חלבון המכיל דומייני SAM ו-SH3 1 (SASH1) זוהה כווסת מרכזי של אפופטוזיס ודלקת של טרופובלסט ברעלת הריון (PE). אקסוזומים המופקים משליה (P-EXOS) מקלים על פגיעה מושרית היפוקסיה על ידי דיכוי הביטוי של SASH1. ממצאים אלו חושפים מנגנון חדש העומד בבסיס הפתוגנזה של PE ומצביעים על SASH1 כמטרה טיפולית פוטנציאלית.
מאמר מחקר
אקסוזומים המופקים משיליה מפחיתים אפופטוזיס של טרופובלסט המושרה על ידי היפוקסיה והתקדמות דלקתית באמצעות SASH1
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
SASH1 הוא חלבון מתאם אותות המעורב בצמיחת תאים, אפופטוזיס ובבקרת מערכת החיסון, ונחקר יותר ויותר בתאי גידול ותאי חיסון. ראיות חדשות מצביעות על כך ש-SASH1 ממלא תפקיד חשוב בתגובות דלקתיות ובהומאוסטזיס תאי, תהליכים הקשורים באופן הדוק להתפתחות של PE. מחקר זה נועד לקבוע האם SASH1 תורם לאפופטוזיס של טרופובלסטים ולתגובות דלקתיות ב-PE והאם P-EXOS מפעיל השפעות מגנות באמצעות ויסות של SASH1. במחקר זה, נותחו שלושה מאגרי נתונים טרנסקריפטומיים הקשורים ל-PE (GSE75010, GSE10588, ו-GSE60438) כדי לזהות גנים בעלי ביטוי שונה (DEGs) משותפים, ולאחריהם בוצעו ניתוחי העשרה של Gene Ontology (GO) ו-Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). אלגוריתמים של למידת מכונה יושמו בהמשך כדי לסנן גני מועמדות מרכזיים, ונתוני רצף RNA של תא בודד שימשו לאפיון ההטרוגניות התאית ברקמת השליה ולקביעת דפוסי ביטוי ספציפיים לסוגי תאים. SASH1 זוהה כגן מועמד קונסנסוסי והיה בעל ביטוי מוגבר משמעותית בתאי טרופובלסט מדגימות של PE. In vitro, הוקם מודל של תאי טרופובלסט HTR-8/SVneo שעברו טיפול בהיפוקסיה, בשילוב עם knockdown של SASH1, ביטוי יתר של SASH1, וקו-קלטורה עם P-EXOS. ניסויים תפקודיים הראו כי knockdown של SASH1 דיכא באופן משמעותי את אפופטוזיס של טרופובלסטים המושרה על ידי היפוקסיה והפחית את הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים, כולל IL-6, IL-1β, ו-TNF-α, בעוד שביטוי יתר של SASH1 קידם אפופטוזיס ותגובות דלקתיות. בנוסף, טיפול ב-P-EXOS הפחית באופן ניכר את ביטוי SASH1 הן ברמת ה-mRNA והן ברמת החלבון והחליש את הפגיעה בטרופובלסטים המושרה על ידי היפוקסיה, בעוד שביטוי יתר של SASH1 ביטל במידה רבה השפעות מגנות אלו. יחד, ממצאים אלו מעידים כי SASH1 ממלא תפקיד קריטי באפופטוזיס של טרופובלסטים ובתגובות דלקתיות ב-PE. P-EXOS עשוי להקל על פגיעה טרופובלסטית המושרית על ידי היפוקסיה באמצעות דיכוי ביטוי SASH1, ובכך מספק תובנות חדשות לגבי המנגנונים המולקולריים ומטרות טיפוליות פוטנציאליות ל-PE.
מבוא
PE היא הפרעה רב-מערכתית הספציפית להיריון, המתרחשת בדרך כלל לאחר 20 שבועות של הריון ומאופיינת קלינית ביתר לחץ דם, בחלבוני שתן ובליקוי בתפקוד של איברים מרובים. היא נותרה גורם מוביל לתחלואה ותמותה אימהית ופרינטלית ברחבי העולם1. למרות התקדמויות מתמשכות בניהול הקליני, הטיפול המכריע ב-PE הוא עדיין לידת השליה, דבר המדגיש את ההבנה החלקית של הפתוגנזה שלה ואת הצורך הדחוף לזהות מנגנונים מולקולריים ותאיים חדשים, כמו גם מטרות טיפוליות פוטנציאליות2,3.
פלישה נאותה של טרופובלסט וקידום התפתחות רחמית תקינה הם מנגנונים קריטיים העומדים בבסיס הפתוגנזה של PE4. במהלך הריון תקין, תאי טרופובלסט פולשים לדצידואה הרחמית ומעצבים מחדש את העורקים הספירליים כדי לבסס מחזור דם בעל התנגדות נמוכה וקיבולת גבוהה. פגיעה בפלישה ובנדידה של תאי טרופובלסט מובילה להפחתה בפרפוזיה של השיליה, מה שגורם לסביבה מתמשכת של היפוקסיה ועקה חמצונית. היפוקסיה משפיעה ישירות על אפופטוזיס תאי, ושחרור חריג של מתווכים פרו-דלקתיים משבש את ההומאוסטזיס בממשק העובר-אם, ובכך מחמיר עוד יותר את התפקוד הלקוי של השיליה5. דלקת היא גם גורם מניע חשוב של PE. נמצא כי IL-17, IL-6 ו-TNF-α מוגברים באופן ניכר בשיליה ובדם הפריפרי של חולות PE6. היפוקסיה ודלקת מחזקות זו את זו, ויוצרות מעגל קסמים המגביר דלקת סיסטמית, גורם לנזק אנדותליאלי ותורם לליקויים בשיליה. הרשתות המולקולריות הבסיסיות השולטות באפופטוזיס של טרופובלסט ובתגובות דלקתיות נותרו במידה רבה לא ידועות.
SASH1 הוא חבר במשפחת חלבוני הפיגום התוך-תאיים SLy/SASH1 המתפקד כמתאם איתות7. SASH1 אופיין בעיקר כמדכא גידולים המעכב מעבר אפיתליאלי-מזנכימלי (EMT), נדידת תאים ופלישה באמצעות אינטראקציות עם שותפי איתות כגון CRKL ונתיב ה-PI3K-Akt-mTOR8,9. מעבר לתפקידיו כמדכא גידולים, ראיות חדשות מצביעות על כך ש-SASH1 משתתף באיתות דלקתי ובויסות חיסוני7. עם זאת, הביטוי והתפקוד של SASH1 בשיליה, ובמיוחד בהקשר של ביולוגיית הטרופובלסט ו-PE, טרם נחקרו.
אקסוזומים התגלו כמתווכים תאיים חשובים ונחקרים יותר ויותר בהקשר של הריון10. אקסוזומים מעבירים מטענים ביו-אקטיביים שונים, כולל חלבונים, ליפידים ו-RNAs לא מקודדים, כדי לווסת את תפקוד התא המקבל. עדויות גוברות מצביעות על כך ש-P-EXOS ממלאים תפקיד קריטי בוויסות חיסוני במהלך ההריון, וכי פעילותם והמטען שהם נושאים משתנים באופן משמעותי ב-PE, מה שעשוי להגביר את המצב הדלקתי11. אקסוזומים נקשרו גם לוויסות של עקה חמצונית12 ואנגיוגנזה13, וייתכן שהם מפעילים השפעות מועילות בסיבוכים הקשורים להריון. עם זאת, המטרות המולקולריות שלהם ומנגנוני הפעולה שלהם ב-PE עדיין אינם מובנים במלואם.
הועלתה השערה כי SASH1 אינו מווסת כראוי בשיליה המעורבות ב-PE ופועל כמניע מרכזי של אפופטוזיס של טרופובלסט ותגובות דלקתיות, וכי P-EXOS עשויים להפעיל השפעות מגנות מפני פגיעה בטרופובלסט על ידי ויסות ביטוי SASH1. כדי לבחון השערה זו, שולבו מספר מאגרי נתונים טרנסקריפטומיים של PE ונתוני ריצוף RNA של תא בודד יחד עם למידת מכונה מרובת-אלגוריתמים כדי לזהות גנים מועמדים מרכזיים. באמצעות מודל של תאי טרופובלסט HTR-8/SVneo שעברו טיפול בהיפוקסיה וניסויי התערבות מבוססי אקסוזומים, נחקר התפקיד התפקודי של SASH1 בדיספונקציה של טרופובלסט והפוטנציאל הטיפולי של P-EXOS ב-PE.
פרוטוקול
הצהרת אתיקה
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים הרביעי בשיג'יאטשואנג (מספר אישור 20200031). הסכמה מודעת בכתב התקבלה מכל תורמי רקמות השילייה לפני איסוף הדגימות. כל ההליכים שכללו משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להצהרת הלסינקי. רשימה מלאה של ריאגנטים, חומרים מתכלים, ציוד ותוכנה ששימשו בפרוטוקול זה מופיעה בטבלת החומרים.
איסוף נתונים
נתוני RNA-seq הופקו ממאגר הנתונים GEO. מערכי הנתונים כללו את GSE75010, המכיל נתוני ביטוי גנים מ-157 שליות עם PE ו-173 שליות ללא PE (N = 330). GSE10588 מכיל נתוני ביטוי גנים מ-26 שליות נורמליות ומ-17 שליות עם PE חמור (N = 43). GSE60438 מכיל נתוני פרופיל טרנסקריפטום של decidua basalis מחולות עם פרה-קלמפסיה והריונות נורמוטנסיביים (N = 125). נתוני טרנסקריפטום של תא בודד הופקו ממערך הנתונים GSE183338 ב-GEO. מערך זה כולל דגימות של גרעינים בודדים מהסילי chorionic/הממשק העוברי-אימי של הריונות עם PE והריונות בריאים.
ניתוח DEGs
ראשית, בוצעו עיבוד מקדמי ונרמול עבור מערכי הנתונים GSE75010, GSE10588 ו-GSE60438 של DEGs הקשורים ל-PE. לאחר מכן, בוצע ניתוח ביטוי דיפרנציאלי באמצעות חבילת ה-R “limma”14 בהתבסס על מידע על חלוקת הדגימות לקבוצות. נבחרו גנים עם p < 0.05 ו- |log2FC| > 0.5. תרשימי Volcano של ה-DEGs הופקו באמצעות חבילת ה-R ggplot2. מפות חום של 20 ה-DEGs המובילים שורטטו באמצעות חבילת ה-R pheatmap. לאחר מכן, נלקח החיתוך של ה-DEGs שנבחרו משלושת מערכי הנתונים, ונבנתה רשת אינטראקציות חלבון-חלבון (PPI) עבור הגנים המועמדים באמצעות הפלטפורמה המקוונת STRING, עם ציון אינטראקציה של ≥0.15. 20 גני ה-hub המובילים זוהו עוד יותר מרשת PPI זו על בסיס דרגת הקישוריות שלהם, ודורגו באמצעות תוכנת Cytoscape. תוצאות רשת ה-PPI הוצגו ויזואלית באמצעות תוכנת Cytoscape או STRING.
ניתוח העשרה
ניתוח העשרה של גנים בוצע באמצעות חבילות התוכנה ClusterProfiler ו-DOSE בשילוב עם אתר Metascape. מסדי הנתונים הופקו מ-GO ומ-KEGG. ניתוח ההעשרה בוצע באמצעות הפונקציה “EnrichGO”. מסלולים עם p < 0.05 נחשבו כבעלי העשרה מובהקת. תוצאות ההעשרה הוצגו באופן ויזואלי באמצעות חבילות התוכנה “ggplot2” ו-“ggpubr”.
למידת מכונה
כדי לזהות גנים מובהים (DEGs) חסונים בעלי משמעות ביולוגית הקשורים ל-PE, בוצע ניתוח בחירת מאפיינים באמצעות למידת מכונה רב-מודלית, המבוסס על מאגר הנתונים הטרנסקריפטומי הזמין לציבור GSE60438 (פלטפורמה: GPL6884). מאגר נתונים זה כולל פרופיל ביטוי של דגימות decidua basalis שנאספו מהריונות עם פרה-קלמפסיה והריונות נורמוטנסיביים בניתוח קיסרי. ה-DEGs שעברו סינון ראשוני עברו סטנדרטיזציה, ומטריצת הביטוי, יחד עם מידע תואם על החלוקה הקלינית, שימשה כקלט לארבעה אלגוריתמים שונים של למידת מכונה, זאת במטרה להפחית את הטיות המודל ולהגביר את היציבות של בחירת המאפיינים.
ארבעת האלגוריתמים יושמו בו-זמנית, ללא סדר ספציפי. LASSO בוצע באמצעות חבילת ה-“glmnet” לביצוע ניתוח רגרסיה ובחירת גנים המהווים תכונות חשובות. איבר רגולריזציית L1 הוסף לפונקציית ההפסד, אשר מקטין את המקדמים של תכונות פחות חשובות לאפס, ובכך משיג בחירת תכונות. SVM-RFE יושם באמצעות חבילת ה-“e1071” לבניית מכונת וקטורים תומכים עם סילוק תכונות רקורסיבי. תחילה אומן מסווג באמצעות SVM, והתכונות הפחות אינפורמטיביות הוסרו באופן איטרטיבי על בסיס משקלי תכונות, מה שהוביל לתת-קבוצה אופטימלית של תכונות. XGBoost יושם באמצעות חבילת ה-“xgboost” לבניית עצי החלטה מרובים. כל עץ התאים את השאריות של העץ הקודם, והפלטים המשוקללים נצברו כדי לקבל את התחזית הסופית. Boruta בוצע באמצעות חבילת ה-“randomForest”, תוך יצירת תכונות צל (shadow features) שהתחרו מול תכונות אמיתיות באימון של יער אקראי. תכונות עם ערכי חשיבות הגבוהים באופן מובהק מרעש אקראי נשמרו.
ניתוח נתוני טרנסקריפטום של תא בודד
נתוני טרנסקריפטום של תא בודד הושגו ממאגר ה-GEO, ומטריצת הספירה הגולמית נשProfileAction מ-GSE183338. מטריצת הספירה יובאה באמצעות פונקציית "Read10X" של חבילת Seurat והומרה לפורמט dgCMatrix. אובייקטים בודדים מוזגו לאובייקט מצטבר יחיד באמצעות פונקציית "merge", ותוויות התאים הפכו לייחודיות באמצעות "RenameCells". תאים באיכות נמוכה סוננו על בסיס הקריטריונים הבאים: גנים שהובעו בפחות משלושה תאים הוסרו, ותאים שהביעו פחות מ-200 גנים הוצאו מהניתוח. תאים שעברו בקרת איכות נורמלו וגנים בעלי שונות גבוהה זוהו. נורמליזציה גלובלית של קנה מידה הוחלה באמצעות "LogNormalize" (scale factor = 10,000), גנים בעלי שונות גבוהה (n = 2,000) נבחרו באמצעות "FindVariableFeatures", והנתונים הותאמו באמצעות "ScaleData". ניתוח רכיבים ראשיים (PCA) בוצע על מאפיינים בעלי שונות גבוהה, ו-30 הרכיבים הראשיים המובילים נשמרו. אפקטים של אצוות (Batch effects) בין דגימות תוקנו באמצעות שיטת Harmony. התאים הוצגו ויזואלית ועברו הפחתת ממדים באמצעות UMAP. גרפים של שכנים קרובים משותפים נבנו באמצעות "FindNeighbors" ו-"FindClusters" בהתבסס על אלגוריתם Louvain. פרמטר הרזולוציה ב-"FindClusters" עבר אופטימיזציה בין 0.1 ל-1. עץ הצבירה הוצג ויזואלית באמצעות פונקציית "clustree", ורזולוציה של 0.9 נבחרה להגדרת צבירי התאים. דובלטים פוטנציאליים הוסרו באמצעות אלגוריתם Scrublet. צבירי התאים סומנו על ידי זיהוי גנים מסמנים המובעים באופן דיפרנציאלי באמצעות פונקציית "FindAllMarkers". מבחן Wilcoxon rank sum לא-פרמטרי הוחל עם תיקון בונפרוני. זהויות תאים הוקצו על בסיס סממנים שטח, ספרות רלוונטית ומסד הנתונים לסיווג תאים 15.
תרבית תאים
תאי שורת התאים של הטרופובלסט HTR-8/SVneo תורבדו במצע RPMI-1640 מועשר ב-10% fetal bovine serum ו-1% penicillin/streptomycin. תנאי היפוקסיה הוקמו על ידי תרבית של תאים ב-1% O₂, 5% CO₂, ו-94% N₂ למשך 24 h; ביקורות נורמוקסיות נשמרו ב-20% O₂ ו-5% CO₂16. יש לבצע את כל הליכי תרבית התאים במC-cabinet לבטיחות ביולוגית מסוג Class II תוך שימוש בטכניקה אספטית. יש להשליך מצעי תרבית, ריאגנטים לטרנספקציה ופסולת תאים בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית המוסדיות.
טרנספקציית תאים
סונתזו פלסמידים המכילים sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 ו-OE-NC. תאי HTR-8/SVneo נזרעו בצפיפות של 5 × 105 תאים לבאר בלוחיות של שש בארות. לאחר מכן, התאים עברו טרנספקציה עם 2 µg של פלסמיד sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 או OE-NC לבאר, תוך שימוש בחומר טרנספקציה בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, DNA פלסמידי ו-P3000 Reagent דוללו ב-Opti-MEM, עורבבו עם Lipofectamine 3000 שדולל בנפרד ב-Opti-MEM, דגרו למשך 15 min בטמפרטורת החדר, והתווספו לתאים שהגיעו ל-70–80% התמזגות (confluency). ארבעים ושמונה שעות לאחר הטרנספקציה, ביטוי SASH1 נבחן באמצעות RT-qPCR ו-Western blot. רצפי המטרה של shRNA ששימשו להשתקה של SASH1 מופיעים ב-Supplementary Table 1.
PCR כמותי בזמן אמת
RNA כולל הוצא מהתאי HTR-8/SVneo ועבר שעתוק הפוך ל-cDNA באמצעות ערכה לשעתוק הפוך ב-42 °C למשך 30 דקות, ולאחר מכן ב-85 °C למשך 5 דקות. PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) בוצע באמצעות SYBR Green master mix בתנאי מחזורים הבאים: 95 °C למשך 10 דקות, ולאחריהם 40 מחזורים של 95 °C למשך 15 שניות ו-60 °C למשך דקה אחת. ביטוי ה-mRNA היחסי חושב באמצעות שיטת ה-ΔΔCt, כאשר β-actin שימש כביקורת פנימית. רצפי הפריימרים ששימשו בניסוי זה מופיעים ב-Supplementary Table 2.
בדיקת Western blot
חלבון כולל הופק מתאי HTR-8/SVneo באמצעות באפר ליזיס. ליזאטים של תאים נאספו, הודגרו על קרח, ועברו סנטריפוגציה ב-12,000 × g למשך 30 דקות ב-4 °C להסרת שאריות בלתי מסיסות. ריכוז החלבון נקבע באמצעות ספקטרופוטומטר. כמויות שוות של חלבון (50 µg) הופרדו ב-SDS-PAGE והועברו לאחר מכן לממברנות PVDF. הממברנות נחסמו עם 5% חלב דל שומן והודגרו עם נוגדנים ראשוניים למשך לילה ב-4 °C. לאחר שטיפה, הממברנות הודגרו עם הנוגדנים המשניים המתאימים, ופסי החלבון הודגמו באמצעות מערכת גילוי כימילומנצנציה מוגברת.
לגילוי חלבונים, הנוגדנים הראשוניים כללו anti-SASH1 ו-β-actin. נעשה שימוש בנוגדנים משניים מתאימים המצומדים ל-horseradish peroxidase (HRP) — goat anti-rabbit ו-goat anti-mouse. β-actin שימש כבקרת טעינה פנימית כדי להבטיח טעינה שווה של חלבונים. עוצמת פסי החלבון נמדדה וכומתה באמצעות תוכנת ImageJ.
בידוד של P-EXOS
P-EXOS בודדו מרקמת סיסי שליה שהושגה משליות במועד של נשים בריאות שעברו ניתוח קיסרי אלקטיבי. רקמת סיסי השליה נשטפה ביסודיות ב-PBS סטרילי, קוצצה למקטעים של כ-1 mm3, ותורבת במצע RPMI-1640 מועשר ב-10% FBS נטול אקסוזומים ב-37 °C ב-5% CO2 למשך 48 h. המצע המותנה הועבר לסבבי צנטריפוגה דיפרנציאלית באופן הבא: 300 × g למשך 10 min להסרת תאים ושאריות רקמה; 2,000 × g למשך 20 min להסרת פסולת תאית; ו-10,000 × g למשך 30 min להסרת מיקרו-וזיקולות, הכל ב-4 °C. הנוזל העליון שהתקבל הועבר לאולטרה-צנטריפוגה ב-120,000 × g למשך 70 min ב-4 °C כדי לשקיע את האקסוזומים. המשקע נשטף פעם אחת ב-PBS והועבר שוב לאולטרה-צנטריפוגה ב-120,000 × g למשך 70 min ב-4 °C. המשקע הסופי הומס מחדש ב-PBS. האקסוזומים המבודדים אופיינו באמצעות אנליזת Western blot לסממני אקסוזומים (PLAP, CD63, ו-TSG101, כאשר GM130 שימש כביקורת שלילית) ונבחנו בהמשך באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר לתצפית מורפולוגית.
ניסוי ספיגה תאית של P-EXOS
כדי לאשר הפנמה תאית של P-EXOS, סומנו אקסוזומים באופן פלואורסצנטי באמצעות צבע ממברנה ליפופילי PKH67 בהתאם לפרוטוקול היצרן. בקצרה, P-EXOS דגרו עם PKH67 (4 µM) ב-Diluent C למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, והתגובה הופסקה על ידי הוספת נפח שווה של 1% bovine serum albumin (BSA). אקסוזומים מסומנים בודדו מחדש באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה (120,000 × g, 70 דקות, 4 °C) כדי להסיר צבע שאינו קשור. לאחר מכן, P-EXOS המסומנים ב-PKH67 (50 µg/mL) התווספו לתאי HTR-8/SVneo ודגרו יחד למשך 24 שעות בתנאי נורמוקסיה או היפוקסיה (1% O₂). לאחר מכן, התאים נשטפו שלוש פעמים ב-PBS, קובעו עם 4% פאראפורמאלדהיד למשך 15 דקות, והגרעינים נצבעו ב-DAPI (1 µg/mL). ההפנמה של אקסוזומים מסומני PKH67 הודגמה באמצעות מיקרוסקופיית סריקה לייזר קונפוקלית (CLSM; עירור 490 nm, פליטה 502 nm). לצורך ניסויי קו-קלטורה פונקציונליים, תאי HTR-8/SVneo טופלו ב-P-EXOS בריכוז של 50 µg/mL (שווה ערך לחלבון) במצע RPMI-1640 מלא המועשר ב-10% FBS נטול אקסוזומים תחת תנאי היפוקסיה (1% O₂) למשך 24 שעות.
בדיקת אימונוסורבנט מקושרת לאנזים (ELISA)
נאספו תלויות של תרביות תאים, ורמות ה-IL-6, IL-1β ו-TNF-α נמדדו באמצעות ערכות ELISA עבור IL-6, IL-1β ו-TNF-α, בהתאמה, בהתאם להוראות היצרן. הבליעה באורך גל של 450 nm נמדדה באמצעות קורא מיקרופלייטים, והריכוזים הממשיים חושבו מעקומות הסטנדרט.
סימון קצוות של חריצים באמצעות dUTP בתיווך TdT (שיטת TUNEL)
תאים אפופטוטיים זוהו באמצעות ערכה לבדיקת TUNEL בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, התאים קובעו ב-4% paraformaldehyde למשך 15 min בטמפרטורת החדר, עברו פרמבליזציה עם 0.1% Triton X-100 ב-PBS למשך 5 min על קרח, ואומחרו עם תערובת תגובת TUNEL למשך 60 min ב-37 °C בחשכה. הגרעינים נצבעו בצביעה נגדית עם DAPI, ותאים חיוביים ל-TUNEL הודגמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה וכמותם נקבעה על ידי ספירת אחוז התאים החיוביים ל-TUNEL בלפחות חמישה שדות שנבחרו באופן אקראי לכל דגימה.
ניתוח סטטיסטי
כל הנתונים נותחו באמצעות R ו-GraphPad Prism. משתנים רציפים מוצגים כממוצע ±SD. השוואות בין שתי קבוצות בוצעו באמצעות מבחן t של Student, בעוד שהשוואות בין קבוצות מרובות בוצעו באמצעות ANOVA חד-כיווני ולאחריו מבחן post hoc של Tukey. מובהקות סטטיסטית עבור משתנים קטגוריאליים הוערכה באמצעות מבחן חי-ריבוע או מבחן מדויק של Fisher. אלא אם צוין אחרת, מתאמים בין מולקולות חושבו באמצעות ניתוח מתאם Spearman. ניסויי אפיון אקסוזומים בוצעו באמצעות P-EXOS שהבודדו משלושה תורמי שליה בלתי תלויים. ניסויי תאים בוצעו בשלוש חזרות ביולוגיות בלתי תלויות, המייצגות ניסויים נפרדים שנערכו במועדים שונים באמצעות תאי HTR-8/SVneo ממעברים שונים, כאשר בכל חזרה נעשה שימוש ב-P-EXOS שהבודדו מתורם שליה שונה. ערך p < 0.05 נחשב למובהק סטטיסטית.
תוצאות
ניתוח טרנסקריפטומי של מטופלים בריאים ומטופלים עם PE
עבור הבדלי ביטוי גנים בין הקבוצה הנורמלית (Normal) לבין חוליות עם PE, נותח הביטוי הדיפרנציאלי באמצעות חבילת ה-R limma במאגרי הנתונים הממוזגים. סה"כ 89 DEGs זוהו (p < 0.05 ו-|log2FC| > 0.5), מתוכם 69 גנים עם ביטוי מוגבר ו-20 גנים עם ביטוי מופחת עבור GSE75010 (איור 1A). קיימים 2,097 גנים עם ביטוי דיפרנציאלי, כאשר 1,121 הם בעלי ביטוי מוגבר ו-976 בעלי ביטוי מופחת (איור 1B). עבור מאגר הנתונים GSE60438 קיימים 7,633 DEGs, עם 3,371 גנים בעלי ביטוי מוגבר ו-4,262 גנים בעלי ביטוי מופחת (איור 1C). ההבדלים המשמעותיים במספר ה-DEGs בין שלושת מאגרי הנתונים משקפים ככל הנראה הבדלים בגודל המדגם, במקור הרקמה (סיסי שליה לעומת דצידואה באזאליס) ובסיווג חומרת ה-PE, מה שמדגיש עוד יותר את הערך של מציאת החיתוך בין מאגרי הנתונים כדי לזהות DEGs משותפים ועמידים.
ניתוח העשרה פונקציונלית של DEGs
לצורך זיהוי סיסטמטי של גנים מובחרי ביטוי (DEGs) מרכזיים הקשורים לרעלת הריון (PE), בוצע ניתוח ון (Venn analysis) על ה-DEGs מתוך מאגרי הנתונים של PE GSE75010, GSE10588 ו-GSE60438, ובסופו של דבר זוהו 56 DEGs משותפים (איור 2A). רשת PPI נבנתה עבור 56 ה-DEGs המשותפים הללו באמצעות הפלטפורמה המקוונת STRING (ציון אינטראקציה ≥0.15), ו-20 הגנים המרכזיים (hub genes) המובילים זוהו בהמשך על בסיס דרגת הקישוריות שלהם בתוך הרשת, ודורגו באמצעות תוכנת Cytoscape (איור 2B). על בסיס גנים אלו, בוצע גם העשרת GO כדי לבחון פונקציונליות פוטנציאלית בתחומי BP, CC ו-MF (איור 2C). ה-DEGs היו ככל הנראה מועשרים בהפרשת הורמונים ובויסות של סיגנלינג של קולטני סרין/תראונין קינאז טרנס-ממברנליים. מבחינת תאים, הגנים היו ממוקמים בעיקר בבסיסי הדבקה (focal adhesions), בצמתים בין תא לתשתית (cell–substrate junctions), ובמגוון גנים הקשורים לשכיות וליסוזומים. בתפקודי מולקולריים, המונחים המועשרים היו פעילות פרוליל הידרוקסילאז, פעילות הורמונלית והסעה טרנס-ממברנלית של מולקולות הקשורות לליפידים. תוצאות אלו מרמזות כי ה-DEGs עשויים למלא תפקידים חשובים בסיגנלינג של תאי השליה, באינטראקציה בין תאים למטריצה ובשמירה על תפקודים הקשורים למערכת ההורמונלית. במקביל, נמצא כי העשרת נתיבי KEGG הניבה DEGs שסביר שיהיו מועשרים באינטראקציה בין ציטוקין לקולטן ציטוקין, אינטראקציה של מולקולות הדבקה תאית, ונתיבי הסיגנלינג של TGF-β ו-HIF-1 (איור 2D). העשרה של מונחים מסוימים הקשורים לנגיפים (למשל, נגיפי ההפטיטיס, Ebolavirus) משקפת ככל הנראה חפיפה לא ספציפית עם גנים רגולטוריים חיסוניים משותפים ולא קשר ביולוגי ישיר ל-PE; לפיכך, המיקוד הפרשני נותר בנתיבים הקשורים לדלקת, הדבקה והיפוקסיה. נתיבים אלו קשורים לתגובה דלקתית, סיגנלינג המתווך על ידי הדבקה תאית וסיגנלינג הקשור להיפוקסיה, ועשויים להשפיע על התקדמות ה-PE על ידי שינוי המצב הדלקתי-חיסוני והתקשורת בין תאים במיקרו-סביבה של השליה.
למידת מכונה מזהה את SASH1 כגן מרכזי ב-PE
כדי לזהות גנים פרוגנוסטיים מרכזיים, יושמו ארבע שיטות של למידת מכונה לבחירת מאפיינים (feature selection). רגרסיית LASSO עם תיקוף צולב (cross-validation) הראתה כי המודל השיג את שגיאת התיקוף הצולב המינימלית כאשר log(λ.min) = -3.8075. גנים בעלי מקדמים שאינם אפס בערך λ זה נבחרו כמאפיינים מרכזיים שזוהו על ידי LASSO (איור 3A–B). אלגוריתם Boruta מעריך את חשיבות המאפיינים באמצעות השוואה למאפייני צל (shadow features). גנים עם ערכי חשיבות הגבוהים מ-shadowMax סווגו כ-Confirmed ונחשבו לגנים מועמדים מרכזיים, בעוד שגנים עם ערכי חשיבות נמוכים מ-shadowMin סווגו כ-Rejected ונחשבו ככאלו שאין להם תרומה משמעותית. גנים שנמצאו בין שני ספים אלו סווגו כ-Tentative, מה שמעיד על חשיבות פוטנציאלית אך לא ודאית (איור 3C). ניתוח SVM-RFE הדגים כי כאשר נשמרו 40–50 מאפיינים, דיוק התיקוף הצולב הגיע לרמה הגבוהה ביותר או קרוב לה, מה שמרמז על ביצועי חיזוי אופטימליים בקנה מידה זה של מאפיינים (איור 3D). דיוק התיקוף הצולב הממוצע (~0.6) מעיד על כך ששום אלגוריתם בודד לא סיפק ביצועים אופטימליים עבור סט נתונים זה; לכן, אומצה אסטרטגיה של חיתוך רב-אלגוריתמי כדי להגביר את חסונו של תהליך בחירת המאפיינים. XGBoost כימת את החשיבות היחסית של הגנים באמצעות ערכי Gain, ובכך זיהה מאפיינים בעלי תרומה גבוהה יותר לחיזוי המודל (איור 3E). ניתוח חיתוך של דיאגרמות ונ (Venn) לתוצאות מארבע השיטות זיהה את SASH1 כגן החופף היחיד. למרות ש-SASH1 סווג כ-Tentative על ידי אלגוריתם Boruta, בחירתו העקבית בכל שלושת האלגוריתמים האחרים תומכת בהגדרתו כגן מועמד בקונסנזוס (איור 3F).
ניתוח של תא בודד
נחקרו ההומוגניות התאית והתהליכים המולקולריים ברקמות שליה עם PE. התאים עברו סינון איכות על בסיס מספר הגנים שזוהו, מספר ספירות ה-RNA ואחוז ביטוי הגנים המיטוכונדריאליים. תאים באיכות נמוכה (פחות מ-200 גנים שזוהו או עם יותר מ-20% תוכן גנים מיטוכונדריאליים) הוסרו כדי להשיג דגימה באיכות גבוהה של תא בודד לצורך ניתוחים המשכיים. מדדי בקרת האיכות וזיהוי הגנים בעלי השונות הגבוהה מוצגים ב-Supplementary Figure 1A–B. לאחר נורמליזציה וזיהוי גנים בעלי שונות גבוהה, בוצע ניתוח רכיבים ראשיים (PCA) באמצעות 2,000 הגנים בעלי השונות הגבוהה ביותר, ונקבעו הרכיבים הראשיים המשמעותיים באמצעות ניתוח JackStraw וניתוח ElbowPlot (Supplementary Figure 2A–B).
על בסיס הרכיבים הראשיים, נעשה שימוש בקירוב והקרנה של סבך אחיד (UMAP) להפחתת ממדיות ולביצוע אשכולה (clustering) לא מפוקחת, שבה כל התאים סווגו ל-22 אשכולות, דבר המדגיש את ההטרוגניות התאית הגבוהה ברקמת השיליה (איור 4A). באמצעות בחינת ביטוי של גנים מסמנים ספציפיים לאשכול והצגת הגנים המובהים (DEGs) במפת חום (איור 4B), כל אשכול סווג על בסיס סמן קנוני והוקרן חזרה על גבי השכבל של ה-UMAP (איור 4C). על בסיס נתונים אלו, זוהו אוכלוסיות תאי שיליה עיקריות, הכוללות תאי B/תאי פלזמה, תאי אנדותל, פיברובלסטים/תאי סטרומה, מקרופאגים/תאים דנדריטיים, תאי NK, תאי T ותאי טרופובלסט. השוואות בין קבוצת הביקורת לקבוצת ה-PE מעלות כי מספר סוגי תאים מראים התפלגות יחסית משמעותית בשילוית PE, דבר המצביע על עיצוב מחדש של המיקרו-סביבה השילייתית (איור 4D).
מקור הרקמה ומצב המחלה שימשו למעקב אחר תאים באותו הטמעת UMAP על בסיס מקור הרקמה (decidua מול villi) ומיון המחלה (ביקורת מול PE) (איור 4E). התפלגות מספר התאים הופרדה חלקית לפי מקור הרקמה, בעוד שתאים מקבוצות מחלה שונות היו מקושרים מאוד. הדבר מרמז ש-PE אינה מסדרת מחדש באופן משמעותי את כל המבנה התרנסקריפטומי, אך עשויה להשפיע על אוכלוסיות תאים בודדות או על מאפיינים מולקולריים מסוימים. הביטוי של SASH1 מופה על גבי ה-UMAP כדי לבחון את התפלגותו בקרב אוכלוסיות תאי השליה (איור 4F–G). SASH1 מראה ביטוי חזק הספציפי לסוג התא, עם הבדלים בולטים בין אוכלוסיות תאי ה-decidua לתאי ה-villi. השוואה סטטיסטית של ביטוי SASH1 בין קבוצות PE וביקורת על פני סוגי תאים (מבחן Wilcoxon rank-sum) חשפה הבדלים משמעותיים במספר אוכלוסיות תאי שליה, כאשר העלייה הבולטת ביותר נצפתה בתאי טרופובלסט מדגימות PE (איור 4H). ממצא זה מספק ראיה ברמת התא הבודד לכך שדיסרגולציה של SASH1 בולטת במיוחד במדור הטרופובלסט, מה שתומך בשימוש בשורת תאי הטרופובלסט HTR-8/SVneo עבור ניסויים פונקציונליים בהמשך.
השתקה של SASH1 מעכבת אפופטוזיס של טרופובלסט ותגובות דלקתיות המושרות על ידי היפוקסיה
כדי לתקף את התחזיות הביואינפורמטיות, הוקם מודל תאי טרופובלסט הקשור ל-PE בתנאי היפוקסיה (1% O2). בוצעו אנליזות qPCR ו-Western blot כדי להעריך את ביטוי SASH1 (איור 5A–B). בהשוואה לתאי HTR-8/SVneo בתנאי נורמוקסיה, תאים שטופלו בהיפוקסיה הראו עלייה משמעותית ברמות הביטוי של SASH1 mRNA וחלבון, דבר המספק תיקוף ניסויי ראשוני לתוצאות הביואינפורמטיות. כדי להעריך את השפעת השתקתו של SASH1 על תהליכים פתולוגיים הקשורים ל-PE, בוצעה השתקה של SASH1 בתאי HTR-8/SVneo שטופלו בהיפוקסיה. אנליזות qPCR ו-Western blot (איור 5C–D) הראו כי ביטוי SASH1 פחת באופן משמעותי בכל קבוצות sh-SASH1 בהשוואה לקבוצת sh-NC. מבין אלה, sh-SASH1#3 הפגין את יעילות ההשתקה הגבוהה ביותר ולכן נבחר לניסויים המשכיים. צביעת TUNEL ובדיקת ELISA בוצעו תחת שלושה תנאים: בקרת נורמוקסיה (Normal), היפוקסיה עם shRNA של בקרת שלילה (Hypoxia + sh-NC), והיפוקסיה עם השתקת SASH1 (Hypoxia + sh-SASH1). בהשוואה לקבוצת ה-Normal, קבוצת ה-Hypoxia + sh-NC הפגינה עלייה משמעותית באפופטוזיס והגברה בהפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים IL-1β, IL-6 ו-TNF-α, מה שמאשר פגיעה בטרופובלסט המושרית על ידי היפוקסיה. השתקת SASH1 הנמיכה משמעותית השפעות אלו, והפחיתה את האפופטוזיס (איור 5E) ואת רמות הציטוקינים (איור 5F) לרמות הקרובות לאלו של קבוצת ה-Normal, מה שמרמז כי השתקת SASH1 יכולה להציל במידה רבה מאפופטוזיס של טרופובלסט ומתגובות דלקתיות המושרות על ידי היפוקסיה. כדי לבסס עוד יותר את התפקיד הסיבתי של SASH1, בוצעו ניסויי gain-of-function. בדיקות qPCR ו-Western blot אישרו ביטוי יתר מוצלח של SASH1 בתאי HTR-8/SVneo (איור 5G–H). בתנאי נורמוקסיה, ביטוי יתר של SASH1 (OE-SASH1) הגביר משמעותית את אפופטוזיס הטרופובלסט ואת הפרשת הציטוקינים הפרו-דלקתיים בהשוואה לקבוצת OE-NC, ובכך שיחזר את הפנוטיפ המושרה על ידי היפוקסיה (איור 5I–J). יחד, נתוני ה-loss- and gain-of-function מבססים כי SASH1 הוא הן נחוץ והן מספיק כדי להניע אפופטוזיס של טרופובלסט ותגובות דלקתיות, ובכך מאשרים את תפקידו הסיבתי בפתולוגיה הקשורה ל-PE.
P-EXOS מדכא אפופטוזה של טרופובלסט ותגובות דלקתיות המושרות על ידי היפוקסיה באמצעות ויסות של SASH1
P-EXOS נחשבים כבעלי ערך טיפולי פוטנציאלי ב-PE. במחקר זה, ניתוח ביואינפורמטיקה העלה כי SASH1 קשור למסלולי איתאות הקשורים לאקסוזומים (כפי שמעידים העשירות של GO ו-KEGG, איור 2C–D), מה שהוביל אותנו להניח כי P-EXOS עשויים להפעיל אפקט מגן ב-PE על ידי ויסות של SASH1. לפני מחקרי התפקוד, בוצע אפיון של P-EXOS מבודדים. ניתוח Western blot אישש את נוכחותם של חלבוני סימון אקסוזומליים PLAP, CD63 ו-TSG101, ללא ביטוי גלוי של סימון הגולג'י GM130, דבר המעיד על טוהר גבוה של הוויסיקולות המבודדות. מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת חשפה בנוסף מבנים ויסיקולריים טיפוסיים בצורת גביע (איור 6A–B). כדי לוודא האם P-EXOS יכולים להיספג ביעילות על ידי תאי מטרה, בוצע צביעת אימונופלורסנציה להערכת הספיגה התאית של P-EXOS. בהשוואה לקבוצת הביקורת, תאי HTR-8/SVneo שטופלו ב-P-EXOS הראו סיגנלי קו-לוקליזציה בולטים בתמונות הממוזגות, מה שמעיד על כך ש-P-EXOS נספגו ביעילות על ידי תאי HTR-8/SVneo (איור 6C).
בהמשך, תאי HTR-8/SVneo תורגלו בתיבה משותפת (co-cultured) עם P-EXOS תחת תנאי היפוקסיה. הן בדיקות qPCR והן בדיקות Western blot הראו הפחתה ניכרת ברמות mRNA ובחלבון של SASH1 בקבוצה שטופלה ב-P-EXOS בהשוואה לבקרה (איור 6D–E>, דבר שסיפק ראיה ראשונית לאינטראקציה רגולטורית בין P-EXOS ל-SASH1. בהתאמה לשינויים מולקולריים אלו, צביעת TUNEL חשפה הנחלה משמעותית של אפו פטוזיס המושרה על ידי היפוקסיה בתאי HTR-8/SVneo בעקבות טיפול ב-P-EXOS (איור 6F). במקביל, בדיקות ELISA הדגימו ירידה ניכרת בהפרשה של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כולל IL-6, IL-1β ו-TNF-α (איור 6G).
כדי לקבוע האם ההשפעות המגנות של P-EXOS תלויות מבחינה מכניסטית בדיכוי של SASH1, בוצע ניסוי הצלה (rescue experiment) בתנאי היפוקסיה. תאים עם ביטוי יתר של SASH1 (OE-SASH1 + P-EXOS) הושוו לתאי ביקורת שליליים (OE-NC + P-EXOS). ביטוי יתר של SASH1 ביטל באופן משמעותי את ההשפעות המגנות של P-EXOS, כפי שמעידים עלייה באפופטוזיס (איור 6H) והגברה של הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים (איור 6I) בהשוואה לקבוצת ה-OE-NC + P-EXOS. תוצאות אלו מדגימות כי ההשפעה המגנה של P-EXOS מתווכת באופן ספציפי באמצעות דיכוי SASH1, ולא באמצעות מסלולים מקבילים, מה שמדגיש את הפוטנציאל הטיפולי של P-EXOS ב-PE.
זמינות נתונים:
המאגרי נתונים התומכים בממצאי מחקר זה זמינים לציבור והופקו ממאגר ה-Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), תחת מספרי גישה GSE75010, GSE10588, GSE60438, ו-GSE183338. אנוטציית סוגי התאים בוצעה בהתבסס על ה-Cell Classification Database (https://ngdc.cncb.ac.cn/celltaxonomy/). תמונות Western blot שאינן חתוכות וכל שאר הנתונים הניסויים הגולמיים התומכים בממצאי מחקר זה מסופקים ב- נתוני גלם משלימים תיקייה
איור 1: זיהוי DEGs ברקמות של שליה ודסידואה ב-PE בשלושה מערכי נתונים עצמאיים. (A) Volcano plot של DEGs בין 157 דגימות שליה עם PE ו-173 דגימות שליה ללא PE ממערך הנתונים המשולב GSE75010. (B) Volcano plot של DEGs בין דגימות שליה עם PE חמור (n = 17) לדגימות שליה נורמליות (n = 26) ממערך הנתונים GSE10588. (C) Volcano plot של DEGs בין דגימות דסידואה עם PE לדגימות דסידואה של ביקורת נורמוטנסית ממערך הנתונים GSE60438. DEGs זוהו באמצעות p < 0.05 ו- |log2FC| > 0.5. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה מוגדלת של איור זה.
איור 2: העשרה תפקודית וניתוח PPI של DEGs משותפים הקשורים לרעלת היריון. (A) דיאגרמת ונ של DEGs שזוהו ממאגרי הנתונים GSE75010, GSE10588 ו-GSE60438 הקשורים ל-PE. (B) רשת PPI של 20 גני ה-hub המובילים שנבחרו מתוך 56 ה-DEGs המשותפים על בסיס דרגת קישוריות, המדורגים באמצעות תוכנת Cytoscape (ציון אינטראקציית STRING ≥0.15). (C) ניתוחי העשראת GO ו-KEGG של ה-DEGs המשותפים מוצגים כגרפי עמודות. (D) ניתוחי העשראת GO ו-KEGG של ה-DEGs המשותפים, מוצגים כדיאגרמות כבלים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סריקה מבוססת למידת מכונה של גני hub מועמדים הקשורים לרעלת הריון. (A) ניתוח רגרסיית LASSO המציג פרופילי מקדמים של גנים מועמדים. (B) בחירת פרמטר הרגולריזציה האופטימלי (λ) על ידי רגרסיית LASSO באמצעות תיקוף צולב (cross-validation). (C) אלגוריתם Boruta. (D) ניתוח SVM-RFE. (E) אלגוריתם XGBoost. (F) תרשים ונ showing את החפיפה של הגנים המועמדים שזוהו על ידי אלגוריתמי LASSO, Boruta, SVM-RFE ו-XGBoost. קיצורים: LASSO = least absolute shrinkage and selection operator; SVM-RFE = support vector machine recursive feature elimination. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח טרנסקריפטומי של תא בודד חושף דפוסי ביטוי של SASH1 הספציפיים לסוגי תאים ברעלת היריון (pre-eclampsia). (A) אשכולות UMAP של מערך נתוני התא הבודד. (B) ניתוח סימון של חמשת הסמנים המובילים במערך נתוני הטרנסקריפטום של תא בודד PE מספר GSE183338. (C) סימון של תתי-אוכלוסיות של תאים. (D) תרשים עמודות המראה את פיזור פרופורציות התאים בדגימות ביקורת ובדגימות PE. (E) תרשים UMAP צבוע לפי מקור הרקמה (decidua ו-villi) ומצב המחלה (ביקורת ו-PE). (F) תרשים UMAP המראה ביטוי של SASH1 באוכלוסיות תאי שליה מקובצות לפי מקור הרקמה (decidua ו-villi). (G) תרשים UMAP המראה ביטוי של SASH1 באוכלוסיות תאי שליה מקובצות לפי מצב המחלה (ביקורת ו-PE). (H) תרשים כינור המראה את פיזור הביטוי של SASH1 בסוגי תאי שליה שונים. ns p > 0.05; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. קיצורים: UMAP = uniform manifold approximation and projection; ns = לא מובהק. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.
איור 5: SASH1 מווסת אפופטוזה של טרופובלסט ודלקת המושרות על ידי היפוקסיה. (A) ניתוח qPCR של ביטוי mRNA של SASH1 וכמות דנסיטומטרית של רמות חלבון SASH1 בתאי HTR-8/SVneo בתנאים נורמליים ובתנאי היפוקסיה. (B) תמונות Western blot מייצגות התואמות לנתונים הדנסיטומטריים המוצגים ב-(A). (C) ניתוח qPCR של ביטוי mRNA של SASH1 וכמות דנסיטומטרית של רמות חלבון SASH1 בתאי HTR-8/SVneo שטופלו בהיפוקסיה והועברו להם קונסטרוקטים של sh-NC או sh-SASH1 (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 ו-sh-SASH1#3). (D) תמונות Western blot מייצגות התואמות לנתונים הדנסיטומטריים המוצגים ב-(C). (E) צביעת TUNEL של תאי HTR-8/SVneo בקבוצות Normal, Hypoxia + sh-NC ו-Hypoxia + sh-SASH1(#3). סרגל קנה מידה = 20 µm. (F) ניתוח ELISA של ציטוקינים דלקתיים (IL-1β, IL-6 ו-TNF-α) בקבוצות Normal, Hypoxia + sh-NC ו-Hypoxia + sh-SASH1(#3). (G) ניתוח qPCR של ביטוי mRNA של SASH1 וכמות דנסיטומטרית של רמות חלבון SASH1 בתאי HTR-8/SVneo שהועברו להם קונסטרוקטים של OE-NC או OE-SASH1. (H) תמונות Western blot מייצגות התואמות לנתונים הדנסיטומטריים המוצגים ב-(G). (I) צביעת TUNEL של תאי HTR-8/SVneo בקבוצות Normal + OE-NC ו-Normal + OE-SASH1. סרגל קנה מידה = 20 µm. (J) ניתוח ELISA של ציטוקינים דלקתיים (IL-1β, IL-6 ו-TNF-α) בקבוצות Normal + OE-NC ו-Normal + OE-SASH1. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD משלוש חזרות ביולוגיות עצמאיות (n = 3). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: P-EXOS מקלים על פגיעה בטרופובלסט המושרית על ידי היפוקסיה באמצעות דיכוי של SASH1. (A) ניתוח Western blot של חלבוני סמן של P-EXOS הכוללים את PLAP, CD63 ו-TSG101, כאשר GM130 משמש כביקורת שלילית. (B) ניתוח במיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) של מורפולוגיית P-EXOS. Scale bar = 1.0 µm. (C) תמונות ממיקרוסקופיה קונפוקלית של סריקת לייזר המראות ספיגה של P-EXOS המסומנים ב-PKH67 (בירוק) בתאי HTR-8/SVneo (באדום). הגרעינים נצבעו ב-DAPI (בכחול). Scale bar = 20 µm. (D) ניתוח qPCR של ביטוי mRNA של SASH1 וכימות דנסイトומטרי של רמות חלבון SASH1 בתאי HTR-8/SVneo בקבוצות Control ו-P-EXOS. (E) תמונות Western blot מייצגות התואמות לנתונים הדנסイトומטריים המוצגים ב-(D). (F) צביעת TUNEL של תאי HTR-8/SVneo בקבוצות Control ו-P-EXOS. Scale bar = 20 µm. (G) ניתוח ELISA של ציטוקינים דלקתיים (IL-1β, IL-6 ו-TNF-α) בתאי HTR-8/SVneo שעברו טיפול בהיפוקסיה בקבוצות Control ו-P-EXOS. (H) צביעת TUNEL של תאי HTR-8/SVneo בקבוצות OE-NC + P-EXOS ו-OE-SASH1 + P-EXOS. Scale bar = 20 µm. (I) ניתוח ELISA של ציטוקינים דלקתיים (IL-1β, IL-6 ו-TNF-α) בתאי HTR-8/SVneo שעברו טיפול בהיפוקסיה בקבוצות OE-NC + P-EXOS ו-OE-SASH1 + P-EXOS. קיצורים: P-EXOS = placenta-derived exosomes; TEM = transmission electron microscopy; PLAP = placental alkaline phosphatase; TSG101 = tumor susceptibility gene 101. *p < 0.05; **p < 0.01. הנתונים מוצגים כממוצע ±SD משלוש חזרות ביולוגיות עצמאיות (n = 3). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: בקרת איכות של נתוני single-cell RNA-seq. (A) תרשים כינור (Violin plot) של רמות ביטוי גנים לאחר בקרת איכות. (B) תרשים תכונות משתנות המציג גנים בעלי שונות גבוהה שזוהו לאחר בקרת איכות.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
איור משלים 2: קביעת רכיבים עיקריים בעלי מובהקות סטטיסטית לצורך מקבץ (clustering) של תאים בודדים. (A) תרשים נקודות (dot plot) מסוג JackStraw המשמש לזיהוי רכיבים עיקריים בעלי מובהקות סטטיסטית. (B) תרשים נקודות מסוג "מרפק" (Elbow plot) המציג את השונות המוסברת על ידי רכיבים ראשיים.אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 1: רצפי מטרה של shRNA ששימשו להשקת SASH1. רצפי מטרה של shRNA (5′–3′) עבור הביקורת השלילית (sh-NC) ושלושה מבנים המכוונים ל-SASH1 (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 ו-sh-SASH1#3) ששימשו להשתקת גנים.אנא לחצו כאן להורדת הקובץ.
טבלה נספחת 2: רצפי פריימרים ששימשו ל-PCR כמותי. רצפי פריימרים קדמיים ואחוריים (5′–3′) עבור SASH1 ו-β-actin (ביקורת פנימית) ששימשו בניתוח qPCR.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.
דיון
במחקר זה, SASH1 זוהה כגן מפתח שביטויו משובש ב-PE באמצעות ניתוח טרנסקריפטומי משולב, ריצוף של תאים בודדים ולמידת מכונה מרובת אלגוריתמים, גישה הרלוונטית במיוחד לאור העובדה שטיפולים ממוקדים עבור PE עדיין אינם זמינים17. הוכח כי SASH1 מועלה באופן משמעותי בתאי טרופובלסט תחת היפוקסיה, וכי הוא מוגבר ספציפית במדור הטרופובלסט של שליות ב-PE ברזולוציה של תאים בודדים. באמצעות ניסויי אובדן תפקוד (loss-of-function) והשגת תפקוד (gain-of-function), נקבע כי SASH1 הוא הן הכרחי והן מספיק להנעת אפופטוזה של טרופובלסטים והפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים. יתרה מכך, טיפול ב-P-EXOS הפחית את הפגיעה בטרופובלסטים המושרית על ידי היפוקסיה, ואפקט הגנתי זה בוטל על ידי ביטוי יתר של SASH1, מה שמאשר כי הגנה תאית המתווכת על ידי P-EXOS תלויה מבחינה מכניסטית בדיכוי של SASH1.
בנוסף, נצפו ב-PE שינויים בפרופורציות של סוגי תאי שליה מרובים, כולל תאי B/תאי פלזמה, תאים אנדותליאליים, פיברובלסטים/תאי סטרומה, מקרופאגים/תאים דנדריטיים, תאי NK, תאי T ותאי טרופובלסט. ממצאים אלו מרמזים כי המיקרו-סביבה השילייתית עוברת עיצוב מחדש (remodeling) משמעותי במהלך PE. מיקרו-סביבה דלקתית שכזו לא רק מחמירה את התפקוד הלקוי של הטרופובלסט, אלא עשויה גם להאיץ את התקדמות המחלה באמצעות אינטראקציות בין מערכת החיסון למטריקס extracelluler18. יתרה מכך, מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs) נקשרו לאחרונה להחמרת הדלקת בשליה ב-PE19. SASH1 נחשב כבעל תפקיד משמעותי בהתפתחות PE בשל מעורבותו באיתות דלקתי, הידבקות תאים ותהליכים הקשורים להיפוקסיה. במחקר זה, פרופילי ביטוי גנים הופקו מדגימות שליה של חוליות PE והריונות נורמוטנסיביים באמצעות חבילת limma, ומספר אלגוריתמים של למידת מכונה — LASSO regression, SVM-RFE, XGBoost ו-Boruta לבחירת מאפיינים. בכל האלגוריתמים, SASH1 עלה באופן עקבי כגן מועמד על בסיס קונסנזוס. ברמת התא הבודד, SASH1 הראה ביטוי ספציפי לסוגי תאים באוכלוסיות תאי שליה מגוונות ושמר ביטוי מוגבר בדגימות PE, כאשר ההבדל הבולט ביותר נצפה בתאי טרופובלסט, מה שמרמז כי הוא עשוי להפעיל השפעות פונקציונליות שונות בהקשרים שונים של תאי שליה.
SASH1 הוא חלבון מתאם של אותות (signaling adaptor protein) שדווח כי הוא משתתף בתהליכים ביולוגיים שונים, כולל נדידה ופלישה של תאים, מעבר אפיתלי-מזנכימלי (EMT) ובקרת אותות בתגובה למעמדות (stress-responsive signaling regulation)8,9. כדי לחקור את התפקיד התפקודי של SASH1 בפתולוגיה הקשורה ל-PE, הוקם מודל של טרופובלסט המושרה על ידי היפוקסיה באמצעות תאי HTR-8/SVneo. התוצאות שלנו הדגימו כי חשיפה להיפוקסיה העלתה באופן משמעותי את ביטוי SASH1, בעוד ששתיקה (knockdown) של SASH1 החלישה באופן ניכר את האפופטוזיס המושרה על ידי היפוקסיה והפחיתה את הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים, כולל IL-1β, IL-6 ו-TNF-α. לעומת זאת, ביטוי יתר של SASH1 בתנאי נורמוקסיה הספיק כדי לשחזר את הפנוטיפ המושרה על ידי היפוקסיה, מה שביסס את התפקיד הסיבתי של SASH1 בהנעת פגיעה בטרופובלסט. ממצאים אלו מרמזים כי SASH1 עשוי לווסת באופן שלילי את המצב התפקודי של הטרופובלסט על ידי אפלולת תגובות דלקתיות. בהתחשב בכך שטרופובלסטים מהווים מקור מרכזי למתווכי דלקת של השילייה20, ביטוי שגוי של SASH1 עשוי להוות בסיס מולקולרי קריטי להגברת הדלקת ב-PE. ראוי לציין כי התפקודים הפרו-אפופטוטים והפרו-דלקתיים של SASH1 שנצפו בתאי טרופובלסט עומדים בניגוד לתפקידו הקנוני כמדכא גידולים בתאי סרטן, שם הוא בדרך כלל מעכב EMT ונדידה8,9. דואליות תפקודית תלוית-הקשר זו עשויה לשקף הבדלים ספציפיים לסוג התא בבני הזוג המקשרים ל-SASH1 וברשתות האותות במורד הזרם, ומצדיקה חקירה נוספת.
אקסוזומים מוכרים כמתווכים חשובים של תקשורת בין-תאית והם מעורבים בפתוגנזה של PE21. בפרט, P-EXOS עשויים למלא תפקיד חשוב בוויסות חיסוני במהלך הריון תקין, כגון שמירה על סבילות חיסונית בין האם לעובר, אשר עשויה להעניק הגנה מפני PE22. במחקר זה, ניתוח ביו-אינפורמטי revealed קשר בין SASH1 לבין מסלולי איתות הקשורים לאקסוזומים, מה שהוביל לחקירה נוספת של תפקידם של P-EXOS בוויסות תפקוד התרופובלסט. ניסויי תרבית משותפת הדגימו כי טיפול ב-P-EXOS הפחית באופן משמעותי את רמות ה-mRNA והחלבון של SASH1 בתאי טרופובלסט שעברו טיפול בהיפוקסיה, והפחית באופן ניכר את האפופטוזיס והתגובות הדלקתיות המושרים על ידי היפוקסיה. באופן חשוב, ביטוי יתר של SASH1 ביטל את ההשפעות המגנות הללו, מה שמאשר כי ההגנה התאית המתווכת על ידי P-EXOS תלויה מנגנונית בדיכוי של SASH1 ולא פועלת דרך מסלולים מקבילים.
המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם P-EXOS מדכאים את ביטוי SASH1 טרם הובהרו. ידוע כי P-EXOS נושאים מטענים ביו-אקטיביים מגוונים, כולל microRNAs, חלבונים וליפידים, שיכולים לווסת את ביטוי הגנים בתאי המקבל10. אפשרות אחת היא ש-P-EXOS מעבירים miRNAs ספציפיים המכוונים ל-SASH1 באופן ישיר או עקיף. לחלופין, P-EXOS עשויים לווסת מסלולי איתות במעלה הזרם — כגון NF-κB או PI3K-Akt — המתכנסים בבקרה השעתוקית של SASH1. בהינתן ש-SASH1 היה מעורב במסלול PI3K-Akt-mTOR בתאי סרטן8, סביר שוויסות של ציר זה בתיווך אקסוזומים עשוי לתרום להורדה בביטוי SASH1 בתאי טרופובלסט. מחקרים עתידיים שישתמשו בריצוף של מטען אקסוזומלי ובמעכבים ספציפיים למסלולים יהיו נחוצים כדי לנתח את המפל המולקולרי המדויק שדרכו P-EXOS מווסתים את ביטוי SASH1.
במחקר זה, שולבה פרופיל תעתוקי (transcriptomic profiling) עם ריצוף RNA של תא בודד כדי לחקור את השינויים המולקולריים ברקמת השיליה ב-PE. הוכח כי SASH1 ממלא תפקיד מרכזי באפופטוזיס של טרופובלסט המושרה על ידי היפוקסיה ובתגובות דלקתיות, וכי P-EXOS יכול להפעיל אפקט מגן על ידי דיכוי ביטוי SASH1, מה שמספק תובנות חדשות לגבי המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס PE ומציע אסטרטגיה טיפולית פוטנציאלית. עם זאת, למחקר זה מספר מגבלות. ראשית, הממצאים התפקודיים נגזרו בעיקר מקו התאים של טרופובלסט אימוטליזד HTR-8/SVneo; נדרש תיקוף בתאי טרופובלסט ראשוניים. שנית, ביטוי חלבון SASH1 לא תוקף ברקמות שיליה קליניות של PE באמצעות אימונוהיסטוכימיה, דבר המגביל את הפרשנות התרגומית של הממצאים ויש להתייחס לכך במחקרים עתידיים. שלישית, מסווג ה-SVM-RFE הראה דיוק בינוני באימות צולב (~0.6), מה שמשקף את ההטרוגניות המובנית של מערך הנתונים; יידרשו קהלות עצמאיות גדולות יותר כדי לפתח מודלים אבחנתיים חסונים יותר. רביעית, המנגנון המולקולרי המדויק שבאמצעותו P-EXOS מדכא את ביטוי SASH1 נותר לא ברור. חמישית, נצפו פסי צביעה לא ספציפיים בזיהוי SASH1 ב-Western blot, מה שעשוי לנבוע מספציפיות תת-אופטימלית של הנוגדן. הנוגדן ששימש בניסוי זה הוא נוגדן פוליקלונלי, אשר בדרך כלל מציג ספציפיות נמוכה יותר בזיהוי אימונולוגי בהשוואה לנוגדים מונוקלונליים. עם זאת, פסים לא ספציפיים אלו אינם משפיעים על ממצאי חלבון SASH1 או על מסקנות מחקר זה. מחקרים עתידיים שישלבו ניסויי in vivo, ניתוח דגימות קליניות ואפיון של מטען אקסוזומלי נחוצים כדי להבהיר עוד יותר את התפקיד התפקודי של ציר P-EXOS-SASH1 ב-PE ולהעריך את הפוטנציאל התרגומי שלו.
גילויים
אין ניגוד עניינים במחקר זה.
תודות
מחקר זה מומן על ידי תוכנית המחקר המרכזית למדעי הרפואה של ועדת הבריאות המחוזית של חבאי, סין (מס' 20210075).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מצע RPMI-1640 | Gibco | 11875085 | |
| סרום עגל עוברי (FBS) | Gibco | 16140071 | |
| FBS נטול אקסוזומים | System Biosciences | EXO-FBS-50A-1 | |
| פניצילין/סטרפטומייצין | Thermo Fisher Scientific, CN | 15140122 | |
| סוכן טרנספקציה Lipofectamine 3000 (עם סוכן P3000) | Thermo Fisher Scientific, CN | L3000150 | |
| מצע Opti-MEM עם סרום מופחת | Thermo Fisher Scientific, CN | 31985070 | |
| פלסמיד SASH1 shRNA (HuSH) | origene | TL301836 | |
| פלסמיד ביטוי SASH1 ORF | origene | RC218866 | |
| בקרת וקטור ריק | origene | PS100001 | |
| ערכה לשעתוק הפוך | Thermo Fisher Scientific, CN | 4368814 | |
| תערובת PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific, CN | A46110 | |
| פריימרים ל-SASH1 | Sangon Biotech | Custom synthesized | |
| פריימרים ל-β-actin | Sangon Biotech | Custom synthesized | |
| בופר לליזת תאים | Beyotime | P0013B | |
| ספקטרופוטומטר NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, CN | NanoDrop Ultra | |
| ממברנת PVDF | Thermo Fisher Scientific, CN | 88518 | |
| נוגדן Anti-SASH1 | ABclonal | A15248 | |
| נוגדן Anti-β-actin | Abcam | ab6276 | |
| נוגדן משני Goat Anti-Rabbit/Anti-Mouse מצומד ל-HRP | Beyotime | A0208 | |
| תוכנת ImageJ | NIH (public domain) | ImageJ | |
| ערכת סימון תאים פלואורסצנטית ירוקה PKH67 (כולל Diluent C) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | MINI67 | |
| אלבומין סרום בקר (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | 10711454001 | |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| מיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקאלי (CLSM) | Leica | Leica TCS SP8 | |
| ערכת Quantikine ELISA ל-IL-6 אנושי | R&D Systems | D6050B | |
| בדיקת DuoSet ELISA ל-IL-1β/IL-1F2 אנושי | R&D Systems | DY201 | |
| ערכת Quantikine ELISA ל-TNF-α אנושי | R&D Systems | DTA00D | |
| קורא מיקרו-פלייטים | Thermo Scientific | Multiskan FC | |
| ערכה לזיהוי מוות תאי In Situ (ערכת TUNEL Assay) | Roche | 11684795910 | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096 | |
| פראפורמאלדהיד (4%) | Beyotime | P0099 | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | Olympus | BX53 | |
| צנטריפוגה מקוררת (קיבולת 12,000 × g) | Eppendorf | Eppendorf 5430 R | |
| אולטרצנטריפוגה (קיבולת 120,000 × g) | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| תוכנת R | The R Foundation | v4.2.1 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v10.0 | |
| Seurat (חבילת R) | Satija Lab (open-source) | v4.0.4 | |
| Harmony (חבילת R, תיקון batch) | Open-source | v1.2.0 | |
| Scrublet (חבילת Python, זיהוי doublets) | Open-source | v0.2.3 | |
| clustree (חבילת R) | Open-source | v0.5.1 | |
| glmnet (חבילת R, LASSO) | Open-source | v4.1.8 | |
| e1071 (חבילת R, SVM-RFE) | Open-source | v1.7-14 | |
| xgboost (חבילת R) | Open-source | v1.7.7.1 | |
| randomForest (חבילת R, Boruta) | Open-source | v4.7-1.1 | |
| מאגר נתוני Gene Expression Omnibus (GEO) | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | |
| מאגר נתוני STRING | string-db.org | https://www.string-db.org/ | |
| Metascape | metascape.org | https://metascape.org/ | |
| תוכנת Cytoscape | Cytoscape Consortium | v3.10.4 | |
| ggplot2 (חבילת R) | Open-source | v3.5.1 | |
| limma (חבילת R) | Open-source | v3.58.1 | |
| pheatmap (חבילת R) | Open-source | v1.0.12 | |
| ClusterProfiler (חבילת R) | Open-source | v4.8.3 | |
| DOSE (חבילת R) | Open-source | v3.28.2 | |
| ggpubr (חבילת R) | Open-source | v0.6.0 |
מקורות
- Malik A, Jee B, Gupta SK. Preeclampsia: Disease biology and burden, its management strategies with reference to India. Pregnancy Hypertens. 2019;15:23-31.
- Vitoratos N, Hassiakos D, Iavazzo C. Molecular mechanisms of preeclampsia. J Pregnancy. 2012;2012:298343.
- Battarbee AN, et al. Chronic hypertension in pregnancy. Am J Obstet Gynecol. 2020;222(6):532-41.
- Torres-Torres J, et al. A Narrative Review on the Pathophysiology of Preeclampsia. Int J Mol Sci. 2024;25(14).
- Xu Y, et al. DOCK1 deficiency drives placental trophoblast cell dysfunction by influencing inflammation and oxidative stress, hallmarks of preeclampsia. Hypertens Res. 2024;47(12):3434-46.
- Harmon AC, et al. The role of inflammation in the pathology of preeclampsia. Clin Sci (Lond). 2016;130(6):409-19.
- Jaufmann J, et al. The emerging and diverse roles of the SLy/SASH1-protein family in health and disease: Overview of three multifunctional proteins. Faseb J. 2021;35(4):e21470.
- Li S, et al. The downregulation of SASH1 expression promotes breast cancer occurrence and invasion, accompanied by the activation of the PI3K-Akt-mTOR signaling pathway. Sci Rep. 2024;14(1):21914.
- Franke FC, et al. The Tumor Suppressor SASH1 Interacts With the Signal Adaptor CRKL to Inhibit Epithelial-Mesenchymal Transition and Metastasis in Colorectal Cancer. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2019;7(1):33-53.
- Zhang J, et al. Extracellular vesicles in normal pregnancy and pregnancy-related diseases. J Cell Mol Med. 2020;24(8):4377-88.
- David M, Maharaj N. The immune-modulatory dynamics of exosomes in preeclampsia. Arch Gynecol Obstet. 2025;311(6):1477-87.
- Gu M, et al. Preeclampsia impedes fetal kidney development by delivering placenta-derived exosomes to glomerular endothelial cells. Cell Commun Signal. 2023;21(1):336.
- Jiang X, et al. Downregulated miR-199a-3p in Preeclamptic Placenta-derived Exosomes from Cord Blood Hinders VEGF-induced Fetal Glomerular Dysplasia Through Inhibiting Akt1(S473) Phosphorylation via Targeting PHLPP2. Stem Cell Rev Rep. 2025;21(8):2693-710.
- Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43(7):e47.
- Wang X, et al. High expression of THY1 in gallbladder fibroblasts promotes the formation and progression of gallstones. Research Square [Preprint]. 2025. Available from: https://www.researchsquare.com/article/rs-7276422/v1. doi:10.21203/rs.3.rs-7276422/v1.
- Sha M, et al. Extracellular vesicles derived from hypoxic HTR-8/SVneo trophoblast inhibit endothelial cell functions through the miR-150-3p /CHPF pathway. Placenta. 2023;138:21-32.
- Ma'ayeh M, Costantine MM. Prevention of preeclampsia. Semin Fetal Neonatal Med. 2020;25(5):101123.
- Mandalà M. Oxidative Stress and Inflammation in Uterine-Vascular Adaptation During Pregnancy. Antioxidants (Basel). 2025;14(9).
- Lu Y, et al. NETs exacerbate placental inflammation and injury through high mobility group protein B1 during preeclampsia. Placenta. 2025;159:131-9.
- Raghupathy R. Cytokines as key players in the pathophysiology of preeclampsia. Med Princ Pract. 2013;22 Suppl 1(Suppl 1):8-19.
- Esfandyari S, et al. Exosomes as Biomarkers for Female Reproductive Diseases Diagnosis and Therapy. Int J Mol Sci. 2021;22(4).
- Pillay P, Moodley K, Moodley J, Mackraj I. Placenta-derived exosomes: potential biomarkers of preeclampsia. Int J Nanomedicine. 2017;12:8009-23.
הדפסות חוזרות והרשאות
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה