מאמר מחקר

מיצוי Lycopus lucidus משפר תסמונת השחלה פוליציסטית ניסיונית באמצעות עיצוב מחדש של מיקרוביוטת המעי והמטבולום

15 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71084

⸱

28 באוגוסט 2026

 ,  ,  , 
1Department of Gynecology, Cangzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Hebei Province, 2Department of Gynecology, Heilongjiang Provincial Institute of Traditional Chinese Medicine Science

במאמר זה

סיכום

תמצית ZeLan שיפרה פנוטיפים אנדוקריניים ומטבוליים בחולדות עם PCOS המושרה על ידי DHEA. שילוב של ריצוף 16S rRNA ומטבוליקה של סרום הראה השחזה חלקית של גיוון אלפא של המיקרוביום במעי, הרכב מיקרוביאלי משונה ושינויים במטבוליטים הכוללים הורמונים סטרואידיים, חומצות מרה וחומצות שומן קצרות שרשרת.

תקציר

מחקר זה בחן את ההשפעות הטיפוליות של תמצית ZeLan על תסמונת השחלה הפוליציסטית (PCOS) והעריך את הקשר שלה לעיצוב מחדש של המיקרוביוטה והמטבולום במעי. עשרים וארבע חולדות נקבה מסוג Sprague-Dawley חולקו באופן אקראי לקבוצת ביקורת, קבוצת מודל PCOS שהושרה על ידי dehydroepiandrosterone (DHEA), וקבוצת טיפול ב-ZeLan (n = 8 לכל קבוצה). לאחר 28 ימי התערבות, נמדדו רמות הורמונים בסרום באמצעות ELISA; הרכב המיקרוביוטה במעי נותח באמצעות רצף גן 16S rRNA, ופרופילים מטבוליים בסרום אופיינו באמצעות UHPLC-Q-TOF-MS. ניתוח מתאם של Spearman עם בקרת ריבוי בדיקות בוצע כדי לחקור קשרים בין המיקרוביוטה למטבולום. ZeLan שיפר באופן משמעותי פנוטיפים הקשורים ל-PCOS, תוך הפחתה של משקל הגוף, טסטוסטרון (0.92 לעומת 1.85 ng/mL, P < 0.05), יחס LH/FSH ורמות אינסולין בהשוואה לקבוצת המודל. הרצף הראה כי ZeLan השחזר חלקית את הגיוון המיקרוביאלי האלפא (מדד שנון: 5.79 לעומת 4.19) והפחית את היחס בין Firmicutes ל-Bacteroidetes. ZeLan היה קשור להעשרה של Lactobacillus ו-Ruminococcus ולשכיחות נמוכה יותר של Bacteroides, Prevotella ו-Escherichia. המטבוליקה זיהתה 52 תכונות מטבוליות משתנות, כאשר שינויים מרכזיים כללו הורמונים סטרואידיים, חומצות מרה כגון lithocholic acid, וחומצות שומן קצרות שרשרת כגון butyric acid. ממצאים אלו מצביעים על כך ש-ZeLan משפר הפרעות אנדוקריניות ומטבוליות הקשורות ל-PCOS וכי הוא קשור לעיצוב מחדש של הפרופילים המיקרוביאליים במעי והמטבוליים בסרום.

מבוא

תסמונת השחלה הפוליציסטית (PCOS) מהווה אחת מהפרעות האנדוקריניות השכיחות ביותר הפוגעות בנשים בגיל הפוריות, עם שכיחות עולמית המוערכת בין 6% ל-20% בהתאם לקריטריונים האבחנתיים המיושמים1. הפרעה מטבולית ורבייתית מורכבת זו מאופיינת במערך של ביטויים קליניים, הכוללים היפראנדרוגניזם, הפרעה בביוץ ומורפולוגיה שחלאית פוליציסטית, אשר יחד תורמים להשלכות רבייתיות, מטבוליות ופסיכולוגיות משמעותיות2. מעבר להשפעתה המיידית על הפוריות, PCOS מזוהה יותר ויותר כמצב מערכתי הקשור לסיבוכי בריאות ארוכי טווח, כולל סוכרת מסוג 2, מחלות לב וכלי דם וקרצינומה של רירית הרחם, ובכך היא מטילה נטלה כבדת משקל הן על המטופלות הבודדות והן על מערכות הבריאות ברחבי העולם3. הפתופיזיולוגיה של PCOS נותרה לא מובנת במלואה, אם כי מקובל generally כי היא כוללת אינטראקציות מורכבות בין נטייה גנטית, גורמים סביבתיים ומרכיבי סגנון חיים, המביאים לשיבושים ההורמונליים והמטבוליים האופייניים הנצפים באנשים הלוקים בה4.

גישות טיפוליות עכשוויות לתסמונת השחלה הפוליציסטית (PCOS) מתמקדות בעיקר בניהול סימפטומטי באמצעות התערבויות פרמקולוגיות, כוללcontraceptives פומיים להסדרת המחזור החודשי, metformin להגברת הרגישות לאינסולין, ותרופות אנטי-אנדרוגניות לשליטה בהירסוטיזם5. עם זאת, טיפולים קונבנציונליים אלו מספקים לעיתים קרובות הקלה חלקית בלבד בסימפטומים והם קשורים תדיר לתופעות לוואי המגבילות את התשומשיות שלהם לטווח ארוך, במיוחד בקרב נשים השואפות להרות6. כתוצאה מכך, גבר העניין בבחינת גישות של רפואה משלימה ואלטרנטיבית, ובמיוחד רפואה סינית מסורתית (TCM), שצברה מאות שנים של ניסיון אמפירי בטיפול בהפרעות גינקולוגיות באמצעות מנגנוני ויסות הוליסטיים7. בין התרופות הבוטניות הרבות שנחקרו לניהול PCOS, Lycopus lucidus Turcz. (המוכר בדרך כלל כ-ZeLan ברפואה הסינית) עורר עניין רב בשל יישומיו המסורתיים בקידום זרימת הדם, פירוק סטזיס וויסות הווסת8. מחקרי פיטוכימיה שפורסמו מצביעים על כך ש-L. lucidus מכיל פוליפנולים ופרקציות עשירות בפלבונואידים בעלות פעילות נוגדת חמצון ונוגדת דלקת8,9. לפיכך, תכולת פלבונואידים כוללת סטנדרטית שימשה כמדד לבקרת איכות כימית של התמצית במחקר הנוכחי, אם כי זיהוי המonomers הפעילים הספציפיים האחראים לוויסות המיקרוביוטה והמטבוליזם ידורש ניתוח פיטוכימי ממוקד בעתיד.

מיקרוביומה של המעי הפכה לווסת קריטית של חילוף החומרים ותפקודים אנדוקריניים של המארח, כאשר עדויות גוברות תומכות במעורבותה בפתוגנזה של הפרעות מטבוליות שונות, כולל PCOS10. מושג "ציר המעי-שחלה" הוצע כדי לתאר תקשורת דו-כיוונית בין מיקרואורגניזמים במעי לבין תפקוד השחלה, המתווכת על ידי מטבוליטים מיקרוביאליים, איתותי מערכת החיסון ומסלולים נוירואנדוקריניים11. נשים עם PCOS הראו בעקביות דיסביוזיס של המעי המתאפיינת בירידה במגוון המיקרוביאלי, שינוי ביחס בין Firmicutes ל-Bacteroidetes, ומיעוט בשפע של חיידקים מועילים כגון מיני Lactobacillus ו-Bifidobacterium12. שיבושים מיקרוביאליים אלו נחשבים לתורמים לפיתופתולוגיה של PCOS באמצעות מספר מנגנונים, כולל עלייה בחדירות המעי, דלקת סיסטמית נמוכה (low-grade inflammation), ושינויים במטבוליזם של חומצות מרה וחומצות שומן קצרות שרשרת (SCFA), אשר משפיעים בהמשך על רגישות לאינסולין ועל ביוסינתזה של אנדרוגנים13. באופן משמעותי, התערבויות המכוונות למיקרוביומה של המעי, כולל פרוביוטיקה, פרה-ביוטיקה ושינויים תזונתיים, הראו תוצאות מבטיחות בשיפור תסמיני PCOS, ובכך תומכות בציר המעי-שחלה כי יעד טיפולי14.

מטבולומיקה, הניתוח המקיף של מטבוליטים של מולקולות קטנות במערכות ביולוגיות, מספקת גישה רבת עוצמה לאפיון הפרעות מטבוליות הקשורות למצבי מחלה ולהערכת ההשפעות הביוכימיות של התערבויות טיפוליות15. שילוב של ריצוף גן 16S rRNA לאפיון המיקרוביום יחד עם מטבולומיקה לא ממוקדת (untargeted metabolomics) מאפשר חקירה שיסטית של הקשרים בין קהילות מיקרוביאליות במעי לבין חילוף החומרים של המארח, ומספק תובנות לגבי אינטראקציות בין המיקרוביוטה למטבולום שעשויות ללוות הן את הפתוגנזה של המחלה והן את התגובה לטיפול. למרות הרציונל התאורטי להכוונת הטיפול לציר המעי-שחלה בניהול PCOS וההתוויות המסורתיות של ZeLan להפרעות גינקולוגיות, עד כה לא נערכו מחקרים שבחנו באופן שיטתי האם תמצית ZeLan מווסתת את הממשק בין המיקרוביוטה למטבולום במעי ב-PCOS. פער ידע זה מגביל את הבנתנו לגבי התגובות הביולוגיות הקשורות ל-ZeLan ומעכב אופטימיזציה רציונלית של התערבות בוטנית זו לטיפול ב-PCOS.

המחקר הנוכחי תוכנן לבחון את היעילות הטיפולית של תמצית ZeLan במודל חולדות של PCOS המושרה על ידי DHEA, ולהעריך שינויים נלווים במיקרוביוטה ובמטבוליזם של המעי באמצעות שילוב של ריצוף 16S rRNA ואנליזה מטבולומית לא מכוונת. באופן ספציפי, הערכנו את ההשפעות של תמצית ZeLan על פנוטיפים הקשורים ל-PCOS, כולל משקל גוף, רמות טסטוסטרון בנסיוב, יחס בין הורמון לוטאיניזציה להורמון מעורר זקיקים (LH/FSH), ורמות אינסולין; אפיינו שינויים בהרכבה של מיקרוביוטת המעי ובגיוון האלפא לאחר טיפול ב-ZeLan; זיהינו מאפיינים דיפרנציאליים של מטבוליטים בנסיוב ונתיבים מטבוליים מועשרים הקשורים להתערבות ב-ZeLan; ובחנו מתאמים בין טקסונים מיקרוביאליים ספציפיים במעי לבין מטבוליטים מרכזיים. באמצעות הגשמה של מטרות אלו, ביקשנו לספק ראיות רב-אומיות אסוציאטיביות לוויסות של ציר המעי-שחלה הקשור ל-ZeLan במצב של PCOS.

פרוטוקול

כל ההליכים הניסיוניים במחקר הנוכחי בוצעו בהתאם למדריך של המכונים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health) לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה, ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (מספר אישור IACUC-2023-0156).

בעלי חיים

נקבות של חולדות Sprague-Dawley (מספר = 24, גיל 6 שבועות, משקל גוף 180–200 g) הושגו ממרכז החיות למעבדה של המוסד המסונף והושכנו בתנאים סביבתיים מבוקרים (טמפרטורה של 22 ± 2°C, לחות של 50 ± 10%, מחזור אור/חושך של 12 שעות) עם גישה חופשית למזון סטנדרטי למכרסמים ולמים מזוקקים. לאחר תקופת אקלימציה של שבוע אחד, הבעלי החיים חולקו באופן אקראי לשלוש קבוצות ניסוי (מספר = 8 לכל קבוצה): ביקורת, מודל PCOS וטיפול ב-ZeLan. גודל המדגם נקבע על בסיס מחקרים קודמים שבחנו שינויים במיקרוביוטה של המעי במודלים של PCOS, כאשר ניתוח עוצמה הצביע על כך ש-8 בעלי חיים לקבוצה יספקו עוצמה של 80% לזיהוי הבדל פי 1.5 במדדי גיוון אלפא ב-α = 0.05.

הקמה של מודל PCOS ופרוטוקול טיפולי

מודל ה-PCOS הוקם באמצעות פרוטוקול מנוסח היטב הכולל הזרקה תת-עורית של dehydroepiandrosterone (DHEA; Sigma-Aldrich, USA) המומס בשמן שומשום לאזור העורף במינון של 6 mg/100 g ממשקל הגוף מדי יום למשך 21 ימים רצופים. חיות הבקרה קיבלו נפחים שווי ערך של שמן שומשום כנושאי חומר (vehicle). ציר הזמנים הניסויי המלא כלל 7 ימי אקלימציה, 21 ימים של השראת המודל, ו-28 ימי התערבות, כאשר דגימת נקודת הסיום התבצעה ביום ה-56 של הפרוטוקול, כולל תקופת האקלימציה (איור 1). תמצית ה-ZeLan הוכנה מצמח Lycopus lucidus Turcz. מאומת באמצעות מיצוי מימי, ותוקננה כך שתכיל פלבנואידים כלליים בריכוז של לא פחות מ-2.5% לפי כרומטוגרפיה נוזלית בעוצמה גבוהה (HPLC), אשר שימשה כקריטריון בקרת האיכות הכימית עבור התמצית הבוטנית. לאחר השלמת הקמת המודל המושרה על ידי DHEA, חולבים בקבוצת ה-ZeLan קיבלו מתן פהיתה (oral gavage) של תמצית ZeLan במינון של 200 mg/kg ממשקל הגוף מדי יום למשך 28 ימים רצופים, בעוד שקבוצות הבקרה והמודל קיבלו נפחים שווי ערך של מים מזוקקים. מינון ה-200 mg/kg נבחר כמינון פרמקולוגי גשש בהתבסס על ניסיון קודם בשימוש בחיות עם תמציות בוטניות ושיקולי סבילות ראשוניים; הערכה פורמלית של תגובת מינון-מענה לא הייתה חלק מהניסוי הנוכחי. משקל הגוף נרשם מדי שבוע לאורך התקופה הניסויית. בתכנון ניסויי זה, הצלחת הקמת מודל ה-PCOS הוערכה באמצעות פרוטוקול השראת ה-DHEA יחד עם פנוטיפים אנדוקרינים ומטבוליים בנקודת הסיום, כולל משקל גוף, טסטוסטרון בנסיב, יחס LH/FSH ואינסולין בצום. בדיקה היסטופתולוגית של השחלה, ספירת זקיקים, כימות גופי חלקה (corpus luteum) וניטור סדרתי של מחזור ההשבחה לא נכללו כנקודות סיום לאישור המודל, ולכן פרשנות התפקוד השחלאי התבססה על מדדים אנדוקרינים ומטבוליים ולא על הערכה ישירה ברמת הרקמה.

איסוף ועיבוד דגימות

דגימות (סרום וצואה) נאספו מכל שלוש הקבוצות (n = 8 לכל קבוצה) לצורך ניתוחים ביוכימיים, ניתוחי מיקרוביוטה וניתוחי מטבוליזום בהמשך. איסוף הדגימות הסופי בוצע בבוקר לאחר צום של לילה כדי להפחית שונות הקשורה למחזור דבירי (circadian) ולהאכלה. דגימות דם נאספו מאורטה בטנית תחת הרדמה ועברו צנטריפוגציה ב-3,000 × g למשך 15 דקות ב-4°C להשגת סרום, אשר חולק למכסויות (aliquots) ואוחסן ב-80°C- עד לניתוחי ההורמונים והמטבוליזום. דגימות צואה טריות נאספו ישירות מהמעי העיוור (cecum) בתנאים סטריליים לתוך קריו-מבחנות סטריליות, נשמרו על קרח יבש במהלך ההעברה, הוקפאו בהקפאה מהירה בחנקן נוזלי תוך 10 דקות מהאיסוף, ואוחסנו ב-80°C- עד לביצוע ריצוף גן 16S rRNA.

מדידות הורמונים בסרום

ריכוזים בסרום של טסטוסטרון, הורמון לוטאיזינציה (LH), הורמון מעורר זקיקים (FSH) ואינסולין נמדדו באמצעות ערכות ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) זמינות מסחרית (Cusabio Biotech, Wuhan, China) בהתאם להוראות היצרן. יחס ה-LH/FSH חושב כמדד משולב של חוסר איזון בגונדוטרופינים האופייני ל-PCOS. כל הדגימות נותחו בכפולות, ומדידות עם מקדמי שונות של כפולות הגדולים מ-15% בוצעו שוב. נקבע כי מקדמי השונות בתוך הבדיקה (intra-assay) ובין הבדיקות (inter-assay) יישמרו מתחת ל-10% ו-15%, בהתאמה. ערכים חריגים פוטנציאליים נסרקו אל מול רשומות המקור ומידע על ביצועי הבדיקה, ולא הוצא ערך כלשהו מהניתוח על בסיס סטטיסטי בלבד ללא סיבה טכנית מתועדת.

ריצוף של הגן 16S rRNA ואנליזה ביואינפורמטית

DNA גנומי בקטריאלי כולל הופק מתכני העקום באמצעות ערכת QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Germany) בהתאם לפרוטוקול היצרן. איכות וכמות ה-DNA נבחנו באמצעות ספקטרופוטומטריית NanoDrop ואלקטרופורזה בג'ל אגרוז, ותמציות ה-DNA נשמרו בטמפרטורה של -80°C לפני בניית הספריות. האזורים ההיפרו-וריאביליים V3-V4 של גן ה-16S rRNA הוגברו באמצעות הפריימרים אוניברסליים 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') ו-806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') עם רצפי אדפטור של Illumina. ספריות אמפליקונים נבנו, טוהרו, כמותן נמדדה, איחודן בוצע בריכוזים אקו-מולריים, והרצף נקרא בפלטפורמת Illumina NovaSeq 6000 (Novogene, Beijing, China) באמצעות קריאות paired-end של 250 bp.

קריאות רצף גולמיות עובדו באמצעות צינור העיבוד QIIME2 (גרסה 2022.2). קריאות Paired-end עברו דה-מולטיפלקס (demultiplexing), מיזוג, סינון איכות באמצעות סף ציון Phred של לפחות 20, ועיבוד עם DADA2 להסרת רצפים כימריים ולהפקת וריאנטים של רצפי אמפליקון (ASVs). סיווג טקסונומי בוצע מול מאגר הייחוס SILVA 138 באמצעות מסווג naive Bayes. מדדי גיוון אלפא, כולל מדד שאנון (Shannon index), מדד סימפסון (Simpson index) ואומדן Chao1, חושבו כדי להעריך את הגיוון והעשירות בתוך הדגימות. תוצרי עומק הרצף, כולל סיכומי קריאות, טבלאות שפע של ASV, כיסוי של Good (Good's coverage) וקבצי עקומות רריפקציה (rarefaction-curve), נחשבו כחלק מסט הנתונים של המיקרוביום המתואר בסעיף זמינות הנתונים. ניתוח גודל אפקט של אפליה ליניארית (LEfSe) שימש לזיהוי טקסונים הקשורים למחלה בהשוואה בין קבוצת הביקורת (Control) לקבוצת המודל (Model), תוך שימוש בסף ציון LDA הגבוה מ-2.0 ו-P < 0.05; השפעת ההיפוך הקשורה ל-ZeLan הוערכה על ידי השוואת כיוון השינויים בשפע הטקסונומי בקבוצת ה-ZeLan ביחס לקבוצת המודל.

ניתוח מטבוליקה לא מכוון

פרופיל מטבוליקה של סרום בוצע באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד המשולבת עם ספקטרומטריית מסות מסוג quadrupole time-of-flight (UHPLC-Q-TOF-MS; Agilent 1290 Infinity II/6550, USA). דגימות סרום (100 μL) עורבבו עם 400 μL של תערובת קרה של methanol: acetonitrile (1:1, v/v) המכילה סטנדרטים פנימיים, עוברו בערבול (vortex) והודגרו בטמפרטורה של -20°C למשך שעה אחת כדי להשקיע חלבונים. לאחר צנטריפוגציה ב-14,000 × g למשך 15 דקות, תמליי השכבה העליונהיובשו תחת זרם חנקן וחודשו ב-100 μL של acetonitrile:water (1:1, v/v) לצורך הניתוח. הפרדה כרומטוגרפית הושגה בעמודת ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) שנשמרה בטמפרטורה של 40°C, תוך שימוש במים המכילים 0.1% formic acid כפאזה ניידת A וב-acetonitrile המכיל 0.1% formic acid כפאזה ניידת B בקצב זרימה של 0.30 mL/min. לצורך הפרדת המטבוליטים נעשה שימוש בתוכנית גרדיאנט המעלה את הפאזה האורגנית מ-5% ל-95%, ולאחריה שטיפת העמודה ואיזון מחדש. נתוני ספקטרומטריית מסות נרכשו הן במצב יינון חיובי והן במצב יינון שלילי של electrospray עם טווח סריקה של m/z 50–1200; פרמטרי המקור כללו מתח קפילרי של 3.5 kV, זרימת גז ייבוש של 10 L/min, טמפרטורת גז ייבוש של 325°C, לחץ נבולר של 35 psi ומתח fragmentor של 120 V.

קבצי נתונים גולמיים הומרו לפורמט mzXML ועובדו באמצעות חבילת XCMS ב-R לצורך זיהוי שיאים, יישור זמני שימור (retention-time alignment) ואינטגרציה של שטחי שיאים. דגימות לבקרת איכות, שהוכנו על ידי איחוד מנות שוות של כל תמצי סרום, הוכנסו לאורך רצף הניתוח כדי לנטר את יציבות המכשיר. תכונות עם חסר מופרז בנתונים או שחזור לא יציב של בקרת האיכות הוסרו לפני המידול הסטטיסטי. זיהוי המטבוליטים בוצע על ידי התאמת מסה מדויקת, זמן שימור ותבניות פרגמנטציה של MS/MS אל מול מאגרי המידע Human Metabolome Database (HMDB), METLIN וספריות ספקטרליות פנימיות. ניתוחים סטטיסטיים רב-משתנים בוצעו באמצעות MetaboAnalyst 5.0. תכונות של מטבוליטים שנשמרו לדיווח המשכי תועדפו באמצעות קריטריון משולב שכלל תרומה מבחינה מבדילה רב-משתנית, כיוון שינוי קיפול (fold-change) וראיות סטטיסטיות; ערכי P הותאמו באמצעות שיטת Benjamini-Hochberg כדי להתחשב בבדיקות מרובות. טבלת הדיווח המלאה והמannotated, המכילה 52 תכונות של מטבוליטים, מסופקת כ-Supplementary Table 1. ניתוח העשרה של מסלולים בוצע באמצעות מאגר הנתונים Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).

ניתוח סטטיסטי

כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות SPSS גרסה 26.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) ותוכנת R (גרסה 4.2.1). נתונים רציפים הוצגו כממוצע ± סטיית תקן (SD) ונבחנו לנורמליות באמצעות מבחן שפירו-וילק (Shapiro-Wilk) לפני ביצוע בדיקות הסקה. עבור נתונים בעלי התפלגות נורמלית, נעשה שימוש בניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) ולאחריו מבחן פוסט-הוק של Tukey להשוואות בין קבוצות מרובות; עבור נתונים שאינם בעלי התפלגות נורמלית, נעשה שימוש במבחן קרوسקל-וואליס (Kruskal-Wallis) עם מבחן פוסט-הוק של Dunn. מתאמים בין טקסונים של מיקרוביוטת המעי לבין מטבוליטים בנסיוב הוערכו באמצעות מקדם המתאם הרגבי של ספירמן והוצגו כמפות חום עם אשכולהיררכי. ערכי ה-P של המתאמים הותאמו לבדיקות מרובות באמצעות שיטת קצב התגליות השגויות של בנימיני-הוכברג, ורק מתאמים שהיו עקביים בכיוונם ומובהקים סטטיסטית פושטרו. ערך P דו-זנבי < 0.05 נחשב למובהק סטטיסטית, אלא אם צוין סף P מתואם.

תוצאות

השפעות של תמצית ZeLan על פנוטיפים קליניים של PCOS

מתן DHEA השרה של פנוטיפים אנדוקריניים ומטבוליים דמויי PCOS בחולדות, כפי שבא לידי ביטוי בעליות משמעותיות במשקל הגוף, בריכוז הטסטוסטרון בסרום, ביחס LH/FSH ובברמות אינסולין בצום בהשוואה לקבוצת הביקורת (כולם P < 0.05). הערכת התפלגות באמצעות מבחן Shapiro-Wilk תמכה בניתוח פרמטרי עבור נקודות הקצה העיקריות של משקל הגוף והורמונים המסוכמות ב-טבלה 1. טיפול בתמצית ZeLan למשך 28 ימים שיפר באופן משמעותי הפרעות מטבוליות והורמונליות אלו. משקל הגוף נמדד בסיום תקופת הטיפול ביום 56 לפרוטוקול, כולל תקופת אקלמיזציה של 7 ימים. כפי שמוצג ב-טבלה 1, משקל הגוף בקבוצת המודל (291.12 ± 15.35 g) היה גבוה משמעותית מזה של קבוצת הביקורת (227.45 ± 10.12 g, P < 0.05), בעוד שטיפול ב-ZeLan הפחית באופן משמעותי את משקל הגוף ל-245.25 ± 10.21 g (P < 0.05 לעומת מודל). רמות הטסטוסטרון בסרום היו מוגברות באופן ניכר בחולדות מודל PCOS (1.85 ± 0.21 ng/mL) בהשוואה לביקורות (0.51 ± 0.05 ng/mL), והתערבות ב-ZeLan הפחיתה את הטסטוסטרון ל-0.92 ± 0.12 ng/mL. יחס ה-LH/FSH עלה באופן משמעותי בקבוצת המודל (3.28 ± 0.25) ביחס לביקורת (1.25 ± 0.11) והחזיר למצב נורמלי באופן חלקי על ידי טיפול ב-ZeLan (1.85 ± 0.15). רמות אינסולין בצום היו מוגברות בבעלי חיים מהמודל (28.95 ± 2.35 mIU/L לעומת 12.55 ± 1.12 mIU/L בביקורות) והופחתו באופן משמעותי לאחר מתן ZeLan (18.82 ± 1.55 mIU/L) (איור 2). ממצאים אלו אישרו הקמה מוצלחת של פנוטיפ אנדוקרינו-מטבולי דמוי PCOS; עם זאת, היסטופתולוגיה של השחלה, ספירת זקיקים, ניתוח גוף צהוב ומעקב אחר מחזור הבעולת לא בוצעו במחקר זה.

תמצית ZeLan שיחזרה את מגוון האלפא של מיקרוביוטת המעי

ניתוח של מדדי מגוון אלפא (alpha diversity) חשף שינויים משמעותיים במבנה קהילת המיקרוביום במעי הקשור ל-PCOS ולטיפול בו. כפי שמוצג ב-טבלה 2 וב-איור 3, מדד המגוון של שאנון (Shannon diversity index) היה נמוך באופן מובהק בחולדות ממודל PCOS (4.19 ± 0.35) מאשר בביקורות בריאות (6.51 ± 0.28; P < 0.05), מה שמעיד על ירידה במגוון האלפא המיקרוביאלי במצב מחלה. טיפול ב-ZeLan שיקם חלקית את המגוון המיקרוביאלי, כאשר מדד שאנון עלה ל-5.79 ± 0.26 (P < 0.05 לעומת המודל). תוצאות עקביות נצפו עבור מדד סימפסון (Simpson index), שירד מ-0.98 ± 0.01 בביקורות ל-0.82 ± 0.03 בבעלי חיים מהמודל, והשתקם ל-0.93 ± 0.02 בעקבות התערבות ב-ZeLan. מדד Chao1, המשקף את עשירות המינים, הראה דפוס דומה: השראת PCOS הפחיתה באופן משמעותי את ערכי ה-Chao1 מ-1215.3 ± 45.4 ל-665.8 ± 52.1, בעוד שטיפול ב-ZeLan הגביר את העשירות ל-963.5 ± 38.6. ממצאים אלו מעידים במצטבר כי PCOS קשור לדיסביוזיס של מיקרוביום המעי המאופיין בירידה במגוון ובשפע של אלפא, וכי תמצית ZeLan יכולה לשקם חלקית את מבנה הקהילה המיקרוביאלית לכיוון פרופיל הביקורת.

שינויים בהרכב מיקרוביוטת המעי

פרופיל טקסונומי ברמת המערכה (Phylum) חשף הבדלים הרכביים מובחנים בין הקבוצות הניסוייות. כפי שמוצג ב-איור 4, Firmicutes ו-Bacteroidetes היו המערכות הדומיננטיות בכל הקבוצות, ויחד הן היוו למעלה מ-85% מכלל קהילת החיידקים. קבוצת המודל הראתה שפע מוגבר משמעותית של Firmicutes (כ-75%) לצד פרופורציה מופחתת של Bacteroidetes (כ-15%) בהשוואה לקבוצת הביקורת (Firmicutes כ-40%, Bacteroidetes כ-45%), מה שהביא לעלייה ניכרת ביחס בין Firmicutes ל-Bacteroidetes (יחס F/B), המאפיין דיסביוזיס מטבולי. טיפול ב-ZeLan ויסת חוסר איזון זה, על ידי הפחתת שפע ה-Firmicutes לכ-52% תוך הגדלת ה-Bacteroidetes לכ-35%, ובכך נרמול חלקית את יחס ה-F/B לכיוון רמות הביקורת.

ניתוח LEfSe שימש לזיהוי טקסונים חיידקיים שהבדילו בין קבוצת הביקורת (Control) לקבוצת המודל (Model), ובכך הגדירו את החתימה המיקרוביאלית הקשורה למחלה. כפי שמוצג ב-איור 5, ברמת הסוג, קבוצת מודל ה-PCOS הראתה שפע מוגבר באופן משמעותי של Bacteroides (ציון LDA > 3.5), Prevotella (ציון LDA > 3.0) ו-Escherichia (ציון LDA > 2.5), שכולם מקושרים בדרך כלל לתפקוד מטבולי לקוי ולדלקת. לעומת זאת, קבוצת הביקורת הפגינה העשרה של סוגים מועילים, כולל Lactobacillus (ציון LDA > 3.0) ו-Ruminococcus (ציון LDA > 2.5), ששניהם מוכרים בשל תפקידם בשמירה על שלמות מחסום המעי ובהפקת מטבוליטים מועילים כגון חומצות שומן קצרות שרשרת. קבוצת ה-ZeLan לא הוצגה כמחלקה נפרדת בניתוח ה-LEfSe ב-איור 5 כיוון שניתוח זה התמקד בטקסונים המבדילים בין מחלה לבריאות; השפעות הקשורות ל-ZeLan פורשו מתוך שינויי השפע לעבר פרופיל קבוצת הביקורת ומתוך קורלציות בין המיקרוביום למטבולום.

פרופיל מטבולימי וזיהוי מטבוליטים דיפרנציאליים

ניתוח מטבולומיקה לא מכוון זיהה שיבושים מטבוליים משמעותיים הקשורים לתסמונת השחלות הפוליציסטיות (PCOS) ולטיפול בה באמצעות תמצית ZeLan. תרשים ההר געש ב- איור 6 מציג את התפלגות מאפייני המטבוליטים בין קבוצת המודל לקבוצת הביקורת, כאשר מאפיינים עם ביטוי מוגבר (upregulated) ומאפיינים עם ביטוי מופחת (downregulated) מודגשים על פי כיוון השינוי (fold-change) והמובהקות הסטטיסטית. סך של 52 מאפייני מטבוליטים מזוהים נשמרו בטבלת הדיווח המטבולומית המלאה עבור ההשוואה בין קבוצת המודל לקבוצת הביקורת. הרשימה המלאה, הכוללת את שם המטבוליט, מזהה HMDB, סיווג ביוכימי, ערך log2 fold change, ערך P וכיוון הרגולציה, מסופקת כ- טבלה נלווית 1. טבלה 3 מציג מטבוליטים מייצגים ומכוונים בעלי רלוונטיות ביולוגית גבוהה לתסמונת השחלות הפוליציסטיות (PCOS).

טבלה 3 מסכמת מטבוליטים מבדלים מרכזיים מייצגים עם ציוני VIP גבוהים ורלוונטיות ביולוגית לפתופיזיולוגיה של PCOS. הורמונים סטרואידיים, כולל testosterone (VIP = 2.56, P < 0.001) ו-androstenedione (VIP = 2.34, P < 0.001), היו מוגברים באופן משמעותי בבעלי חיים במודל PCOS, בהתאם למצב ההיפראנדרוגני המאפיין מצב זה. גם מטבוליזם של חומצות שומן הופר, כאשר palmitic acid (VIP = 2.12) ו-arachidonic acid (VIP = 1.89) הראו עליות משמעותיות, בעוד שהמתווך הליפי הפרו-דלקתי prostaglandin E2 הוגבר באופן דומה (VIP = 2.05). לעומת זאת, מטבוליטים הקשורים לפעילות מיקרוביאלית מועילה במעי היו מופחתים בבעלי חיים עם PCOS: lithocholic acid, חומצה מרה שניתית המיוצרת באמצעות ביו-טרנספורמציה מיקרוביאלית, פחתה באופן משמעותי (VIP = 2.45), וכך גם חומצת השומן קצרה-השרשרת butyric acid (VIP = 2.21). בנוסף, succinic acid והחומצה האמינו חיונית L-tryptophan הראו ירידות בקבוצת המודל, מה שמרמז על פגיעה בתסיסה מיקרוביאלית ומטבוליזם משתנה של חומצות אמינו.

ניתוח העשרה של מסלולי KEGG

ניתוח העשרה של מסלולים באמצעות מאגר הנתונים KEGG חשף מספר מסלולים מטבוליים בסרום שהיו מושפעים באופן משמעותי ב-PCOS וסבלו משינויים בעקבות טיפול ב-ZeLan. כפי שמתואר ב-איור 7, ביוסינתזה של הורמונים סטרואידיים הופיעה כמסלול המועשר ביותר באופן משמעותי (Rich Factor = 0.80, P < 0.01), באופן העולה בקנה אחד עם הפנוטיפ ההיפראנדרוגני של PCOS. מסלול הסטרואידוגנזה השחלאית היה מועשר במידה גבוהה באופן דומה (Rich Factor = 0.75, P < 0.01), מה שמשקף את מעורבותה של סינתזת אנדרוגנים משובשת בתפקוד לקוי של השחלה. ביוסינתזה של חומצות מרה ראשוניות הראתה העשרה משמעותית (Rich Factor = 0.62, P < 0.02), המצביעה על הפרעה במחזור חומצות המרה האנטרו-הפתי שעשויה להיות קשורה לשינויים במיקרוביוטת המעי. מטבוליזם של חומצה ארכידונית (Rich Factor = 0.56, P < 0.03) ומסלול עמידות לאינסולין (Rich Factor = 0.40, P < 0.04) היו גם הם מועשרים באופן משמעותי, מה שתומך בנוכחות של הפרעות דלקתיות ומטבוליות האופייניות ל-PCOS. מסלול ביוסינתזה של חומצות שומן הראה העשרה מתונה (Rich Factor = 0.30), מה שמרמז על מעורבות של הפרה בבקרת המטבוליזם של ליפידים.

ניתוח קורלציה בין המיקרוביום למטבולום

כדי להעריך קשרים תפקודיים בין הרכב מיקרוביוטת המעי לבין שינויים מטבוליים, בוצע ניתוח מתאם Spearman עם בקרת שיעור גילויים שגויים (false-discovery rate) בין סוגים של חיידקים בעלי שפע שונה לבין מטבוליטים מרכזיים. מפת החום של המתאמים, המאורגנת במקבצים היררכיים ומוצגת ב-איור 8 , חושפת תבניות מובחנות של קשרים בין המיקרוביוטה למטבולום. חיידקים מועילים, הכוללים את Lactobacillus ו-Ruminococcus, הראו מתאמים חיוביים חזקים עם lithocholic acid (r = 0.72 ו-0.68, בהתאמה) ועם butyric acid (r = 0.65 ו-0.60, בהתאמה), בעוד שהראו מתאמים שליליים עם testosterone (r = -0.75 ו-0.80-) ו-androstenedione (r = -0.68 ו-0.72-). ממצאים אלו מרמזים כי חיידקים מועילים שזוהו בניתוח הטקסונומי היו קשורים למטבוליטים הקשורים לאנדרוגנים ולפעילות מטבולית הקשורה ל-SCFA.

לעומת זאת, הסוגים Bacteroides, Prevotella ו-Escherichia הקשורים ל-PCOS הראו דפוסי מתאם הפוכים. חיידקים אלו היו במתאם חיובי עם טסטוסטרון (r = 0.85, 0.82 ו-0.60, בהתאמה), אנדרוסטנדיון (r = 0.78, 0.75 ו-0.55) וחומצה פלמיטית (r = 0.65, 0.60 ו-0.45), בעוד שהם הראו מתאמים שליליים עם מטבוליטים מועילים, כולל חומצה ליתוכולית וחומצה בוטירהטית. דפוסי מתאם אלו תומכים בקשרים פונקציונליים בין טקסונומיות מיקרוביאליות ספציפיות במעי לבין ההפרעות המטבוליות האופייניות ל-PCOS, אך הם אינם מבססים סיבתיות ישירה.

זמינות נתונים:

מערכי הנתונים שהופקו ונותחו במהלך מחקר זה כוללים מטא-נתונים של דגימות, נתוני מקור של פנוטיפ, מדדי alpha-diversity של 16S, סיכומי שכיחות ברמת phylum, תוצאות של טקסונים חיידקיים דיפרנציאליים, טבלאות ניתוח דיפרנציאלי של מטבוליזם, תוצאות של מטבוליטים נבחרים, תוצאות העשרה של נתיבי KEGG, ומטריצת מתאם בין המיקרוביוטה למטבוליטים. נתוני מקור אלו מסופקים כSupplementary File 1 המצורף. מערך הנתונים המעובד של המטבוליטים הדיפרנציאליים מסופק כSupplementary Table 1.

תרשים ציר זמן ניסויי המציג את קבוצות הביקורת, המודל ו-ZeLan עם הזרקות DHEA ואיסוף דגימות.
איור 1: עיצוב ניסויי וציר זמן הטיפול. איור סכמטי של זרימת העבודה הניסויית המציג תקופת אקלמיזציה של 7 ימים, תקופת הזרקות של DHEA או vehicle למשך 21 ימים, טיפול בתמצית ZeLan או vehicle למשך 28 ימים, ואיסוף סופי של דגימות סרום וצואה ביום ה-56 לפרוטוקול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

תרשימי קופסה של טסטוסטרון בנסיוב, יחס LH/FSH, משקל גוף; השוואה בין קבוצת הביקורת, המודל ו-ZeLan.
איור 2: השפעות של תמצית ZeLan על פרמטרים אנדוקריניים ומטבוליים. תרשימי קופסה המראים (A) ריכוז טסטוסטרון בנסיוב, (B) יחס LH/FSH, ו-(C) משקל גוף בקבוצות הביקורת (Control), המודל (Model) והטיפול ב-ZeLan לאחר תקופת ההתערבות. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים קופסה להשוואת מדד שאנון; קבוצות ביקורת, מודל ו-ZeLan; תוצאות ניתוח מגוון.
איור 3: מגוון אלפא של מיקרוביומה במעי. השוואה של מדד מגוון שאנון בין קבוצת הביקורת, קבוצת המודל וקבוצת הטיפול ב-ZeLan, הממחישה הבדלים במגוון אלפא של מיקרוביומה במעי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים עמודות של הרכב מיקרוביאלי; שכיחות של מפתחות (phyla) בקבוצות ה-Control, Model ו-ZeLan; ניתוח מיקרוביום.
איור 4: הרכב מיקרוביוטת המעי ברמת המפה (phylum). תרשים עמודות מוערם המציג את השכיחות היחסית של המפות הבקטריאליות השולטות במיקרוביוטת המעי של קבוצות ה-Control, Model והטיפול ב-ZeLan. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח מיקרוביום, תרשים עמודות של ציון LDA המראה העשרה של סוגים (genera) בקבוצת הביקורת ובקבוצת המודל.
איור 5: טקסונים בקטריאליים דיפרנציאליים שזוהו על ידי ניתוח LEfSe. ניתוח גודל אפקט של אנליזה מבדילה ליניארית (LEfSe) המזהה סוגים בקטריאליים המבדילים בין קבוצת הביקורת לקבוצת המודל. ציוני LDA מציינים את גודל האפקט של טקסונים בעלי שפע דיפרנציאלי. שינויים הקשורים ל-ZeLan מתוארים בתוצאות על בסיס שינויי שפע ביחס לקבוצת המודל. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים Volcano המציג ניתוח ביטוי גנים; log2 fold change מול -log10 p-value.
איור 6: פרופיל מטבוליטים דיפרנציאלי. תרשים Volcano המציג מאפייני מטבוליטים דיפרנציאליים בין קבוצת המודל לקבוצת הביקורת. נקודות אדומות וכחולות מייצגות מאפייני מטבוליטים עם עלייה (upregulated) וירידה (downregulated) משמעותית בביטוי, בהתאמה, בהתבסס על fold change ומובהקות סטטיסטית. אנא לחץ כאן להצגת גרסה מוגדלת של איור זה.

תרשים בועות (dot plot) של ניתוח מסלולים; גודל הבועה מציין את הכמות; הצבע מראה את ערך ה-p-value; צירים: Rich Factor מול מסלול (Pathway).
איור 7ניתוח העשרה של נתיבי KEGG. תרשים בועות (Bubble plot) המציג מסלולים מטבוליים שהועשרו באופן מובהק, אשר זוהו מתוך מטבוליטים דיפרנציאליים. גודל הבועה מייצג את מספר המטבוליטים שמופו, וצבע הבועה מציין את המובהקות הסטטיסטית (P-value) של העשרת המסלול. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

תרשים מפת חום של מתאמים בין מיקרובים למטבוליטים; ניתוח נתונים של מיקרוביוטת המעי.
איור 8: מתאם בין מיקרוביוטת המעי למטבוליטים בסרום. מפת חום המבוססת על מקבץ היררכי המציגה מקדמי מתאם של Spearman בין סוגים של חיידקים בעלי שפע דיפרנציאלי לבין מטבוליטים נבחרים בסרום. צבע אדום מציין מתאמים חיוביים, בעוד שצבע כחול מציין מתאמים שליליים. אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

קבוצהNמשקל גוף (ג')טסטוסטרון (ng/mL)יחס LH/FSHאינסולין (mIU/L)
ביקורת8227.45 ± 10.120.51 ± 0.051.25 ± 0.1112.55 ± 1.12
מודל8291.12 ± 15.35a1.85 ± 0.21a 3.28 ± 0.25a28.95 ± 2.35a
ZeLan8245.25 ± 10.21b0.92 ± 0.12b1.85 ± 0.15b18.82 ± 1.55b
הערה: הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD). a = p < 0.05 בהשוואה לקבוצת הביקורת; b = p < 0.05 בהשוואה לקבוצת המודל (Model group).

טבלה 1: פרמטרים אנדוקריניים ומטבוליים בחולדות עם PCOS. משקל גוף, רמות טסטוסטרון בנסיוב, יחס LH/FSH ורמות אינסולין בצום נמדדו בקבוצת הביקורת, בקבוצת המודל ובקבוצת הטיפול ב-ZeLan. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD.

קבוצהמדד שאנוןמדד סימפסוןמעריך Chao1
ביקורת6.51 ± 0.280.98 ± 0.011215.3 ± 45.4
מודל4.19 ± 0.35a0.82 ± 0.03a665.8 ± 52.1a
ZeLan5.79 ± 0.26b0.93 ± 0.02b963.5 ± 38.6b
הערה: הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SD). a = p < 0.05 בהשוואה לקבוצת הביקורת; b = p < 0.05 בהשוואה לקבוצת המודל.

טבלה 2: מדדי alpha diversity של מיקרוביומ המעי. השוואה של מדד Shannon, מדד Simpson ומעריך Chao1 בין קבוצת הביקורת (Control), קבוצת המודל (Model) וקבוצות הטיפול ב-ZeLan. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD.

שם המטבוליטHMDB IDסוג/מחלקהמגמה (מודל מול ביקורת)p-valueציון VIP
TestosteroneHMDB0000286סטרואידעלייה ↑< 0.0012.56
AndrostenedioneHMDB0000055סטרואידעלייה ↑< 0.0012.34
Palmitic acidHMDB0000220חומצת שומןעלייה ↑< 0.0012.12
Arachidonic acidHMDB0001043חומצת שומןעלייה ↑0.0031.89
Prostaglandin E2HMDB0001036ליפידעלייה ↑< 0.0012.05
Lithocholic acidHMDB0000752חומצת מרהירידה ↓< 0.0012.45
Butyric acidHMDB0000039SCFAירידה ↓< 0.0012.21
Succinic acidHMDB0000254חומצה אורגניתירידה ↓0.0211.65
L-TryptophanHMDB0000929חומצה אמיניתירידה ↓0.0151.58
הערה: VIP = Variable Importance in Projection (ערך של VIP > 1 נחשב למשמעותי).

טבלה 3: מטבוליטים דיפרנציאליים מייצגים בסרום. מטבוליטים רפרנטיביים מזוהים הקשורים לתסמונת השחלות הפוליציסטיות (PCOS) והמוסדרים על ידי תמצית ZeLan, כולל מזהי HMDB, סיווג מטבוליטים, מגמת ויסות, ערך P וציון VIP. הרשימה המלאה של 52 מאפייני מטבוליטים מזוהים מופיעה ב- טבלה נלווית 1.

טבלה נלווית 1: מערך נתונים מלא של מטבוליטים מאונוטטים. רשימה מלאה של 52 מאפייני מטבוליטים מאונוטטים שנשמרו לדיווח מטבולומי, הכוללת את שם המטבוליט, מזהה HMDB, סיווג ביוכימי, fold change, ערך P, וכיוון רגולציה.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 1: נתוני מקור התומכים בניתוחים הניסויים, המיקרוביומיים והמטבוליים. חוברת עבודה זו מכילה את מידע הדגימות, מדידות פנוטיפ קליני, מדדי גיוון של ריצוף 16S rRNA, שפע יחסי של מיקרובים ברמת המערכה (phylum), ניתוח טקסונים דיפרנציאליים באמצעות LEfSe, ניתוח מטבולי דיפרנציאלי, מטבוליטים מייצגים, ניתוח העשרה של נתיבי KEGG, נתוני מטריצת מתאם וסיכום אימות נתונים ששימשו ליצירת האיורים והטבלאות המוצגים במאמר.אנא לחצו כאן להורדת קובץ זה.

דיון

המחקר הנוכחי מספק ראיות לכך שמיצוי ZeLan משפר פנוטיפים אנדוקרינים ומטבוליים הקשורים לתסמונת השחלה הפוליציסטית (PCOS) במודל חולדות ש प्रेरित על ידי DHEA, וכי השפעות אלו קשורות לשינויים חיוביים בהרכב מיקרוביוטת המעי ובפרופילים מטבוליים של הסרום. גישת מולטי-אומיקה משולבת הראתה כי טיפול ב-ZeLan שיפר היפראנדרוגנמיה, יחס LH/FSH מוגבר ותנגודת לאינסולין, תוך השבה חלקית של שונות אלפא (alpha diversity) של מיקרוביוטת המעי, איזון מחדש של הרכב המיקרובים ונרמול של מספר מסלולים מטבוליים המעורבים בפתופיזיולוגיה של PCOS. ממצאים אלו מרחיבים את ההבנה הנוכחית של תגובות ביולוגיות לתרופות בוטניות מסורתיות רפואת סין ותומכים בחקירה נוספת של ציר המעי-שחלה כיעד פוטנציאלי להתערבות ב-PCOS.

הירידה ברמות הטסטוסטרון בסרום וביחס LH/FSH בעקבות טיפול ב-ZeLan עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים שהדגימו תכונות אנטי-אנדרוגניות של תמציות בוטניות המכילות פלבונואידים ותרכובות פנוליות16. סקירה מקיפה של מחקרים קליניים על רפואה צמחית לטיפול ב-PCOS סיכמה שיפורים אנדוקריניים ומטבוליים על פני התערבויות בוטניות שונות17. המנגנון שבאמצעותו ZeLan מווסת את הביוסינתזה של אנדרוגנים עשוי לכלול השפעות ישירות על מסלולים סטרואידוגניים בשחלה, השפעות אנטי-דלקתיות סיסטמיות והשפעות המרגישות לאינסולין, או השפעות עקיפות הקשורות למטבוליטים של מיקרוביומת המעי, והניסוי הנוכחי אינו יכול להפריד באופן מלא בין אפשרויות אלו. השיפור ביחס LH/FSH מעיד על שחזור חלקי של תפקודי ציר ההיפותלמוס-היפופיזה-הגונדס, אשר לרוב אינו מאוזן ב-PCOS18. סקירות שיטתיות של ניסויי בעלי חיים על פורמולות של רפואה סינית מסורתית ל-PCOS דיווחו אף הן על שיפורים במדדים רבייתיים ואנדוקריניים19. השיפור המקבילי במדדים הקשורים לאינסולין מרמז כי ZeLan עשוי להסב יתרונות מטבוליים מעבר לוויסות אנדוקריני, פוטנציאלית באמצעות הגברת סיגנל האינסולין הפריפרי או הפחתת מתווכי דלקת הפוגעים בתפקוד קולטני האינסולין20.

השחזור של גיוון אלפא (alpha diversity) של מיקרוביום המעי בעקבות טיפול ב-ZeLan עקבי עם תגובה הקשורה למיקרוביום. הירידה בגיוון אלפא שנצפתה בחולדות במודל של PCOS עקבית עם גוף הספרות הגדל המתעד דיסביוזה של המעי הן במודלים ניסיוניים של PCOS והן באוכלוסיות קליניות21. Insenser ואחרים דיווחו עוד כי פרופילי מיקרוביוטת המעי ב-PCOS מושפעים ממין, הורמוני מין והשמנה22. התצפית שלנו, לפיה טיפול ב-ZeLan שחזר חלקית את מדד שנון (Shannon index) מ-4.19 ל-5.79, מרמזת כי תמצית בוטנית זו עשויה לתמוך במבנה הקהילה המיקרוביאלית. השפעות דומות של שחזור גיוון דווחו עבור תמציות צמחים אחרות העשירות בפוליפנולים, העשויות לעודד באופן סלקטיבי אוכלוסיות חיידקים מועילות תוך דיכוי טקסונומיות פתוגניות פוטנציאליות23. השינויים הטקסונומיים שנצפו ברמת המערכה (phylum), ובמיוחד הירידה ביחס בין Firmicutes ל-Bacteroidetes בעקבות טיפול ב-ZeLan, רלוונטיים לאור הקשר המקובל בין יחסי F/B מוגברים לבין תפקוד מטבולי לקוי, כולל השמנה ותנגודת לאינסולין24. מחקרים נוספים, כולל עבודתם של Jobira ואחרים בבני נוער עם PCOS, דיווחו על שינויים במגוון הביולוגי המיקרוביאלי במערכת העיכול, מה שמחזק את הרלוונטיות הביולוגית של ההרכב המיקרוביאלי למטבוליזם של המארח25.

זיהוי סוגים בקטריאליים ספציפיים הקשורים באופן דיפרנציאלי ל-PCOS ולטיפול ב-ZeLan מספק הקשר ביולוגי לקשרי המיקרוביוטה-מטבולם שנצפו במחקר זה. העשירה של Lactobacillus ו-Ruminococcus בביקרות בריאות והירידה שלהם בבעלי חיים עם PCOS עולים בקנה אחד עם דיווחים קודמים המדגישים את תפקידיהם המגנים של סוגים אלו26. מיני Lactobacillus מוכרים בזכות ייצורם של חומצה לקטית ופפטידים אנטימיקרוביאליים השומרים על שלמות מחסום המעי ומדכאים בקטריות פתוגניות, בעוד שמיני Ruminococcus הם יצרנים חשובים של חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFA) באמצעות תססור של סיבים תזונתיים27. השחזור של סוגים מועילים אלו בעקבות טיפול ב-ZeLan עשוי לשפר את תפקוד מחסום המעי ולהגביר את הפעילות המטבולית הקשורה ל-SCFA, כפי שמשתקף ברמות המוגברות של חומצה בוטירית שנצפו בניתוח המטבולי. לעומת זאת, השכיחות המוגברת של Bacteroides, Prevotella ו-Escherichia בבעלי חיים עם PCOS תואמת למחקרים המקשרים סוגים אלו להפרעות דלקתיות ומטבוליות28. מיני Escherichia, ובמיוחד Escherichia coli, יכולים לייצר ליפופוליסכריד, שעשוי לעורר דלקת מערכתית ועמידות לאינסולין באמצעות סיגנלינג של קולטן מסוג Toll-like receptor 4, מה שמייצג קשר סביר בין דיסביוזיס במעי לבין תפקוד מטבולי לקוי הקשור ל-PCOS29.

הממצאים המטבולומיים מספקים ראיות לקשרים מטבוליים בין מיקרוביוטת המעי למארח הנלווים לטיפול ב-ZeLan. שינויים בחומצות מרה משניות, כגון lithocholic acid, הם רלוונטיים מבחינה ביולוגית מכיוון שמטבוליטים אלו נוצרים באמצעות פעילות אנזימטית בקטריאלית30. חומצות מרה מתפקדות לא רק בספיגת ליפידים, אלא גם כמולקולות איתות המווסתות את חילוף הגלוקוז והליפידים באמצעות farnesoid X receptor ו-Takeda G protein-coupled receptor 5, מה שמרמז כי נורמליזציה של פרופילי חומצות המרה עשויה לתרום לשיפור ההומאוסטזיס המטבולי. באופן דומה, השחזור של רמות butyric acid הוא רלוונטי בהתחשב בהשפעותיו המיטיבות הרבות, הכוללות שיפור של תפקוד מחסום המעי, תכונות אנטי-דלקתיות וקידום רגישות לאינסולין. המתאמים שנצפו בין חיידקים מועילים למטבוליטים מגינים, לעומת קשרים בין חיידקים פתוגניים למטבוליטים מזיקים, מספקים תמיכה אסוציאטיבית להיפותזת ציר המעי-שחלה, תוך הדגשת הצורך בתיקוף מכניסטי ישיר.

יש לפרש את ההשלכות הקליניות של ממצאים אלו במסגרת המגבלות של תכנון מחקר פרה-קליני גישש. התוצאות תומכות בהערכה נוספת של תמצית ZeLan כגישה משלימה לניהול PCOS, ובמיוחד בהקשר של התערבויות בוטניות שעשויות להשפיע הן על מדדים אנדוקריניים-מטבוליים והן על המיקרו-סביבה של המעי. זיהוי של סמנים ביולוגיים מיקרוביאליים ומטבוליים הקשורים לתגובה לטיפול עשוי לסייע בהכוונת מחקרים מכניסטיים ותרגומיים עתידיים. בנוסף, ציר המעי-שחלה עשוי בסופו של דבר לתמוך באסטרטגיות שילוב המשלבות ZeLan עם פרוביוטיקה או שינויים תזונתיים, אך אסטרטגיות אלו דורשות תיקוף מבוקר לפני יישום קליני.

מספר מגבלות של המחקר הנוכחי מחייבות הכרה. ראשית, בעוד שמודל החולדה המושרה על ידי DHEA משחזר מספר מאפיינים של PCOS בבני אדם, הוא אינו לוכד באופן מלא את ההטרוגניות של פנוטיפים של PCOS בבני אדם, כולל תת-סוגים רזים, מעובים, עמידים לאינסולין ודלקתיים; לפיכך, תרגום קליני דורש תיקוף באוכלוסיות חולים מאופיינות היטב. שנית, המחקר השתמש במינון בודד של ZeLan ללא מדרג של תגובת-מינון או בקרת תרופה חיובית כגון metformin, כך שטווח המינון היעיל, היעילות ההשוואתית ומחזור המתן האופטימלי טרם נקבעו. שלישית, הדגימה בוצעה רק בנקודת הסיום, מה שמגביל את הפרשנות של שינויים זמניים דינמיים במיקרוביוטה, במטבוליטים ובפרופילים הורמונליים במהלך תקופת ההתערבות. רביעית, היסטופתולוגיה של השחלה, ספירת זקיקים, כימות של גוף צהוב וניטור סדרתי של מחזור ה regularity של ה-estrous לא נכללו בעיצוב ניסיוני זה; לכן, התאוששות תפקודית שחלתית הוסקה ממדדים אנדוקריניים ומטבוליים ולא מהערכה ישירה ברמת הרקמה וברמת המחזור. חמישית, המחקר זיהה מתאמים בין טקסונים מיקרוביאליים למטבוליטים אך לא כלל השתלת מיקרוביוטה צואית, ניסויים בבעלי חיים נטולי גורמים מיקרוביאליים (germ-free), תוספת מטרתית של מטבוליטים, בדיקות סממני דלקת או מדידות של אנזימים סטרואידוגניים שחלתיים כגון CYP17A1, CYP19A1 ו-StAR; כתוצאה מכך, לא ניתן לאשש מנגנונים סיבתיים מהנתונים הנוכחיים. שישית, מטבולומיקה לא-מכוונת מספקת ראיות ברמת גילוי, ותיקוף כמותי מטרתי של מטבוליטים מרכזיים כגון lithocholic acid, butyric acid ו-testosterone נדרש בעבודות עתידיות. שביעי, ויזואליזציה של beta-diversity, חיזוי תפקודי מיקרוביאלי ומידול אינטגרטיבי של מסלולי מיקרוביוטה-מטבוליט-גן לא היו זמינים להגשה הנוכחית, מה שמגביל את היכולת לבנות רשת רגולטורית מלאה. לבסוף, תמצית ZeLan תוקננה לפי תכולת פלבנואידים כוללת, אך נדרש עדיין אפיון פיטוכימי איכותי וכמותי מקיף של מונומרים פעילים.

לסיכום, תמצית ZeLan שיפרה פנוטיפים אנדוקריניים ומטבוליים הקשורים ל-PCOS במודל של חולדות, והייתה קשורה לשקום חלקי של גיוון אלפא של מיקרוביומ המעי, שינוי בהרכב המיקרוביאלי וסינון של מסלולים מטבוליים בסרום, כולל ביוסינתזה של הורמוני סטרואידים, מטבוליזם של חומצות מרה ומטבוליזם הקשור לחומצות שומן קצרות שרשרת. המתאמים שנצפו בין חיידקים מועילים למטבוליטים מגנים, בניגוד לקשרים בין חיידקים המועשרים ב-PCOS למטבוליטים מזיקים, תומכים בקשר סביר ביולוגית של ציר מעי-שחלה. ממצאים אלו מספקים בסיס למחקרי מנגנון ומחקרי תרגום עתידיים של תמצית ZeLan בניהול PCOS, תוך הדגשת הצורך באישוש סיבתי ואפיון פיטוכימי רחב יותר.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

מחקר זה מומן על ידי פרויקט תכנון המחקר המדעי של מנהלת הרפואה הסינית המסורתית של מחוז חביי  (מענק מס׳ 2021316).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אצטוניטרילFisher Chemical / Thermo Fisher ScientificA955-4בדרגת Optima LC-MS, 4 ליטר; פאזה ניידת ושחזור דגימות
עמודת ACQUITY UPLC HSS T3Waters Corporation186003539100 Å, 1.8 μm, 2.1 × 100 מ"מ; הפרדת UHPLC
מערכת אלקטרופורזה בג'ל אגרוזBio-Rad Laboratories1704486מערכת אלקטרופורזה אופקית Mini-Sub Cell GT; הערכת איכות DNA
Agilent 1290 Infinity II/6550 UHPLC-Q-TOF-MSAgilent TechnologiesG7120A/G7167B/G7116B/G6550Bסט מודולים של 1290 Infinity II UHPLC המחובר ל-6550 iFunnel Q-TOF MS; פלטפורמה למטבוליקה לא מכוונת (untargeted metabolomics) של סרום
אלגוריתם DADA2Bioconductorגרסה 1.24.0יצירת ASV והסרת כימרות; גרסה המותאמת לזרימת העבודה של R 4.2.1/Bioconductor 3.15
דהידרו-אפיאנדרוסטרון (DHEA)Sigma-Aldrich / MilliporeSigmaD4000השראה של מודל PCOS; 6 מ"ג/100 גרם משקל גוף; CAS 53-43-0
מים מזוקקיםInvitrogen / Thermo Fisher Scientific10977015מים מזוקקים UltraPure נקיים מ-DNase/RNase; נושאי חומר למתן דרך הפה (oral gavage) בקבוצות הביקורת ובקבוצות המודל
חומצה פורמיתFisher Chemical / Thermo Fisher ScientificA117-50בדרגת Optima LC-MS, 50 מ"ל; תוסף 0.1% עבור פאזות ניידות ב-LC-MS
מאגר המטבולום האנושיאוניברסיטת אלברטה / HMDBHMDB 5.0מאגר נתונים לאנוטציה של מטאבוליטים
פלטפורמת Illumina NovaSeq 6000Illumina20012850מערכת ריצוף המשמשת ספק שירותי ריצוף עבור ריצוף 16S rRNA בשיטת קצוות כפולים (paired-end) באורך 250 bp
צמח Lycopus lucidus Turcz.Beijing Tongrentang Chinese Medicine Co., Ltd.סדרה ZL-20230315חומר גלם בוטני מאושר עבור תמצית מימית של ZeLan
מתנולFisher Chemical / Thermo Fisher ScientificA456-4בדרגת Optima LC-MS, נפח 4 ליטר; שיקוע חלבונים עבור מטבוליקה של סרום
מאגר הנתונים METLINScripps ResearchMETLIN Classic 2023מאגר נתונים לאנוטציה של ספקטרומטריית מסות של מטבוליטים
ספקטרופוטומטר NanoDropThermo Fisher ScientificND-ONE-Wספקטרופוטומטר UV-Vis למיקרו-נפחים NanoDrop One; הערכת כמות וטוהר של DNA
QIAamp Fast DNA Stool Mini KitQiagen51604מיצוי DNA מתכני העקום; ערכה למיצוי DNA מצואה עבור 50 דגימות
QIIME2צוות הפיתוח של QIIME2גרסה 2022.2עיבוד רצפי 16S rRNA
תוכנת RR Foundationגרסה 4.2.1ניתוח סטטיסטי ועיבוד באמצעות XCMS
ערכות ELISA לסרום עבור טסטוסטרון, LH, FSH ואינסוליןCusabio BiotechCSB-E05100r; CSB-E12654r; CSB-E06869r; CSB-E05070rערכות ELISA לטסטוסטרון, LH, FSH ואינסולין בחולדה לכימות הורמונים ואינסולין בסרום
שמן שומשוםSigma-Aldrich / MilliporeSigmaS3547נושאי הזרקה עבור DHEA
נתרן פנטובארביטאלSigma-Aldrich / MilliporeSigmaP3761הרדמה; 50 מ"ג/ק"ג פריטוניאלית
תוכנת SPSSIBM Corporationגרסה 26.0ניתוח סטטיסטי
פריימרים אוניברסליים ל-16S rRNA 338F/806RSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.סינתזה מותאמת אישית: 338F/806Rהגברה של אזורי V3-V4; 338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG, 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT
חבילת XCMSBioconductor / Rגרסה 3.18.0זיהוי שיאים, יישור זמני מעכבה ואינטגרציה
תמצית ZeLanתמצית מימית שהוכנה במעבדהסדרה ZLE-20230402טיפול באמצעות זריקה פהית (Gavage); פלבנואידים סהריים סטנדרטיים ≥2.5%

מקורות

  1. Joham AE, Norman RJ, Stener-Victorin E, et al. Polycystic ovary syndrome. Lancet Diabetes Endocrinol. 2022;10(9):668-680.
  2. Islam H, Masud J, Islam YN, et al. An update on polycystic ovary syndrome: a review of the current state of knowledge in diagnosis, genetic etiology, and emerging treatment options. Womens Health (Lond). 2022;18:17455057221117966.
  3. Azziz R, Carmina E, Chen Z, et al. Polycystic ovary syndrome. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16057.
  4. Fahs D, Salloum D, Nasrallah M, et al. Polycystic ovary syndrome: pathophysiology and controversies in diagnosis. Diagnostics (Basel). 2023;13(9):1559.
  5. Conway G, Dewailly D, Diamanti-Kandarakis E, et al. The polycystic ovary syndrome: a position statement from the European Society of Endocrinology. Eur J Endocrinol. 2014;171(4):P1-P29.
  6. Huddleston HG, Dokras A. Diagnosis and treatment of polycystic ovary syndrome. JAMA. 2022;327(3):274-275.
  7. Zhang J, Xin X, Zhang H, et al. The efficacy of Chinese herbal medicine in animal models of polycystic ovary syndrome: a systematic review and meta-analysis. Evid Based Complement Alternat Med. 2022;2022:4892215.
  8. Chen J, Na E, Lim SY. Effect of fractions from Lycopus lucidus Turcz. leaves on genomic DNA oxidation and matrix metalloproteinase activity. Comb Chem High Throughput Screen. 2022;25(10):1778-1784.
  9. Ślusarczyk S, Hajnos M, Skalicka-Woźniak K, et al. Antioxidant activity of polyphenols from Lycopus lucidus Turcz. Food Chem. 2009;113(1):134-138.
  10. Qi X, Yun C, Sun L, et al. Gut microbiota-bile acid-interleukin-22 axis orchestrates polycystic ovary syndrome. Nat Med. 2019;25(8):1225-1233.
  11. He FF, Li YM. Role of gut microbiota in the development of insulin resistance and the mechanism underlying polycystic ovary syndrome. J Ovarian Res. 2020;13(1):73.
  12. Chadchan SB, Singh V, Kommagani R. Female reproductive dysfunctions and the gut microbiota. J Mol Endocrinol. 2022;69(3):R81-R94.
  13. Puspitasari VD, Lestari ES, Pramono N. Testosterone induced Wistar rat model for gut microbiota dysbiosis of polycystic ovarian syndrome research. J Indones Med Assoc. 2024;74(3):132-140.
  14. Zhang J, Sun Z, Jiang S, et al. Probiotic Bifidobacterium lactis V9 regulates the secretion of sex hormones in polycystic ovary syndrome patients. mSystems. 2019;4(2):e00017-19.
  15. Xuan Y, Hong X, Zhou X, et al. The vaginal metabolomics profile with features of polycystic ovary syndrome: a pilot investigation in China. PeerJ. 2024;12:e18194.
  16. Hu M, Zhang Y, Guo X, et al. Hyperandrogenism and insulin resistance induce gravid uterine defects in association with mitochondrial dysfunction and aberrant ROS production. Endocrinology. 2019;160(9):2208-2223.
  17. Moini Jazani A, Nasimi Doost Azgomi H, Nasimi Doost Azgomi A, et al. A comprehensive review of clinical studies with herbal medicine on polycystic ovary syndrome (PCOS). DARU J Pharm Sci. 2019;27(2):863-877.
  18. McCartney CR, Marshall JC. Polycystic ovary syndrome. N Engl J Med. 2016;375(1):54-64.
  19. Cui Y, Zhang C, Li X, et al. Systematic review and meta-analysis of animal experiments on Bushen formulas for the treatment of polycystic ovary syndrome. Sci Rep. 2025;15(1):7648.
  20. Thackray VG. Sex, microbes, and polycystic ovary syndrome. Trends Endocrinol Metab. 2019;30(1):54-65.
  21. Torres PJ, Siakowska M, Banaszewska B, et al. Gut microbial diversity in women with polycystic ovary syndrome correlates with hyperandrogenism. J Clin Endocrinol Metab. 2018;103(4):1502-1511.
  22. Insenser M, Murri M, Del Campo R, et al. Gut microbiota and the polycystic ovary syndrome: influence of sex, sex hormones, and obesity. J Clin Endocrinol Metab. 2018;103(7):2552-2562.
  23. Guo Y, Qi Y, Yang X, et al. Association between polycystic ovary syndrome and gut microbiota. PLoS One. 2016;11(4):e0153196.
  24. Liu R, Zhang C, Shi Y, et al. Dysbiosis of gut microbiota associated with clinical parameters in polycystic ovary syndrome. Front Microbiol. 2017;8:324.
  25. Jobira B, Frank DN, Pyle L, et al. Obese adolescents with PCOS have altered biodiversity and relative abundance in gastrointestinal microbiota. J Clin Endocrinol Metab. 2020;105(6):e2134-e2144.
  26. Bai X, Ma J, Wu X, et al. Impact of visceral obesity on structural and functional alterations of gut microbiota in polycystic ovary syndrome (PCOS): a pilot study using metagenomic analysis. Diabetes Metab Syndr Obes. 2023;16:1-14.
  27. Rizk MG, Thackray VG. Intersection of polycystic ovary syndrome and the gut microbiome. J Endocr Soc. 2021;5(2):bvaa177.
  28. He S, Li H, Yu Z, et al. The gut microbiome and sex hormone-related diseases. Front Microbiol. 2021;12:711137.
  29. Chu W, Han Q, Xu J, et al. Metagenomic analysis identified microbiome alterations and pathological association between intestinal microbiota and polycystic ovary syndrome. Fertil Steril. 2020;113(6):1286-1298.
  30. Yurtdaş G, Akdevelioğlu Y. A new approach to polycystic ovary syndrome: the gut microbiota. J Am Coll Nutr. 2020;39(4):371-382.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ZeLan16S rRNAUHPLC Q TOF MS

מאמרים קשורים