הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מבחן Invitro לפירוק LpxC על ידי פרוטאז קשור לממברנה FtsH ומתאם LapB מ-Escherichia coli

173 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/71092

⸱

22 ביוני 2026

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Yale University School of Medicine, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

Escherichia coli מווסת את ביוסינתזת הליפופוליסכרידים (LPS) בעיקר על ידי שליטה בפירוק LpxC, הדאצטילז שמזרז את הצעד הראשון שמחויב בסינתזת LPS. מטרת הפרוטוקול היא להקים מבחן רגיש וכמותי לפירוק חוץ גופני עבור LpxC, תוך שימוש ב-AAA+ פרוטאז FtsH משוחזר ו-LapB מתאם בפרוטאוליפוסומים.

תקציר

פרוטוקול זה מציג בדיקה רגישה וכמותית לפירוק חוץ גופני של LpxC באמצעות פרוטאז FtsH של AAA+ (ATPase הקשור לפעילויות תאיות מגוונות) ו-LapB מתאם בפרוטאוליפוסומים. פרוטאזות AAA+ הן מכונות מולקולריות התלויות ב-ATP, השומרות על הומאוסטזיס חלבוני ומווסתות תהליכים תאיים מגוונים בציטופלזמה או בממברנות התאים. בהשוואה למקביליהם הציטופלזמטיים, פרוטאזות AAA+ הקשורות לממברנה עדיין מאופיינות בצורה לקויה בשל אתגרים טכניים בשיקום ומדידת פעילותם במבחנה. כאן, אנו משתמשים במערכת FtsH–LapB–LpxC כמודל לפיתוח מבחן פירוק מבוסס פלואורסצנציה בפרוטאוליפוסומים. FtsH ו-LapB מורכבים מחדש לפרוטאוליפוזומים כדי לחקות את סביבת הממברנה הטבעית, ו-LpxC מסומן קוולנטית עם הצבע הפלואורסצנטי Atto488. הפירוק מתחיל על ידי שילוב פרוטאוליפוזומים עם LpxC ו-ATP מסומנים ומסתיים בחומצה טריכלורואצטית (TCA). בדיקה מוצלחת מוגדרת על ידי עלייה תלויה בזמן בפלואורסצנציה בשבר הסופרנטנט המסיס לאחר שקיעת TCA, התואמת לשחרור קטעי פפטיד פלואורסצנטיים שנוצרים על ידי פרוטאוליזה של LpxC. אות זה מאפשר כימות ישיר של קצבי הידרדרות התחלתיים בתנאים מוגדרים. בהשוואה לבדיקות אלקטרופורזה מסורתיות מבוססות סודרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE), שיטה זו מספקת רגישות משופרת משמעותית ומאפשרת ניתוח קינטי כמותי. יתרה מזאת, מערכת הפרוטאוליפוזומים מאפשרת חקירה שיטתית של האופן שבו רכיבי חלבון, כגון מתאמים ואנטי-מתאמים, וכן הרכב הליפידים, משפיעים על פירוק LpxC. למרות שפותחה עבור מערכת FtsH–LapB–LpxC, בדיקה זו ניתנת להתאמה בקלות לפרוטאזות AAA+ הקשורות לממברנה ולתת-קרקעים, ומספקת פלטפורמה כללית לחקר פרוטאוליזה הקשורה לממברנה במבחנה.

מבוא

פרוטאזות AAA+ הן מכונות מולקולריות שמורות, התלויות ב-ATP, שממלאות תפקידים מרכזיים בבקרת איכות חלבונים ובפרטאוליזה רגולטורית 1,2. מכונות אלו מכילות טבעת הקסמרית של דומיין AAA+ ATPאזות, אשר מבצעת הידרוליזה של ATP, מזהה, פורשת ומעבירה את הסובסטרטים לתחום הפרוטאז המחוזי לצורך פירוק1. בעוד שפרוטאזות AAA+ ציטופלזמיות כמו ClpXP3 ו-Lon4 אופיינו בהרחבה באמצעות בדיקות מבוססות במבחנה, פרוטאזות AAA+ הקשורות לממברנה עדיין מובנות בצורה פחות מובנת יחסית. פער זה משקף במידה רבה את האתגרים הטכניים הקשורים לשחזור חלבוני ממברנה לסביבות שומן מוגדרות ולמדידה כמותית של פעילות הפרוטאוליטית שלהם במבחנה. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להקים מבחנים רגישים וכמותיים לחקירת הפעילות הפרוטאוליטית של פרוטאזות הקשורות לממברנה.

FtsH הוא הפרוטאז היחיד החיוני של AAA+ באשריצ'יה קולי ומשמש כפרוטוטיפ מסוג AAA+ הקשור לממברנה 5,6,7. ה-FtsH מעוגן לממברנה הפנימית באמצעות הליקסים טרנסממברניים בקצה N, ומפרק סט מגוון של תת-קרקעים ציטופלזמיים וקשורים לממברנה, ובכך מווסת בקרת איכות חלבוני ממברנה, תגובות לחץ והומאוסטזיס של שומנים 8,9,10,11. אחד הסובסטרטים המאופיינים ביותר שלו הוא LpxC, דה-אצטילאז מסיס שמזרז את השלב הראשון שמחויב לביוסינתזה של ליפופוליסכרידים (LPS) 12,13. פירוק יעיל של LpxC על ידי FtsH דורש את חלבון הממברנה LapB, הפועל כמתאם, לזהות את LpxC ולהעבירו לפרוטאז 14,15,16,17,18.

למרות חשיבותו הפיזיולוגית, ניתוח כמותי של פרוטאוליזה בתיווך FtsH במבחנה היה מוגבל, במיוחד עבור סובסטרטים ציטופלזמיים כגון LpxC. בדיקות פירוק מסורתיות במבחנה משתמשות ב-FtsH מטוהר במיצלות 13,19, שאינן מספקות את הסביבה הממברנית לפרוטאזת המעוגן בממברנה. בנוסף, בדיקות הפירוק נשענות לעיתים קרובות על זיהוי מבוסס SDS–PAGE של היעלמות מצע13, שיכול להיות עתיר עבודה, בעל תפוקה נמוכה ורגיש מספיק לניתוחים קינטיים. בשנים האחרונות, FtsH ששוחזר לביצלים שימש לחקר התדרדרות של תת-קרקעי ממברנה, כפי שפותח על ידי קבוצת20 של הידיוק הונג; עם זאת, מערכת דומה לניתוח מצעים ציטופלזמיים נותרה חסרה. כאן, אנו מתאימים את שיקום הביצל של הידאוק הונג לשיקום פרוטאוליפוזום כדי לחקות את סביבת הממברנה. בנוסף לכך, המצע המסיס במים LpxC מסומן בפלואורסצנציה, מה שמאפשר מדידה רגישה וכמותית של הקינטיקה של פירוק LpxC התלוי ב-FtsH/LapB במבחנה.

שיטה זו צריכה לשמש כאשר חוקרים צריכים למדוד באופן כמותי את הפרוטאוליזיס המתווך על ידי FtsH של תת-קרקעים מסיסים במים. היא מספקת מספר יתרונות על פני גישות קיימות. ראשית, גילוי מבוסס פלואורסצנציה של תוצרי פרוטאוליטיס, במקום היעלמות הסובסטרט, משפר משמעותית את הרגישות והטווח הדינמי, ומקל על השוואות כמותיות של פעילות פרוטאוליטית. שנית, השימוש בפרוטאוליפוזומים שומר על ההקשר הממברני הנדרש לתפקוד FtsH תוך מתן שליטה מדויקת על הרכב החלבונים והליפידים18. לבסוף, אף שפותח באמצעות מערכת FtsH–LapB–LpxC, פרוטוקול זה ניתן להתאמה בקלות לפרוטאזות AAA+ אחרות הקשורות לממברנה ולתת-החומרים הציטופלזמיים שלהן, הדורשים מנגנון פירוק הקשור לממברנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תיוג LpxC עם Atto488

  1. הכנת LpxC
    1. להוציא ולטהר חלבון LpxC כפי שדווח קודםלכן 18. החלף את הבופר של LpxC המטוהר מ-Tris ל-50 mM Fosphate buffer, pH 7.6 (6 mM NaH2PO4, 44 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) בסינון ג'ל באמצעות עמודת סינון ג'ל ברזולוציה גבוהה (למשל, עמודת Superdex 200 Increase 10/300 GL).
    2. רכז LpxC באמצעות עמודת אולטרה-פילטרציה לריכוז סופי של לפחות 5 מ"ג/מ"ל בטמפרטורה של 4°C.
  2. סימון LpxC עם Atto488
    1. דילל 0.5 מ"ג LpxC בבופר פוספט של 50 מ"מ, pH 7.6, לנפח סופי של 225 מיקרוליטר. הוסף 25 מיקרו-ליטר של 1 מיליון נתרן ביקרבונט כדי לכוון את ה-pH לכ-8.3.
    2. המיס 0.24 מ״ג של צבע תגובתי Atto488 ב-20 מיקרוליטר של בופר ביקרבונט נתרן בעומק 0.1 מיליון להכנת תמיסה מלאית (0.012 מ"ג/מיקרוליטר). הכינו תמיסה עובדת על ידי דילול 2 מיקרוליטר של תמיסת המלאי עם 18 מיקרוליטר של בופר ביקרבונט נתרן בעומק 0.1 מיליטר, מה שמניב ריכוז סופי של 0.0012 מ"ג/מיקרוליטר.
    3. מיד הוסיפו 4 מיקרוליטר מתמיסת Atto488 לתמיסת החלבון (התואם ליחס מולרי של LpxC: Atto488 של 3:1). עטוף את הצינור בנייר אלומיניום ודגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עם ערבוב עדין (18 סל"ד).
      הערה: גם המלאי של Atto488 וגם התמיסות הפועלות ניתנים להקפאה מהירה בחנקן נוזלי ולאחסון בטמפרטורה של -80°C.
  3. הפרדה בין LpxC–Atto488 לצבע חופשי
    1. איזון עמודת דה-מלח PD-10 עם 10 מ"ל מים אולטרה-טהורים, ואחריה 15 מ"ל של בופר פוספט 50 מ"מ, pH 7.6.
    2. מרחים את תערובת תגובת התווית על העמודה ומאפשרים לה להיכנס לגמרי לשרף.
    3. סלוט עם 5 מ"ל של בופר פוספט 50 מ"מ, pH 7.6. שני פסים מובחנים התואמים ל-LpxC–Atto488 (פס ראשון) וצבע Atto488 חופשי (רצועה שנייה) צריכים להיות גלויים. אסוף שברים מהרצועה הראשונה ב-~0.5 מ"ל אליקווט.
    4. ניתוח שברים מושלפים באמצעות SDS-PAGE. לדמיין פלואורסצנציה תחת תאורת UV לפני צביעת Coomassie Brilliant Blue (CBB).
    5. שברים מבריקים המכילים LpxC–Atto488 ומרוכזים את החלבון המסומן לכ-2 מ"ג/מ"ל.
    6. הערכת יעילות התיוג על ידי מדידת ריכוז החלבון וריכוז Atto488 באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח.
      הערה: יחס של ריכוז Atto488 (ב-pmol/μL) לריכוז LpxC (בmg/mL) בטווח של 2–5 מצביע על רמת תיוג מתאימה. זה תואם ליחס מולרי של Atto488 ל-LpxC שנע בין 1:15 ל-1:6 לאחר הסימון.
    7. Aliquot LpxC–Atto488 לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, הקפאה בזרימה בחנקן נוזלי, ואחסון בטמפרטורה של -80°C. בשלב זה, ניתן להשהות את הפרוטוקול עד 3 חודשים.
      זהירות: חנקן נוזלי קר מאוד; לטפל בזה עם ציוד מגן מתאים (כפפות קריו, הגנה לעיניים).

2. שיקום של FtsH/LapB לפרוטאוליפוזומים

  1. הכנת ליפוזומים
    1. העבר 100 מ"ג של 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-פוספוכולין (POPC) בכלורופורם למבחנה זכוכית. אידוי את הממס בזרם עדין של N₂, ולאחר מכן ייבוש בלילה בוואקום.
      הערה: ל-POPC יש טמפרטורת מעבר פאזה של ~-2 °C והוא בשימוש נרחב בביופיזיקה של ממברנות, נוסחאות ליפוזום ומערכות מודלים של תאים.
      אזהרה: כלורופורם עלול להזיק לעיניים, לעור, לכבד, לכליות ולמערכת העצבים. נדרש ציוד מגן מתאים (כפפות, מגן עיניים, מסכה) במהלך הטיפול. תטפל בזה עם מכסה מנוע עם מזרק זכוכית.
    2. הוסף 1,315 מיקרוליטר של בופר A (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl) לסרט ה-POPC היבש. החזירו את הליפידים על ידי החלפה של דקה אחת של סוניקציה באמבט מים עם דקה אחת של מערבולת במהירות מקסימלית למשך ~15 דקות, או עד שהתפזרו לחלוטין. (ריכוז השומנים הסופי: 100 מ"מ).
      הערה: כדי לשפר את השעיית השומנים מחדש, כוונן את עומק הטבילה של מבחנה הזכוכית בסוניקוטור אמבט המים כדי למקסם את הערבוב. ליפידים תלויים יכולים להיאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. בשלב זה, ניתן להשהות את הפרוטוקול עד חודש אחד.
    3. מחברים את מתלי הליפוזום לחלקים של 200 מיקרוליטר ואחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  2. אקסטרוזיה של ליפוזומים
    1. הפשרה של 200 מיקרו-ליטר ליפוזום באמבט מים בטמפרטורת החדר ומדללת עם 800 מיקרו-ליטר של בופר A לנפח סופי של 1 מ"ל.
    2. חשוף את הליפוזומים לשלושה מחזורי הקפאה והפשרה על ידי חילופי חנקן נוזלי לאמבט מים בטמפרטורת החדר.
    3. שטוף מזרקים, שני תומכי מסנן, וממברנת פוליקרבונט של 200 ננומטר עם בופר A. הרכיבו את המיני-אקסטרודר ואקסטרודו את הליפוזומים 20 פעמים.
      הערה: מתלה הליפוזום אמור להיראות שקוף לאחר האקסטרוזיה.
    4. חלק את מתליית הליפוזום המוחלטת בנפח 1 מ"ל לשלושה צינורות (330 מיקרוליטר לכל צינור) ודילל כל אחד מהם ב-600 מיקרוליטר של בופר A.
  3. טיטרציה לנפיחות טריטון X-100
    הערה: טריטון X-100 הוא חומר ניקוי עם ריכוז קריטי נמוך של מיצל (CMC), והוכח כיעיל ביותר במקרים רבים21
    זהירות: טריטון X-100 הוא חומר כימי מסוכן, הגורם בעיקר לנזק חמור לעיניים, גירוי בעור ולנזקים מזיקים אם הוא נבלע. נדרש ציוד מגן מתאים (כפפות, הגנה לעיניים) במהלך הטיפול.
    1. הכינו טריטון X-100 של 10% (v/v) על ידי ערבוב 100 מיקרוליטר טריטון X-100 עם מים אולטרה-טהורים של 900 מיקרוליטר, ודגרו בשייקר כדי להמיס את טריטון X-100 במלואו.
    2. מדדו את הספיגה של ליפוזומים ב-540 ננומטר (A₅₄₀) באמצעות ספקטרופוטומטר.
    3. מוסיפים 5 מיקרו-ליטר אליקוטים של 10% טריטון X-100 ברצף, ערבוב בעדינות לאחר כל הוספה, ומדידו A₅₄₀. המשך להוסיף את טריטון X-100 עד ש-A₅₄₀ מגיע למקסימום, ואז מוסיפים את טריטון X-100 עוד 4–5 פעמים עד שהספיגה יורדת לכ-60% מהערך השיא.
    4. בהתבסס על עקומת הטיטרציה, יש להגדיל ליפוזומים על ידי הוספת 35 מיקרוליטר של 10% טריטון X-100 ולדגור בטמפרטורת החדר במשך שעה עם ערבוב עדין.
  4. שיקום FtsH/LapB לליפוזומים
    1. לבטא ולטהר חלבוני FtsH ו-LapB כפי שתוארו קודם18.
    2. שטוף ~2 גרם של סופח פוליסטירן לא פולרי (למשל, Bio-Beads SM-2) פעם אחת עם 10 נפחי מתנול, פעם אחת עם 10 נפחי אתנול, ועשר פעמים עם 10 נפחי מים אולטרה-טהורים. אחסן את הסופח השטוף בבופר A בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    3. לכל צינור של ליפוזומים טריטון X-100 נפוחים, הוסף 3 מיקרוליטר של 500 מ"מ טריס(2-קרבוקסיתיל)פוספין (TCEP), 22.5 מיקרוגרם של FtsH, ו-22.5 מיקרוגרם של LapB. כוון את הנפח הכולל ל-1 מ"ל עם בופר A ודגר ב-RT למשך שעה עם ערבוב עדין.
      הערה: יחס חלבון-לשומן של 1:20 עד 1:200 (משקל/משקל) שימש באופן שגרתי במהלך שיקום פרוטאוליפוזומים21. כאן משתמשים ביחס של 1:100.
    4. הסרת חומר ניקוי באמצעות דגירה רציפה עם סופח פוליסטירן לא פולרי: 40 מ"ג ב-RT למשך 0.5 שעה, אחריה 40 מ"ג ב-RT לשעה, אחר כך 40 מ"ג ב-4°C ללילה, ולבסוף 40 מ"ג ב-4°C לשעה.
    5. צנטריפוגה קצרה לפלט את הפוליסטירן הלא-קוטבי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (400 × גרם למשך 3 שניות). העבר את הסופרנטנט לצינורות אולטרה-צנטריפוגה. שטוף את הסופח הלא-פולרי של פוליסטירן עם 1 מ"ל בופר A ומשלב את השטיפה עם הסופרנטנט. הוסף בופר נוסף A לנפח סופי של ~6 מ"ל.
      הערה: למען בטיחות, צינורות אולטרה-צנטריפוגה חייבים להכיל לפחות 6 מ"ל נוזל.
    6. איזון הצינורות והאולטרה-צנטריפוגה ב-250,000 × גרם בטמפרטורה של 4°C למשך 45 דקות ברוטור בזווית קבועה (למשל, MLA-80) לפלט פרוטאוליפוזומים.
    7. השליך את הסופרנטנט והשלים מחדש את כדור הפרוטאוליפוזום ב-70 מיקרוליטר של בופר A בתוספת 1 mM TCEP.
      הערה: נפח הפרוטאוליפוזום הסופי הוא כ-100 מיקרוליטר.
    8. הקפיאו במהירות את הפרוטאוליפוזומים בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 80°C.
      הערה: בשלב זה, ניתן להשהות את הפרוטוקול עד חודש.
  5. ניתוח SDS-PAGE של פרוטאוליפוזומים
    1. מערבבים היטב פרוטאוליפוזומים ומשלבים 5 מיקרוליטר של הדגימה עם 5 מיקרוליטר של בופר טעינה SDS 2× (0.1 M Tris-HCl, pH 6.8, 5% SDS, 20% גליצרול, 0.01% ברומופנול כחול, 200 mM DTT).
    2. טעין דגימות פרוטאוליפוזום לצד 525 ng של FtsH (המקביל ל-0.06 מיקרומום FtsH hexamer ב-20 מיקרוליטר) על ג'ל SDS-PAGE של 4–20%.
    3. צבעי את הג'ל ב-CBB.
    4. סרוק את הג'ל וכמת את עוצמת הרצועה של FtsH עבור כל דגימה. חשב את נפח השעיית הפרוטאוליפוזום השווה ל-525 ng של FtsH.

3. פירוק חוץ גופי של LpxC–Atto488

  1. לבצע בדיקות פירוק חוץ-גופית בתגובה של 20 מיקרוליטר המכילה פרוטאוליפוזומי FtsH/LapB (המתאימים ל-0.06 מיקרומום FtsH) ו-0.5, 1, 2, 2.5, 5, 10, 20, 40 מיקרומום LpxC-Atto488 בבופר פירוק (50 מ"מ טריס-אצטט, pH 8.0, 10 מ"מ מ"מ מילימטר-אצטט, 5 מ"מ אל-אטפ, 25 מיקרומום אבץ-אצטט, 80 מ"מ NaCl, 1.4 מ"מ β-מרקפטואנול).
  2. למדידת כל ריכוז של מצע, יש להכין תגובה של 70 מיקרוליטר.
    1. קח שבר של 20 מיקרולטר וכיבה אותו מיד עם 48 מיקרוליטר של חומצה טריכלורואצטית (TCA) של 5% בצינורות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל (0 דקה). קח את השברים השני והשלישי וכיבה אותם ב-10 ו-20 דקות, בהתאמה.
    2. במקביל, הכינו תגובות בקרה מתאימות ללא פרוטאוליפוזומים לחיסור רקע.
      הערה: מומלץ לבצע שלוש מדידות שכפול כדי להשיג תוצאות אמינות.
      מזעור חשיפה לאור בעת טיפול ב-LpxC–Atto488.
      אזהרה: TCA הוא חומר כימי קורוזיבי מאוד שגורם לכוויות עור קשות, נזק קבוע לעיניים וגירוי נשימתי עז בשאיפה. לטפל בזה עם ציוד מגן מתאים (כפפות, מגן עיניים, מסכה).
  3. דגמו דגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לשיקוע חלבונים, ואז צנטריפוגה ב-18,800 × גרם בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  4. לנטרל דגימות על ידי העברת 50 מיקרוליטר של סופרנטנט לצינור המכיל 60 מיקרוליטר של 500 מ"מ Tris-HCl, pH 8.8. ערבב היטב והעבר 100 מיקרוליטר לפלטת שחורה עם 96 בארות. מדדו פלואורסצנציה באמצעות קורא לוחות עם עירור ב-498 ננומטר ופליטה ב-520 ננומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לשפר את הרגישות של מבחן הפירוק במבחנה , סובסטרט LpxC סומן בצבע הפלואורסצנטי Atto488. קבוצת האסטר הסוקסינימידיל של Atto488 מגיבה ביעילות עם קבוצות האמינו הראשוניות של LpxC בתנאים בסיסיים קלים. מכיוון שבופר טריס מכיל אמינים ראשוניים שמפריעים לתגובה זו, LpxC שטוהר בבופר טריס הוחלף לבופר פוספט באמצעות סינון ג'ל לפני הסימון. לתגובת התיוג, נעשה שימוש ביחס מולרי של LpxC ל-Atto488 של 3:1 להשגת תיוג מתון ולמנוע תיוג יתר (ראו דיון). לאחר הסרת הצבע החופשי, חלקי LpxC–Atto488 נותחו על יד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השלב הקריטי הראשון בפרוטוקול זה הוא תיוג Atto488 של LpxC. תיוג מתון הוא קריטי למדידה מדויקת של פעילות התדרדרות במבחנה . בהתבסס על ניסויי האופטימיזציה שלנו, יחס מולרי של LpxC ל-Atto488 בין 9:1 ל-3:1 הוא האופטימלי. Atto488 מופרז גורם לתיוג יתר, מה שכנראה מפריע למצב הטבעי של LpxC. בתנאים אלו, ההבדל בהתדרדרות של LpxC–Atto488 על ידי FtsH בלבד לעומת FtsH/LapB מצטמצם משמעותית (הנתונים לא מוצגים). לעומת זאת, תיוג לא מספק יוצר אותות פלואורסצנטיים חלשים מדי למדידות קינטיות רגישות. בעת התא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

כל המחקר נערך באוניברסיטת ייל. W.M. נתמכת על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית תחת מספרי הפרס R01GM137068 ו-RM1GM149406, ועל ידי קרן משפחת ריצ'רד וסוזן סמית' דרך פרס Odyssey.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.5 mL microcentrifuge tubeUSA scientific1415-2500
200 nm polycarbonate membraneAvanti Polar Lipids610006
4-20% SDS-PAGEHome made
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrateSigmaA26209
Atto 488 Protein Labeling KitSigma38371
Bio-Beads SM-2 Bio-Rad152-8920Nonpolar polystyrene adsorbent 
Black 96-well plate Costar3915
Bromophenol blueSigma114391
Coomassie Brilliant Blue R250Sigma1.12553
DTTSigmaD9779
EthanolSigma459844
Filter supportAvanti Polar Lipids610014
Glass syringeAvanti Polar Lipids610017
Glass test tubeKIMBLE45066-16150
GlycerolAvantor2136-01
Magnesium acetate tetrahydrateSigma228648
MethanolSigma179337
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75-002-436
Mini-extruderAvanti Polar Lipids610000
MLA-80 rotor Beckman367096Fixed-angle rotor 
Plate readerTecanInfinite M1000 PRO
POPC Avanti Polar Lipids850457C
Refrigerated microcentrifugeThermo Fisher Scientific75002559
SDSAmerican BioAB01920-00500
Sodium bicarbonate SigmaS6014
Sodium chlorideSigmaS9888
Sodium dihydrogen phosphateSigma38400100
Sodium phosphate dibasicSigma567547
SonicatorFisherbrandFB-11201
SpectrophotometerSCILOGEXSCI-V1000
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva 28990944High-resolution gel filtration column 
Tabletop ultracentrifugeBeckmanOptima MAX-XP
TCEP HClGold BiotechnologyTCEP1
Trichloroacetic acid SigmaT6399
Tris BaseSigma252859
Triton X-100 SigmaT8787
Ultracentrifuge tubes Beckman355647
Ultrafiltration column MilliporeUFC8030
Vortex-Genie 2 MixerScientific IndustriesSI-0236 
Zinc acetate dihydrateSigma379786
β-mercaptoethanolSigma444203

מקורות

  1. Sauer, R. T., Baker, T. A. Aaa+ proteases: ATP-fueled machines of protein destruction. Annu Rev Biochem. 80 (1), 587-612 (2011).
  2. Neuwald, A. F., Aravind, L., Spouge, J. L., Koonin, E. V. AAA: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res. 9 (1), 27-43 (1999).
  3. Kim, Y. I., Burton, R. E., Burton, B. M., Sauer, R. T., Baker, T. A. Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpxP degradation machine. Mol Cell. 5 (4), 639-648 (2000).
  4. Gur, E., Sauer, R. T. Recognition of misfolded proteins by Lon, a AAA+ protease. Genes Dev. 22 (16), 2267-2277 (2008).
  5. Ogura, T., Wilkinson, A. J. Aaa+ superfamily ATPases: Common structure-diverse function. Genes Cells. 6 (7), 575-597 (2001).
  6. Tomoyasu, T., et al. The Escherichia coli FtsH protein is a prokaryotic member of a protein family of putative ATPases involved in membrane functions, cell-cycle control, and gene expression. J Bacteriol. 175 (5), 1344-1351 (1993).
  7. Tomoyasu, T., et al. Topology and subcellular localization of FtsH protein in Escherichia coli. J Bacteriol. 175 (5), 1352-1357 (1993).
  8. Ito, K., Akiyama, Y. Cellular functions, mechanism of action, and regulation of FtsH protease. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 211-231 (2005).
  9. Chai-Danino, M., et al. Membrane-embedded polar residues target membrane proteins for degradation by the quality control protease FtsH. bioRxiv. , (2023).
  10. Arends, J., Thomanek, N., Kuhlmann, K., Marcus, K., Narberhaus, F. In vivo trapping of ftsh substrates by label-free quantitative proteomics. Proteomics. 16 (24), 3161-3172 (2016).
  11. Westphal, K., Langklotz, S., Thomanek, N., Narberhaus, F. A trapping approach reveals novel substrates and physiological functions of the essential protease ftsh in Escherichia coli. J Biol Chem. 287 (51), 42962-42971 (2012).
  12. Young, K., et al. The envA permeability cell division gene of Escherichia coli encodes the second enzyme of lipid a biosynthesis: UDP-3-o-(r-3-hydroxymyristoyl)-n-acetylglucosamine deacetylase. J Biol Chem. 270 (51), 30384-30391 (1995).
  13. Ogura, T., et al. Balanced biosynthesis of major membrane components through regulated degradation of the committed enzyme of lipid a biosynthesis by the AAA protease FtsH (HflB) in Escherichia coli. Mol Microbiol. 31 (3), 833-844 (1999).
  14. Klein, G., Kobylak, N., Lindner, B., Stupak, A., Raina, S. Assembly of lipopolysaccharide in Escherichia coli requires the essential LapB heat shock protein. J Biol Chem. 289 (21), 14829-14853 (2014).
  15. Mahalakshmi, S., Sunayana, M. R., Saisree, L., Reddy, M. YciM is an essential gene required for regulation of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli. Mol Microbiol. 91 (1), 145-157 (2014).
  16. Nicolaes, V., et al. Insights into the function of YciM, a heat shock membrane protein required to maintain envelope integrity in Escherichia coli. J Bacteriol. 196 (2), 300-309 (2014).
  17. Shu, S., Tsutsui, Y., Nathawat, R., Mi, W. Dual function of LapB (yciM) in regulating Escherichia coli lipopolysaccharide synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (17), e2321510121(2024).
  18. Shu, S., Mi, W. Regulatory mechanisms of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli. Nat Commun. 13 (1), 4576(2022).
  19. Tomoyasu, T., et al. Escherichia coli FtsH is a membrane-bound, ATP-dependent protease that degrades the heat-shock transcription factor sigma(32). EMBO J. 14 (11), 2551-2560 (1995).
  20. Yang, Y. Q., et al. Folding-degradation relationship of a membrane protein mediated by the universally conserved ATP-dependent protease FtsH. J Am Chem Soc. 140 (13), 4656-4665 (2018).
  21. Geertsma, E. R., Mahmood, N. A. B. N., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function. Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).
  22. Asahara, Y., et al. FtsH recognizes proteins with unfolded structure and hydrolyzes the carboxyl side of hydrophobic residues. J Biochem. 127 (5), 931-937 (2000).
  23. Kihara, A., Akiyama, Y., Ito, K. Host regulation of lysogenic decision in bacteriophage lambda: Transmembrane modulation of FtsH (HflB), the cII degrading protease, by HflKC (HflA). Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (11), 5544-5549 (1997).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

פרוטואז FtsHמתאם LapBשחזור לפרוטאו-ליפוזומיםפרוטואז AAA+בדיקת פלואורסצנציההומאוסטזיס של חלבוניםניתוח קינטי

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.