכנת ג'לים SDS-PAGE
Agar	BioShop	AGR002.1	אגר המשמש להכנת צלחות LB עמידות לאמפיצילין
Ampicillin	IBI Scientific	IB02040	אנטיביוטיקה המשמשת בצלחות LB-אגר
Baffled 2.8 L Fernbach flasks	Fisher Scientific	955239	משמש לגידול תרביות חיידקים בנפח גדול
β-mercaptoethanol	TCI Chemicals	60-24-2	סוכן מחזר המשמש בהכנת דגימות SDS-PAGE
Column (1.5 cm diameter gravity column)	Bio-Rad	7371522	משמש לטיהור אפיניות ניקל
Dialysis tubing (3500 kDa MWCO)	BioDesign	D302	משמש להחלפת מאגר במהלך טיהור
Emission filter	Edmund Optics	84080	משמש לניסויי ThT (494 ננומטר, פס 20 ננומטר)
Excitation filter	Edmund Optics	67012	משמש לניסויי ThT (438 ננומטר, פס 24 ננומטר)
Fluorescence microplate reader	Tecan	Infinite F200 Pro	משמש למדידת עוצמת הפלואורסצנציה של ThT
Hotplate	Lab Fish	HS5C	משמש להגדרת אמבט מים עם ניטור טמפרטורה
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Chemical	A144-212	משמש להתאמת pH של מאגרים
Imidazole	TCI Chemicals	288-32-4	משמש בטיהור IMAC (מאגרי שטיפה ושחרור)
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	367-93-1	מגרה ביטוי חלבון ב-E. coli
LB broth (Lennox)	BioShop	LBL405.5	מדיום גידול לתרבית חיידקים
Low-speed refrigerated centrifuge	Beckman Coulter	360291	משמש לפלוט תאים לפני אחסון
Nickel NTA agarose beads	GoldBio	H-350-50	שרף המשמש לטיהור אפיניות של חלבונים עם תג His
SC16 plasmid	BioBasic	N/A	מבנה DNA מותאם אישית המקודד לחלבון נגזרת H-GB1-SC16
SHuffle T7 Express competent E. coli	New England Biolabs	C3029J	זן מארח המשמש לביטוי חלבון רקומביננטי
Sodium chloride (NaCl)	BioShop	SOD001.5	רכיב מאגר ומוסדר כוח יוני
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Chemical	SS255-1	משמש להתאמת pH של מאגרים
Sodium phosphate	BioShop	SPD579.1	רכיב מאגר לשמירה על pH
Spectrophotometer	Pharmacia Biotech	5096	משמש לכימות של SC16
Thioflavin T (ThT)	Acros Organics	2390-54-7	צבע פלואורסצנטי המשמש למעקב אחר הרכבה עצמית של חלבונים
Thrombin protease	Sigma-Aldrich	04-04-9002	משמש לפיצול חלבון נגזרת H-GB1-SC16
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	BioShop	TRS001.5	מאגר המשמש בפתרונות טיהור ובמבחנים
High-speed refrigerated centrifuge	Sorvall	46915	משמש לבירור לישט לאחר פירוק תאים
SDS-PAGE setup	Bio-Rad	1658000EDU	משמש להכנת והפעלת ג'לים SDS-PAGE