הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

אקסוזומים המופקים משיליה מפחיתים אפופטוזיס של טרופובלסט המושרה על ידי היפוקסיה והתקדמות דלקתית באמצעות SASH1

56 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71083

⸱

18 באוגוסט 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, The Fourth Hospital of Shijiazhuang

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

חלבון המכיל דומייני SAM ו-SH3 1 (SASH1) זוהה כווסת מרכזי של אפופטוזיס ודלקת של טרופובלסט ברעלת הריון (PE). אקסוזומים המופקים משליה (P-EXOS) מקלים על פגיעה מושרית היפוקסיה על ידי דיכוי הביטוי של SASH1. ממצאים אלו חושפים מנגנון חדש העומד בבסיס הפתוגנזה של PE ומצביעים על SASH1 כמטרה טיפולית פוטנציאלית.

תקציר

SASH1 הוא חלבון מתאם אותות המעורב בצמיחת תאים, אפופטוזיס ובבקרת מערכת החיסון, ונחקר יותר ויותר בתאי גידול ותאי חיסון. ראיות חדשות מצביעות על כך ש-SASH1 ממלא תפקיד חשוב בתגובות דלקתיות ובהומאוסטזיס תאי, תהליכים הקשורים באופן הדוק להתפתחות של PE. מחקר זה נועד לקבוע האם SASH1 תורם לאפופטוזיס של טרופובלסטים ולתגובות דלקתיות ב-PE והאם P-EXOS מפעיל השפעות מגנות באמצעות ויסות של SASH1. במחקר זה, נותחו שלושה מאגרי נתונים טרנסקריפטומיים הקשורים ל-PE (GSE75010, GSE10588, ו-GSE60438) כדי לזהות גנים בעלי ביטוי שונה (DEGs) משותפים, ולאחריהם בוצעו ניתוחי העשרה של Gene Ontology (GO) ו-Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). אלגוריתמים של למידת מכונה יושמו בהמשך כדי לסנן גני מועמדות מרכזיים, ונתוני רצף RNA של תא בודד שימשו לאפיון ההטרוגניות התאית ברקמת השליה ולקביעת דפוסי ביטוי ספציפיים לסוגי תאים. SASH1 זוהה כגן מועמד קונסנסוסי והיה בעל ביטוי מוגבר משמעותית בתאי טרופובלסט מדגימות של PE. In vitro, הוקם מודל של תאי טרופובלסט HTR-8/SVneo שעברו טיפול בהיפוקסיה, בשילוב עם knockdown של SASH1, ביטוי יתר של SASH1, וקו-קלטורה עם P-EXOS. ניסויים תפקודיים הראו כי knockdown של SASH1 דיכא באופן משמעותי את אפופטוזיס של טרופובלסטים המושרה על ידי היפוקסיה והפחית את הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים, כולל IL-6, IL-1β, ו-TNF-α, בעוד שביטוי יתר של SASH1 קידם אפופטוזיס ותגובות דלקתיות. בנוסף, טיפול ב-P-EXOS הפחית באופן ניכר את ביטוי SASH1 הן ברמת ה-mRNA והן ברמת החלבון והחליש את הפגיעה בטרופובלסטים המושרה על ידי היפוקסיה, בעוד שביטוי יתר של SASH1 ביטל במידה רבה השפעות מגנות אלו. יחד, ממצאים אלו מעידים כי SASH1 ממלא תפקיד קריטי באפופטוזיס של טרופובלסטים ובתגובות דלקתיות ב-PE. P-EXOS עשוי להקל על פגיעה טרופובלסטית המושרית על ידי היפוקסיה באמצעות דיכוי ביטוי SASH1, ובכך מספק תובנות חדשות לגבי המנגנונים המולקולריים ומטרות טיפוליות פוטנציאליות ל-PE.

מבוא

PE היא הפרעה רב-מערכתית הספציפית להיריון, המתרחשת בדרך כלל לאחר 20 שבועות של הריון ומאופיינת קלינית ביתר לחץ דם, בחלבוני שתן ובליקוי בתפקוד של איברים מרובים. היא נותרה גורם מוביל לתחלואה ותמותה אימהית ופרינטלית ברחבי העולם1. למרות התקדמויות מתמשכות בניהול הקליני, הטיפול המכריע ב-PE הוא עדיין לידת השליה, דבר המדגיש את ההבנה החלקית של הפתוגנזה שלה ואת הצורך הדחוף לזהות מנגנונים מולקולריים ותאיים חדשים, כמו גם מטרות טיפוליות פוטנציאליות2,3.

פלישה נאותה של טרופובלסט וקידום התפתחות רחמית תקינה הם מנגנונים קריטיים העומדים בבסיס הפתוגנזה של PE4. במהלך הריון תקין, תאי טרופובלסט פולשים לדצידואה הרחמית ומעצבים מחדש את העורקים הספירליים כדי לבסס מחזור דם בעל התנגדות נמוכה וקיבולת גבוהה. פגיעה בפלישה ובנדידה של תאי טרופובלסט מובילה להפחתה בפרפוזיה של השיליה, מה שגורם לסביבה מתמשכת של היפוקסיה ועקה חמצונית. היפוקסיה משפיעה ישירות על אפופטוזיס תאי, ושחרור חריג של מתווכים פרו-דלקתיים משבש את ההומאוסטזיס בממשק העובר-אם, ובכך מחמיר עוד יותר את התפקוד הלקוי של השיליה5. דלקת היא גם גורם מניע חשוב של PE. נמצא כי IL-17, IL-6 ו-TNF-α מוגברים באופן ניכר בשיליה ובדם הפריפרי של חולות PE6. היפוקסיה ודלקת מחזקות זו את זו, ויוצרות מעגל קסמים המגביר דלקת סיסטמית, גורם לנזק אנדותליאלי ותורם לליקויים בשיליה. הרשתות המולקולריות הבסיסיות השולטות באפופטוזיס של טרופובלסט ובתגובות דלקתיות נותרו במידה רבה לא ידועות.

SASH1 הוא חבר במשפחת חלבוני הפיגום התוך-תאיים SLy/SASH1 המתפקד כמתאם איתות7. SASH1 אופיין בעיקר כמדכא גידולים המעכב מעבר אפיתליאלי-מזנכימלי (EMT), נדידת תאים ופלישה באמצעות אינטראקציות עם שותפי איתות כגון CRKL ונתיב ה-PI3K-Akt-mTOR8,9. מעבר לתפקידיו כמדכא גידולים, ראיות חדשות מצביעות על כך ש-SASH1 משתתף באיתות דלקתי ובויסות חיסוני7. עם זאת, הביטוי והתפקוד של SASH1 בשיליה, ובמיוחד בהקשר של ביולוגיית הטרופובלסט ו-PE, טרם נחקרו.

אקסוזומים התגלו כמתווכים תאיים חשובים ונחקרים יותר ויותר בהקשר של הריון10. אקסוזומים מעבירים מטענים ביו-אקטיביים שונים, כולל חלבונים, ליפידים ו-RNAs לא מקודדים, כדי לווסת את תפקוד התא המקבל. עדויות גוברות מצביעות על כך ש-P-EXOS ממלאים תפקיד קריטי בוויסות חיסוני במהלך ההריון, וכי פעילותם והמטען שהם נושאים משתנים באופן משמעותי ב-PE, מה שעשוי להגביר את המצב הדלקתי11. אקסוזומים נקשרו גם לוויסות של עקה חמצונית12 ואנגיוגנזה13, וייתכן שהם מפעילים השפעות מועילות בסיבוכים הקשורים להריון. עם זאת, המטרות המולקולריות שלהם ומנגנוני הפעולה שלהם ב-PE עדיין אינם מובנים במלואם.

הועלתה השערה כי SASH1 אינו מווסת כראוי בשיליה המעורבות ב-PE ופועל כמניע מרכזי של אפופטוזיס של טרופובלסט ותגובות דלקתיות, וכי P-EXOS עשויים להפעיל השפעות מגנות מפני פגיעה בטרופובלסט על ידי ויסות ביטוי SASH1. כדי לבחון השערה זו, שולבו מספר מאגרי נתונים טרנסקריפטומיים של PE ונתוני ריצוף RNA של תא בודד יחד עם למידת מכונה מרובת-אלגוריתמים כדי לזהות גנים מועמדים מרכזיים. באמצעות מודל של תאי טרופובלסט HTR-8/SVneo שעברו טיפול בהיפוקסיה וניסויי התערבות מבוססי אקסוזומים, נחקר התפקיד התפקודי של SASH1 בדיספונקציה של טרופובלסט והפוטנציאל הטיפולי של P-EXOS ב-PE.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים הרביעי בשיג'יאטשואנג (מספר אישור 20200031). הסכמה מודעת בכתב התקבלה מכל תורמי רקמות השילייה לפני איסוף הדגימות. כל ההליכים שכללו משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להצהרת הלסינקי. רשימה מלאה של ריאגנטים, חומרים מתכלים, ציוד ותוכנה ששימשו בפרוטוקול זה מופיעה בטבלת החומרים.

איסוף נתונים

נתוני RNA-seq הופקו ממאגר הנתונים GEO. מערכי הנתונים כללו את GSE75010, המכיל נתוני ביטוי גנים מ-157 שליות עם PE ו-173 שליות ללא PE ‏(N = 330). GSE10588 מכיל נתוני ביטוי גנים מ-26 שליות נורמליות ומ-17 שליות עם PE חמור (N = 43). GSE60438 מכיל נתוני פרופיל טרנסקריפטום של decidua basalis מחולות עם פרה-קלמפסיה והריונות נורמוטנסיביים (N = 125). נתוני טרנסקריפטום של תא בודד הופקו ממערך הנתונים GSE183338 ב-GEO. מערך זה כולל דגימות של גרעינים בודדים מהסילי chorionic/הממשק העוברי-אימי של הריונות עם PE והריונות בריאים.

ניתוח DEGs

ראשית, בוצעו עיבוד מקדמי ונרמול עבור מערכי הנתונים GSE75010, GSE10588 ו-GSE60438 של DEGs הקשורים ל-PE. לאחר מכן, בוצע ניתוח ביטוי דיפרנציאלי באמצעות חבילת ה-R ‏“limma”14 בהתבסס על מידע על חלוקת הדגימות לקבוצות. נבחרו גנים עם p < 0.05 ו- |log2FC| > 0.5. תרשימי Volcano של ה-DEGs הופקו באמצעות חבילת ה-R ‏ggplot2. מפות חום של 20 ה-DEGs המובילים שורטטו באמצעות חבילת ה-R ‏pheatmap. לאחר מכן, נלקח החיתוך של ה-DEGs שנבחרו משלושת מערכי הנתונים, ונבנתה רשת אינטראקציות חלבון-חלבון (PPI) עבור הגנים המועמדים באמצעות הפלטפורמה המקוונת STRING, עם ציון אינטראקציה של ≥0.15. 20 גני ה-hub המובילים זוהו עוד יותר מרשת PPI זו על בסיס דרגת הקישוריות שלהם, ודורגו באמצעות תוכנת Cytoscape. תוצאות רשת ה-PPI הוצגו ויזואלית באמצעות תוכנת Cytoscape או STRING.

ניתוח העשרה

ניתוח העשרה של גנים בוצע באמצעות חבילות התוכנה ClusterProfiler ו-DOSE בשילוב עם אתר Metascape. מסדי הנתונים הופקו מ-GO ומ-KEGG. ניתוח ההעשרה בוצע באמצעות הפונקציה “EnrichGO”. מסלולים עם p < 0.05 נחשבו כבעלי העשרה מובהקת. תוצאות ההעשרה הוצגו באופן ויזואלי באמצעות חבילות התוכנה “ggplot2” ו-“ggpubr”.

למידת מכונה

כדי לזהות גנים מובהים (DEGs) חסונים בעלי משמעות ביולוגית הקשורים ל-PE, בוצע ניתוח בחירת מאפיינים באמצעות למידת מכונה רב-מודלית, המבוסס על מאגר הנתונים הטרנסקריפטומי הזמין לציבור GSE60438 (פלטפורמה: GPL6884). מאגר נתונים זה כולל פרופיל ביטוי של דגימות decidua basalis שנאספו מהריונות עם פרה-קלמפסיה והריונות נורמוטנסיביים בניתוח קיסרי. ה-DEGs שעברו סינון ראשוני עברו סטנדרטיזציה, ומטריצת הביטוי, יחד עם מידע תואם על החלוקה הקלינית, שימשה כקלט לארבעה אלגוריתמים שונים של למידת מכונה, זאת במטרה להפחית את הטיות המודל ולהגביר את היציבות של בחירת המאפיינים.

ארבעת האלגוריתמים יושמו בו-זמנית, ללא סדר ספציפי. LASSO בוצע באמצעות חבילת ה-“glmnet” לביצוע ניתוח רגרסיה ובחירת גנים המהווים תכונות חשובות. איבר רגולריזציית L1 הוסף לפונקציית ההפסד, אשר מקטין את המקדמים של תכונות פחות חשובות לאפס, ובכך משיג בחירת תכונות. SVM-RFE יושם באמצעות חבילת ה-“e1071” לבניית מכונת וקטורים תומכים עם סילוק תכונות רקורסיבי. תחילה אומן מסווג באמצעות SVM, והתכונות הפחות אינפורמטיביות הוסרו באופן איטרטיבי על בסיס משקלי תכונות, מה שהוביל לתת-קבוצה אופטימלית של תכונות. XGBoost יושם באמצעות חבילת ה-“xgboost” לבניית עצי החלטה מרובים. כל עץ התאים את השאריות של העץ הקודם, והפלטים המשוקללים נצברו כדי לקבל את התחזית הסופית. Boruta בוצע באמצעות חבילת ה-“randomForest”, תוך יצירת תכונות צל (shadow features) שהתחרו מול תכונות אמיתיות באימון של יער אקראי. תכונות עם ערכי חשיבות הגבוהים באופן מובהק מרעש אקראי נשמרו.

ניתוח נתוני טרנסקריפטום של תא בודד

נתוני טרנסקריפטום של תא בודד הושגו ממאגר ה-GEO, ומטריצת הספירה הגולמית נשProfileAction מ-GSE183338. מטריצת הספירה יובאה באמצעות פונקציית "Read10X" של חבילת Seurat והומרה לפורמט dgCMatrix. אובייקטים בודדים מוזגו לאובייקט מצטבר יחיד באמצעות פונקציית "merge", ותוויות התאים הפכו לייחודיות באמצעות "RenameCells". תאים באיכות נמוכה סוננו על בסיס הקריטריונים הבאים: גנים שהובעו בפחות משלושה תאים הוסרו, ותאים שהביעו פחות מ-200 גנים הוצאו מהניתוח. תאים שעברו בקרת איכות נורמלו וגנים בעלי שונות גבוהה זוהו. נורמליזציה גלובלית של קנה מידה הוחלה באמצעות "LogNormalize" (scale factor = 10,000), גנים בעלי שונות גבוהה (n = 2,000) נבחרו באמצעות "FindVariableFeatures", והנתונים הותאמו באמצעות "ScaleData". ניתוח רכיבים ראשיים (PCA) בוצע על מאפיינים בעלי שונות גבוהה, ו-30 הרכיבים הראשיים המובילים נשמרו. אפקטים של אצוות (Batch effects) בין דגימות תוקנו באמצעות שיטת Harmony. התאים הוצגו ויזואלית ועברו הפחתת ממדים באמצעות UMAP. גרפים של שכנים קרובים משותפים נבנו באמצעות "FindNeighbors" ו-"FindClusters" בהתבסס על אלגוריתם Louvain. פרמטר הרזולוציה ב-"FindClusters" עבר אופטימיזציה בין 0.1 ל-1. עץ הצבירה הוצג ויזואלית באמצעות פונקציית "clustree", ורזולוציה של 0.9 נבחרה להגדרת צבירי התאים. דובלטים פוטנציאליים הוסרו באמצעות אלגוריתם Scrublet. צבירי התאים סומנו על ידי זיהוי גנים מסמנים המובעים באופן דיפרנציאלי באמצעות פונקציית "FindAllMarkers". מבחן Wilcoxon rank sum לא-פרמטרי הוחל עם תיקון בונפרוני. זהויות תאים הוקצו על בסיס סממנים שטח, ספרות רלוונטית ומסד הנתונים לסיווג תאים 15.

תרבית תאים

תאי שורת התאים של הטרופובלסט HTR-8/SVneo תורבדו במצע RPMI-1640 מועשר ב-10% fetal bovine serum ו-1% penicillin/streptomycin. תנאי היפוקסיה הוקמו על ידי תרבית של תאים ב-1% O₂, 5% CO₂, ו-94% N₂ למשך 24 h; ביקורות נורמוקסיות נשמרו ב-20% O₂ ו-5% CO₂16. יש לבצע את כל הליכי תרבית התאים במC-cabinet לבטיחות ביולוגית מסוג Class II תוך שימוש בטכניקה אספטית. יש להשליך מצעי תרבית, ריאגנטים לטרנספקציה ופסולת תאים בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדיות.

טרנספקציית תאים

סונתזו פלסמידים המכילים sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 ו-OE-NC. תאי HTR-8/SVneo נזרעו בצפיפות של 5 × 105 תאים לבאר בלוחיות של שש בארות. לאחר מכן, התאים עברו טרנספקציה עם 2 µg של פלסמיד sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 או OE-NC לבאר, תוך שימוש בחומר טרנספקציה בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, DNA פלסמידי ו-P3000 Reagent דוללו ב-Opti-MEM, עורבבו עם Lipofectamine 3000 שדולל בנפרד ב-Opti-MEM, דגרו למשך 15 min בטמפרטורת החדר, והתווספו לתאים שהגיעו ל-70–80% התמזגות (confluency). ארבעים ושמונה שעות לאחר הטרנספקציה, ביטוי SASH1 נבחן באמצעות RT-qPCR ו-Western blot. רצפי המטרה של shRNA ששימשו להשתקה של SASH1 מופיעים ב-Supplementary Table 1.

PCR כמותי בזמן אמת

RNA כולל הוצא מהתאי HTR-8/SVneo ועבר שעתוק הפוך ל-cDNA באמצעות ערכה לשעתוק הפוך ב-42 °C למשך 30 דקות, ולאחר מכן ב-85 °C למשך 5 דקות. PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) בוצע באמצעות SYBR Green master mix בתנאי מחזורים הבאים: 95 °C למשך 10 דקות, ולאחריהם 40 מחזורים של 95 °C למשך 15 שניות ו-60 °C למשך דקה אחת. ביטוי ה-mRNA היחסי חושב באמצעות שיטת ה-ΔΔCt, כאשר β-actin שימש כביקורת פנימית. רצפי הפריימרים ששימשו בניסוי זה מופיעים ב-Supplementary Table 2.

בדיקת Western blot

חלבון כולל הופק מתאי HTR-8/SVneo באמצעות באפר ליזיס. ליזאטים של תאים נאספו, הודגרו על קרח, ועברו סנטריפוגציה ב-12,000 × g למשך 30 דקות ב-4 °C להסרת שאריות בלתי מסיסות. ריכוז החלבון נקבע באמצעות ספקטרופוטומטר. כמויות שוות של חלבון (50 µg) הופרדו ב-SDS-PAGE והועברו לאחר מכן לממברנות PVDF. הממברנות נחסמו עם 5% חלב דל שומן והודגרו עם נוגדנים ראשוניים למשך לילה ב-4 °C. לאחר שטיפה, הממברנות הודגרו עם הנוגדנים המשניים המתאימים, ופסי החלבון הודגמו באמצעות מערכת גילוי כימילומנצנציה מוגברת.

לגילוי חלבונים, הנוגדנים הראשוניים כללו anti-SASH1 ו-β-actin. נעשה שימוש בנוגדנים משניים מתאימים המצומדים ל-horseradish peroxidase (HRP) — goat anti-rabbit ו-goat anti-mouse. β-actin שימש כבקרת טעינה פנימית כדי להבטיח טעינה שווה של חלבונים. עוצמת פסי החלבון נמדדה וכומתה באמצעות תוכנת ImageJ.

בידוד של P-EXOS

P-EXOS בודדו מרקמת סיסי שליה שהושגה משליות במועד של נשים בריאות שעברו ניתוח קיסרי אלקטיבי. רקמת סיסי השליה נשטפה ביסודיות ב-PBS סטרילי, קוצצה למקטעים של כ-1 mm3, ותורבת במצע RPMI-1640 מועשר ב-10% FBS נטול אקסוזומים ב-37 °C ב-5% CO2 למשך 48 h. המצע המותנה הועבר לסבבי צנטריפוגה דיפרנציאלית באופן הבא: 300 × g למשך 10 min להסרת תאים ושאריות רקמה; 2,000 × g למשך 20 min להסרת פסולת תאית; ו-10,000 × g למשך 30 min להסרת מיקרו-וזיקולות, הכל ב-4 °C. הנוזל העליון שהתקבל הועבר לאולטרה-צנטריפוגה ב-120,000 × g למשך 70 min ב-4 °C כדי לשקיע את האקסוזומים. המשקע נשטף פעם אחת ב-PBS והועבר שוב לאולטרה-צנטריפוגה ב-120,000 × g למשך 70 min ב-4 °C. המשקע הסופי הומס מחדש ב-PBS. האקסוזומים המבודדים אופיינו באמצעות אנליזת Western blot לסממני אקסוזומים (PLAP, CD63, ו-TSG101, כאשר GM130 שימש כביקורת שלילית) ונבחנו בהמשך באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר לתצפית מורפולוגית.

ניסוי ספיגה תאית של P-EXOS

כדי לאשר הפנמה תאית של P-EXOS, סומנו אקסוזומים באופן פלואורסצנטי באמצעות צבע ממברנה ליפופילי PKH67 בהתאם לפרוטוקול היצרן. בקצרה, P-EXOS דגרו עם PKH67 (4 µM) ב-Diluent C למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, והתגובה הופסקה על ידי הוספת נפח שווה של 1% bovine serum albumin (BSA). אקסוזומים מסומנים בודדו מחדש באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה (120,000 × g, 70 דקות, 4 °C) כדי להסיר צבע שאינו קשור. לאחר מכן, P-EXOS המסומנים ב-PKH67 (50 µg/mL) התווספו לתאי HTR-8/SVneo ודגרו יחד למשך 24 שעות בתנאי נורמוקסיה או היפוקסיה (1% O₂). לאחר מכן, התאים נשטפו שלוש פעמים ב-PBS, קובעו עם 4% פאראפורמאלדהיד למשך 15 דקות, והגרעינים נצבעו ב-DAPI (1 µg/mL). ההפנמה של אקסוזומים מסומני PKH67 הודגמה באמצעות מיקרוסקופיית סריקה לייזר קונפוקלית (CLSM; עירור 490 nm, פליטה 502 nm). לצורך ניסויי קו-קלטורה פונקציונליים, תאי HTR-8/SVneo טופלו ב-P-EXOS בריכוז של 50 µg/mL (שווה ערך לחלבון) במצע RPMI-1640 מלא המועשר ב-10% FBS נטול אקסוזומים תחת תנאי היפוקסיה (1% O₂) למשך 24 שעות.

בדיקת אימונוסורבנט מקושרת לאנזים (ELISA)

נאספו תלויות של תרביות תאים, ורמות ה-IL-6, IL-1β ו-TNF-α נמדדו באמצעות ערכות ELISA עבור IL-6, IL-1β ו-TNF-α, בהתאמה, בהתאם להוראות היצרן. הבליעה באורך גל של 450 nm נמדדה באמצעות קורא מיקרופלייטים, והריכוזים הממשיים חושבו מעקומות הסטנדרט.

סימון קצוות של חריצים באמצעות dUTP בתיווך TdT (שיטת TUNEL)

תאים אפופטוטיים זוהו באמצעות ערכה לבדיקת TUNEL בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, התאים קובעו ב-4% paraformaldehyde למשך 15 min בטמפרטורת החדר, עברו פרמבליזציה עם 0.1% Triton X-100 ב-PBS למשך 5 min על קרח, ואומחרו עם תערובת תגובת TUNEL למשך 60 min ב-37 °C בחשכה. הגרעינים נצבעו בצביעה נגדית עם DAPI, ותאים חיוביים ל-TUNEL הודגמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה וכמותם נקבעה על ידי ספירת אחוז התאים החיוביים ל-TUNEL בלפחות חמישה שדות שנבחרו באופן אקראי לכל דגימה.

ניתוח סטטיסטי

כל הנתונים נותחו באמצעות R ו-GraphPad Prism. משתנים רציפים מוצגים כממוצע ±SD. השוואות בין שתי קבוצות בוצעו באמצעות מבחן t של Student, בעוד שהשוואות בין קבוצות מרובות בוצעו באמצעות ANOVA חד-כיווני ולאחריו מבחן post hoc של Tukey. מובהקות סטטיסטית עבור משתנים קטגוריאליים הוערכה באמצעות מבחן חי-ריבוע או מבחן מדויק של Fisher. אלא אם צוין אחרת, מתאמים בין מולקולות חושבו באמצעות ניתוח מתאם Spearman. ניסויי אפיון אקסוזומים בוצעו באמצעות P-EXOS שהבודדו משלושה תורמי שליה בלתי תלויים. ניסויי תאים בוצעו בשלוש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות, המייצגות ניסויים נפרדים שנערכו במועדים שונים באמצעות תאי HTR-8/SVneo ממעברים שונים, כאשר בכל חזרה נעשה שימוש ב-P-EXOS שהבודדו מתורם שליה שונה. ערך p < 0.05 נחשב למובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתוח טרנסקריפטומי של מטופלים בריאים ומטופלים עם PE

עבור הבדלי ביטוי גנים בין הקבוצה הנורמלית (Normal) לבין חוליות עם PE, נותח הביטוי הדיפרנציאלי באמצעות חבילת ה-R ‏limma במאגרי הנתונים הממוזגים. סה"כ 89 DEGs זוהו (p < 0.05 ו-|log2FC| > 0.5), מתוכם 69 גנים עם ביטוי מוגבר ו-20 גנים עם ביטוי מופחת עבור GSE75010 (איור 1A). קיימים 2,097 גנים עם ביטוי דיפרנציאלי, כאשר 1,121 הם בעלי ביטוי מוגבר ו-976 בעלי ביטוי מופחת (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה, SASH1 זוהה כגן מפתח שביטויו משובש ב-PE באמצעות ניתוח טרנסקריפטומי משולב, ריצוף של תאים בודדים ולמידת מכונה מרובת אלגוריתמים, גישה הרלוונטית במיוחד לאור העובדה שטיפולים ממוקדים עבור PE עדיין אינם זמינים17. הוכח כי SASH1 מועלה באופן משמעותי בתאי טרופובלסט תחת היפוקסיה, וכי הוא מוגבר ספציפית במדור הטרופובלסט של שליות ב-PE ברזולוציה של תאים בודדים. באמצעות ניסויי אובדן תפקוד (loss-of-function) והשגת תפקוד (gain-of-function), נקבע כי SASH1 הוא הן הכרחי והן מספיק להנעת אפופטוזה של טרופובלסטים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגוד עניינים במחקר זה.

תודות

מחקר זה מומן על ידי תוכנית המחקר המרכזית למדעי הרפואה של ועדת הבריאות המחוזית של חבאי, סין (מס' 20210075).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מצע RPMI-1640Gibco11875085
סרום עגל עוברי (FBS)Gibco16140071
FBS נטול אקסוזומיםSystem BiosciencesEXO-FBS-50A-1
פניצילין/סטרפטומייציןThermo Fisher Scientific, CN15140122
סוכן טרנספקציה Lipofectamine 3000 (עם סוכן P3000)Thermo Fisher Scientific, CNL3000150
מצע Opti-MEM עם סרום מופחתThermo Fisher Scientific, CN31985070
פלסמיד SASH1 shRNA (HuSH)origeneTL301836
פלסמיד ביטוי SASH1 ORForigeneRC218866
בקרת וקטור ריקorigenePS100001
ערכה לשעתוק הפוךThermo Fisher Scientific, CN4368814
תערובת PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific, CNA46110
פריימרים ל-SASH1Sangon BiotechCustom synthesized
פריימרים ל-β-actinSangon BiotechCustom synthesized
בופר לליזת תאיםBeyotimeP0013B
ספקטרופוטומטר NanoDropThermo Fisher Scientific, CNNanoDrop Ultra
ממברנת PVDFThermo Fisher Scientific, CN88518
נוגדן Anti-SASH1ABclonalA15248
נוגדן Anti-β-actinAbcamab6276
נוגדן משני Goat Anti-Rabbit/Anti-Mouse מצומד ל-HRPBeyotimeA0208
תוכנת ImageJNIH (public domain)ImageJ
ערכת סימון תאים פלואורסצנטית ירוקה PKH67 (כולל Diluent C)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CNMINI67
אלבומין סרום בקר (BSA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN10711454001
DAPIBeyotimeC1002
מיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקאלי (CLSM)LeicaLeica TCS SP8
ערכת Quantikine ELISA ל-IL-6 אנושיR&D SystemsD6050B
בדיקת DuoSet ELISA ל-IL-1β/IL-1F2 אנושיR&D SystemsDY201
ערכת Quantikine ELISA ל-TNF-α אנושיR&D SystemsDTA00D
קורא מיקרו-פלייטיםThermo ScientificMultiskan FC
ערכה לזיהוי מוות תאי In Situ (ערכת TUNEL Assay)Roche11684795910
Triton X-100BeyotimeP0096
פראפורמאלדהיד (4%)BeyotimeP0099
מיקרוסקופ פלואורסצנטיOlympusBX53
צנטריפוגה מקוררת (קיבולת 12,000 × g)EppendorfEppendorf 5430 R
אולטרצנטריפוגה (קיבולת 120,000 × g)Beckman CoulterOptima MAX-XP
תוכנת RThe R Foundationv4.2.1
GraphPad PrismGraphPad Softwarev10.0
Seurat (חבילת R)Satija Lab (open-source)v4.0.4
Harmony (חבילת R, תיקון batch)Open-sourcev1.2.0
Scrublet (חבילת Python, זיהוי doublets)Open-sourcev0.2.3
clustree (חבילת R)Open-sourcev0.5.1
glmnet (חבילת R, LASSO)Open-sourcev4.1.8
e1071 (חבילת R, SVM-RFE)Open-sourcev1.7-14
xgboost (חבילת R)Open-sourcev1.7.7.1
randomForest (חבילת R, Boruta)Open-sourcev4.7-1.1
מאגר נתוני Gene Expression Omnibus (GEO)NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
מאגר נתוני STRINGstring-db.orghttps://www.string-db.org/
Metascapemetascape.orghttps://metascape.org/
תוכנת CytoscapeCytoscape Consortiumv3.10.4
ggplot2 (חבילת R)Open-sourcev3.5.1
limma (חבילת R)Open-sourcev3.58.1
pheatmap (חבילת R)Open-sourcev1.0.12
ClusterProfiler (חבילת R)Open-sourcev4.8.3
DOSE (חבילת R)Open-sourcev3.28.2
ggpubr (חבילת R)Open-sourcev0.6.0

מקורות

  1. Malik A, Jee B, Gupta SK. Preeclampsia: Disease biology and burden, its management strategies with reference to India. Pregnancy Hypertens. 2019;15:23-31.
  2. Vitoratos N, Hassiakos D, Iavazzo C. Molecular mechanisms of preeclampsia. J Pregnancy. 2012;2012:298343.
  3. Battarbee AN, et al. Chronic hypertension in pregnancy. Am J Obstet Gynecol. 2020;222(6):532-41.
  4. Torres-Torres J, et al. A Narrative Review on the Pathophysiology of Preeclampsia. Int J Mol Sci. 2024;25(14).
  5. Xu Y, et al. DOCK1 deficiency drives placental trophoblast cell dysfunction by influencing inflammation and oxidative stress, hallmarks of preeclampsia. Hypertens Res. 2024;47(12):3434-46.
  6. Harmon AC, et al. The role of inflammation in the pathology of preeclampsia. Clin Sci (Lond). 2016;130(6):409-19.
  7. Jaufmann J, et al. The emerging and diverse roles of the SLy/SASH1-protein family in health and disease: Overview of three multifunctional proteins. Faseb J. 2021;35(4):e21470.
  8. Li S, et al. The downregulation of SASH1 expression promotes breast cancer occurrence and invasion, accompanied by the activation of the PI3K-Akt-mTOR signaling pathway. Sci Rep. 2024;14(1):21914.
  9. Franke FC, et al. The Tumor Suppressor SASH1 Interacts With the Signal Adaptor CRKL to Inhibit Epithelial-Mesenchymal Transition and Metastasis in Colorectal Cancer. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2019;7(1):33-53.
  10. Zhang J, et al. Extracellular vesicles in normal pregnancy and pregnancy-related diseases. J Cell Mol Med. 2020;24(8):4377-88.
  11. David M, Maharaj N. The immune-modulatory dynamics of exosomes in preeclampsia. Arch Gynecol Obstet. 2025;311(6):1477-87.
  12. Gu M, et al. Preeclampsia impedes fetal kidney development by delivering placenta-derived exosomes to glomerular endothelial cells. Cell Commun Signal. 2023;21(1):336.
  13. Jiang X, et al. Downregulated miR-199a-3p in Preeclamptic Placenta-derived Exosomes from Cord Blood Hinders VEGF-induced Fetal Glomerular Dysplasia Through Inhibiting Akt1(S473) Phosphorylation via Targeting PHLPP2. Stem Cell Rev Rep. 2025;21(8):2693-710.
  14. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43(7):e47.
  15. Wang X, et al. High expression of THY1 in gallbladder fibroblasts promotes the formation and progression of gallstones. Research Square [Preprint]. 2025. Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-7276422/v1. doi:10.21203/rs.3.rs-7276422/v1.
  16. Sha M, et al. Extracellular vesicles derived from hypoxic HTR-8/SVneo trophoblast inhibit endothelial cell functions through the miR-150-3p /CHPF pathway. Placenta. 2023;138:21-32.
  17. Ma'ayeh M, Costantine MM. Prevention of preeclampsia. Semin Fetal Neonatal Med. 2020;25(5):101123.
  18. Mandalà M. Oxidative Stress and Inflammation in Uterine-Vascular Adaptation During Pregnancy. Antioxidants (Basel). 2025;14(9).
  19. Lu Y, et al. NETs exacerbate placental inflammation and injury through high mobility group protein B1 during preeclampsia. Placenta. 2025;159:131-9.
  20. Raghupathy R. Cytokines as key players in the pathophysiology of preeclampsia. Med Princ Pract. 2013;22 Suppl 1(Suppl 1):8-19.
  21. Esfandyari S, et al. Exosomes as Biomarkers for Female Reproductive Diseases Diagnosis and Therapy. Int J Mol Sci. 2021;22(4).
  22. Pillay P, Moodley K, Moodley J, Mackraj I. Placenta-derived exosomes: potential biomarkers of preeclampsia. Int J Nanomedicine. 2017;12:8009-23.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ויסות SASH1פגיעה מושרית היפוקסיהתגובות דלקתיותמנגנוני רעלת היריוןריצוף RNA של תא בודדניתוח ביטוי גניםציטוקינים פרו-דלקתייםסינון באמצעות למידת מכונה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.